JPS63122954A - 生育可能細胞の標識 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 魚匪囚ば匣 本発明は、細胞組織または機能に悪影響を及ぼすことな
く生育可能（ｖｉａｂｌｅ）細胞を標識する新規な方法
に関する。

光肌囚艷晟 蛍光検出法は、多くの細胞の特性を測定するための分析
手段として免疫学および細胞生物学全般において用いら
れている。蛍光測定の利点は、１つの染料分子が、多く
の光量子として放射しながら１秒間当たり何千回も励起
し、かつ、基底状態に復帰しうるということにある。す
なわち、１つの抗体分子が２または３個の染料分子で標
識された場合、１つの抗原−抗体部位から数千の光量子
を得ることができる。これは、非常な信号増幅方法であ
る。

ジオキサカルボシアニン染料が、白血球識別分析を行な
うために用いられている［ギエンター・パレット、マッ
クス・ブランク・ゲス・ヴイッシェンシュ（Ｇｕｎｔｅ
ｒ　Ｖａｌｅｔ、　Ｍａｘ　　Ｐｌａｎｃｋ　　Ｇｅ５
Ｗ　１ｓｓｅｎｓｃｈ）　；特許照会番号第８４−１０
２３０７／１７号、選択的染色および容積測定および蛍
光による血液の同時定量分析（Ｓ　ｉｍｕｌｔａｎｅｏ
ｕｇＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓ　ｂｙ　５
ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｍｅａ
ｓｕｒｉｎｇＶｏｌｕｍｅ　　ａｎｄ　　Ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅ）Ｊ。しかしながら１これらの研究に用い
られた染料は、短鎖カルボシアニン染料（１０以下）で
あり、かつ、膜電位の変化に応答する。さらに、該短鎖
カルボシアニン染料は、細胞ミトコンドリアに侵入し、
細胞毒であり、かつ、該細胞を洗浄した場合、該染料は
、該細胞の膜電位が変化しようとしまいと該細胞から容
易に流出する。本発明の長鎖染料は、細胞膜に閉じ込め
られ、かつ、膜電位により非常に僅かしか影響されない
。そ゛れらは細胞から流出しない。

白血球識別を行うために用いられる他のタイプの染料は
、シアニンタイプの染料ではなく、かつ、脂質中に分配
しない。ピリリウムまたはチアピリリウム化合物が、白
血球の種類を識別するために用いられている［デビット
・ニス・フランク、アール・ティー・ベリー（Ｄａｖｉ
ｄ　　Ｓ、　Ｆｒａｎｋ、　Ｒ。

Ｔ、　Ｂｅ１ｌｙ）、特許照会番号第８４−１６６２７
５／２７号、ピリリウムまたはチアピリリウム化合物を
用いた染色による生物試料中の細胞識別（Ｄｉｓｔｉｎ
ｇｕｉｓｈｉｎｇ　　Ｃａ１ｌｓ　　ｉｎ　　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌＳａｍｐｌｅｓ　　ｂｙ　　Ｓｔａｉｎｉ
ｎｇ　　ｗｉｔｈ　　ＰｙｒｙｌｉｕｍｏｒＴｈｉａｐ
ｙｒｙｌｉｕｍ　　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）Ｊ。しかしな
がら、これらの染料は、該細胞の細胞質または核成分に
結合する。すなわち、それらは、細胞膜に特異的に結合
しない。他のカチオン染料「エル・カス、（Ｌ、Ｋａｓ
ｓ）、特許照会番号第８１−７８１８７／４３号、メタ
クロマチンカチオン染料を用いた染色による異なる白面
球種の分析（Ｄ　ｅｔｅｒｍｉｎａｔ　１ｏｎｏｆ　　
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　　Ｃａｔ
ｅｇｏｒｉｅｓ　　ｂｙＳｔａｉｎｉｎｇ　　ｗｉｔｈ
　Ｍｅｔａ：　Ｃｈｒｏｍａｔｉｃ　Ｃａｔｉｏｎｉｃ
Ｄ　ｙｅｓ）、エル・カス（Ｌ、　ＫａｓＳ）、米国特
許第４４００３７０号、白血球の示差定量のためのメタ
クロマチン染料収着法（ＭｅｔａｃｈｒｏｍａＬｉｃ　
　Ｄ　ｙｅＳｏｒｐｔｉｏｎ　　Ｍｅａｎｓ　　ｆｏｒ
　　ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎ　　ｏｒ　　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、エル中カス
（Ｌ、　Ｋａｓｓ）、特許照会番号第８３−７７１９８
２／３９号、特異的塩基性染料を用いた染色非固定細胞
によるヒト血液細胞の分析（Ａ　ｎａｌｙｓ　ｉｓ　ｏ
ｒＨｕｍａｎ　　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　ｂｙ　Ｓｔ
ａｉｎｉｎｇ　ＵｎｆｉｘｅｄＣｅｌｌｓ　　ｗｉｔｈ
　　５ｐｅｃｉｆｉｅｄ　　Ｂａ５ｉｃ　　Ｄｙｅｓ）
Ｊが、白血球識別を行うために用いられている。しかし
、これらの染料は、膜脂質中に特異的に分配しないが、
該細胞内の種々のオルガネラを染色する。白血球を識別
するために用いられる他の異染性染料は、アクリジンオ
レンジである「ピー・ジェイ・ナタレ（Ｐ、　Ｊ、　Ｎ
ａｔａｌｅ）、米国特許第４３３６０２９号、全血中の
網状赤血球および血小板の定量分析法および試薬（Ｍｅ
ｔｈｏｄ　　ａｎｄ　　ＲｅａｇｅｎｔｓＦｏｒ　　Ｑ
ｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ　　ｏｆＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ　　ａｎｄ　　
Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ　　ｉｎ　　ＷｈｏｌｅＢ　Ｉｏｏ
ｄ）、アール・ジェイ・ガーシュマン（Ｒ，Ｊ。

Ｇ　ｅｒｓｈｍａｎ）、米国特許第４３２５７０６号、
全血中の血小板および網状赤血球の自動検出（Ａｕｔｏ
ｍａｔｅｄ　　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｐ　！
ａｔｅｌｅＬｓ　ａｎｄＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ　
　ｉｎ　　Ｗｈｏｌｅ　　Ｂ　ｆｏｏｄ）Ｊ。アクリジ
ンオレンジ染料は、細胞のＲＮＡおよびＤＮＡを染色す
るが、膜脂質中に顕著に分配しない。

別の出願は、悪性細胞から正常細胞を識別するためにメ
ロシアニン５４０を使用している。この染料は、１５炭
素迄の長い炭化水素末端を有している。しかし、この分
子は、該炭化水素末端の端に親水性基を有しており、か
つ、該細胞が露光した場合、細胞毒になる「バリンスキ
ー、ジエイ・イー、ライヒ、イーおよびイーストン、テ
ィー・ジー（Ｖａｌｉｎｓｋｙ、　Ｊ、　Ｅ１４　Ｒｅ
１ｃｈ、　Ｅ、　ａｎｄＥａｓｔｏｎ、　Ｔ、　Ｇ、　
）、米国特許第４４２４２０１号、悪性白血球細胞の検
出のためのメロシアニン染料の使用（Ｅｍｐｌｏｙｍｅ
ｎｔ　　ｏｆ　　ａ　ＭｅｒｏｃｙａｎｉｎｅＤｙｅ　
　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　ｏｒ　
　ＭａｌｉｇｎａｎｔＬ　ｅｕｋｏｃｕｔ　ｉｃ　　Ｃ
ｅｌ　１ｓ）Ｊ。メロシアニンは、正常および悪性細胞
の膜に特異的に取り込まれる。

脂肪族短鎖長のシアニン染料は、多くの生物学的検定に
用いられている。しかしながら、これらの脂肪族短鎖分
子は、膜電位に応答し、かつ、該細胞膜を横断して該細
胞のミトコンドリア中に浸透する［エッチ・エム・シャ
ピロ（Ｈ，Ｍ、　５ｈａｐｉｒｏ）、米国特許第４３４
３７８２号」。該短鎖シアニン染料は、また、該細胞に
対して毒性であり、かつ、それらは、迅速に細胞から流
出するので細胞を探知するために用いることができない
。

トリカルボシアニン染料「フォックス、アイ・ジエイら
、プロシーディンゲス・イブ・マヨ・り。

リニク（Ｆｏｘ、　　Ｉ　、　　Ｊ、　ｅｔ　　ａｌ、
　、　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｙ。

Ｃ１１ｎｉｃ）、３２，４７８〜４８４（１９５７）Ｊ
およびエバンズーブルー染料「シアツド、エッチら、プ
フレガーズ・アルカイブ−ヨーロピアン・ジャーナル・
イブ・フィジオロジー（Ｐ　ｒ　Ｉｕｅｇｅｒｓ　。

Ａｒｃｈ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　）、
　３７０（２）、　　１３９〜１４４（１９７７）Ｊが
ｉｎ　ｖｉｖｏにて希釈法により心臓出力を測定するた
めに用いられている。

ダウ「ダウ、ビー、フィジオロジカル・レビューズ（Ｄ
ｏｔ、　Ｐ、　、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　）、
　３６　、７７〜１０２（１９５６）Ｊは、既知量のあ
る種の血管的指示薬を肺の静脈側に注入し、該指示薬の
動脈濃度を経時的に測定して注入時およびサンプリング
時の間の容積を測定するような方法を記載している。こ
れらの染料は、細胞を染色するために用いられない。

フルオレセインおよびローダミンの長鎖脂肪族誘導体が
、細胞融合をモニターするために用いられている「ワン
ダ、ピー・イーおよびスミス、ジエイ・ディー、ジャー
ナル・イブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミ
ストリー（Ｗａｎｄａ、　Ｐ。

Ｅ、　ａｎｄ　　Ｓｍ１ｔｈ、　　Ｊ、　Ｄ、　、　　
Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）、３０．１２９７〜１３００（１
９８２）」。しかしながら、これらの染料は、１つの脂
肪族炭素鎖しか含有せず、かつ、膜中にて長時間安定で
はない。さらに、ヘテロカリオン形成の検出法は該２染
料分子間の共鳴エネルギー移動であった。さらに、該染
色は、生理食塩水中にて行われ、溶解性の一致は見られ
なかった。

生物物理学者らは、細胞膜流動性を研究するため長鎖タ
イプの２脂肪族シアニン染料の主な適用を用いている「
ディー・アクセルロッド、バイオフィジカル・ジャーナ
ル（Ｄ、　Ａｘｅｌｒｏｄ、　Ｂｉｏ−ｐｈｙｓｉｃａ
ｌ　　Ｊ、　）、　２６．５５７〜５７４（１９７９）
」。この種の研究において、該染料は、エタノール原料
からの短期間培養中の細胞に適用される。

染色における変化性が非常に大きいことが数人の研究者
により報告された。しかし、生物物理学的測定のために
は、試験するそれぞれの細胞を数回測定するいくつかの
細胞のみを注視することが必要である。また、原形質膜
中に取込まれる長鎖カルボシアニン染料は、培養中のニ
ューロンの独特の同一性を決定するために用いられてい
る［ホニグ、エム・ジーおよびヒユーム、アール・アイ
、ジャーナル・才ブ・セル・バイオロジー（Ｈｏｎｉｇ
。

Ｍ、　Ｇ、　ａｎｄ　　Ｈｕｍｅ、　Ｒ，１１４Ｊ、　
Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、　　１０３．　１７１
〜１８７（１９８６）Ｊ。

前記文献には、細胞組織または機能に悪影響を及ぼすこ
となく生育可能細胞を染色する特有の方法を欠いている
。

倉肌ｑ炙絢 本発明は、細胞の組織および機能を顕著に変化させるこ
となく生育可能細胞の正確かつ再現性のある標識を可能
にする新規な方法に関する。本発明によれば、細胞は、
十分な脂質溶解性および高い細胞膜分配係数を有し、細
胞膜からの染料分子の移動を最小限にするか、防止する
シアニン染料にて標識される。正確かつ再現性のある標
識は、細胞生育力に顕著な影響を及ぼすことなく、かつ
、その中に該染料が溶解しうる浸透圧調節剤を含有する
培地中に懸濁した細胞に染料を添加することにより行わ
れる。そのような浸透圧調節剤は、糖、糖−アルコール
、アミノ酸およびある種の水素イオン緩衝剤（グツド緩
衝剤）を包含する。

魚哩旦護朦 細胞の組織または機能に悪影響を及ぼすことなく種々の
細胞を標識する本発明方法においては、シアニン染料が
用いられる。

つぎの構造を有する化合物： ［式中、Ｙは酸素、硫黄、メチレンまたはアルキル置換
メチレン；ｍは０〜３；およびｎは１２〜２２を意味す
る］ を本明細書においてシアニン染料と称する。

本明細書にて用いられているように、アルキル置換メチ
レンは、メチル、エチルまたはプロピル置換基のいずれ
かの組合せを有するモノ−またはジー置換メチレンを意
味する。

前記構造の化合物は、つぎの一般的に知られた簡略式： ％式％） により表わされる［シムズ、ピー・ジェイら、バイオケ
ストリー（Ｓｉｎｓ、　Ｐ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ１４　Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋＋＋。

）、■、３３１５（１９７４）Ｊ。すなわち、例えばＹ
が硫黄であり、鎖環を架橋する３個の炭素および１４個
の炭素の脂肪族鎖を２つ有する化合物をＤｉＳＣ，４（
３）と称する。同様に、Ｄ　ｉｒ　Ｃ＋４（５）は、Ｙ
がイソプロピルであり、鎖環を架橋する５個の炭素およ
び１４個の炭素の脂肪族鎖を２つ有する化合物を示す。

ｌまたはそれ以上の置換を有する前記構造の化合物は、
そのような置換化合物が、少なくとも標識に必要な間細
胞標識培地に溶解し、かつ、十分に高い細胞膜分配係数
を有し、依然として標識細胞膜に結合している場合に、
本明細書にてシアニン染料と称する化合物に包含される
。そのような化合物は、また、標識に必要な濃度にて細
胞生育力に顕著な影響を及ぼしてはならない。細胞標識
培地中の溶解度は、該標識培地中にシアニン染料を分散
し、かつ、標準分光蛍光法により細胞の蛍光強度を期間
中測定することにより以下に示すように決定する。蛍光
強度の減少は、染料の沈澱および容器壁への付着を示し
ている。該染料が依然として細胞膜に結合しているかど
うかは、例えば、公知のフローサイトメトリー法を用い
て、標識後供血動物中に再注入した赤血球の蛍光強度を
モニターして決定する。本質的に、再注入後の標識細胞
の一定蛍光強度は、細胞膜中の該染料の安定性を決定す
る。

核磁気共鳴画像により検出できる原子を取込んだ前記構
造の化合物もシアニン染料のような本明細書にて言及し
ている化合物に包含される。そのような化合物は、例え
ば、該脂肪族鎖のメチル基の１つにフッ素原子を取込む
ことにより製造する。

＋２５１のようなガンマ放出体を付加した前記構造の化
合物も本明細書にてシアニン染料と称す。

本発明にて用いられるシアニン染料は、モレキュラー・
ブローブズ・インコーボレーティッド、ニージーン、オ
レゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　　Ｉ　
ｎｃ、。

Ｅｕｇｅｎｅ、　Ｏｒｅｇｏｎ）のような種々の源から
購入でき、かつ、公知の合成法を用いて入手可能な出発
物質から製造できる「ハマー、エフ・エム、ザ・シアニ
ン・タイプ・アンド・リレーティラド・カンパウンズ、
インターサイエンス・パブリッシャーズ（Ｈａｌｌｌｅ
ｒ、　Ｐ、　Ｍ１４　Ｔ）＋ｅ　　Ｃｙａｎｉｎｅ　　
Ｄｙｅｓａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　　Ｃｏｍｐｏｕｎ
ｄｓ、　　　Ｉ　ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰ　ｕｂｌ　
１ｓｈｅｒｓＸ　１９６４　）Ｊ。

本発明方法を用いれば、いずれの生育可能細胞もシアニ
ン染料にて標識できる。本明細書にて用いられているよ
うに、「細胞」なる語は、バクテリアのような原核細胞
、白血球のような有核真核生物細胞、種々の腫瘍細胞、
哺乳動物の培養細胞、例えば、チャイニーズハムスター
卵巣細胞、酵母、赤血球および血小板のような無核細胞
を包含する。

有核細胞は、それが、その種の細胞に対して予期される
ように本質的に増殖または機能しうる場合に生育可能で
あり、無核細胞は、それが、例えば、生育可能な赤血球
が酸素および二酸化炭素を運搬できるようなその予期さ
れる機能を発揮しうる場合に生育可能であり、生育可能
な血小板は、例えば、凝集および解離検定において予期
されるように本質的に機能する。

細胞標識は、細胞に対して致命的でなく、かつ、再現可
能な細胞標識を供給する培地中にて行なわれる。必要な
特性を該培地に付与するため、シアニン染料が、少なく
とも標識に要する間安定な溶液を形成する浸透圧調節剤
を用いる。許容可能な浸透圧調節剤は、糖、例えば、グ
ルコース、フルクトース、ソルボース、キシロース、リ
ボースのような単糖類およびシュークロースのような三
糖類、マンニトール、グリセロール、イノシトール、キ
シリトールおよびアドニトールのような糖−アルコール
、グリシンおよびアルギニンのようなアミノ酸、Ｎ−ト
リス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパン
スルホン酸のようなある種のグツド緩衝剤ならびに以下
の第２表に挙げたもののような薬剤またはその組合せを
包含する「グツド、エヌ・イーら、バイオケミストリー
（Ｇ　ｏｏｄ　。

Ｎ、　Ｅ、　、　ｅｔ　　ａｌ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｔ
ｒｒ、　）、　　Ｉ　５．　４６７〜４７７（１９６６
）、　グツド、エヌ・イーおよびニス・イザワ、メソッ
ズ・イブ・エンザイモロジー（Ｇｏｏｄ、　Ｎ、Ｅ、ａ
ｎｄ　Ｓ、　ｒ　ｚａｗａ、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙ
ｍｏｌ、　）、　　２４　、バートＩ３，５３（１９６
８）、フェグソン、ダブリュー・ジェイら、アナリティ
カル・バイオケミストリー（Ｆｅｇｕｓｏｎ、　Ｗ、　
Ｊ、。

ｅｔ　　ａｌｌ、　　Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　）、　　ｆ　Ｑ　４　、　３０１〜３１０（１９８０
）Ｊ。しかしながら、いくつかの細胞系は、ｌまたはそ
れ以上の浸透圧調節剤、特に、糖−アルコールに対して
感受性である。したがって、標識前に標準試験を行って
、該細胞が予定した浸透圧調節剤中にて生育可能である
ということを確かめる。さらに、少量の緩衝剤を該標識
培地に加えて水素イオン濃度を調節する。

種々の浸透圧調節剤に対する暴露の細胞生育力に対する
影響は、該細胞を種々の浸透圧調節剤に３０分間暴露し
た後のＹａｃ細胞の倍加時間を測定することにより決定
した。Ｙａｃ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションから公に入手できるマウスリンパ腫組織
培養細胞系であり、キースリング、アール、ヨーロピア
ン・ジャーナル・イブ・イムノロジー（Ｋｉｅｓｓｌｉ
ｎｇ、　Ｒ，。

Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
、　　５．　１１２〜１１７（１９７５）により記載さ
れている。第１表に示したデータが示すように、リン酸
塩緩衝生理食塩水と比較した場合、シュークロース、グ
ルコースおよびグツド緩衝剤、ＴＡＰＳ　　ＣＡＰＳ、
ＥＰＰＳＳＨＥＰＰＳＯおよびＤＩＰＳＯに対する暴露
は、細胞倍加時間に対して無視できる影響しか生じず、
暴露に関係した細胞毒性が存在しないことを示している
。

第１表 浸透圧調整剤　　　　　　　　　倍加時間（時間）リン
酸緩衝生理食塩水　　　　　　　　　３１．０シユーク
ロース　　　　　　　　　　　　　４１．０グルコース
　　　　　　　　　　　　　　　　３４，５ＴＡＰＳ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　３２．７ＣＡ　Ｐ
　Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５．８Ｅ
　Ｐ　Ｐ　Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
２．２ＨＥＰＰＳＯ２３，４ Ｄ　Ｉ　Ｐ　Ｓ　Ｏ３６，７ ３−アミノ−１−プロパンスルホン酸　　　　　９９．
６ａ−ｃＮ−モノホリノ）プロパンスルホン酸　　　Ａ
ナトリウム（ＭＯＰＳ） ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパン　　　　　
Ｂジオール 第１表（続き） 浸透圧調整剤　　　　　　　　　倍加時間（時間）２−
アミノ−２−メチル−１−プロパツール　　　　ＢＮ−
）リス（ヒドロキシメチル）メチル　　　　Ｂアミノエ
タンスルホン酸（ＴＢＳ） Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−Ａアミノ
エタンスルホン酸（ＢＥＳ） ３−（シクロへキシルアミノ）−２−ヒドロ　　　Ａキ
シ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）トリエタノ
ールアミン　　　　　　　　　　　Ｂトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノ　　　　　Ｂメタ：／（ＴＲＩＺＭＡ
） ビス−トリスプロパン　　　　　　　　　　Ｂ２−（Ｎ
−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）　　Ｂ３−
［ジメチル（ヒドロキシメチル）　　　　　Ａメチルア
ミノコ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ
Ｏ） Ｎ、　Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）　　　　　　
　５７．７グリシン（ＢＩＣＩＭＥ） 第１表（続き） 浸透圧調整剤　　　　　　　　　倍加時間（時間）３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチル　　　　Ｂアンモ
ニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）３−
［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）　　　　　　６３．
６メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸
（ＴＡＰＳＯ） ３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシ　　　　　１
７８．４プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ） ２−［２−アミノ−２−オキソエチル）アミノコ　　１
０３８．４エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ） ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリ　　Ａスー
（ヒドロキシメチル）メタン（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ）２−
（Ｎ−シクロへキシルアミノ）エタン　　　　５１．５
スルホン酸（ＣＩＩＥＳ） Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチル　　　Ａグリ
シン（ＴＲＩＣＩＮＥ） グルコサミン　　　　　　　　　　　　　　２８８．４
イミダゾール　　　　　　　　　　　　　Ｂグリシルグ
リシン　　　　　　　　　　　６６．９Ａ−非増殖また
は部分的細胞毒 Ｂ−急性細胞毒 第２表は、シアニン染料溶解性について調べた種々の浸
透圧調節剤を示している。濃度の測定は、全て、遠心分
離により沈澱を除去し、かつ、分光蛍光分析のためにシ
アニン染料を含有する浸透圧調節剤の少量をエタノール
中に溶解した後に行った。用いた染料はＤｉＳＣ１４（
５）およびＤ　ｉ　ＯＣ＋　４（３）であり、かつ、該
浸透圧調節剤は等浸透圧濃度であった。エタノール溶液
標準からの蛍光濃度の減少は、シアニン染料溶解度の減
少と直接相関している。

第２表 相対蛍光強度（ＣＤＮＣ） ゛送圧：節　　　　　　　ＤｉｓＣｌ−（５）　　Ｄｉ
ＯＣ，４（３）エタノール　　　　　　　　　１００　
　　　１００グルコース　　　　　　　　　３１　　　
　１００フルクトース　　　　　　　　３５　　　　１
００ソルボース　　　　　　　　４０　　　　１００シ
ユークロース　　　　　　　４１　　　　１００第２表
（続き） 相対蛍光強度（ＣＤＮＣ） ゛送圧７簡Ｉ　　　　　　　ＤｉＳＣｌ−（５）　　Ｄ
ｉＯＣ３−（３）キシロース　　　　　　　　　３６　
　　　１９−５２リボース　　　　　　　　　２４　　
　　１００リキソース　　　　　　　　　　０．１２　
　　　１．８グリシン　　　　　　　　　３１９３ アルギニン　　　　　　　　　１７　　　　１７．２グ
リセロール　　　　　　　３９　　　　９９．５イノシ
トール　　　　　　　４２９２ キシリトール　　　　　　　　３４　　　　　７６．４
マンニトール　　　　　　　２９＊ アドニトール　　　　　　　３４　　　　　ＮＤトリス
（ヒドロキシメチル）　　１８　　　　　　ＮＤチルア
ミノプロパンスルホン 酸（ＴＡＰＳ） ３−（シクロへキシルアミノ）４ＯＮＤ−１−プロパン
スルホン酸（ＣＡＰＳ）Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
１８ＮＤピペラジン−Ｎ′〜３−プロパン スルホン酸（ＮＰＰＳ） 第２表（続き） 相対蛍光強度（ＣＤＮＣ） 送圧調節剤　　　　　　ＤｉＳＣ，４（５）　　ＤｉＯ
Ｃ，４（３）Ｎ−２−ヒドロキシエチル　　　　２０　
　　　　ＮＤピペラジン−Ｎ′−２−ヒドロキシ プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ） ３−［Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ　　４３＊＊＊　
　ＮＤエチル）アミノコ−２−ヒドロキシ プロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ） ＮＡＣｌ　　　　　　　　　　　　６　　　　　１．７
リン酸塩緩衝生理食塩水　　　２．１　　　　６．５Ｎ
ａ、Ｓ　０．　　　　　　　　　７．４　　　　１．６
Ｎａｌ　　　　　　　　　　　　　１．１　　　　０．
１４塩化コリン　　　　　　　　ｌｌ＊＊　　　　６゜
３ヨウ化コリン　　　　　　　　　０．１６　　　２．
３＊：エタノール中にて沈澱し、データ得られず。

＊＊：ペレットにならず大結晶のために人為結果＊＊＊
：エタノール中にて沈澱（データ疑問あり）ＮＤ：測定
せず。

第２表から明らかなように、シアニン染料は、リキソー
スを除く糖、糖−アルコール、アミノ酸およびグツド緩
衝剤、ＴＡＰＳｌＨＥＰＰＳＯｌＤＩＰＳＯｌＣＡＰＳ
およびＥＰＰＳの存在下より古典的塩の存在下にてずっ
と溶解しにくい。さらに、グルコース、フルクトース、
リボース、ソルボース、シュークロースおよびキシロー
スのような糖、グリセロール、イノシトール、キシリト
ールおよびアドニトールのような糖−アルコールならび
にグリシンおよびアルギニンのようなアミノ酸中のＤ　
ｉＳ　Ｃ１４（５）溶液の安定性を測定した。

該シアニン染料は、再現可能な標識のために十分な時間
である少なくとも２０分間試験溶液中で安定であり、か
つ、多くの該薬剤において、溶液中のシアニン染料の量
は、６０分では著しい減少を示さなかった。

さらに、シアニン染料が溶解可能である古典的塩および
浸透圧調節剤を含有する培地中のシアニン染料の溶解度
を調べた。等浸透圧性グルコース溶液中のＤｉＳＣ，４
（５）の溶解度は、蒸留水での等浸透圧性グルコース溶
液中のＤｉＳＣｌ４（５）の溶解度は、約２０％等浸透
圧性塩化ナトリウム溶液のみにて希釈することにより顕
著に減少した。

すなわち、シアニン染料を用いた再現可能な細胞標識は
、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢
酸ナトリウム、酢酸カリウム、硫酸ナトリウム、ヨウ化
ナトリウム、塩化コリンまたはヨウ化コリンのような古
典的塩の極く少量を含有する培地中にて行うことができ
、好ましくは、古典的塩を用いずに浸透圧を調節した培
地中にて行う。

本発明方法を用いて標識した細胞シアニン染料を分析し
て細胞生育力に対する標識の影響を測定した。アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロヅクビル、
メリーランド（ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手で
き、かつ、ブレスコツト、ディー・エム、アナルズ・イ
ブ・ニューヨーク・アカデミ−・イブ・サイエンシーズ
（Ｓｃｉ、）、３９７．１０１〜１０９（１９８２）に
記載されているＶ７９細胞を、１０−５または４×１０
−５Ｍの濃度にてＤｉＯＣ１４（３）を含有する溶液を
用いて標識し、該染色細胞の増殖動力学を、染色細胞な
らびに染色および非染色細胞の等ｍ混合物と比較した。

細胞倍加時間は、シアニン染料標識により影響されなか
った。すなわち、標識は、細胞増殖に影響しなかった。

また、トリパンプル排除およびヨウ化プロピジウム排除
のようないくつかの池の細胞生育力の標準試験は、前記
方法によるシアニン染料標識の細胞生育力に対する影響
の欠如を確認した。

また、細胞生育力に対するシアニン染料標識の影響は、
赤血球脆性を測定することにより分析した。標識および
非標識赤血球を、塩濃度を変えることにより浸透圧強度
を変えた塩化ナトリウム培地中に懸濁した。該細胞の容
積分布は、チャネライザ−アタッチメントを有するコー
ルタ−・カウンター０を用いて測定した。平均容積を測
定し、それぞれの塩濃度に対してプロットした。容積は
、該容積が急激な低下を示す約０．５９／　１００ｘＱ
まで塩化ナトリウム濃度が減少するにつれて増加した。

この時点において、該赤血球は溶血する。さらに、該容
積変化は、該細胞がシアニン染料にて標識されると否と
にかかわらず同じであった。

同様に、同じ試料にて、塩化ナトリウム濃度の関数とし
て溶血をモニターした。赤血球を約２〜３分間塩化ナト
リウム中に置いた後、該溶液を遠心分離していずれもの
未溶解細胞をベレットにした。ついで上清溶液を分光蛍
光分析に付してヘモグロビン濃度を測定した。全溶血対
照に対するそれぞれの試料のヘモグロビン濃度を比較す
ることにより溶血百分率を測定する。１ＱＯｉｆ２当た
り塩化ナトリウム約０．５９に達するまで遊離ヘモグロ
ビン濃度は相対的に低く、ついで、ヘモグロビンが直ち
に放出される。赤血球脆性結果と比較すると、容積変化
は、ヘモグロビン放出と直接相関していた。さらに、ヘ
モグロビン放出は、標識および非標識細胞において同じ
であった。

本発明方法により標識した細胞シアニン染料のｉｎ　　
ｖｉｖｏ安定性を試験するため、ウサギ赤血球を採取し
、ＤｉＳＣＩ４（５）にて標識し、再注入した。その後
定期的に血液試料を採取し、標識細胞百分率および該標
識細胞の蛍光強度を分析した。

循環赤血球の数は、時間の関数として１次的に減少し、
測定した標識細胞の５２日の寿命は、ウサギ赤血球につ
いて報告されている４０〜６０日の平均寿命と密接に相
関していた。すなわち、シアニン染料標識は、赤血球の
クリアランス率に影響を及ぼさなかった。

試験した５匹のウサギのうち１匹を除き全てにおいて、
染色細胞の蛍光強度は、標識および再注入後６０日の間
実質的に未変化であった。５番目の動物においては、該
シアニン染料の２０％以下が、ウサギの循環において６
０日後に該標識細胞から移動した。これらのデータは、
標識細胞から非標識細胞への染料の移動がないことを示
す組織培養からのデータと合わせて、該細胞が該染料に
て安定に標識されるということを示している。

本発明によるシアニン染料を用いて標識した生育可能細
胞は、細胞の母集団の多数の部分母集団を識別する能力
を必要とする多くの応用に用いられる。例えば、赤血球
輸血後、ヘマトクリットの減少が出血または該輸血細胞
に対する免疫反応に起因するかどうかを決定するために
、輸血前に該細胞の一部を本発明により標識し、かつ、
輸血後直ちに循環中の標識赤面味の両分の測定を行う。

その後、ヘマトクリットの低下が見られた際、標識細胞
の両分を輸血直後のそれと比較し、標識および非標識細
胞についての減少の相対速度の評価を行う。標識および
非標識細胞における同等の減少は、出血に起因する血液
減少を示し、一方、標識細胞のより大きな減少は、輸血
細胞に対する免疫反応を示している。同様の方法論を用
いれば、血小板輸血後の出血に起因する血小板数の減少
を、該輸血血小板に対する免疫反応から識別できる。

また、本発明方法は、培養哺乳動物細胞の増殖率を測定
するために用いられる。標識培養細胞が分割する度に、
該シアニン染料を娘細胞間に等しく分布させる。その結
果、フローサイトメトリー法を用いである増殖期後の該
細胞の蛍光強度と標識直後の蛍光強度を比較して細胞分
裂の数、すなわち増殖率を測定できる。

実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではない。

実施例１ 組織培養細胞の染色方法 １、細胞の調製 最良の結果を得るために対数期組織培養細胞を用いる。

懸濁培養物を培養容器から取り出し、ポリプロピレン遠
沈管に入れる。

単層培養を用いる場合、上清を除去し、カルシウムおよ
びマグネシウム不含リン酸塩緩衝生理食塩水溶液にて付
着細胞を洗浄して、該フラスコから血清タンパクを除去
しなければならない。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ギブ
コ・ラボラトリーズ、グランド・アイランド、ニューヨ
ーク（Ｇｉｂｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　　ｌ５ｌａ
ｎｄ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）＃６１Ｏ〜５３００）を
加えて該フラスコの底をおおい、該細胞単層が移動し、
かつ、分離するまで室温にてインキュベートする。得ら
れた細胞懸濁液をポリプロピレン遠沈管に移し、ｌＯ％
胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ハラエルトンＨａｚｅｌｔｏ
ｎ））を含有する等容量の培地を加えてトリプシンの酵
素作用を抑制する。細胞を室温にて１０分間４００×９
にて遠心分離する。上清を吸収し、等容量の等浸透圧性
マンニトールを該細胞ベレットの再懸濁のために取り替
える。このマンニトール洗浄は、血漿タンパクを該細胞
懸濁液から除去し、かつ、染色用細胞を調製するためで
ある。再度、細胞を室温にて１０分間４００Ｘ９にて遠
心分離する。

上清を吸収し、得られた細胞ベレットを染色のため２Ｘ
ＩＯ”’細胞／ｚＱの濃度にてマンニトール溶液中で再
懸濁する。しかし、いくつかの細胞系は、糖−アルコー
ル（マンニトール）の使用に対して感受性であり、その
ような場合、等浸透圧性グルコース溶液（ＭＷ１８０．
＋６．５４．０５９／Ｑ）を用いることができる。

■、貯蔵染料溶液の調製 ２Ｘ１０−’Ｍ貯蔵溶液は、以下のように無水エタノー
ル中にて調製する。

Ｄ　ｉＯ−Ｃｓ４＜　３　）　　　　ＭＷ８００（１，
６００巧／屑Ｑ）Ｄ　ｉＳ　−Ｃ、−（５）　　　　　
ＭＷ８１４（１，６２８仄ｇ／酎）Ｄ　ｉｏ　−０１ｇ
（３）　　　　ＭＷ９３６（１，８７２１１９／酎）Ｄ
　ｉ　ｒ　−０，４（５）　　　　　ＭＷ８５０（１，
７００ｏ／ｄ）全ての染料は、モレキュラー中プローブ
ス、ニージーン、オレゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒ
ｏｂｅｓ、　Ｅｕｇｅｎｅ。

Ｏｒｅｇｏｎ）から得られる。

染料貯蔵物を音波処理して該染料の完全溶解を確実にし
、かつ管に対する付着を最小限にする。

貯蔵溶液の調製のためにポリスチレン管を用いるので該
試料の溶解性を観察できる。しかし、水性雰囲気下にお
けるシアニン染料は、ポリスチレンと比較した場合ポリ
プロピレンに対する付着がずっと少ないためポリプロピ
レン管を用いて細胞を染色する。

■、細胞染色 細胞を等浸透圧性マンニトール中２ＸｌＯ’細胞／雇の
濃度に調整する。細胞を染色するために、２ＸＩＯ−’
Ｍ貯蔵染料溶液を細胞懸濁液ＩＪ！ρ当たり染料５μρ
にて該染色溶液に加える。染色する試料をピペットで分
注するか、または撹拌して該試料を十分に混合する。細
胞と該染料を１０分間インキュベートし、その後蛍光顕
微鏡下での試験用に少量を取って強く、かつ、均一な染
色が生じていることを確実にする。ＤｉＯ染料系列は、
４８８ｎｍ励起光に対して選択的な顕微鏡フィルターを
用い、一方、ＤｉＳおよびＤｉ！染料系列は、蛍光観察
のために５７５ｎｍ付近にて励起を必要とする。

インキュベージジン期間後、等容量のリン酸塩緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）を該染色細胞懸濁液に加える。該細胞
を２０℃にて１０分間４００Ｘ９にて遠心分離する。該
上清を吸引し、ベレットをＰＢＳ中で再懸濁する。該遠
心分離操作を繰り返し、染料の存在について得られた上
清を観察する。染料が上清中に見られる場合、分光蛍光
計により測定した時に該上清が遊離染料を有しなくなる
まで洗浄を繰り返す。最終洗浄後、上清を除去し、ベレ
ットを適当な培地中にて所望の濃度に再懸濁する。全て
の操作は、滅菌条件下にて行なう。

実施例２ 赤血球染色 ■、試薬調製 Ａ、クエン酸塩抗凝血剤 クエン酸ナトリウム　　　　　　　１，６６ｇクエン酸
　　　　　　　　　　　　　０．２０６９ＮａＨｔＰ０
４　　　　　　　　　　　０．１４０９グルコース　　
　　　　　　　　　１．６１９前記成分を蒸留水６３ｘ
Ｑに溶解し、該溶液をｐＨ５、６に調整する。最終溶液
を滅菌のため０．２２ミクロンフィルターに通す。

８９等浸透圧性グルコース溶液 グルコース５４．０５９を蒸留水１１２中に溶解する。

フィスケ（Ｆｉｓｋｅ）浸透圧計を用いて浸透圧を検査
し、要すれば、３２０ｍＯｓ＋＊に調整する。

■、貯蔵染料の調製 ２ｘｌＯ−’ＭＤｉｒｃ１４（５）の貯蔵溶液は、染料
１　、６２８　ｚ９／ｚＱを無水エタノール中に溶解す
ることにより調製する。該染料を完全に溶解するために
は音波処理を必要とする。

■、染色方法 クエン酸ナトリウムを含有するバキュテーナーまたはシ
リンジの全容量の１／１０に等しい量の調製クエン酸塩
抗凝血剤を含有するシリンジを用いて全血を無菌的に収
集する。フローサイトメトリーまたは機能性試験のため
に少量を保存しておく。該血液を室温にて１０分間１１
００Ｘにて遠心分離して赤血球をペレットにする。血小
板含有血漿を除去し、保存し、充填赤血球ペレットの容
積の５倍に等しい量の等浸透圧性グルコースを加えるこ
とにより該赤血球を洗浄する。該細胞を再度室温にて１
０分間１ｏｏｘｖにて遠心分離し、上清を吸引する。血
漿タンパクを除去し、かつ、より強く、かつ、均一な染
色を可能とするこの洗浄を再度繰り返す。最終遠心分離
および上清の吸引後、該赤血球を等浸透圧性グルコース
中４ＸＩＱａｌ胞／＊Ｑの濃度に再懸濁する。

染料添加前に、該試料をピペットで分注するか、または
撹拌して沈降が生じないことを確実にする。

１５μｅの貯蔵Ｄｔｓ　＋ｓ（５）（エタノール中２＋
ａＭ）を、それぞれ１ｘＱの赤血球懸濁液に加える。該
試料を直ちに混合して溶液中の迅速かつ均一な該染料の
分散を確実にする。約５分後、少量を顕微鏡観察のため
に取る。ワックスペンを用いて顕微鏡スライドグラス上
に環を描き、染色溶液中の細胞の小試料を該ワックス環
内に置く。該スライド上にカバーグラスを置き、該試料
を観察する。該ワックス環の使用は、スライドグラスお
よびカバーグラスによるディスコサイトーエキノサイト
形質転換を減少させる。プラスチック製のスライドおよ
びカバーの使用もこの形質転換を抑制する。この方法に
て、強く、かつ、均一な染色が生じることを確実にしな
がら該染色方法の間該赤血球構造を維持することが保証
されうる。細胞は、５分後に均一に染色され、１０分以
上の暴露時間は必要としない。

該細胞が均一に染色されていることを分析した後、等容
積のリン酸塩緩衝生理食塩水を該染色懸濁液に加える。

細胞を室温にて１０分間４００×９にて遠心分離し、上
清を除去する。通常、遠心分離後肢上清中に目に見える
遊離染料の痕跡が存在するので、該上清が分光蛍光計に
より測定した時遊離染料を有しなくなるまでカルシウム
およびマグネシウム含有リン酸緩衝生理食塩水を用いた
洗浄方法を繰り返さなければならない。

この時点で細胞を、実験用の適当な溶液または受容動物
中に再注入するための血小板欠乏血漿中のいずれかに懸
濁する。再注入のための一般的方法は、収集した全面の
最初の遠心分離から回収し、かつ、４０００　×９にて
遠心分離して血小板を除去した血漿の体積中に該染色赤
血球を再懸濁するものである。全ての操作は、滅菌方法
を用いて行なわれる。

実施例３ 血小板の染色 ■、細胞の調製 クエン酸ナトリウムを含有するバキュテーナーまたはシ
リンジの全容量の！／ＩＯに等しい虫の調製クエン酸ナ
トリウム抗凝血剤を含有するシリンジを用いて全血を収
集する。該細胞を室温にて１０分間ｆ００Ｘｙにて遠心
分離して血小板の豊富な血漿を得る。活性化を抑制する
ため血小板を含有する全操作についてプラスチック製ピ
ペットおよびポリプロピレン遠沈管を用いる。

血小板の豊富な血漿を吸引し、他の遠沈管に移す。つい
で、該血小板を２０℃にて１０分間１０００×９にて遠
心分離することにより血漿を用いてペレットにする。つ
いで、血漿を収集し、機能性試験または再注入用懸濁培
地としての使用のいずれかのために保存する。この血漿
を１０分間４０００　Ｘ９にて遠心分離し、再懸濁培地
として用いる前にいずれの残留血小板の除去を確実にし
、血小板欠乏血漿（ＰＰＰ）と称する。

ｔ　ｏ　ｏ　ｏ　×ｇの遠心分離から得られた血小板ベ
レットを少量のクエン酸塩抗凝血剤中に穏やかに懸濁し
て濃厚均一懸濁液を得る。これを実施した後、等浸透圧
性グルコースを希釈剤として最初から存在する血漿に等
容量にて加える。ついで、該血小板を５分間３００　Ｘ
９にて遠心分離し、上清を吸引する。このグルコース洗
浄は、残留血漿タンパクを除去し、均一、かつ、より強
い染色を可能にする。該血小板ベレットをグルコース溶
液中に再懸濁し、染色の準備をする。

血小板濃度を４Ｘ１０’細胞／１１Ｑに調整し、血小板
懸濁液１ｚ（ｌ当たり１５μ（Ｊ貯蔵ＤｉＯＣ＋＋（３
）（無水エタノール中２ｍＭ）を加える。該懸濁液を直
ちに、しかし、穏やか、かつ十分に混合して該染料の均
一分散を確実にする。蛍光顕微鏡を用いて血小板を観察
して均一染色が生じていることを確実にし、そうである
場合、懸濁液中の遊離染料からの分離の準備ができる。

■、標識血小板の分離のためのセファデックスＧ−１０
０カラムの使用 セファロース２Ｂは、血小板の豊富な血漿からの血小板
の単離に従来から用いられている。本発明者らは、セフ
ァデックスＧ−１００が、また、血小板の単離に十分使
用できることを見出した。

この手法は、以下の方法にて染色技術および作業に適用
される。該血小板−染料懸濁液を該カラム上に付す。小
分子量染料分子は該粒子内にトラップされるが、大きな
血小板は、該カラムを素通りする。この方法にて、セフ
ァデックスＧ−１００を用いて蛍光的に標識した血小板
を懸濁液中の遊離染料から分離できる。

Ａ、カラムの調製 セファデックスＧ−１００（ファルマシア・ラボラトリ
ーズ、ピスカタウエイ、ニュージャージ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｐｉｓｃａｔａ
ｗａｙ、ＮｅｖＪ　ｅｒｓｅｙ））を製造者の指示に従
って水和し、アセトン（１００％）中で洗浄し、血小板
用分離培地として用いる準備をする。該洗浄操作は、該
セファデックスを室温にて１０分間３００Ｘ９にて遠心
分離し、該上清を除去し、ハンクス液中に再懸濁するこ
とにより行う。アセトン臭がもはや検出できなくなるま
で該セファデックスを繰り返しハンクス液にて洗浄する
。得られた溶液を沸騰水浴中に入れるか減圧下ＮＩＱ気
する。

ついで、セファデックススラリーを用い、カラムを注ぐ
。プランジャーを除去した１０ｃｃシリンジをカラム支
持体として用いる。シリコーンチューブを該シリンジの
受口に取付け、小型の調節可能なチューブクランプを用
いてカラムを通過する流体流量を調節する。４７μナイ
ロンメツシユを支持体として該シリンジの底にて用い、
セファデックスビーズを保持する。フリット化グラスフ
ィルター支持体を有する従来のガラスカラムは、これら
が血小板を活性化するのに役立つため避けるべきである
。該カラムをハンクス液で満たし、少量のセファデック
ススラリーを該カラムに加える。

該クランプを、緩慢であるが一定の流量を可能にするの
に十分開放する。この方法は、セファデックスを平滑か
つ均一に充填し、溝または泡からの空隙を防止する。所
望の大きさの充填カラムを得るまでＨＢＳＳおよびセフ
ァデックススラリーの添加操作を繰り返す。該カラムは
、使用する前にＨＢＳＳ（２気孔率）にて完全にフラッ
シュすべきである。

Ｂ、血小板の分離 血小板染料および懸濁液を該セファデックス上に注意深
く加層する。該カラムの底部のクランプを開け、カラム
中の液面が、該セファデックス流体の上端に達するまで
低下させる。流動を再開して該懸濁液を該セファデック
スに浸透させる。液面がセファデックスの上端に達した
時流動を再び減じる。セファデックスを乱すことなく追
加のＩ（ＢＳＳを容易に加えることができるように十分
なＨＢ　Ｓ　Ｓを注意深く該カラムの上端に加えて緩衝
部を形成する。再度、該カラムの流動を再開する。

この方法を用いて該血小板懸濁液を該ゲル中にて隙間の
ないバンドにし、カラムの長さの間十分均−な速度にて
移動させる。

この方法にてかなり濃厚な血小板溶離液が得られる。該
カラムを継続的に流し、０．５〜１．０酎の画分を収集
する。該血小板含有画分は、その不透明性により認識で
き、合して貯蔵してよい。ついで、該貯蔵画分を３００
Ｘ９にて１０分間遠心分離する。該上清を吸引し、該ベ
レットを実験もしくは分析のため適当な媒質中に再懸澗
し、または、血小板欠乏血漿を機能性分析もしくは再注
入のために用いる。

特許出願人　スミスクライン・ベックマン・コーポレイ
ション

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞生育力に顕著な影響を与えず、かつ、再現可
   能な細胞標識を提供する浸透圧調節剤を含有する培地中
   にて生育可能細胞をシアニン染料と接触させることを特
   徴とするシアニン染料を用いた生育可能細胞の標識方法
   。
2. （２）該浸透圧調節剤が糖、糖−アルコール、アミノ酸
   もしくはグッド緩衝剤またはそれらの組合せである前記
   第（１）項の方法。
3. （３）該培地が等浸透圧性である前記第（２）項の方法
   。
4. （４）該細胞が赤血球である前記第（３）項の方法。
5. （５）該細胞が白血球である前記第（３）項の方法。
6. （６）該細胞が血小板である前記第（３）項の方法。
7. （７）該浸透圧調節剤が糖である前記第（３）項の方法
   。
8. （８）該糖がグルコースである前記第（７）項の方法。
9. （９）該浸透圧調節剤が糖−アルコールである前記第（
   ３）項の方法。
10. （１０）該糖−アルコールがマンニトールである前記第
    （９）項の方法。
11. （１１）該浸透圧調節剤がアミノ酸である前記第（３）
    項の方法。
12. （１２）該アミノ酸がグリシンである前記第（１１）項
    の方法。
13. （１３）該浸透圧調節剤がグッド緩衝剤である前記第（
    ３）項の方法。
14. （１４）該グッド緩衝剤がＨＥＰＰＳＯである前記第（
    １３）項の方法。
15. （１５）該グッド緩衝剤がＥＰＰＳである前記第（１３
    ）項の方法。
16. （１６）該グッド緩衝剤がＴＡＰＳである前記第（１３
    ）項の方法。
17. （１７）該グッド緩衝剤がＣＡＰＳである前記第（１３
    ）項の方法。
18. （１８）該グッド緩衝剤がＤＩＰＳＯである前記第（１
    ３）項の方法。
19. （１９）該シアニン染料がＤｉＳＣ＿１＿４（５）であ
    る前記第（３）項の方法。
20. （２０）該シアニン染料がＤｉＯＣ＿１＿４（３）であ
    る前記第（３）項の方法。
21. （２１）細胞生育力に顕著な影響を及ぼさない浸透圧調
    節剤に溶解したシアニン染料からなることを特徴とする
    組成物。
22. （２２）該浸透圧調節剤が糖、糖−アルコール、アミノ
    酸もしくはグッド緩衝剤またはその組合せである前記第
    （２１）項の組成物。
23. （２３）該糖がグルコースである前記第（２２）項の組
    成物。
24. （２４）該糖−アルコールがマンニトールである前記第
    （２３）項の組成物。
25. （２５）該アミノ酸がグリシンである前記第（２３）項
    の組成物。
26. （２６）該グッド緩衝剤がＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔ
    ＡＰＳ、ＣＡＰＳまたはＤＩＰＳＯである前記第（２２
    ）項の組成物。
27. （２７）該シアニン染料がＤｉＳＣ＿１＿４（５）また
    はＤｉＯＣ＿１＿４（３）である前記第（２２）項の組
    成物。
28. （２８）該細胞が組織培養細胞である前記第（３）項の
    方法。