JPS63134957A - フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、臨床検査分野における血球の分類測定法に
関するものであり、さらに詳しくは、フローサイトメー
ターを用いて、螢光染色処理された血球を光学的シて測
定し、白血球を分類する方法に関するものである。

（従来の技術） 健常人の末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好中
球、好酸球、好塩基琢の種類がある。これらは各々その
機能が異っておシ、血液中の白血球を種類別に計数する
ことによって、病気の診断に貢献することができる。た
とえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白血病など
にみられ、好中球の減少は、ウィルス性疾患、再性不艮
性貧血、無顆粒球症などに見られる。好酸球の増加は、
寄生虫症、ホジキン病、アレルギー疾患などにみられる
。単球の増加は、感染症の快復期、単球性臼１病などに
みられる。

白血球を分類・計数するために従来から最も良〈実施さ
れている方法は、血液像鑑定（視算法、用手法）と呼ば
れるものである。

この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球を
固定し、さらに染色したのち、顕微鏡で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴（白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の有無等）や染色度合から測定者が
いずれの血球であるかを判定し、分類・計数するもので
ある。このとき、一般の検査室では１００〜２００個の
白血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血
球の百分率Ｃ％）を測定値としている。

この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、固
定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわずかな差を見分
けなげればならないこととのために、測定者に大きな負
担をか（するものとなっている。さらに、計数する白血
球数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布とな
っている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のある
ＩＩＩ定値を出すことは難しし・。

このだめに、白血球の分類・計数が自動的に行なえる方
法が強く求められておシ、現在のところ、大きく分けて
二種類の方法が実現されている。

そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等でと
らえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を分
類するものである。この方法は従来の視算法に原理的に
は近い方法であるが、コンピューターによる処理では分
類できない血球も多く、完全には視算法に取ってかわる
ものとはなっていない。また、装置が複雑で大型になり
、価格が高くなるという問題もある。

白血球を自動的に分類・計数するもう一つの方法は、フ
ローシステムを利用した方法である。この方法は、血球
を希釈蔽中に浮遊させた試料を用℃・、血球が一個ずつ
細い検出器中を通過するようにこの試料を流し、このと
き検出器で発生する信号を分析することにより白血球を
分類するものである。このフローシステムを利用した方
法は、さらに、二つの方法に細分される。

第１の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみが
浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通過した
ときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信号
の大きさによって白血球を分類するものである。

第２の方法は、光源と、試料中の細胞が１個ずつ細い流
路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せられ
た光を検出する測光部と、検出信号を解析する解析装置
とを備えたフローサイトメーターを使用するものである
。この方法では、血球を染色し、染色された血球を光で
照射し、そのとき血球から発する螢光および場合によっ
ては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によって白
血球を分類しよ５とするものである。

この第２の方法に属するものとしては、例えば特公昭５
９−８５３号公報およびエル・エイ・カメンツキー（Ｌ
　、　Ａ　、　Ｋａｍｅｎｔｓｋｙ　）　「ブラッド・
セルズ（Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ）　Ｊ、第６巻、１２
１〜１４０頁、１９８０年に記載された方法がある。こ
の方法は、血液に１０倍量のアクリジンオレンジ染色液
を加え、１分間インキュベートしたのち、アルゴンイオ
ンレーザ−等の光源で照射したとき血球から発する緑色
螢光と赤色螢光を測定し、その二次元分布から、白血球
を分類・計数するものである。

第２の方法に属する他の例としては、特開昭５０−２０
８２０号公報およびエイチ・エム・シャピｏ　（Ｈ，Ｍ
、５ｈａｐｉｒｏ）他「ザ・ジャーナル・オプ・ヒスト
ケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｔｈｅ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　ＨｉｓｔｏＣｈｅｍｉｓｔｒ
ｙａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｔｒｒｎｉａｔｒｙ）第２４巻
第１号、３９６〜４１１頁、１９７６年；同じく第２５
巻第８号、９７６〜９８９頁、１９７７年に記載された
方法がある。この方法は、血液に４倍量の染色液■を加
え、３分間インキュテートシた後、血液と等容の２０％
ホルムアルデヒドを加え、５分間固定を行ない、希釈用
の染色液■で１５〜２０倍に希釈し、フローサイトメー
ターで測定するものである。

この測定に用いられるフローサイトメーターは、光源と
して光を３分割した水銀アークランプ又は三本のレーザ
ーを備え、染色液に含まれる３種の螢光染料を各々励起
し、その３種の螢光と前方散乱光、側方散乱光、吸光の
６つのパラメーターを測定し、４段階の二次元分布解析
によシ白血球を分類・計数する装置である。

さらに、昭和６１年９月１０日出願の特願昭６１−２１
３７１５号においては、緩衝液、無機塩類及び螢光染料
からなる染色液に血液を加えて染色するという一段階染
色工程が開示されているが、未溶解の赤血球が測定デー
タに影響を及ぼし、測定か不明確となるおそれがあった
。

（発明が解決しようとする問題点） フローシステムを利用して白血球を分類・計数する方法
のうち第１の方法においては、赤血球を破壊しなければ
ならないが、血液によっては赤血球の溶解が完全に行な
われ得ない場合もあり、このときにはβ１ｊ定値の正確
さが損なわれるという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの特公昭５
９−８５３号公報等に記載された方法は、細胞による染
料の吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中で
各白血球の螢光強度の差元・：設犬となる時間に測定す
ることを特徴としＣｏる。

しかしながら、白血球数が極端に多いか、または少い検
体については、染色強度が適正レベルとなる染色時間は
正常な検体とは異ることになシ、検体ごとに適切な染色
時間を選定しなげればならない。また、この方法は螢光
強度の差のみによって白血球を分類しようとしているた
め、リンパ球と半球との分離等容血球の分離が必ずしも
艮〈ないという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの他の例す
なわち特開昭５０−２０８２０号公報等に記載された方
法は、操作手順が多く、染色時間−が長くかかる上に、
複雑な試薬を使用しなければならない。また、光源が３
種必要であることに加え、６つのパラメーターを測定し
なげればならないため装置が非常に複雑で高価なものと
なる。さらに、このように多くのパラメーターを測定し
ているため解析が複雑となり、大容量の解析装置を必要
とするという問題もある。

前出の特願昭６１−２１３７１５号においては次のよう
な問題があった。すなわち測定用試料中の赤血球は非常
に弱い螢光しか発しないので、螢光強度を測定する限シ
においては、赤血球が白血球と同時に検出部を通過（同
時通過）しても、白血球の測定には妨害を与えない。し
かし、散乱光を測定する場合には、赤血球は白血球と同
レベルの強度の散乱光を発するため、白血球の計数に対
して妨害を与える。このとき、螢光と散乱光を同時に測
定し、一定レベル以上の強度の螢光を発したもののみを
白血球とすることはできるが、白血球と赤血球が同時通
過したときには、白血球による散乱光に赤血球による散
乱光が重畳されるので、正しい白血球の散乱光強度を測
定することが困難である。

上記出願の発明においては、測定用試料の希釈倍率をた
とえば２０倍とし、赤血球と白血球との同時通過が起る
確率を減少させたが、完全には赤血球による妨害を阻止
し得なかった。そのため螢光強度によって好酸球と好塩
基球を除外したのちの残った白血球すなわちリンパ球、
単球、好中球を側方散乱光信号の強度によって識別する
場合、第２図に示すように、これらを完全に分離するこ
とは困難であった。

測定用試料の希釈倍率をさらに上げ、赤血球と白血球と
の同時通過が起る確率を、赤血球による妨害が完全に無
視できる程度に抑えれば、リンパ球、単球、好中球によ
る側方散乱光信号強度の度数分布は第３図のようになシ
、これら三つは完全に分離できるようになる。しかし測
定値の精密度を確保するためには白血球数で約１０，０
００個測定する必要があるため、希釈倍率を上げて試料
を薄くすると測定時間が長くかかりすぎ、実用的でなく
なる。

測定試料に対して、赤血球溶血処理等の赤血球除去操作
を行えば、赤血球による妨害の上記問題は解決できるが
、従来技術では染色条件に適合する赤血球溶血法等の赤
血球除去方法が存在しなかつたため行なえなかった。螢
光染色による白血球５分類で溶血を行なっている先行技
術例はない。

又、１分以内で赤血球のみを溶血し、白血球の側方散乱
光（形態情報）を損なわない様な方法は存在しなかった
。

一般に赤血球を除去した白血球測定用試料を調整するに
は、下記の方法が知られている。

１）赤血球溶血法 ａ）界面活性剤処理 ｂ）四級アンモニウム塩（たとえばＮＨ，Ｃｔ　）処Ｃ
）低張処理（生理的ｐＨ） １り分離法 ｄ）遠心分離 ｅ）沈降分離 ｆ）その他 上記（ａ）〜（ｇｌについて以下に説明する。

ａ）界面活性剤処理は染色を阻害する、赤血球溶血と同
時に、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学的変化を
生じ、散乱光信号による、白血球分画が、困難となる白
血球形態が経時的に変化する等の問題がある。

ｂ）四級アンモニウム塩処理 染色を阻害する、赤血球溶血能力が低く、たとえば全血
を２０倍希釈した濃厚試料は調整が困難、赤血球溶血に
時間がかかる（３〜５分）等の問題がある。

Ｃ）低張処理 一般に低張溶液中では、赤血球（（比べ白血球の抵抗性
が高いことを利用し、赤血球のみを溶血し、白血球のみ
を残すが、生理的ｐＨのもとでは赤血球が完全に溶血す
る条件下では白血球の一部も、破壊される。

ｄ）およびｅ）遠心分離と沈降分離 操作が繁雑で時間がかかる。

白血球の損失、分画比の変動がおこシやすい等の問題が
ある。

この発明は、上記従来の問題点を解決するためになされ
たもので、簡単な手順と構成で、白血球を正確に分類・
計数するための方法を提供するものである。

（問題点を解決するための手段および作用）この発明の
白血球の分類方法は以下の各工程から構成される。

（ａ）　好酸球を特異的に強く染色する染料ニュートラ
ルレッドと、好塩基球を特異的に強く染色する染料アス
トラゾン・オレンジＧと、ｐＨを酸性域に保つだめの緩
衝剤とからなる低張な第１ｇに、抗凝固処理を施した新
鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工程。

ｂ）第１ｇの緩衝剤中の酸を中和し、溶液ｐＨを後述の
染色ｐＨに保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を
保持する浸透圧に調整するための浸透圧補償剤とからな
る第２液を、前記で得られた、赤血球を溶血させた第１
液に加えて、白血球を染色する工程。

Ｃ）前記染色された試料をフローサイトメーターに流し
、白血球と他の血球やゴーストとを螢光強度によって区
別し、白血球の螢光信号と側方（９０°）散乱光信号と
を測定する工程。

ｄ）白血球より発せられた前記複数の信号により、各白
血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を算出す
る工程。

上記工程で使用される染料の化学構造式は次のとおりで
ある。

ニュートラルレッド （Ｎ−％ｔデαｌＲａｄ） （Ａａｔｒａｇｏｎｍ　　Ｏｒａｎｇｅ　　Ｇ）さて、
白血球よシ発せられる前記複数の信号のうち、側方散乱
光信号は細胞内情報を反映するものである。すなわち、
細胞内の細胞核が大きいほど、また、顆粒が多いほど細
胞内での元の反射が強まり、側方散乱光強度は増大する
。したがって、リンパ球は、その内部に顆粒が存在しな
いかあるいは少いので、散乱光強度は一番小さく、好中
球は、その内部に顆粒が多く存在し、また、大きな核を
持つので、散乱光強度は一番大きくなる。単球、による
散乱光強度はリンパ球と好中球の中間にある。このよう
な理由により、各白血球の側方散乱光の相対強度は、第
３図に示すものとなる。

一方、螢光信号は、細胞化学的特性を反映するものであ
り、染料と各白血球との相互作用により、各白血球から
異なる強度の信号が得られる。

したがって、好酸球と好塩基球を特異的に染色し、螢光
強度により好酸球と好塩基球を分離し、残った白血球す
なわちリンパ球、単球、好中球を側方散乱光強度によっ
て分離することによシ、白血球の５分類が可能となる。

この発明の方法は、前述のよ５に、複雑な前逃埋等の操
作を必要とせず、二段階の簡単な染色のみで、フローサ
イトメーターによシ血液中の白血球だけを分類・計数す
るものである。

この発明に使用されるフローサイトメーターの光学系の
一具体例を第１図に示された図面に基いて説明する。第
１図は側方散乱光と赤帯光と緑螢光とを測定する場合を
示している。このフローサイトメーターの光学系１０に
使用された光源は、波長：４８８ｎｍ１出力；１０ｒｒ
ＬＷのアルゴンイオンレーザ−１２である。レーザー１
２から発せられた光は、シリンドリカルレンズ１６によ
って絞うれ、フローセル１４中を流れる測定用状、料を
照射する。

測定用試料中の染色された白血球がレーザー光によって
照射されると、白血球からは散乱光と螢光が発せられる
。

このうち、側方へ発せられた散乱光と螢光はコンデンサ
レンズ１８によって集められ、アパーチャ２０を通過し
たのち、ダイクロイックミラー２２に達する。

ダイクロイックミラー２２は側方散乱光２４を反射し、
螢光２６を透過させる。ダイクロイックミラー２２によ
って反射された側方散乱′）ＹＳ２・１は光電子増倍管
２８によって測定される。ダイクロイックミラー２２を
透過した螢光２６のうち赤帯光３２はダイクロイックミ
ラー３０によって反射させられ、緑螢光３８のみが透過
させられる。反射さ、ｈた赤帯光３２はカラーフィルタ
ー３４を通過したのち、光電子増倍管３６によって測定
される。透過した緑螢光３８はカラーフィルター４０を
通過したのち光電子増倍管４２によって測定される。

さて、本発明では、前述の赤血球−白血球同時通過によ
る、側方散乱光強度分布の乱れを低減させるだめ試料中
の赤血球を酸性低張処理することにより破壊している。

前述のように、生理的ｐＨ域で低張処理を行なった場合
、赤血球破壊と同時に一部の白血球の破壊も生ずる。酸
性ｐＨ域特にｐＨ２，０〜５．０で低張処理を行なった
場合、白血球は完全に保持され赤血球のみが破壊される
。この場合、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学的
変化は、生じない。

赤血球選択溶血の作用機序は不明であるが、おそら（低
張処理による赤血球溶血の進行とともに酸性低ｐＨによ
る赤血球膜の脆弱化、白血球の酸性固定が進行し、赤血
球に比べ抵抗力のある白血球のみが残ると考えられる。

酸性低張処理によって赤血球はゴースト化され、一部フ
ラグメント化される。その結果赤血球側方散乱元信号強
度は、リンパ球側方散乱光信号強度の３４〜％以下とな
シ事実上赤血球−白血球の同時通過は、無視しつるもの
となる。

しかし、酸性低張処理においては、赤血球が全部フラグ
メント化されるわけではないので、散乱光信号強度によ
って赤血球と白血球を完全に弁別することは困難である
。

したがって、赤血球と白血球との弁別は、前述のように
螢光信号強度によって行なうことが望ましい。

次に染料の作用について述べる。

抗凝固剤処理を施された血液は、まず、第１液と混合す
ることにより、赤血球がゴースト、フラグメント化され
、次に、第２液の添加によシ白血球と血小・１（が染色
される。

染色液中に含まれる色素は、白血球中の細胞構成成分（
特に、顆粒成分）とイオン的に結合すると考えられる。

アストラゾンオレンジＧは、好塩基球顆粒中のヘパリン
、ヒスタミン等の酸性物質と強く結合すると考えられ、
結合によりアストラゾンオレンジＧの螢光波長が５２０
〜５４０ｎｍから５６０〜５８０ｎｍＶＣシフトする（
これをメタクロマジー現象と言う）。アストラゾンオレ
ンジＧは、同時に、他の白血球（好酸球、リンパオ、単
球、好中球）顆粒とも結合するが、好塩基球に見られる
ようなメタクロマジー現象は認め難い。また、アストラ
ゾンオレンジＧは核表面や細胞表面にも弱く結合し、５
２０〜５４０　ｎｔｎの螢光を発する。

ニュートラルレッドも主に顆粒を染色し、６２０ｎｍの
螢光を発する。特に、好酸球顆粒において強く結合し、
他の白血球に比べ強い螢光を発する。

第４液と第２液が添加された試料をフローサイトメータ
ーで測定すると第４図に示されるような二次元分布が得
られる。第４図シこンいてＲｅｄＦＬ、は赤螢光の相対
強度企、ＧｒｓｅｎＦＬは縁帯光の相対強度を表わして
いる。まだ、１はリンパ球、２は単球、３は好中球、４
は好酸球、５は好塩基球、６は白血球以外のものすなわ
ち血小板、赤血球のゴースト、フラグメントを表わして
いる（以下同じ）。

第４図において、６で示される血小板、赤血球のゴース
ト、フラグメントは縁帯光の強度が低いため、白血球と
分離できる。好酸球４と好塩基球５は二次元分布上で完
全に分離される。特異的な螢光を発しない他の白血球（
リンパ球１、単球２、好中球３）は緑と赤の螢光による
二次元分布によっては分離されず、側方散乱光強度によ
って第３図に示されるように分類される。

次に、第１液、第２液の組成、ｐＨ，浸透圧について詳
細に述べる。

（１）　　色素濃度 α、アストラゾンオレンジＧ濃度 アストラゾンオレンジＧ濃度は、染色ｐＨ９，０の場合
１５　ｐｐｍにおいて最も、好塩基球と好中球の分離が
艮い。

１５　ｐｐｍ以下では好塩基球の縁帯光強度の低下によ
り分離能は悪化する。

１５　ｐｐｍ以上では好塩基球の縁帯光強度の低下と、
好中球の縁帯光強度の増加によシ分離能は悪化する。

最適分離能の得られるアストラゾンオレンジＧ濃度は、
ｐＨによシ異なシｐＨの低下により染色性は低下する。

ｂ、ニュートラルレッド濃度 ニュートラルレッド濃度は、１〜１０　ｐｐｍノ濃度域
では、高濃度程好酸球と好中球の分離が良い。

低ｐＨ程好酸球の染色性は艮い。

Ｃ，アストラゾンオレンジＧとニュートラルレッドの相
互作用 ニュートラルレッドは好塩基球の顆粒をも染色する（螢
光強度に特異性はない）ため、アストラゾンオレンジＧ
による好塩基球の特異染色を阻害す°る。したがって、
好酸球と好塩基球の両者に対して分離度の良いニュート
ラルレッド濃度を決定する必要がある。

第５図はアストラゾンオレンジＧ濃度１５ｐｐｍ、　ｐ
Ｈ９，０の条件のもとてのニュートラルレッド濃度に対
する好酸球と好中球の分離能および好塩基と好中球の分
離能の変化を図示したものである。第５図において好塩
基球／好中球緑色螢光比は好塩基球と好中球の縁帯光強
度の比を示し、好酸球／好中球赤色螢光比は好酸球と好
中球の赤祭光強度の比を示しく以下同じ）でおシ、図中
の上方の点はど、好塩基球または好酸球と好中球との分
離の程度が良いことを表わしている。

第５図では、ニュートラルレッド濃度３．０ｐｐｍで好
塩基球、好酸球の分離が同程度となるが実際には、白血
球中の好塩基球の個数が通常は少ないので、好塩基球の
分離能を向上させるだめ、ニュートラルレッドの濃度を
低めに、たとえば、２　ｐｐｍに設定することが望まし
い。

なお、第１液と第２液の滞積比を後の実施例で述べるよ
うに９：１とする場合には、最Ｐ濃度をアストラゾンオ
レンジ０１５　ｐｐｍ１ニユ一トラルレツド２ｐｐｍと
するために、第】液中のアストラゾンオレンジＧの濃度
ヲ１６．５　ｐｐｍ、ニュートラルレッドの濃度を２．
２　ｐｐｍとすれば艮い。

（２ｊ　　ｐＨ α、最終（混合時の）　ｐＨ アストラゾンオレンジＧ　濃度１５．０　ｐｐｍ。

ニュートラルレッド濃度３．０　ｐｐｍの条件のもとて
のｐＨの変化に対する、好塩基球または好酸球の好中球
に対する分離能の変化を第６図に示す。ｐＨの上昇に伴
い好酸球の好中球に対する分離能は低下する。好塩基球
の好中球に対する分離能はｐＨ９，０付近まではｐＨの
上昇に伴って上シ、ｐＨ９，０以上では低下する。

なお、ｐＨの上昇に伴い、好塩基球の染色速度（螢光強
度が最大に達するまでの時間）は速くなる。しかし、最
大強度に達つしてから後の劣化も速くなる。好酸球の染
色速度はｐＨによっては余シ変化しない。

結局、好酸球、好塩基球の分離能と好塩基球の螢光強度
の劣化を考慮して、最終ｐＨは８．６〜８．７付近にす
ることが望ましい。本発明では、この最終ｐＨの値を染
色ｐＨと呼んでいる。

ｂ、第１液ｐＨ 第１液ｐＨは赤血球溶血能に影響する。赤血球の溶血は
ｐＨ５，０以下で速やかに進行し、ｐＨの低い程溶血は
速くなる。しかしｐＨ２，０以下では、溶血の進行とと
もに、ヘモグロビン等のタンパクの変性が始まり、変性
ノ進行は低ｐＨはど速くなる。タンパクが変性した場合
には、最終の染色ｐＨにした時点で凝集塊を生成してし
まう。上記の点を考慮し、第１液のｐＨは２．０〜５．
０とすることが望ましい。

（３）緩衝剤 α、第１液緩衝剤 第１緩衝剤は、溶液のｐＨを溶血条件に維持するために
添加するものであり、ｐＫａ３．５±１．５ならば、い
ずれの緩衝剤でも使用可能である。たとえばマレイン酸
、マロン酸、フタル酸、ジグリコール酸、サリチル酸、
フマル酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸などである。緩
衝剤の濃度は、第１液の浸透圧を低くするためなるべく
少なくすることが望ましい。本発明の目的には５０ｍＭ
以下が望ましい。さらに好適には、５〜３０　ｍ　Ｍが
望ましい。

ｂ、第２液緩衝剤 第２液緩衝剤は、第１液緩優剤中の酸を中和し、溶液ｐ
Ｈを染色ｐＨに維持するものである。ｐＨ６８，０〜９
．５の緩衝剤であれば、いずれの緩衝剤でも使用可能で
ある。たとえばトリス、トライシン、ピシン、２−アミ
ノ−２メチル−１；３−プロパンジオール、タウリン、
ホウ酸、セリンなどである。緩衝剤の濃度は、最終（混
合時）濃度１０ｍＭ以上であることが望ましい。本発明
の目的には最終濃度３０〜１００ｍＭが好適である。

（４）浸透圧 α、第１液浸透圧 第１液の浸透圧は低いほど赤血球の溶血が速やかに行な
われる。本発明の目的には０〜１００　ｍ０５ｍ／１４
の範囲、特に、０〜５０ｍｏｓｓ／＃であることが望ま
しい。

ｂ、第２ｇ浸透圧 第２液浸透圧は最終（混合時）の浸透圧を決定するもの
である。最終浸透圧は白血球の形態保持に影響し、１５
０〜６００　ｍｏｓｍｌＫの範囲、特に、１５０〜３０
０脩０８常／館であることが望ましい。

（実施例） 本発明を前述した組成範囲の中で最も好適な条件のもと
で実施した例を以下に示す。

試薬組成 第１液 （好酸球特異染料） ｐＨ３，０、浸透圧１０　ｒｎｏ　ｓ　ｍｌ　１ｇ第２
液 ｐＨ９，７〜９．８、浸透圧２６００　ｔｎｏｓｍ／に
＆染色方法 １容量部のＢＤＴＡ２に抗凝固血液に１８容量部の第１
液を加え、撹拌後２５℃で２０秒間インキュベートした
のち、２容量部の第２液を加え、撹拌後２５℃で４０秒
間インキュベートする。最終染色条件はｐＨ９，７、浸
透圧２６０　ｔｎｏａｍ／に９となる。

螢光特性 上記組成の試薬で染色した場合の各白血球の波長特性を
第７図に示す。

上記螢光特性によシ、最適のフィルター、ダイクロイッ
クミラーは以下のように選定さ九た。

分析結果 上記条件にて、フローサイトメーターで測定し、赤帯光
強度と縁帯光強度とによる二次元分布図を描くと第８図
のようになる。血小板等６は白血球と分離されている。

好酸球４と好塩基球５は他の白血球と艮ぐ分離されてい
る。残シの白血球すなわちリンパ球１、単球２、好中球
３について側方散乱光の度数分布を書くと第９図のよう
になシ、三つは良く分離されている。なお、第９図にお
いて、５ｉｄｅ　Ｓｃ、は側方散乱光の相対強度を、ｐ
ｒｇｑｓは度数を表わしている。

なお、以上述べた実施例は、完全に染色が終了したのち
に（すなわち染色が平衡状態に達つしたのちに）、測定
を開始するものであるから、測定中に試料が経時変化す
ることはなく、また、白血球が唖端に多いか、または、
少い検体についても、常に、一定時間で適正な強度にま
で染色レベルが達している。したがって、安定な測定が
可能となるとともに、比較的低出力の光源を使用しても
、充分な螢光強度の信号が得られる。たとえば、この実
施例では１０ｍＷのアルゴンイオンレーザ−をフローサ
イトメーターの光源として使用している。

しかし、この発明に使用されるフローサイトメーターの
光源は、前述の低出力のアルゴンイオンレーザ−に限ら
ず、他の光源、たとえば、水銀アークランプ、クセノン
アークランプ、Ｈｅ−Ｃｄレーザー、Ｈａ−Ｎｅレーザ
ー、大出力のアルゴンイオンレーザ−等の光源であって
もかまわない。そのときには、各光源に応じた染色集注
、測定条件を設定すれば艮い。

（発明の効果） この発明の方法によって血液を測定し、白血球を分類・
計数すると、以下に述べる様な効果が得られる。

（１）抗反因処理を施しだ血液に第１液を加え、次に第
２）浅を加えるという二段階の染色のみで測定用試ｆ＋
が得られるので、試料の前処理が簡単である。

１２）１分程度の試参４１整時間で測定することが可能
であるため、ｆ゛：穴迄に要する時間が短くて済む。

（３）完全に染色が終了した状態で測定するため、測定
中の試料の経時的変化が無く、また、正常な検体のみな
らず、白血球が極端に多いか、または少い検体について
も、一定時間で常に適正な強度に染色がなされている。

このため検体によって染色時間を変えるという必要は生
じない。

（４）完全に染色が終了し、強い染色強度に達つしたの
ち測定するので、光源は低出力のもので艮い。さらに光
源は一個しか必要とせず、測定パラメーターも螢光２チ
ヤンネル、側方散乱光ｌチャンネルを測定し、分析する
だけで良いので、この発明の方法を実施するだめの装置
は、構成が簡単で低価格のものとなる。

（５）　　酸性低張処理によシ赤血球のみを溶血させて
しまうので、赤血球と白血球の同時通過が無くなったた
め、側方散乱光信号によるリンパ球と単球と好中球との
分離が著しく良くなった。

（６）　　螢光信号によって好酸球と好塩基球をまず分
離し、残った白血球すなわちリンパ球と単球と好中球と
を側方散乱光により分離することによシ、分離度の非常
に艮い白血球の５分類が可能となった。

（力　白血球と池の血球等との分離は螢光強度によって
行っているので、全ての赤血球が７ラグメント化されな
くても、測定値に影響を与えることがない。

本発明の方法において、一検体につき１００００個以上
の白血球を測定すると、正確度および再現性にすぐれた
測定値が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明に使用されるフローサイトメーター
の光学系の一具体例を示す概略図。第１図中の符号は次
のとおシに説明される：１０７０−サイトメーターの光
学系 １２　レーザー １４　フローセル １６　シリンドリカルレンズ １８　コンデンサーレンズ ２０　アノく−チャー ２２　ダイクロイックミラー ２４　側方散乱光 ２Ｇ　螢光 ２８　光電子増倍管 ３０　ダイクロイックミラー ３２　赤螢光 ３４　カラーフィルター ３６　光電子増倍管 ３８　縁帯光 ４０　カラーフィルター ４２　光電子増倍管 第２図は赤血球の同時通過の影響があるときの側方散乱
光相対強度の度数分布を示す図。 第３図は赤血球の同時通過の影響が無いときの側方散乱
光相対強度の度数分布を示す図。 第４図は赤螢光と縁帯光を使用して、白血球を分類した
ときの二次元分布図。図面中の符号１はリンパ球、２は
単球、３は好中球、４は好酸球、５は好塩基球の集合を
表わしている。 第５図はニュートラルレッドの濃度に対する好酸球と好
中球の分離能および好塩基球と好中球の分離能の変化を
示す図。 第６図はｐＨの変化に対する好酸球と好中球の分離能お
よび好塩基球と好中球の分離能の変化を示す図。 第７図は各白血球の螢光波長強度分布を示す図。 第８図は本発明の実施例において、赤螢光と縁帯光を使
用して、白血球を分類したときの二次元分布図。 第９図は同じく側方散乱光相対強度の度数分布を示す図
。 第１図 第２図 →則Ｙ敞孔九相廿社贋 第３図 第４図 第５図 二エートつルレノト５裏曳 第６図 ｅｆ、（Ｊ　　　　ｅｌ、５　　　　！＋１．（Ｊ　　
　　ソ５ＩυυＨ 第７図 第８　図 Ｒｅｄ　　ＦＬ。 第９図 ５ｉｄｅ　　Ｓｃ。 手　　続　　補　　正　　書 昭和６２年４月２日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下（ａ）〜（ｄ）の各工程からなることを特徴
   とする、フローサイトメトリーによる白血球の分類方法
   。 （ａ）好酸球を特異的に螢光染色する染料と、好塩基球
   を特異的に螢光染色する染料と、ｐＨを酸性域に保つた
   めの緩衝剤とからなる低張な第１液に、抗凝固処理を施
   した新鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工程。 （ｂ）第１液の緩衝剤中の酸を中和し、溶液ｐＨを染色
   ｐＨに保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を保持
   する浸透圧に調整するための浸透圧補償剤とからなる第
   ２液を、前記（ａ）で得られた、第１液で処理された血
   液試料に加えて、白血球を染色する工程。 （ｃ）前記染色された試料をフローサイトメーターに流
   し、白血球と他の血球やゴーストとを螢光強度によって
   区別し、白血球の螢光信号と側方（９０°）散乱光信号
   とを測定する工程。 （ｄ）白血球より発せられた前記複数の信号により、各
   白血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を算出
   する工程。
2. （２）好酸球を特異的に螢光染色する染料がニュートラ
   ルレッドである特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）好塩基球を特異的に螢光染色する染料がアストラ
   ゾンオレンジＧである特許請求の範囲第（１）項記載の
   方法。