JPS6370166A - フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法 - Google Patents

フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法

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JPS6370166A
JPS6370166A JP61213715A JP21371586A JPS6370166A JP S6370166 A JPS6370166 A JP S6370166A JP 61213715 A JP61213715 A JP 61213715A JP 21371586 A JP21371586 A JP 21371586A JP S6370166 A JPS6370166 A JP S6370166A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、臨床検査分野にンける血球の分類測定法に
関するものであり、さらに詳しくは、フローサイトメー
タを用いて、螢光染色処理された血球を光学的に測定し
、白血球を分類する方法に関するものである。
（従来の技術） 健常人の末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好中
球、好酸球、好塩基球の種類がある。これらは各々その
機能が異っており、血液中の白血球を種類別に計数する
ことＫよって、病気の診断に貢献することができる。た
とえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白血病など
にみられ、好中球の減少は、ウィルス性疾患、再性不艮
性貧血、無顆粒球症などに見られる。好酸球の増加は、
寄生虫症、ホジキン病、アレルギー疾、＠なトニみられ
る。単球の増加は、感染症の快復期、単球性白血病など
にみられる。
白血球を分類−計数するために従来から濠も良〈実施さ
れている方法は、血液像鑑定（視箕法、用手法）と呼ば
れるものである。
この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球を
固定し、さらに染色したのち、顕微使で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴（白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の重態等）や染色度合から測定者が
いずれの血球であるかを判定し、分類−計数するもので
ある。このとき、一般の検査室では１００〜２００個の
白血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血
球の百分率（％）をｎ：ｔ＋定位としている。
この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、固
定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわずかな差を見分
けなければならないこととのため−に、測定者に大きな
負担をかけるものとなっている。さらに、計数する白血
球数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布とな
っている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のある
測定値を出すことは難しい。
このために、白血球の分類−計数が目動的に行なえる方
法が強く求められており、現在のところ、大きく分けて
二種類の方法が実現されている。
そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等でと
らえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を分
類するものである。この方法は従来の視算法に原理的に
は近い方法であるが、コンピューターによる処理では分
類できない血球も多く、完全には祝算法に取ってかわる
ものとはなっていない。また、装置が複雑で大型になり
、価格が高くなるという問題もある。
白血球を自動的に分類−計数するもう−の方法は、フロ
ーシステムを利用した方法である。この方法は、血球を
希釈液中に浮遊させた試料を用い、血球が一個ずつ細い
検出器中を通過するようにこの試料を流し、このとき検
出器で発生する信号を分析することにより白血球を分類
するものである。
このフローシステムを利用した方法は、さらに、二つの
方法に細分される。
第１の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみが
浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通過した
ときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信号
の大きさによって白血球を分類するものである。
第２の方法は、光源と、試料中の細胞が１個ずつ細い流
路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せられ
た光を検出する測光部と、検出信号を解析する解析装置
とを４（１イえたフローサイトメーターを使用するもの
である。この方法では、血球を染色し、染色された血球
を元で照射し、そのとき血球から発する螢光および場合
によっては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によ
って白血球を分類しようとするものである。
この第２の方法に属するものとしては、例えば特公昭５
９−８５３号公報およびエル・エイ・カメンツキー（Ｌ
、Ａ、Ｋａｍｍ？Ｌｔｓｋｙ　）ｒブラッド・セルズ（
Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　）　Ｊ、第６巻、１２１〜１
４０頁、１９８０年に記載された方法がある。
この方法は、血液に１０倍量のアクリジンオレンジ染色
液を加え、１分間インキュベートしたのち、アルゴンイ
オンレーザ−等の光源で照射したとき血球から発する緑
色螢光と赤色螢光を測定し、その二次元分布から、白血
球を分類・計数するものである。
第２の方法に属する他の例としては、特開昭５０−２０
８２０号公報およびエイチ・エム・シャピロ（Ｉｉ、Ｍ
、Ｓんαｐｉｒｏ　）他「ザ・ジャーナル・オブ・ヒス
トケミストリー・アンド・サイトケミス　ト　リー　（
Ｔルｇ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｍｍｉｔｔｔｒｙａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｇｍｉａｔｒｙ
　）　１、第２４巻第１号、３９６〜４１１頁、１９７
６年；同じく第２５巻第８号、９７６〜９８９頁、１９
７７年に記載された方法がある。この方法は、血液に４
倍量の染色ｉ１を加え、３分間インキュベートした後、
血液と等容の２０％ホルムアルデヒドを加え、５分間固
定を行ない、希釈用の染色液■で１５〜２０倍に希釈し
、フローサイトメーターで測定するものである。この測
定に用いられるフローサイトメーターは、光源として光
を３分割した７に銭アークランプ又は三本のレーザーを
備え、染色液に首１れる３ａの螢光染料を各々励起し、
その３種の螢光と前方散乱光、側方散乱光、吸光の６つ
のパラメーターを６１１１定し、４段階の二次元分布解
析により白血球を分類・計数する装置である。
（発明が解決しようとする問題点） フローシステムを利用して白血球を分類・計数する方法
のうち第１の方法においては、赤血球を破壊しなければ
ならないが、血液によっては赤血球の溶解が完全に行な
われ得ない場合もあり、このときＫは測定値の正確さが
損なわれるとい５問題がある。
フローシステムを利用した第２の方法のうちの特公昭５
９−８５３号公報等に記載された方法は、細胞による染
料の吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中で
各白血球の螢光強度の差がで大となる時間に測定するこ
とを特徴としている。
しかしながら、白血球数が極端に多いか、または少い検
体については、染色強度が適正レベルとなる染色時間は
正常な検体とは異ることになり、検体ごとに適切な染色
時間を選定しなければならない。また、この方法は螢光
強度の差のみによって白血球を分類しようとしているた
め、リンパ球と卓球との分離等容血球の分離が必ずしも
良くないという問題がある。
フローシステムを利用した第２の方法のうちの他の例す
なわち特開昭５０−２０８２０号公報等に記載された方
法は、操作手順が多く、染色時間が長くかかる上に、複
雑な試薬を使用しなければならない。また、光源が３種
必要であることに加え、６つのパラメーターを測定しな
ければならないため装置が非常に複雑で高価なものとな
る。さらに１このように多くのパラメーターを測定して
いるため解析が複雑となり、大容量の解析装置を必要と
するという問題もある。
この発明は、上記従来の問題点を解決するためになされ
たもので、簡単な手順と構成で、白血球を正確に分類・
計数するだめの方法と装置を提供するものである。
（問題点を解決するだめの手段） この発明の白血球の分類方法は以下の各工程から構成さ
れる。
（ａｔ　　アＲを３．５〜１０．０に保つための緩衝剤
と、白血球が極端に変形しないように染色液の浸透圧を
生理的浸透圧の３’ｔ〜２倍に保つための無機塩類と、 白血球をその細胞化学的特性に応じて染め分ける螢光染
料とからなる染色液に、 抗凝固処理を施した新鮮な血液を加えて、平衡状態に達
つするまで染色された測定用試料を作１スする工程。
（ｂｌ　　前記測定用試料をフローサイトメーターに流
し、白血球と他の血琢とを螢光強度によって区別し、白
血球の側方（９０’　）散乱光信号と、少くとも一つの
螢光信号とを測定する工程。
（ｂ）白血球より発せられた前記複数の信号により、各
白血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を算出
する工程。
白血球より発せられる前記複数の信号のうち、側方散乱
光信号は細胞内情報を反映するものである。すなわち、
細胞内の細胞核が大きいほど、また、顆粒が多いほど細
胞内での光の反射が強まり、側方散乱光強度は増大する
。したがって、リンパ球は、その内部に顆粒が存在しな
いかあるいは少いので、散乱光強度は一番小さく、好中
球は、その内部に顆粒が多く存在し、また、大きな核を
持つので、散乱光強度は一番犬きくなる。単琢、好酸球
、好塩基球による散乱光強度はリンバエＦと好中球の中
間にある。このような理由により、各白血球の側方散乱
光の相対強度は、第１３図に示すものとなる。
一万、螢光信号は、細胞化学的特性を反映するものであ
り、染料と各白血球との相互作用により、各白血球から
異なる強度の信号が得られる。
したがって、側方散乱光信号に、染料に応じて、少くと
も一つの螢光信号を、組み合わせることにより、白血球
をさらに艮く分類できるようになる。
この発明の方法は、前述のように、複雑な前処理等の操
作を必要とせず、一段階の簡単な染色のみで、フローサ
イトメーターにより血液中の白血球だけを分類・計数す
るものである。
この発明に使用されるフローサイトメーターの光学系の
一具体例を第１図に示された図面に基いて説明する。第
１図は側方散乱光と赤螢光と緑螢光とを測定する場合を
示している。このフローサイトメーターの光学系１０に
使用された光源は、波長；４８８ｎｍ１出力；１０ｍＷ
のアルゴンイオンレーザ−１２である。レーザー１２が
ら発せられた元は、シリンドリカルレンズ１６によって
絞られ、フローセル１４中を流れるσ１１］定用試料を
照射する。
測定用試料中の染色された白血球がレーザー元によって
照射されると、白血球からは散乱光と螢光が発せられる
。
このうち、側方へ発せられた散乱光と螢光はコンデンサ
レンズ１８によって集められ、アパーチャ２０を通過し
たのち、ダイクロイックミラー２２に達する。
ダイクロイックミラー２２は側方散乱光２４を反射し、
螢光２６を透過させる。ダイクロイックミラー２２によ
って反射された側方散乱光２４は光電子増倍管２８によ
って測定される。ダイクロイックミラー２２を透過した
螢光２６のうち赤螢光３２はダイクロイックミラー３０
によって反射させられ、緑螢元３８のみが透過させられ
る。反射された赤螢元３２はカラーフィルター３４を通
過したのち、光電子増倍管３６によって６１＋１定され
る。透過した緑螢元３８はカラーフィルター４０を通過
したのち光電子増倍Ｗ４２によって測定される。
ところで、測定用試料中の赤血球は非常に弱い螢光しか
発しないので、螢光強度を測定する限りにおいては、赤
血球が白血球と同時に検出部を通過（同時通過）しても
、白血球の測定には妨害を与えない。しかし、散乱光を
測定する場合には、赤血球は白血球と同レベルの強度の
散乱光を発するため、白血球の計数に対して妨害を与え
る。このとき、螢光と散乱光を同時に測定し、一定レベ
ル以上の強度の螢光を発したもののみを白血球とするこ
とはできるが、白血球と赤血球が同時通過したときには
、白血球による散乱光に赤血球による散乱光が重畳され
るので、正しい白血球の散乱光強度を測定することがで
きない。第１図に示したフローサイトメーターの光学系
１０では、希釈倍率をたとえば２０倍とし、赤血球と白
血球との同時通過が起るｊ４率を減少させ、赤血球によ
る妨害の程度を実用上無視できる程度におさえた測定用
試料をフローセル１４に流すようにしている。
なお、フローサイトメーターでカ１］定する白血球数は
、測定値の再現性を向上させるために、一検体あたり約
１００００個以上とすることが望ましい。
さて、第１図に示した光学系を備えたフローサイトメー
ターを使用して前記試料を測定すると、表１に示した６
つの群の１７種の螢光染料により白血球の分類が行なえ
ることがわかった。
”　Ｄｓ　ＯＣ１（３１：　１　＋　１　’−ジメチル
オキサカルボシアニン ＤｉＯＣ２１３１；　１　、１’−ジエチルオキサカル
ボシアニン ＤｉＯＣ３（３１；　１　、１’−ジー（ｔＬ−プロピ
ル）オキサカルボシアニン ＤｓＯＣ５（３１；　１　、１’−ジー（％−ペンチル
）オキサカルボシアニン ＤｓＯＣ６（３１；　］　、　］１’−ジー％−ヘキシ
ル）オキサカルボシアニン これら６つの群の染料は、各白血球をその細胞化学的特
性に基づき染め分ける。そこで、染料に応じた染色条件
、測定や件、測定パラメーターを適切に選択すると、フ
ローサイトメーターで測定したとき、第３図α〜ｄに示
される様な分類結果が得られる。ただし、第３図中の１
はリンパ球、２は単球、３は好中球、４は好酸球、５は
好塩基球の集合を表わしている。また、５ｉｄｅ　ＳＣ
，は側方散乱光の相対強度、ＦＬ、は螢光の相対強度、
ＲａｄＦＬ、は赤発光の相対強度、Ｇｒｅｅｎ　ＦＬｓ
は緑螢光の相対強度を表わしている（以下の図において
も同じ）。
表１中の第１、第２群の染料は、螢光と側方散乱光を測
定パラメーターとすると、＠３図αに示される様に白血
球を４種類以上に分類する（実施例１．２参照）。
第３群の染料は、緑螢光と赤発光を測定パラメーターと
すると、第３図すに示される様に白血球を４種類以上に
分類する（実施例３参照）。
第４群の染料は、赤発光と側方散乱光を測定パラメータ
ーとすると、第３　（Ｍｌ　ｃに示される様に白血球を
４種類以上に分類する（実施例４参照）。
第５、第６群の染料は、螢光と側方散乱光を測定パラメ
ーターとすると、第３　＆ｔ　ｄに示される様に白血球
を４種類以上に分類する（実施例５．６参照）。
各染料の具体的な染色条件、測定条件、６１１ｊ定パラ
メーターの例を表２に示した。
表２の１７種の染料のうち、アクリジン・オレンジ、ロ
ードリン・オレンジでは一種の染料で白血球が５種類に
分類できる。しかし、この他の染料では、例えば第４群
の染料と第６群の染料を組み合せ、螢光と側方散乱元を
測定パラメーターとして測定してはじめて第３図６に示
されるように、白血球の５分類が可能となる（実施例７
参照）。
次に、表３に示す染料では、４８８　ｓｍという制限さ
れた励起光では白血球を４分類以上することはできない
が、リンパ球、単球、顆粒球への３分類は可能である。
このうち特に表４に示す染料では、表４に示された栄件
で測定し、螢光と側刃散乱党を測定パラメーターとする
と、第３図ｆに示されるように、リンパ球、単球、顆粒
球の分離が非常に艮い二次元分布パターンが得られる（
実施例８参照）。
ここで、表１に示す１７種の染料またはそれらの組み合
わせに対し、さらに表４に示す染料を加え、螢光と側方
散乱光を測定パラメーターとすると、第３図ｇに示され
るように１一層明確に各白血球を区別することが可能と
なる（実施例９参照）。
（作用） このように、螢光に加えて側方散乱光をも測定パラメー
ターとしたことと、細胞を染めわける作用が強い染料及
びその組み合わせを見いだし、使用したこととにより、
リンパ球と単球との分離をはじめ、各白血球の分離が非
常に艮くなった。
（実施例） 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明は何らそれらに限定されるものではない。
実施例１゜ 第１群の染料フルオレセインによる染色例ＥＤＴＡ抗凝
固新鮮血８０μｔを表２に示した組成のフルオレセイン
染色液（即ち、］Ｏｙ＋ａＡｆクエン酸緩衝液ｐＨ４，
５、ＮａＣ１１５０ｔａｕ　、フルオレセイン１００μ
ｙ／ｒｄ）２−に添加し、８分間インキュベートした後
、第１図に示した欠字系１０を備えたフローサイトメー
ター、第１図において、ダイクロイックミラー３０に６
００　ｎｍの赤反射型のものを用い、カラーフィルター
３４及び４０にそれぞれ５８０％ｔＩ％％５２０　ｎ？
ＰＬのロングパス（Ｌｏ％ｇｐαＳａ）フィルターを使
用している）のフローセル部１４のレーザー元照射部へ
層流原理に基づき、細胞を流し、ある一定の螢光強度を
有する細胞のみの側方散乱光及び５２０〜６００ｓｔｘ
の螢光を測定し、解析を行なった。
解析結果を第４図に示す。
実施例２〜６゜ 表１記載の第２群ないし第６群の染料を使用し、実施例
１と同様に、表２の条件で白血球を測定した。
実施例７．′ 表１中の第４群の染料と第６群の染料との混合による５
分類染色例（第１０図） アストラゾン・オレンジＧＩＯμ９／−、ニュートラル
レッドＩ　Ａｙ／ｌｎｔ％ＮａＣ１７５ｍ　Ｍ、　　１
０ｍ　ＡＩホウ酸緩衝液、ｐＨ９，０の染色液を使い、
染色時間１分で５６０％ｍ以上の赤螢光と側方散乱光を
測定パラメーターとして実施例１と同様に白血球を測定
した。
実施例８゜ 表４中の染料による３分類染色例（第１１図）ＴＡ−２
を用い、表４の条件で実施例１と同様に白血球を測定し
た。
実施例９゜ 表１の第４群の染料と第６群の染料と表４中の染料との
３種類の染料混合による５分類染色例アストラゾンオレ
ンジＧＩＯμ２／−、ニュートラルレッド１μＶゴ、Ｔ
Ａ−２１０μｆ／Ｗｄ、ＮａＣＬ　７５　ｍＭ、　　１
０　ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ９，０の染色液を使い、染
色時間１分で、５４０〜６００％鴨の緑螢光、６００％
惰以上の赤螢光及び側方散乱光を測定パラメーターとし
て、実施例１と同様に白血球をｆｉ１１定した。
第１２図は赤螢光と側方散乱光による白血球の５分類例
を示している。
第１３図は赤螢光と緑螢光により好塩基球５と好酸球４
とを分画した（第１３図α〕のち、第２回の解析として
緑螢光と側方散乱を用いてリンパ球１、単球２、好中球
３を分画した（第１３図ｂ）例を示している。
なお、以上述べた実施例は、すべて、兄全に染色が終了
したのちＫ（すなわち染色が平衡状態に達つしたのちに
）、測定を開始するものであるから、６１１１定中に試
料が経時変化することはなく、また、白血球が極端に多
いか、または、少い検体についても、常に、一定時間で
適正な強度にまで染色レベルが達している。したがって
、安定な測定が可能となるとともに、比較的低出力の光
源を使用しても、充分な螢光強度の信号が得られる。た
とえば、この実施例では、すべて、１０ｍＷのアルゴン
イオンレーザ−をフローサイトメーターの光源として使
用している。
しかし、この発明に使用されるフローサイトメーターの
光源は、前述の低出力のアルゴンイオンレーザ−に限ら
ず、他の光源、たとえば、水銀アークランプ、クセノン
アークランフ”、Ｈａ−Ｃｄしｆ−１Ｅａ−Ｎ−レーザ
ー、大出力のアルゴンイオンレーザ−等の光源であって
もかまわない。そのときには、各光源に応じた最適染料
、染色条件、測定条件を設定すれば艮い。
（発明の効果） この発明の方法によって血液を測定し、白血球を分類・
計数すると、以下に述べる様な効果が得られる。
（１）染色液に抗凝固処理を施した血液を加えるという
一段階の染色のみで測定用試料が得られるので、試料の
前処理が非常に簡単にできる。
（２）染料によっては、１分程度の染色時間で測定する
ことが可能であるため、測定迄に要する時間が短くて済
む。
（３）完全に染色が終了した状態で測定するため、測定
中の試料の経時的変化が無く、寸た、正常な検体のみな
らず、白血球が極端に多いか、または少い検体について
も、一定時間で常に適正な強度に染色がなされている。
このため検体圧よって染色時間を変えるという必要は生
じない。
（４）完全に染色が終了し、強い染色強度に違つしたの
ち測定するので、光源は低め力のもので艮い。さらに光
源は一個しか必要とせず、測定パラメーターも螢光２チ
ヤンネル、側方散乱光１チャンネルの中から２つのパラ
メーターを選択して測定し、分析するだけで良いので、
この発明の方法を実施するた約の装置は、構成が簡単で
低価格のものとなる。
（５）　　螢光に加えて、側方散乱光も一緒に測定して
いること、および、細胞を染め分ける作用が強い染料と
、その組み合わせを見いだし、使用したことにより、リ
ンパ球と単球の分離をはじめとして、分離度の非常に良
い各白血球の分類結果が得られる。
（６）赤血球、血小板、および幼若赤血球は、螢光強度
が白血球に比べて非常に弱いので、これらは白血球と完
全に区別できる。このため、測定前にあらかじめ赤血球
を溶解させる必要がない。
本発明の方法において、 赤血球と白血球との同時通過の確率が充分に少なくなる
ような希釈倍率で血液を薄めると、側方散乱光を測定す
る上においても、赤血球による妨害は無視できる程度に
おさえられる。
又、一検体につき１００００個以上の白血球を測定する
と、正確度および再現性にすぐれた測定値が得られる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、この発明に使用されるフローサイトメータの
光学系の一実施例を示す概鵡°１図、第１図中の符号は
次のとおりに説明される： １０７０−サイトメーターの光学系 １２　レーザー １４　フローセル １６　シリンドリカルレンズ １８　：Ｉンデンサーレンズ ２０　アノマーチャー ２２　ダイクロイックミラー ２４　側方散乱光 ２６　螢光 ２８　光電子増倍管 ３０　ダイクロイックミラー ３２　赤螢光 ３４　カラーフィルター ３６　光電子増倍管 ３８　緑螢光 ４０　カラーフィルター ４２　光電子増倍管 第２図は、各白血球の側刃散乱光相対残灰を示すグラフ
。 第３ａ〜σ図は、二つの信号を使用して、白血球を分類
したときの二次元分布図。図面中の符号１はリンパ球、
２は単球、３は好中球、４は好酸球、５は好塩基球の集
合を表わしている。 第４〜１３図は、二つの信号を使用して、白血球を分類
したときの二次元分布の測定例を示す図。 第３〜１３図中５ｉｄｅ　Ｓｔ　は側方散乱元の相対強
度、ＦＬは螢光の相対強度、ＲｍｄＦＬは昼餐光の相対
強度、Ｇデー＃％ＦＬは緑螢光の相対強度を表わす。 特許出願人　東亜医用電子株式会社 （外５名） 第１薗 第２図 嬌−−−ソンパ球 イ則方斂舌し党」上付ｌｕｌ 第３図 ５ｉｄｅ　Ｓｃ、　　　　　　　　　　　Ｒｅｄ　　Ｆ
Ｌ、　　　　　　　５ｉｄｅ　Ｓｃ。 ＋ＣＩ　ｌ　　　　　　　　　　（ｂ＋　　　　　　　
　　（ｃ　）（ｄ）　　　　（ｅ）　　　　（ｆ） Ｓｉｃｌｅ　　Ｓｃ。 第４図 ５ｉｄｅ　　Ｓｃ。 フルオレセイン１；よる白ｍ球分頽イ列第５図 ５ｉｄｅ　　Ｓｃ。 ＤｉＯＣ５（６）’＝二よる　白ｋｓｒ求分類イ列第６
図 Ｒｅｄ　　ＦＬ。 ブリリアントホスフィンによる白ｆ１１１球分類イ列第
７図 ５ｉｄｅ　　Ｓｃ。 二１−トフルレッドによｈ　白ｊｎ球′分頚例第８図 ５ｉｄｅ　　Ｓｃ。 λ−ラミンｏｔ二よん白血球°分趙イ列第９図 アストフヂンオレンヅＧ１；よる白ｋｔｋ分類仔１第１
０図 ５ｉｄｅ　　Ｓｃ。 アストラソ゛ンオレンヅＧとニュートラルレット１：よ
ん白１■工矢分突郵イ列第１１図 ５ｉｄｅ　　Ｓｃ。 ＴＡ−２によろ色ｋｘ５求の介→頂イ刈第１２図 ５ｉｄｅ　　Ｓｃ。 ３才監の染孝斗によん色ｊ且工求介仲例第１３図 Ｒｅｄ　　ＦＬ。 ５ｉｄｅ　　Ｓｃ。 手　　続　　補　　正　　書 ２、発明の名称 フローサイトメトリーによる白血球の分類方、去６、補
正をする者 ５、補正の対象 ６、補正の内容 別紙の通り （別紙） （１）　　特許請求の範囲を下記のように訂正する。 ［（１）　　以下（ａＪ〜［ｃ）の各工程からなること
を特徴とする、フローサイトメトリーによる白血球の分
類方法。 （ａ）　　ｐＨを３．５〜１０．０に保つための緩衝剤
と。 白血球が極端に変形しないように染色液の浸透圧を生理
的浸透圧の捧〜２倍に保つための無機塩類と、 白血球をその細胞化学的特性に応じて染め分ける螢光染
料とからなる染色液に、抗凝固処理を施した新鮮な血液
を加えて、平衡状態に達ザするまで染色して測定用試料
を調製する工程。 Ｉｂ）　　前記測定用試料をフローサイトメーターに流
し、白血球と他の血球とを螢光強度によって区別し、白
血球の側方（９０’）散乱光信号と、少くとも一つの螢
光信号とを測定する工程。 （ｃ）　　白血球より発せられた前記複数の信号により
、各白血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を
算出する工程。 （２）工程（ａ）において使用する染料が下記に示すも
のであり、白血球を４以上に分類する特許請求の範囲第
１項の方法。 第１群：キサンテン系染料　ピロニンＹローダミン３Ｇ
。 フルオレセイン Ｉ）ｔＯｃ３（３１ ＤｔＯＣ５（３１ Ｄ１０Ｃ６（３） 第３群ニアクリジン系染料　アクリジンオレンジブリリ
アントホスフィン ローダリンオレンジ ニークリジン３ＲＸ フラボホスフィンＲ コリホスフィン○ 第４詳ニアシン系染料　　　ニュートラルレッド第５群
ニジフェニルメタン　オーラミンＯ系染料 第６群：メチン系染料　　　アストラゾンオレンジＧ（
３）　　工程（ａ）に於いて使用する染料が下記に示す
ものであり、白血球を３以上に分類する特許請求の範囲
第１項の方法。 第１群：キサンテン系染料　アクリジンレッドローダミ
ンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン ダロウＶツド カルボシアニン 第９群ニスチリル系染料　　アストラゾンレツト６Ｂペ
イシックバイオレット （４）工程（ａ）に於いて使用する染料が下記に示すも
のの組み合わせであり、白血球を５以上に分類する特許
請求の範囲第１項の方法。 第１群：キサンテン系染料　ピロニンＹローダミ７３Ｇ
Ｏ フルオレセイン Ｄ１００３（３１ ＤｔＯＣ５（３１ ＤｉＯＣ６ｆ３１ 第３群ニアクリジン系染料　アクリジンオレンジブリリ
アントホスフィン ローダリンオレンジ ュークリジン３ＲＸ 〕２ボホスフインＲ コリホスフィ１０ 第４群ニアシン糸染料　　　ニュートラルレッド第６群
：メチン系染料　　　アストラゾンオレンジＧ（５１　
　さらに下記の染料な徂み合せて白血球を５以上に分種
する特許請求の範囲第４項の方法。 ローダミンＳ ローダミン１９ペルクロレート アクロノールフロキシンＦＦ’Ｓ ミド アストラゾンレッド６Ｂ Ａ−２ （６）工程１ｂ）に於いてフローサイトメーターの光源
としてＡｒイオンレーザ−、Ｈｅ−Ｎｅし・−ザー、ｕ
ｅ−ｃａ　　レーザー、Ｈｇ−アークランプ、Ｘｅ　　
−アークランプのいづれかを用いた特許請求の範囲第１
項の方法。 （刀　下記染料のうちの一つ又は２つ以上”、ｆ　７１
み合・ぜた染料を用いる特許請求の範囲第６項の方法。 アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ベルクロレート ローダミン１２３ エオンンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット グロウレソド アクロノールフワキシンＦＦＳ；　１．ｌ’３，３．３
’　、３’−ヘキサメチルインドカルボシアニン １．１′　−ジメチルチオカルボシアニン１１１’−ジ
エチルチオカルボシアニンアストラゾ：／レット”（３
Ｂ ベインツクバイオレット１６ Ａ−２ ピロニンＹ ローダミン３ＧＯ フルオレセイン Ｄ　ｉ　ＱＣ１（３１ Ｄ　１０　Ｃ２（３１ Ｄ１０Ｃ３（３１ Ｄ　ｔ　ＯＣ５（３１ Ｄ　１０　Ｃ（３（３１ アクリジンオレンジ ズリリアントホスフイン ローダリンオレンジ ニークリジン３ＲＸ フラボホスフィンＲ コリホスフィン〇 ニュートラルレッド オーラミン０ アクリジンオレンジＧ　」 （２）明細書を下記の如く訂正する。 頁　　　行　　　　　　　誤　　　　　　　　　正９　
　下５　　　メータ　　　　　　メーター１２　　３　
　　　−の　　　　　　　一つの１４　　１　　　　　
）１、　　　　　　　）２７　１３　　　クレシル　　
　　　クレジル２８　７　　　　フラキシン　　　　フ
ロキシン３６　３　　　　実施例　　　　　具体例（３
）明細書２７貞末行の下に下記を挿入する。 ｒ　＊３　　ＤｘＳＣｔ（３１：　　１，１’−ジメチ
ルチオカルボシアニン１１ｈＳＣ２（３１：　　１．１
’　　−ジエチルチオカルボシアニン」手続補正書 昭和６２年４月３日

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）以下（ａ）〜（ｃ）の各工程からなることを特徴
    とする、フローサイトメトリーによる白血球の分類方法
    。 （ａ）ｐＨを３．５〜１０．０に保つための緩衝剤と、
    白血球が極端に変形しないように染色液の浸透圧を生理
    的浸透圧の１／２〜２倍に保つための無機塩類と、 白血球をその細胞化学的特性に応じて染め分ける螢光染
    料とからなる染色液に、抗凝固処理を施した新鮮な血液
    を加えて、平衡状態に達っするまで染色して測定用試料
    を調製する工程。 （ｂ）前記測定用試料をフローサイトメーターに流し、
    白血球と他の血球とを螢光強度によって区別し、白血球
    の側方（９０°）散乱光信号と、少くとも一つの螢光信
    号とを測定する工程。 （ｃ）白血球より発せられた前記複数の信号により、各
    白血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を算出
    する工程。
  2. （２）工程（ａ）において使用する染料が下記に示すも
    のであり、白血球を４以上に分類する特許請求の範囲第
    １項の方法。 第１群：キサンテン系染料　　　　　　ピロニンＹ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ローダミン３Ｇ
    Ｏ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　フルオレセイン 第２群：オキサカルボシアニン系染料　ＤｉＯＣ１（３
    ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＤｉＯＣ２（３
    ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＤｉＯＣ３（３
    ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＤｉＯＣ５（３
    ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＤｉＯＣ６（３
    ） 第３群：アクリジン系染料　　　　　　アクリジンオレ
    ンジ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ブリリアントホ
    スフィン 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ローダリンオレ
    ンジ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ユークリジン３
    ＲＸ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　フラボホスフィ
    ンＲ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　コリホスフィン
    Ｏ 第４群：アジン系染料　　　　　　　　ニュートラルレ
    ッド 第５群：ジフェニルメタン系染料　　　オーラミンＯ 第６群：メチン系染料　　　　　　　　アストラゾンオ
    レンジＧ
  3. （３）工程（ａ）に於いて使用する染料が下記に示すも
    のであり、白血球を３以上に分類する特許請求の範囲第
    １項の方法。 第１群：キサンテン系染料　　　　　　アクリジンレッ
    ド 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ローダミンＳ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ローダミン６Ｇ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ローダミンＢ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ローダミン１９
    ペルクロレート 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ローダミン１２
    ３ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　エオシンＹ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　シアノシン 第７群：オキサジン系染　　　　　　　クレシルファー
    ストバイオレット 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ダロウレッド 第８群：シアニン系染料　　　　　　　アクロノールフ
    ロキシンＦＦＳ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　１，１′−ジメ
    チルチオカルボシアニン 　　　　　　　　　　　　　　　　　　１，１′−ジエ
    チルチオカルボシアニン 　　　　　　　　　　　　　　　　　　４，５，４′，
    ５′−ジベンゾ−３，３′−ジエチル−９−メチルカル
    ボシアニンブロミド 　　　　　　　　　　　　　　　　　　２−〔ｒ−（１
    ′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾリリデン）プロ
    ペニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾオキサゾリウム
    ヨージド 第９群：スチリル系染料　　　　　　　アストラゾンレ
    ッド６Ｂ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ベイシックバイ
    オレット１６ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　２−（ｐ−ジメ
    チルアミノスチリル）−１−エチル−４，５−ベンゾチ
    アゾリウムヨージド 　　　　　　　　　　　　　　　　　　２，４−ビス（
    ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−ピリジウ
    ムヨージド 　　　　　　　　　　　　　　　　　　２，６−ビス（
    ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−ピリジウ
    ムヨージド 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＴＡ−２
  4. （４）工程（ａ）に於いて使用する染料が下記に示すも
    のの組み合わせであり、白血球を５以上に分類する特許
    請求の範囲第１項の方法。 第１群：キサンテン系染料　　　　　　ピロニンＹ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ローダミン３Ｇ
    Ｏ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　フルオレセイン 第２群：オキサカルボシアニン系染料　ＤｉＯＣ１（３
    ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＤｉＯＣ２（３
    ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＤｉＯＣ３（３
    ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＤｉＯＣ５（３
    ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＤｉＯＣ６（３
    ） 第３群：アクリジン系染料　　　　　　アクリジンオレ
    ンジ　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ブリリアントホ
    スフィン 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ローダリンオレ
    ンジ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ユークリジン３
    ＲＸ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　フラボホスフィ
    ンＲ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　コリホスフィン
    Ｏ 第４群：アジン系染料　　　　　　　　ニュートラルレ
    ッド 第５群：ジフェニルメタン系染料　　　オーラミンＯ 第６群：メチン系染料　　　　　　　　アストラゾンオ
    レンジＧ
  5. （５）さらに下記の染料を組み合せて白皿球を５以上に
    分類する特許請求の範囲第４項の方法。 ローダミンＳ ローダミン１９ペルクロレート アクロノールフロキシンＦＦＳ ２−〔ｒ−（ｒ′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
    リリデン）プロペニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾ
    オキサゾリウムヨージド ９−Ｍ＿６−ＤｉＳＣ２（３） アストラゾンレッド６Ｂ ＴＡ−２
  6. （６）工程（ｂ）に於いてフリーサイトメーターの光源
    としてＡｒイオンレーザー、Ｈ＿６−Ｎ＿６レーザー、
    Ｃｄレーザー、Ｈｇ−アークランプ、Ｘ＿６−アークラ
    ンプのいづれかを用いた特許請求の範囲第１項の方法。
  7. （７）下記染料のうちの一つ又は２つ以上を組み合せた
    染料を用いる特許請求の範囲第６項の方法。 アクリジンレツド ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ペルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレシルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ；１，１′−ジメチルイ
    ンドカルボシアニン １，１′−ジメチルチオカルボシアニン １，１′−ジエチルチオカルボシアニン ４，５，４′，５′−ジベンゾ−３，３′−ジエチル−
    ９−メチルカルボシアニンブロミド；（９−Ｍ＿６−Ｄ
    ｉＳＣ２（３）） ２−〔ｒ−（１′−エチル−４′，５′−ベンゾチアゾ
    リリデン）プロペニル〕−１−エチル−４，５−ベンゾ
    オキサゾリウムヨージド アストラゾンレッド６Ｂ ベイシックバイオレット１６ ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−４
    ，５−ベンゾチアゾリリウムヨージド ２，４−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
    チルピリジウムヨージド ２，６−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
    チルピリジウムヨージド ＴＡ−２ ピロニンＹ ローダミン３ＧＯ フルオレセイン １，１′−ジメチルオキサカルボシアニン １，１′−ジエチルオキサカルボシアニン １，１′−ジ−（ｎ−プロピル）オキサカルボシアニン １，１′−ジ−（ｎ−ペンチル）オキサカルボシアニン １，１′−ジ−（ｎ−ヘキシル）オキサカルボジアニン アクリジンオレンジ ブリリアントホスフィン ローダリンオレンジ ユークリジン３ＲＸ フラボホスフィンＲ コリホスフィンＯ ニュートラルレッド オーラミンＯ アストラゾンオレンジＧ
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