JPS63134957A - フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法 - Google Patents
フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
この発明は、臨床検査分野における血球の分類測定法に
関するものであり、さらに詳しくは、フローサイトメー
ターを用いて、螢光染色処理された血球を光学的シて測
定し、白血球を分類する方法に関するものである。
関するものであり、さらに詳しくは、フローサイトメー
ターを用いて、螢光染色処理された血球を光学的シて測
定し、白血球を分類する方法に関するものである。
(従来の技術)
健常人の末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好中
球、好酸球、好塩基琢の種類がある。これらは各々その
機能が異っておシ、血液中の白血球を種類別に計数する
ことによって、病気の診断に貢献することができる。た
とえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白血病など
にみられ、好中球の減少は、ウィルス性疾患、再性不艮
性貧血、無顆粒球症などに見られる。好酸球の増加は、
寄生虫症、ホジキン病、アレルギー疾患などにみられる
。単球の増加は、感染症の快復期、単球性臼1病などに
みられる。
球、好酸球、好塩基琢の種類がある。これらは各々その
機能が異っておシ、血液中の白血球を種類別に計数する
ことによって、病気の診断に貢献することができる。た
とえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白血病など
にみられ、好中球の減少は、ウィルス性疾患、再性不艮
性貧血、無顆粒球症などに見られる。好酸球の増加は、
寄生虫症、ホジキン病、アレルギー疾患などにみられる
。単球の増加は、感染症の快復期、単球性臼1病などに
みられる。
白血球を分類・計数するために従来から最も良〈実施さ
れている方法は、血液像鑑定(視算法、用手法)と呼ば
れるものである。
れている方法は、血液像鑑定(視算法、用手法)と呼ば
れるものである。
この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球を
固定し、さらに染色したのち、顕微鏡で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴(白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の有無等)や染色度合から測定者が
いずれの血球であるかを判定し、分類・計数するもので
ある。このとき、一般の検査室では100〜200個の
白血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血
球の百分率C%)を測定値としている。
固定し、さらに染色したのち、顕微鏡で観察し、一つず
つの白血球の形態的特徴(白血球の大きさ、核の形態、
細胞質の形態、顆粒の有無等)や染色度合から測定者が
いずれの血球であるかを判定し、分類・計数するもので
ある。このとき、一般の検査室では100〜200個の
白血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血
球の百分率C%)を測定値としている。
この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、固
定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわずかな差を見分
けなげればならないこととのために、測定者に大きな負
担をか(するものとなっている。さらに、計数する白血
球数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布とな
っている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のある
III定値を出すことは難しし・。
定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要であることと、
顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわずかな差を見分
けなげればならないこととのために、測定者に大きな負
担をか(するものとなっている。さらに、計数する白血
球数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布とな
っている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のある
III定値を出すことは難しし・。
このだめに、白血球の分類・計数が自動的に行なえる方
法が強く求められておシ、現在のところ、大きく分けて
二種類の方法が実現されている。
法が強く求められておシ、現在のところ、大きく分けて
二種類の方法が実現されている。
そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等でと
らえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を分
類するものである。この方法は従来の視算法に原理的に
は近い方法であるが、コンピューターによる処理では分
類できない血球も多く、完全には視算法に取ってかわる
ものとはなっていない。また、装置が複雑で大型になり
、価格が高くなるという問題もある。
らえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を分
類するものである。この方法は従来の視算法に原理的に
は近い方法であるが、コンピューターによる処理では分
類できない血球も多く、完全には視算法に取ってかわる
ものとはなっていない。また、装置が複雑で大型になり
、価格が高くなるという問題もある。
白血球を自動的に分類・計数するもう一つの方法は、フ
ローシステムを利用した方法である。この方法は、血球
を希釈蔽中に浮遊させた試料を用℃・、血球が一個ずつ
細い検出器中を通過するようにこの試料を流し、このと
き検出器で発生する信号を分析することにより白血球を
分類するものである。このフローシステムを利用した方
法は、さらに、二つの方法に細分される。
ローシステムを利用した方法である。この方法は、血球
を希釈蔽中に浮遊させた試料を用℃・、血球が一個ずつ
細い検出器中を通過するようにこの試料を流し、このと
き検出器で発生する信号を分析することにより白血球を
分類するものである。このフローシステムを利用した方
法は、さらに、二つの方法に細分される。
第1の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみが
浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通過した
ときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信号
の大きさによって白血球を分類するものである。
浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通過した
ときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信号
の大きさによって白血球を分類するものである。
第2の方法は、光源と、試料中の細胞が1個ずつ細い流
路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せられ
た光を検出する測光部と、検出信号を解析する解析装置
とを備えたフローサイトメーターを使用するものである
。この方法では、血球を染色し、染色された血球を光で
照射し、そのとき血球から発する螢光および場合によっ
ては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によって白
血球を分類しよ5とするものである。
路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せられ
た光を検出する測光部と、検出信号を解析する解析装置
とを備えたフローサイトメーターを使用するものである
。この方法では、血球を染色し、染色された血球を光で
照射し、そのとき血球から発する螢光および場合によっ
ては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によって白
血球を分類しよ5とするものである。
この第2の方法に属するものとしては、例えば特公昭5
9−853号公報およびエル・エイ・カメンツキー(L
、 A 、 Kamentsky ) 「ブラッド・
セルズ(Blood Ce1ls) J、第6巻、12
1〜140頁、1980年に記載された方法がある。こ
の方法は、血液に10倍量のアクリジンオレンジ染色液
を加え、1分間インキュベートしたのち、アルゴンイオ
ンレーザ−等の光源で照射したとき血球から発する緑色
螢光と赤色螢光を測定し、その二次元分布から、白血球
を分類・計数するものである。
9−853号公報およびエル・エイ・カメンツキー(L
、 A 、 Kamentsky ) 「ブラッド・
セルズ(Blood Ce1ls) J、第6巻、12
1〜140頁、1980年に記載された方法がある。こ
の方法は、血液に10倍量のアクリジンオレンジ染色液
を加え、1分間インキュベートしたのち、アルゴンイオ
ンレーザ−等の光源で照射したとき血球から発する緑色
螢光と赤色螢光を測定し、その二次元分布から、白血球
を分類・計数するものである。
第2の方法に属する他の例としては、特開昭50−20
820号公報およびエイチ・エム・シャピo (H,M
、5hapiro)他「ザ・ジャーナル・オプ・ヒスト
ケミストリー・アンド・サイトケミストリー(The
Journal of HistoChemistr
yand Cytochtrrniatry)第24巻
第1号、396〜411頁、1976年;同じく第25
巻第8号、976〜989頁、1977年に記載された
方法がある。この方法は、血液に4倍量の染色液■を加
え、3分間インキュテートシた後、血液と等容の20%
ホルムアルデヒドを加え、5分間固定を行ない、希釈用
の染色液■で15〜20倍に希釈し、フローサイトメー
ターで測定するものである。
820号公報およびエイチ・エム・シャピo (H,M
、5hapiro)他「ザ・ジャーナル・オプ・ヒスト
ケミストリー・アンド・サイトケミストリー(The
Journal of HistoChemistr
yand Cytochtrrniatry)第24巻
第1号、396〜411頁、1976年;同じく第25
巻第8号、976〜989頁、1977年に記載された
方法がある。この方法は、血液に4倍量の染色液■を加
え、3分間インキュテートシた後、血液と等容の20%
ホルムアルデヒドを加え、5分間固定を行ない、希釈用
の染色液■で15〜20倍に希釈し、フローサイトメー
ターで測定するものである。
この測定に用いられるフローサイトメーターは、光源と
して光を3分割した水銀アークランプ又は三本のレーザ
ーを備え、染色液に含まれる3種の螢光染料を各々励起
し、その3種の螢光と前方散乱光、側方散乱光、吸光の
6つのパラメーターを測定し、4段階の二次元分布解析
によシ白血球を分類・計数する装置である。
して光を3分割した水銀アークランプ又は三本のレーザ
ーを備え、染色液に含まれる3種の螢光染料を各々励起
し、その3種の螢光と前方散乱光、側方散乱光、吸光の
6つのパラメーターを測定し、4段階の二次元分布解析
によシ白血球を分類・計数する装置である。
さらに、昭和61年9月10日出願の特願昭61−21
3715号においては、緩衝液、無機塩類及び螢光染料
からなる染色液に血液を加えて染色するという一段階染
色工程が開示されているが、未溶解の赤血球が測定デー
タに影響を及ぼし、測定か不明確となるおそれがあった
。
3715号においては、緩衝液、無機塩類及び螢光染料
からなる染色液に血液を加えて染色するという一段階染
色工程が開示されているが、未溶解の赤血球が測定デー
タに影響を及ぼし、測定か不明確となるおそれがあった
。
(発明が解決しようとする問題点)
フローシステムを利用して白血球を分類・計数する方法
のうち第1の方法においては、赤血球を破壊しなければ
ならないが、血液によっては赤血球の溶解が完全に行な
われ得ない場合もあり、このときにはβ1j定値の正確
さが損なわれるという問題がある。
のうち第1の方法においては、赤血球を破壊しなければ
ならないが、血液によっては赤血球の溶解が完全に行な
われ得ない場合もあり、このときにはβ1j定値の正確
さが損なわれるという問題がある。
フローシステムを利用した第2の方法のうちの特公昭5
9−853号公報等に記載された方法は、細胞による染
料の吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中で
各白血球の螢光強度の差元・:設犬となる時間に測定す
ることを特徴としCoる。
9−853号公報等に記載された方法は、細胞による染
料の吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中で
各白血球の螢光強度の差元・:設犬となる時間に測定す
ることを特徴としCoる。
しかしながら、白血球数が極端に多いか、または少い検
体については、染色強度が適正レベルとなる染色時間は
正常な検体とは異ることになシ、検体ごとに適切な染色
時間を選定しなげればならない。また、この方法は螢光
強度の差のみによって白血球を分類しようとしているた
め、リンパ球と半球との分離等容血球の分離が必ずしも
艮〈ないという問題がある。
体については、染色強度が適正レベルとなる染色時間は
正常な検体とは異ることになシ、検体ごとに適切な染色
時間を選定しなげればならない。また、この方法は螢光
強度の差のみによって白血球を分類しようとしているた
め、リンパ球と半球との分離等容血球の分離が必ずしも
艮〈ないという問題がある。
フローシステムを利用した第2の方法のうちの他の例す
なわち特開昭50−20820号公報等に記載された方
法は、操作手順が多く、染色時間−が長くかかる上に、
複雑な試薬を使用しなければならない。また、光源が3
種必要であることに加え、6つのパラメーターを測定し
なげればならないため装置が非常に複雑で高価なものと
なる。さらに、このように多くのパラメーターを測定し
ているため解析が複雑となり、大容量の解析装置を必要
とするという問題もある。
なわち特開昭50−20820号公報等に記載された方
法は、操作手順が多く、染色時間−が長くかかる上に、
複雑な試薬を使用しなければならない。また、光源が3
種必要であることに加え、6つのパラメーターを測定し
なげればならないため装置が非常に複雑で高価なものと
なる。さらに、このように多くのパラメーターを測定し
ているため解析が複雑となり、大容量の解析装置を必要
とするという問題もある。
前出の特願昭61−213715号においては次のよう
な問題があった。すなわち測定用試料中の赤血球は非常
に弱い螢光しか発しないので、螢光強度を測定する限シ
においては、赤血球が白血球と同時に検出部を通過(同
時通過)しても、白血球の測定には妨害を与えない。し
かし、散乱光を測定する場合には、赤血球は白血球と同
レベルの強度の散乱光を発するため、白血球の計数に対
して妨害を与える。このとき、螢光と散乱光を同時に測
定し、一定レベル以上の強度の螢光を発したもののみを
白血球とすることはできるが、白血球と赤血球が同時通
過したときには、白血球による散乱光に赤血球による散
乱光が重畳されるので、正しい白血球の散乱光強度を測
定することが困難である。
な問題があった。すなわち測定用試料中の赤血球は非常
に弱い螢光しか発しないので、螢光強度を測定する限シ
においては、赤血球が白血球と同時に検出部を通過(同
時通過)しても、白血球の測定には妨害を与えない。し
かし、散乱光を測定する場合には、赤血球は白血球と同
レベルの強度の散乱光を発するため、白血球の計数に対
して妨害を与える。このとき、螢光と散乱光を同時に測
定し、一定レベル以上の強度の螢光を発したもののみを
白血球とすることはできるが、白血球と赤血球が同時通
過したときには、白血球による散乱光に赤血球による散
乱光が重畳されるので、正しい白血球の散乱光強度を測
定することが困難である。
上記出願の発明においては、測定用試料の希釈倍率をた
とえば20倍とし、赤血球と白血球との同時通過が起る
確率を減少させたが、完全には赤血球による妨害を阻止
し得なかった。そのため螢光強度によって好酸球と好塩
基球を除外したのちの残った白血球すなわちリンパ球、
単球、好中球を側方散乱光信号の強度によって識別する
場合、第2図に示すように、これらを完全に分離するこ
とは困難であった。
とえば20倍とし、赤血球と白血球との同時通過が起る
確率を減少させたが、完全には赤血球による妨害を阻止
し得なかった。そのため螢光強度によって好酸球と好塩
基球を除外したのちの残った白血球すなわちリンパ球、
単球、好中球を側方散乱光信号の強度によって識別する
場合、第2図に示すように、これらを完全に分離するこ
とは困難であった。
測定用試料の希釈倍率をさらに上げ、赤血球と白血球と
の同時通過が起る確率を、赤血球による妨害が完全に無
視できる程度に抑えれば、リンパ球、単球、好中球によ
る側方散乱光信号強度の度数分布は第3図のようになシ
、これら三つは完全に分離できるようになる。しかし測
定値の精密度を確保するためには白血球数で約10,0
00個測定する必要があるため、希釈倍率を上げて試料
を薄くすると測定時間が長くかかりすぎ、実用的でなく
なる。
の同時通過が起る確率を、赤血球による妨害が完全に無
視できる程度に抑えれば、リンパ球、単球、好中球によ
る側方散乱光信号強度の度数分布は第3図のようになシ
、これら三つは完全に分離できるようになる。しかし測
定値の精密度を確保するためには白血球数で約10,0
00個測定する必要があるため、希釈倍率を上げて試料
を薄くすると測定時間が長くかかりすぎ、実用的でなく
なる。
測定試料に対して、赤血球溶血処理等の赤血球除去操作
を行えば、赤血球による妨害の上記問題は解決できるが
、従来技術では染色条件に適合する赤血球溶血法等の赤
血球除去方法が存在しなかつたため行なえなかった。螢
光染色による白血球5分類で溶血を行なっている先行技
術例はない。
を行えば、赤血球による妨害の上記問題は解決できるが
、従来技術では染色条件に適合する赤血球溶血法等の赤
血球除去方法が存在しなかつたため行なえなかった。螢
光染色による白血球5分類で溶血を行なっている先行技
術例はない。
又、1分以内で赤血球のみを溶血し、白血球の側方散乱
光(形態情報)を損なわない様な方法は存在しなかった
。
光(形態情報)を損なわない様な方法は存在しなかった
。
一般に赤血球を除去した白血球測定用試料を調整するに
は、下記の方法が知られている。
は、下記の方法が知られている。
1)赤血球溶血法
a)界面活性剤処理
b)四級アンモニウム塩(たとえばNH,Ct )処C
)低張処理(生理的pH) 1り分離法 d)遠心分離 e)沈降分離 f)その他 上記(a)〜(glについて以下に説明する。
)低張処理(生理的pH) 1り分離法 d)遠心分離 e)沈降分離 f)その他 上記(a)〜(glについて以下に説明する。
a)界面活性剤処理は染色を阻害する、赤血球溶血と同
時に、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学的変化を
生じ、散乱光信号による、白血球分画が、困難となる白
血球形態が経時的に変化する等の問題がある。
時に、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学的変化を
生じ、散乱光信号による、白血球分画が、困難となる白
血球形態が経時的に変化する等の問題がある。
b)四級アンモニウム塩処理
染色を阻害する、赤血球溶血能力が低く、たとえば全血
を20倍希釈した濃厚試料は調整が困難、赤血球溶血に
時間がかかる(3〜5分)等の問題がある。
を20倍希釈した濃厚試料は調整が困難、赤血球溶血に
時間がかかる(3〜5分)等の問題がある。
C)低張処理
一般に低張溶液中では、赤血球((比べ白血球の抵抗性
が高いことを利用し、赤血球のみを溶血し、白血球のみ
を残すが、生理的pHのもとでは赤血球が完全に溶血す
る条件下では白血球の一部も、破壊される。
が高いことを利用し、赤血球のみを溶血し、白血球のみ
を残すが、生理的pHのもとでは赤血球が完全に溶血す
る条件下では白血球の一部も、破壊される。
d)およびe)遠心分離と沈降分離
操作が繁雑で時間がかかる。
白血球の損失、分画比の変動がおこシやすい等の問題が
ある。
ある。
この発明は、上記従来の問題点を解決するためになされ
たもので、簡単な手順と構成で、白血球を正確に分類・
計数するための方法を提供するものである。
たもので、簡単な手順と構成で、白血球を正確に分類・
計数するための方法を提供するものである。
(問題点を解決するための手段および作用)この発明の
白血球の分類方法は以下の各工程から構成される。
白血球の分類方法は以下の各工程から構成される。
(a) 好酸球を特異的に強く染色する染料ニュートラ
ルレッドと、好塩基球を特異的に強く染色する染料アス
トラゾン・オレンジGと、pHを酸性域に保つだめの緩
衝剤とからなる低張な第1gに、抗凝固処理を施した新
鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工程。
ルレッドと、好塩基球を特異的に強く染色する染料アス
トラゾン・オレンジGと、pHを酸性域に保つだめの緩
衝剤とからなる低張な第1gに、抗凝固処理を施した新
鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工程。
b)第1gの緩衝剤中の酸を中和し、溶液pHを後述の
染色pHに保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を
保持する浸透圧に調整するための浸透圧補償剤とからな
る第2液を、前記で得られた、赤血球を溶血させた第1
液に加えて、白血球を染色する工程。
染色pHに保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を
保持する浸透圧に調整するための浸透圧補償剤とからな
る第2液を、前記で得られた、赤血球を溶血させた第1
液に加えて、白血球を染色する工程。
C)前記染色された試料をフローサイトメーターに流し
、白血球と他の血球やゴーストとを螢光強度によって区
別し、白血球の螢光信号と側方(90°)散乱光信号と
を測定する工程。
、白血球と他の血球やゴーストとを螢光強度によって区
別し、白血球の螢光信号と側方(90°)散乱光信号と
を測定する工程。
d)白血球より発せられた前記複数の信号により、各白
血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を算出す
る工程。
血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を算出す
る工程。
上記工程で使用される染料の化学構造式は次のとおりで
ある。
ある。
ニュートラルレッド
(N−%tデαlRad)
(Aatragonm Orange G)さて、
白血球よシ発せられる前記複数の信号のうち、側方散乱
光信号は細胞内情報を反映するものである。すなわち、
細胞内の細胞核が大きいほど、また、顆粒が多いほど細
胞内での元の反射が強まり、側方散乱光強度は増大する
。したがって、リンパ球は、その内部に顆粒が存在しな
いかあるいは少いので、散乱光強度は一番小さく、好中
球は、その内部に顆粒が多く存在し、また、大きな核を
持つので、散乱光強度は一番大きくなる。単球、による
散乱光強度はリンパ球と好中球の中間にある。このよう
な理由により、各白血球の側方散乱光の相対強度は、第
3図に示すものとなる。
白血球よシ発せられる前記複数の信号のうち、側方散乱
光信号は細胞内情報を反映するものである。すなわち、
細胞内の細胞核が大きいほど、また、顆粒が多いほど細
胞内での元の反射が強まり、側方散乱光強度は増大する
。したがって、リンパ球は、その内部に顆粒が存在しな
いかあるいは少いので、散乱光強度は一番小さく、好中
球は、その内部に顆粒が多く存在し、また、大きな核を
持つので、散乱光強度は一番大きくなる。単球、による
散乱光強度はリンパ球と好中球の中間にある。このよう
な理由により、各白血球の側方散乱光の相対強度は、第
3図に示すものとなる。
一方、螢光信号は、細胞化学的特性を反映するものであ
り、染料と各白血球との相互作用により、各白血球から
異なる強度の信号が得られる。
り、染料と各白血球との相互作用により、各白血球から
異なる強度の信号が得られる。
したがって、好酸球と好塩基球を特異的に染色し、螢光
強度により好酸球と好塩基球を分離し、残った白血球す
なわちリンパ球、単球、好中球を側方散乱光強度によっ
て分離することによシ、白血球の5分類が可能となる。
強度により好酸球と好塩基球を分離し、残った白血球す
なわちリンパ球、単球、好中球を側方散乱光強度によっ
て分離することによシ、白血球の5分類が可能となる。
この発明の方法は、前述のよ5に、複雑な前逃埋等の操
作を必要とせず、二段階の簡単な染色のみで、フローサ
イトメーターによシ血液中の白血球だけを分類・計数す
るものである。
作を必要とせず、二段階の簡単な染色のみで、フローサ
イトメーターによシ血液中の白血球だけを分類・計数す
るものである。
この発明に使用されるフローサイトメーターの光学系の
一具体例を第1図に示された図面に基いて説明する。第
1図は側方散乱光と赤帯光と緑螢光とを測定する場合を
示している。このフローサイトメーターの光学系10に
使用された光源は、波長:488nm1出力;10rr
LWのアルゴンイオンレーザ−12である。レーザー1
2から発せられた光は、シリンドリカルレンズ16によ
って絞うれ、フローセル14中を流れる測定用状、料を
照射する。
一具体例を第1図に示された図面に基いて説明する。第
1図は側方散乱光と赤帯光と緑螢光とを測定する場合を
示している。このフローサイトメーターの光学系10に
使用された光源は、波長:488nm1出力;10rr
LWのアルゴンイオンレーザ−12である。レーザー1
2から発せられた光は、シリンドリカルレンズ16によ
って絞うれ、フローセル14中を流れる測定用状、料を
照射する。
測定用試料中の染色された白血球がレーザー光によって
照射されると、白血球からは散乱光と螢光が発せられる
。
照射されると、白血球からは散乱光と螢光が発せられる
。
このうち、側方へ発せられた散乱光と螢光はコンデンサ
レンズ18によって集められ、アパーチャ20を通過し
たのち、ダイクロイックミラー22に達する。
レンズ18によって集められ、アパーチャ20を通過し
たのち、ダイクロイックミラー22に達する。
ダイクロイックミラー22は側方散乱光24を反射し、
螢光26を透過させる。ダイクロイックミラー22によ
って反射された側方散乱′)YS2・1は光電子増倍管
28によって測定される。ダイクロイックミラー22を
透過した螢光26のうち赤帯光32はダイクロイックミ
ラー30によって反射させられ、緑螢光38のみが透過
させられる。反射さ、hた赤帯光32はカラーフィルタ
ー34を通過したのち、光電子増倍管36によって測定
される。透過した緑螢光38はカラーフィルター40を
通過したのち光電子増倍管42によって測定される。
螢光26を透過させる。ダイクロイックミラー22によ
って反射された側方散乱′)YS2・1は光電子増倍管
28によって測定される。ダイクロイックミラー22を
透過した螢光26のうち赤帯光32はダイクロイックミ
ラー30によって反射させられ、緑螢光38のみが透過
させられる。反射さ、hた赤帯光32はカラーフィルタ
ー34を通過したのち、光電子増倍管36によって測定
される。透過した緑螢光38はカラーフィルター40を
通過したのち光電子増倍管42によって測定される。
さて、本発明では、前述の赤血球−白血球同時通過によ
る、側方散乱光強度分布の乱れを低減させるだめ試料中
の赤血球を酸性低張処理することにより破壊している。
る、側方散乱光強度分布の乱れを低減させるだめ試料中
の赤血球を酸性低張処理することにより破壊している。
前述のように、生理的pH域で低張処理を行なった場合
、赤血球破壊と同時に一部の白血球の破壊も生ずる。酸
性pH域特にpH2,0〜5.0で低張処理を行なった
場合、白血球は完全に保持され赤血球のみが破壊される
。この場合、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学的
変化は、生じない。
、赤血球破壊と同時に一部の白血球の破壊も生ずる。酸
性pH域特にpH2,0〜5.0で低張処理を行なった
場合、白血球は完全に保持され赤血球のみが破壊される
。この場合、白血球の裸核化、膨潤、収縮等の形態学的
変化は、生じない。
赤血球選択溶血の作用機序は不明であるが、おそら(低
張処理による赤血球溶血の進行とともに酸性低pHによ
る赤血球膜の脆弱化、白血球の酸性固定が進行し、赤血
球に比べ抵抗力のある白血球のみが残ると考えられる。
張処理による赤血球溶血の進行とともに酸性低pHによ
る赤血球膜の脆弱化、白血球の酸性固定が進行し、赤血
球に比べ抵抗力のある白血球のみが残ると考えられる。
酸性低張処理によって赤血球はゴースト化され、一部フ
ラグメント化される。その結果赤血球側方散乱元信号強
度は、リンパ球側方散乱光信号強度の34〜%以下とな
シ事実上赤血球−白血球の同時通過は、無視しつるもの
となる。
ラグメント化される。その結果赤血球側方散乱元信号強
度は、リンパ球側方散乱光信号強度の34〜%以下とな
シ事実上赤血球−白血球の同時通過は、無視しつるもの
となる。
しかし、酸性低張処理においては、赤血球が全部フラグ
メント化されるわけではないので、散乱光信号強度によ
って赤血球と白血球を完全に弁別することは困難である
。
メント化されるわけではないので、散乱光信号強度によ
って赤血球と白血球を完全に弁別することは困難である
。
したがって、赤血球と白血球との弁別は、前述のように
螢光信号強度によって行なうことが望ましい。
螢光信号強度によって行なうことが望ましい。
次に染料の作用について述べる。
抗凝固剤処理を施された血液は、まず、第1液と混合す
ることにより、赤血球がゴースト、フラグメント化され
、次に、第2液の添加によシ白血球と血小・1(が染色
される。
ることにより、赤血球がゴースト、フラグメント化され
、次に、第2液の添加によシ白血球と血小・1(が染色
される。
染色液中に含まれる色素は、白血球中の細胞構成成分(
特に、顆粒成分)とイオン的に結合すると考えられる。
特に、顆粒成分)とイオン的に結合すると考えられる。
アストラゾンオレンジGは、好塩基球顆粒中のヘパリン
、ヒスタミン等の酸性物質と強く結合すると考えられ、
結合によりアストラゾンオレンジGの螢光波長が520
〜540nmから560〜580nmVCシフトする(
これをメタクロマジー現象と言う)。アストラゾンオレ
ンジGは、同時に、他の白血球(好酸球、リンパオ、単
球、好中球)顆粒とも結合するが、好塩基球に見られる
ようなメタクロマジー現象は認め難い。また、アストラ
ゾンオレンジGは核表面や細胞表面にも弱く結合し、5
20〜540 ntnの螢光を発する。
、ヒスタミン等の酸性物質と強く結合すると考えられ、
結合によりアストラゾンオレンジGの螢光波長が520
〜540nmから560〜580nmVCシフトする(
これをメタクロマジー現象と言う)。アストラゾンオレ
ンジGは、同時に、他の白血球(好酸球、リンパオ、単
球、好中球)顆粒とも結合するが、好塩基球に見られる
ようなメタクロマジー現象は認め難い。また、アストラ
ゾンオレンジGは核表面や細胞表面にも弱く結合し、5
20〜540 ntnの螢光を発する。
ニュートラルレッドも主に顆粒を染色し、620nmの
螢光を発する。特に、好酸球顆粒において強く結合し、
他の白血球に比べ強い螢光を発する。
螢光を発する。特に、好酸球顆粒において強く結合し、
他の白血球に比べ強い螢光を発する。
第4液と第2液が添加された試料をフローサイトメータ
ーで測定すると第4図に示されるような二次元分布が得
られる。第4図シこンいてRedFL、は赤螢光の相対
強度企、GrsenFLは縁帯光の相対強度を表わして
いる。まだ、1はリンパ球、2は単球、3は好中球、4
は好酸球、5は好塩基球、6は白血球以外のものすなわ
ち血小板、赤血球のゴースト、フラグメントを表わして
いる(以下同じ)。
ーで測定すると第4図に示されるような二次元分布が得
られる。第4図シこンいてRedFL、は赤螢光の相対
強度企、GrsenFLは縁帯光の相対強度を表わして
いる。まだ、1はリンパ球、2は単球、3は好中球、4
は好酸球、5は好塩基球、6は白血球以外のものすなわ
ち血小板、赤血球のゴースト、フラグメントを表わして
いる(以下同じ)。
第4図において、6で示される血小板、赤血球のゴース
ト、フラグメントは縁帯光の強度が低いため、白血球と
分離できる。好酸球4と好塩基球5は二次元分布上で完
全に分離される。特異的な螢光を発しない他の白血球(
リンパ球1、単球2、好中球3)は緑と赤の螢光による
二次元分布によっては分離されず、側方散乱光強度によ
って第3図に示されるように分類される。
ト、フラグメントは縁帯光の強度が低いため、白血球と
分離できる。好酸球4と好塩基球5は二次元分布上で完
全に分離される。特異的な螢光を発しない他の白血球(
リンパ球1、単球2、好中球3)は緑と赤の螢光による
二次元分布によっては分離されず、側方散乱光強度によ
って第3図に示されるように分類される。
次に、第1液、第2液の組成、pH,浸透圧について詳
細に述べる。
細に述べる。
(1) 色素濃度
α、アストラゾンオレンジG濃度
アストラゾンオレンジG濃度は、染色pH9,0の場合
15 ppmにおいて最も、好塩基球と好中球の分離が
艮い。
15 ppmにおいて最も、好塩基球と好中球の分離が
艮い。
15 ppm以下では好塩基球の縁帯光強度の低下によ
り分離能は悪化する。
り分離能は悪化する。
15 ppm以上では好塩基球の縁帯光強度の低下と、
好中球の縁帯光強度の増加によシ分離能は悪化する。
好中球の縁帯光強度の増加によシ分離能は悪化する。
最適分離能の得られるアストラゾンオレンジG濃度は、
pHによシ異なシpHの低下により染色性は低下する。
pHによシ異なシpHの低下により染色性は低下する。
b、ニュートラルレッド濃度
ニュートラルレッド濃度は、1〜10 ppmノ濃度域
では、高濃度程好酸球と好中球の分離が良い。
では、高濃度程好酸球と好中球の分離が良い。
低pH程好酸球の染色性は艮い。
C,アストラゾンオレンジGとニュートラルレッドの相
互作用 ニュートラルレッドは好塩基球の顆粒をも染色する(螢
光強度に特異性はない)ため、アストラゾンオレンジG
による好塩基球の特異染色を阻害す°る。したがって、
好酸球と好塩基球の両者に対して分離度の良いニュート
ラルレッド濃度を決定する必要がある。
互作用 ニュートラルレッドは好塩基球の顆粒をも染色する(螢
光強度に特異性はない)ため、アストラゾンオレンジG
による好塩基球の特異染色を阻害す°る。したがって、
好酸球と好塩基球の両者に対して分離度の良いニュート
ラルレッド濃度を決定する必要がある。
第5図はアストラゾンオレンジG濃度15ppm、 p
H9,0の条件のもとてのニュートラルレッド濃度に対
する好酸球と好中球の分離能および好塩基と好中球の分
離能の変化を図示したものである。第5図において好塩
基球/好中球緑色螢光比は好塩基球と好中球の縁帯光強
度の比を示し、好酸球/好中球赤色螢光比は好酸球と好
中球の赤祭光強度の比を示しく以下同じ)でおシ、図中
の上方の点はど、好塩基球または好酸球と好中球との分
離の程度が良いことを表わしている。
H9,0の条件のもとてのニュートラルレッド濃度に対
する好酸球と好中球の分離能および好塩基と好中球の分
離能の変化を図示したものである。第5図において好塩
基球/好中球緑色螢光比は好塩基球と好中球の縁帯光強
度の比を示し、好酸球/好中球赤色螢光比は好酸球と好
中球の赤祭光強度の比を示しく以下同じ)でおシ、図中
の上方の点はど、好塩基球または好酸球と好中球との分
離の程度が良いことを表わしている。
第5図では、ニュートラルレッド濃度3.0ppmで好
塩基球、好酸球の分離が同程度となるが実際には、白血
球中の好塩基球の個数が通常は少ないので、好塩基球の
分離能を向上させるだめ、ニュートラルレッドの濃度を
低めに、たとえば、2 ppmに設定することが望まし
い。
塩基球、好酸球の分離が同程度となるが実際には、白血
球中の好塩基球の個数が通常は少ないので、好塩基球の
分離能を向上させるだめ、ニュートラルレッドの濃度を
低めに、たとえば、2 ppmに設定することが望まし
い。
なお、第1液と第2液の滞積比を後の実施例で述べるよ
うに9:1とする場合には、最P濃度をアストラゾンオ
レンジ015 ppm1ニユ一トラルレツド2ppmと
するために、第】液中のアストラゾンオレンジGの濃度
ヲ16.5 ppm、ニュートラルレッドの濃度を2.
2 ppmとすれば艮い。
うに9:1とする場合には、最P濃度をアストラゾンオ
レンジ015 ppm1ニユ一トラルレツド2ppmと
するために、第】液中のアストラゾンオレンジGの濃度
ヲ16.5 ppm、ニュートラルレッドの濃度を2.
2 ppmとすれば艮い。
(2j pH
α、最終(混合時の) pH
アストラゾンオレンジG 濃度15.0 ppm。
ニュートラルレッド濃度3.0 ppmの条件のもとて
のpHの変化に対する、好塩基球または好酸球の好中球
に対する分離能の変化を第6図に示す。pHの上昇に伴
い好酸球の好中球に対する分離能は低下する。好塩基球
の好中球に対する分離能はpH9,0付近まではpHの
上昇に伴って上シ、pH9,0以上では低下する。
のpHの変化に対する、好塩基球または好酸球の好中球
に対する分離能の変化を第6図に示す。pHの上昇に伴
い好酸球の好中球に対する分離能は低下する。好塩基球
の好中球に対する分離能はpH9,0付近まではpHの
上昇に伴って上シ、pH9,0以上では低下する。
なお、pHの上昇に伴い、好塩基球の染色速度(螢光強
度が最大に達するまでの時間)は速くなる。しかし、最
大強度に達つしてから後の劣化も速くなる。好酸球の染
色速度はpHによっては余シ変化しない。
度が最大に達するまでの時間)は速くなる。しかし、最
大強度に達つしてから後の劣化も速くなる。好酸球の染
色速度はpHによっては余シ変化しない。
結局、好酸球、好塩基球の分離能と好塩基球の螢光強度
の劣化を考慮して、最終pHは8.6〜8.7付近にす
ることが望ましい。本発明では、この最終pHの値を染
色pHと呼んでいる。
の劣化を考慮して、最終pHは8.6〜8.7付近にす
ることが望ましい。本発明では、この最終pHの値を染
色pHと呼んでいる。
b、第1液pH
第1液pHは赤血球溶血能に影響する。赤血球の溶血は
pH5,0以下で速やかに進行し、pHの低い程溶血は
速くなる。しかしpH2,0以下では、溶血の進行とと
もに、ヘモグロビン等のタンパクの変性が始まり、変性
ノ進行は低pHはど速くなる。タンパクが変性した場合
には、最終の染色pHにした時点で凝集塊を生成してし
まう。上記の点を考慮し、第1液のpHは2.0〜5.
0とすることが望ましい。
pH5,0以下で速やかに進行し、pHの低い程溶血は
速くなる。しかしpH2,0以下では、溶血の進行とと
もに、ヘモグロビン等のタンパクの変性が始まり、変性
ノ進行は低pHはど速くなる。タンパクが変性した場合
には、最終の染色pHにした時点で凝集塊を生成してし
まう。上記の点を考慮し、第1液のpHは2.0〜5.
0とすることが望ましい。
(3)緩衝剤
α、第1液緩衝剤
第1緩衝剤は、溶液のpHを溶血条件に維持するために
添加するものであり、pKa3.5±1.5ならば、い
ずれの緩衝剤でも使用可能である。たとえばマレイン酸
、マロン酸、フタル酸、ジグリコール酸、サリチル酸、
フマル酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸などである。緩
衝剤の濃度は、第1液の浸透圧を低くするためなるべく
少なくすることが望ましい。本発明の目的には50mM
以下が望ましい。さらに好適には、5〜30 m Mが
望ましい。
添加するものであり、pKa3.5±1.5ならば、い
ずれの緩衝剤でも使用可能である。たとえばマレイン酸
、マロン酸、フタル酸、ジグリコール酸、サリチル酸、
フマル酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸などである。緩
衝剤の濃度は、第1液の浸透圧を低くするためなるべく
少なくすることが望ましい。本発明の目的には50mM
以下が望ましい。さらに好適には、5〜30 m Mが
望ましい。
b、第2液緩衝剤
第2液緩衝剤は、第1液緩優剤中の酸を中和し、溶液p
Hを染色pHに維持するものである。pH68,0〜9
.5の緩衝剤であれば、いずれの緩衝剤でも使用可能で
ある。たとえばトリス、トライシン、ピシン、2−アミ
ノ−2メチル−1;3−プロパンジオール、タウリン、
ホウ酸、セリンなどである。緩衝剤の濃度は、最終(混
合時)濃度10mM以上であることが望ましい。本発明
の目的には最終濃度30〜100mMが好適である。
Hを染色pHに維持するものである。pH68,0〜9
.5の緩衝剤であれば、いずれの緩衝剤でも使用可能で
ある。たとえばトリス、トライシン、ピシン、2−アミ
ノ−2メチル−1;3−プロパンジオール、タウリン、
ホウ酸、セリンなどである。緩衝剤の濃度は、最終(混
合時)濃度10mM以上であることが望ましい。本発明
の目的には最終濃度30〜100mMが好適である。
(4)浸透圧
α、第1液浸透圧
第1液の浸透圧は低いほど赤血球の溶血が速やかに行な
われる。本発明の目的には0〜100 m05m/14
の範囲、特に、0〜50moss/#であることが望ま
しい。
われる。本発明の目的には0〜100 m05m/14
の範囲、特に、0〜50moss/#であることが望ま
しい。
b、第2g浸透圧
第2液浸透圧は最終(混合時)の浸透圧を決定するもの
である。最終浸透圧は白血球の形態保持に影響し、15
0〜600 mosmlKの範囲、特に、150〜30
0脩08常/館であることが望ましい。
である。最終浸透圧は白血球の形態保持に影響し、15
0〜600 mosmlKの範囲、特に、150〜30
0脩08常/館であることが望ましい。
(実施例)
本発明を前述した組成範囲の中で最も好適な条件のもと
で実施した例を以下に示す。
で実施した例を以下に示す。
試薬組成
第1液
(好酸球特異染料)
pH3,0、浸透圧10 rno s ml 1g第2
液 pH9,7〜9.8、浸透圧2600 tnosm/に
&染色方法 1容量部のBDTA2に抗凝固血液に18容量部の第1
液を加え、撹拌後25℃で20秒間インキュベートした
のち、2容量部の第2液を加え、撹拌後25℃で40秒
間インキュベートする。最終染色条件はpH9,7、浸
透圧260 tnoam/に9となる。
液 pH9,7〜9.8、浸透圧2600 tnosm/に
&染色方法 1容量部のBDTA2に抗凝固血液に18容量部の第1
液を加え、撹拌後25℃で20秒間インキュベートした
のち、2容量部の第2液を加え、撹拌後25℃で40秒
間インキュベートする。最終染色条件はpH9,7、浸
透圧260 tnoam/に9となる。
螢光特性
上記組成の試薬で染色した場合の各白血球の波長特性を
第7図に示す。
第7図に示す。
上記螢光特性によシ、最適のフィルター、ダイクロイッ
クミラーは以下のように選定さ九た。
クミラーは以下のように選定さ九た。
分析結果
上記条件にて、フローサイトメーターで測定し、赤帯光
強度と縁帯光強度とによる二次元分布図を描くと第8図
のようになる。血小板等6は白血球と分離されている。
強度と縁帯光強度とによる二次元分布図を描くと第8図
のようになる。血小板等6は白血球と分離されている。
好酸球4と好塩基球5は他の白血球と艮ぐ分離されてい
る。残シの白血球すなわちリンパ球1、単球2、好中球
3について側方散乱光の度数分布を書くと第9図のよう
になシ、三つは良く分離されている。なお、第9図にお
いて、5ide Sc、は側方散乱光の相対強度を、p
rgqsは度数を表わしている。
る。残シの白血球すなわちリンパ球1、単球2、好中球
3について側方散乱光の度数分布を書くと第9図のよう
になシ、三つは良く分離されている。なお、第9図にお
いて、5ide Sc、は側方散乱光の相対強度を、p
rgqsは度数を表わしている。
なお、以上述べた実施例は、完全に染色が終了したのち
に(すなわち染色が平衡状態に達つしたのちに)、測定
を開始するものであるから、測定中に試料が経時変化す
ることはなく、また、白血球が唖端に多いか、または、
少い検体についても、常に、一定時間で適正な強度にま
で染色レベルが達している。したがって、安定な測定が
可能となるとともに、比較的低出力の光源を使用しても
、充分な螢光強度の信号が得られる。たとえば、この実
施例では10mWのアルゴンイオンレーザ−をフローサ
イトメーターの光源として使用している。
に(すなわち染色が平衡状態に達つしたのちに)、測定
を開始するものであるから、測定中に試料が経時変化す
ることはなく、また、白血球が唖端に多いか、または、
少い検体についても、常に、一定時間で適正な強度にま
で染色レベルが達している。したがって、安定な測定が
可能となるとともに、比較的低出力の光源を使用しても
、充分な螢光強度の信号が得られる。たとえば、この実
施例では10mWのアルゴンイオンレーザ−をフローサ
イトメーターの光源として使用している。
しかし、この発明に使用されるフローサイトメーターの
光源は、前述の低出力のアルゴンイオンレーザ−に限ら
ず、他の光源、たとえば、水銀アークランプ、クセノン
アークランプ、He−Cdレーザー、Ha−Neレーザ
ー、大出力のアルゴンイオンレーザ−等の光源であって
もかまわない。そのときには、各光源に応じた染色集注
、測定条件を設定すれば艮い。
光源は、前述の低出力のアルゴンイオンレーザ−に限ら
ず、他の光源、たとえば、水銀アークランプ、クセノン
アークランプ、He−Cdレーザー、Ha−Neレーザ
ー、大出力のアルゴンイオンレーザ−等の光源であって
もかまわない。そのときには、各光源に応じた染色集注
、測定条件を設定すれば艮い。
(発明の効果)
この発明の方法によって血液を測定し、白血球を分類・
計数すると、以下に述べる様な効果が得られる。
計数すると、以下に述べる様な効果が得られる。
(1)抗反因処理を施しだ血液に第1液を加え、次に第
2)浅を加えるという二段階の染色のみで測定用試f+
が得られるので、試料の前処理が簡単である。
2)浅を加えるという二段階の染色のみで測定用試f+
が得られるので、試料の前処理が簡単である。
12)1分程度の試参41整時間で測定することが可能
であるため、f゛:穴迄に要する時間が短くて済む。
であるため、f゛:穴迄に要する時間が短くて済む。
(3)完全に染色が終了した状態で測定するため、測定
中の試料の経時的変化が無く、また、正常な検体のみな
らず、白血球が極端に多いか、または少い検体について
も、一定時間で常に適正な強度に染色がなされている。
中の試料の経時的変化が無く、また、正常な検体のみな
らず、白血球が極端に多いか、または少い検体について
も、一定時間で常に適正な強度に染色がなされている。
このため検体によって染色時間を変えるという必要は生
じない。
じない。
(4)完全に染色が終了し、強い染色強度に達つしたの
ち測定するので、光源は低出力のもので艮い。さらに光
源は一個しか必要とせず、測定パラメーターも螢光2チ
ヤンネル、側方散乱光lチャンネルを測定し、分析する
だけで良いので、この発明の方法を実施するだめの装置
は、構成が簡単で低価格のものとなる。
ち測定するので、光源は低出力のもので艮い。さらに光
源は一個しか必要とせず、測定パラメーターも螢光2チ
ヤンネル、側方散乱光lチャンネルを測定し、分析する
だけで良いので、この発明の方法を実施するだめの装置
は、構成が簡単で低価格のものとなる。
(5) 酸性低張処理によシ赤血球のみを溶血させて
しまうので、赤血球と白血球の同時通過が無くなったた
め、側方散乱光信号によるリンパ球と単球と好中球との
分離が著しく良くなった。
しまうので、赤血球と白血球の同時通過が無くなったた
め、側方散乱光信号によるリンパ球と単球と好中球との
分離が著しく良くなった。
(6) 螢光信号によって好酸球と好塩基球をまず分
離し、残った白血球すなわちリンパ球と単球と好中球と
を側方散乱光により分離することによシ、分離度の非常
に艮い白血球の5分類が可能となった。
離し、残った白血球すなわちリンパ球と単球と好中球と
を側方散乱光により分離することによシ、分離度の非常
に艮い白血球の5分類が可能となった。
(力 白血球と池の血球等との分離は螢光強度によって
行っているので、全ての赤血球が7ラグメント化されな
くても、測定値に影響を与えることがない。
行っているので、全ての赤血球が7ラグメント化されな
くても、測定値に影響を与えることがない。
本発明の方法において、一検体につき10000個以上
の白血球を測定すると、正確度および再現性にすぐれた
測定値が得られる。
の白血球を測定すると、正確度および再現性にすぐれた
測定値が得られる。
第1図は、この発明に使用されるフローサイトメーター
の光学系の一具体例を示す概略図。第1図中の符号は次
のとおシに説明される:1070−サイトメーターの光
学系 12 レーザー 14 フローセル 16 シリンドリカルレンズ 18 コンデンサーレンズ 20 アノく−チャー 22 ダイクロイックミラー 24 側方散乱光 2G 螢光 28 光電子増倍管 30 ダイクロイックミラー 32 赤螢光 34 カラーフィルター 36 光電子増倍管 38 縁帯光 40 カラーフィルター 42 光電子増倍管 第2図は赤血球の同時通過の影響があるときの側方散乱
光相対強度の度数分布を示す図。 第3図は赤血球の同時通過の影響が無いときの側方散乱
光相対強度の度数分布を示す図。 第4図は赤螢光と縁帯光を使用して、白血球を分類した
ときの二次元分布図。図面中の符号1はリンパ球、2は
単球、3は好中球、4は好酸球、5は好塩基球の集合を
表わしている。 第5図はニュートラルレッドの濃度に対する好酸球と好
中球の分離能および好塩基球と好中球の分離能の変化を
示す図。 第6図はpHの変化に対する好酸球と好中球の分離能お
よび好塩基球と好中球の分離能の変化を示す図。 第7図は各白血球の螢光波長強度分布を示す図。 第8図は本発明の実施例において、赤螢光と縁帯光を使
用して、白血球を分類したときの二次元分布図。 第9図は同じく側方散乱光相対強度の度数分布を示す図
。 第1図 第2図 →則Y敞孔九相廿社贋 第3図 第4図 第5図 二エートつルレノト5裏曳 第6図 ef、(J el、5 !+1.(J
ソ5IυυH 第7図 第8 図 Red FL。 第9図 5ide Sc。 手 続 補 正 書 昭和62年4月2日
の光学系の一具体例を示す概略図。第1図中の符号は次
のとおシに説明される:1070−サイトメーターの光
学系 12 レーザー 14 フローセル 16 シリンドリカルレンズ 18 コンデンサーレンズ 20 アノく−チャー 22 ダイクロイックミラー 24 側方散乱光 2G 螢光 28 光電子増倍管 30 ダイクロイックミラー 32 赤螢光 34 カラーフィルター 36 光電子増倍管 38 縁帯光 40 カラーフィルター 42 光電子増倍管 第2図は赤血球の同時通過の影響があるときの側方散乱
光相対強度の度数分布を示す図。 第3図は赤血球の同時通過の影響が無いときの側方散乱
光相対強度の度数分布を示す図。 第4図は赤螢光と縁帯光を使用して、白血球を分類した
ときの二次元分布図。図面中の符号1はリンパ球、2は
単球、3は好中球、4は好酸球、5は好塩基球の集合を
表わしている。 第5図はニュートラルレッドの濃度に対する好酸球と好
中球の分離能および好塩基球と好中球の分離能の変化を
示す図。 第6図はpHの変化に対する好酸球と好中球の分離能お
よび好塩基球と好中球の分離能の変化を示す図。 第7図は各白血球の螢光波長強度分布を示す図。 第8図は本発明の実施例において、赤螢光と縁帯光を使
用して、白血球を分類したときの二次元分布図。 第9図は同じく側方散乱光相対強度の度数分布を示す図
。 第1図 第2図 →則Y敞孔九相廿社贋 第3図 第4図 第5図 二エートつルレノト5裏曳 第6図 ef、(J el、5 !+1.(J
ソ5IυυH 第7図 第8 図 Red FL。 第9図 5ide Sc。 手 続 補 正 書 昭和62年4月2日
Claims (3)
- (1)以下(a)〜(d)の各工程からなることを特徴
とする、フローサイトメトリーによる白血球の分類方法
。 (a)好酸球を特異的に螢光染色する染料と、好塩基球
を特異的に螢光染色する染料と、pHを酸性域に保つた
めの緩衝剤とからなる低張な第1液に、抗凝固処理を施
した新鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工程。 (b)第1液の緩衝剤中の酸を中和し、溶液pHを染色
pHに保つための緩衝剤と、溶液を白血球の形態を保持
する浸透圧に調整するための浸透圧補償剤とからなる第
2液を、前記(a)で得られた、第1液で処理された血
液試料に加えて、白血球を染色する工程。 (c)前記染色された試料をフローサイトメーターに流
し、白血球と他の血球やゴーストとを螢光強度によって
区別し、白血球の螢光信号と側方(90°)散乱光信号
とを測定する工程。 (d)白血球より発せられた前記複数の信号により、各
白血球の種類を判別し、計数し、各白血球の比率を算出
する工程。 - (2)好酸球を特異的に螢光染色する染料がニュートラ
ルレッドである特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 - (3)好塩基球を特異的に螢光染色する染料がアストラ
ゾンオレンジGである特許請求の範囲第(1)項記載の
方法。
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61282697A JPH0635972B2 (ja) | 1986-11-27 | 1986-11-27 | フロ−サイトメトリ−による白血球の分類方法 |
CA000546200A CA1309327C (en) | 1986-09-10 | 1987-09-04 | Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry |
DE19873783838 DE3783838T2 (de) | 1986-09-10 | 1987-09-08 | Reagenz und verfahren zum klassifizieren von leukozyten durch durchfluss-zytometrie. |
EP19870113112 EP0259833B1 (en) | 1986-09-10 | 1987-09-08 | Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry |
US07/663,090 US5175109A (en) | 1986-09-10 | 1991-02-28 | Reagent for classifying leukocytes by flow cytometry |
JP4228837A JPH0723890B2 (ja) | 1986-11-27 | 1992-08-27 | 白血球測定用試薬及び白血球測定用試料調製方法 |
US07/947,784 US5296378A (en) | 1986-09-10 | 1992-09-18 | Method for classifying leukocytes by flow cytometry |
US08/153,767 US5928949A (en) | 1986-09-10 | 1993-11-17 | Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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