JPS63122954A - 生育可能細胞の標識 - Google Patents
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
く生育可能(viable)細胞を標識する新規な方法
に関する。
手段として免疫学および細胞生物学全般において用いら
れている。蛍光測定の利点は、1つの染料分子が、多く
の光量子として放射しながら1秒間当たり何千回も励起
し、かつ、基底状態に復帰しうるということにある。す
なわち、1つの抗体分子が2または3個の染料分子で標
識された場合、1つの抗原−抗体部位から数千の光量子
を得ることができる。これは、非常な信号増幅方法であ
る。
うために用いられている[ギエンター・パレット、マッ
クス・ブランク・ゲス・ヴイッシェンシュ(Gunte
r Valet、 Max Planck Ge5
W 1ssensch) ;特許照会番号第84−10
2307/17号、選択的染色および容積測定および蛍
光による血液の同時定量分析(S imultaneo
ugQuantitative Determina
tion of BloodCells by 5
elective Staining and Mea
suringVolume and Fluore
scence)J。しかしながら1これらの研究に用い
られた染料は、短鎖カルボシアニン染料(10以下)で
あり、かつ、膜電位の変化に応答する。さらに、該短鎖
カルボシアニン染料は、細胞ミトコンドリアに侵入し、
細胞毒であり、かつ、該細胞を洗浄した場合、該染料は
、該細胞の膜電位が変化しようとしまいと該細胞から容
易に流出する。本発明の長鎖染料は、細胞膜に閉じ込め
られ、かつ、膜電位により非常に僅かしか影響されない
。そ゛れらは細胞から流出しない。
、シアニンタイプの染料ではなく、かつ、脂質中に分配
しない。ピリリウムまたはチアピリリウム化合物が、白
血球の種類を識別するために用いられている[デビット
・ニス・フランク、アール・ティー・ベリー(Davi
d S、 Frank、 R。
5/27号、ピリリウムまたはチアピリリウム化合物を
用いた染色による生物試料中の細胞識別(Distin
guishing Ca1ls in Biol
ogicalSamples by Staini
ng with PyryliumorThiap
yrylium Compounds)J。しかしな
がら、これらの染料は、該細胞の細胞質または核成分に
結合する。すなわち、それらは、細胞膜に特異的に結合
しない。他のカチオン染料「エル・カス、(L、Kas
s)、特許照会番号第81−78187/43号、メタ
クロマチンカチオン染料を用いた染色による異なる白面
球種の分析(D eterminat 1onof
Different Leucocyte Cat
egories byStaining with
Meta: Chromatic Cationic
D yes)、エル・カス(L、 KasS)、米国特
許第4400370号、白血球の示差定量のためのメタ
クロマチン染料収着法(MetachromaLic
D yeSorption Means for
DifferentialDeterminati
on or Leukocytes)、エル中カス
(L、 Kass)、特許照会番号第83−77198
2/39号、特異的塩基性染料を用いた染色非固定細胞
によるヒト血液細胞の分析(A nalys is o
rHuman Blood Ce1ls by St
aining UnfixedCells with
5pecified Ba5ic Dyes)
Jが、白血球識別を行うために用いられている。しかし
、これらの染料は、膜脂質中に特異的に分配しないが、
該細胞内の種々のオルガネラを染色する。白血球を識別
するために用いられる他の異染性染料は、アクリジンオ
レンジである「ピー・ジェイ・ナタレ(P、 J、 N
atale)、米国特許第4336029号、全血中の
網状赤血球および血小板の定量分析法および試薬(Me
thod and ReagentsFor Q
uantitative Determinatio
n ofReticulocytes and
Platelets in WholeB Ioo
d)、アール・ジェイ・ガーシュマン(R,J。
全血中の血小板および網状赤血球の自動検出(Auto
mated Detection of P !
ateleLs andReticulocytes
in Whole B food)J。アクリジ
ンオレンジ染料は、細胞のRNAおよびDNAを染色す
るが、膜脂質中に顕著に分配しない。
ロシアニン540を使用している。この染料は、15炭
素迄の長い炭化水素末端を有している。しかし、この分
子は、該炭化水素末端の端に親水性基を有しており、か
つ、該細胞が露光した場合、細胞毒になる「バリンスキ
ー、ジエイ・イー、ライヒ、イーおよびイーストン、テ
ィー・ジー(Valinsky、 J、 E14 Re
1ch、 E、 andEaston、 T、 G、
)、米国特許第4424201号、悪性白血球細胞の検
出のためのメロシアニン染料の使用(Employme
nt of a MerocyanineDye
for the Detection or
MalignantL eukocut ic C
el 1s)J。メロシアニンは、正常および悪性細胞
の膜に特異的に取り込まれる。
用いられている。しかしながら、これらの脂肪族短鎖分
子は、膜電位に応答し、かつ、該細胞膜を横断して該細
胞のミトコンドリア中に浸透する[エッチ・エム・シャ
ピロ(H,M、 5hapiro)、米国特許第434
3782号」。該短鎖シアニン染料は、また、該細胞に
対して毒性であり、かつ、それらは、迅速に細胞から流
出するので細胞を探知するために用いることができない
。
、プロシーディンゲス・イブ・マヨ・り。
、 Proc、 May。
およびエバンズーブルー染料「シアツド、エッチら、プ
フレガーズ・アルカイブ−ヨーロピアン・ジャーナル・
イブ・フィジオロジー(P r Iuegers 。
370(2)、 139〜144(1977)Jが
in vivoにて希釈法により心臓出力を測定するた
めに用いられている。
ot、 P、 、 Physiol、 Rev、 )、
36 、77〜102(1956)Jは、既知量のあ
る種の血管的指示薬を肺の静脈側に注入し、該指示薬の
動脈濃度を経時的に測定して注入時およびサンプリング
時の間の容積を測定するような方法を記載している。こ
れらの染料は、細胞を染色するために用いられない。
、細胞融合をモニターするために用いられている「ワン
ダ、ピー・イーおよびスミス、ジエイ・ディー、ジャー
ナル・イブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミ
ストリー(Wanda、 P。
J、 Histochem。
982)」。しかしながら、これらの染料は、1つの脂
肪族炭素鎖しか含有せず、かつ、膜中にて長時間安定で
はない。さらに、ヘテロカリオン形成の検出法は該2染
料分子間の共鳴エネルギー移動であった。さらに、該染
色は、生理食塩水中にて行われ、溶解性の一致は見られ
なかった。
イプの2脂肪族シアニン染料の主な適用を用いている「
ディー・アクセルロッド、バイオフィジカル・ジャーナ
ル(D、 Axelrod、 Bio−physica
l J、 )、 26.557〜574(1979)
」。この種の研究において、該染料は、エタノール原料
からの短期間培養中の細胞に適用される。
により報告された。しかし、生物物理学的測定のために
は、試験するそれぞれの細胞を数回測定するいくつかの
細胞のみを注視することが必要である。また、原形質膜
中に取込まれる長鎖カルボシアニン染料は、培養中のニ
ューロンの独特の同一性を決定するために用いられてい
る[ホニグ、エム・ジーおよびヒユーム、アール・アイ
、ジャーナル・才ブ・セル・バイオロジー(Honig
。
Ce1l Biology)、 103. 171
〜187(1986)J。
となく生育可能細胞を染色する特有の方法を欠いている
。
となく生育可能細胞の正確かつ再現性のある標識を可能
にする新規な方法に関する。本発明によれば、細胞は、
十分な脂質溶解性および高い細胞膜分配係数を有し、細
胞膜からの染料分子の移動を最小限にするか、防止する
シアニン染料にて標識される。正確かつ再現性のある標
識は、細胞生育力に顕著な影響を及ぼすことなく、かつ
、その中に該染料が溶解しうる浸透圧調節剤を含有する
培地中に懸濁した細胞に染料を添加することにより行わ
れる。そのような浸透圧調節剤は、糖、糖−アルコール
、アミノ酸およびある種の水素イオン緩衝剤(グツド緩
衝剤)を包含する。
細胞を標識する本発明方法においては、シアニン染料が
用いられる。
メチレン;mは0〜3;およびnは12〜22を意味す
る] を本明細書においてシアニン染料と称する。
レンは、メチル、エチルまたはプロピル置換基のいずれ
かの組合せを有するモノ−またはジー置換メチレンを意
味する。
ストリー(Sins、 P、J、et al14 Bi
oche+++。
が硫黄であり、鎖環を架橋する3個の炭素および14個
の炭素の脂肪族鎖を2つ有する化合物をDiSC,4(
3)と称する。同様に、D ir C+4(5)は、Y
がイソプロピルであり、鎖環を架橋する5個の炭素およ
び14個の炭素の脂肪族鎖を2つ有する化合物を示す。
そのような置換化合物が、少なくとも標識に必要な間細
胞標識培地に溶解し、かつ、十分に高い細胞膜分配係数
を有し、依然として標識細胞膜に結合している場合に、
本明細書にてシアニン染料と称する化合物に包含される
。そのような化合物は、また、標識に必要な濃度にて細
胞生育力に顕著な影響を及ぼしてはならない。細胞標識
培地中の溶解度は、該標識培地中にシアニン染料を分散
し、かつ、標準分光蛍光法により細胞の蛍光強度を期間
中測定することにより以下に示すように決定する。蛍光
強度の減少は、染料の沈澱および容器壁への付着を示し
ている。該染料が依然として細胞膜に結合しているかど
うかは、例えば、公知のフローサイトメトリー法を用い
て、標識後供血動物中に再注入した赤血球の蛍光強度を
モニターして決定する。本質的に、再注入後の標識細胞
の一定蛍光強度は、細胞膜中の該染料の安定性を決定す
る。
造の化合物もシアニン染料のような本明細書にて言及し
ている化合物に包含される。そのような化合物は、例え
ば、該脂肪族鎖のメチル基の1つにフッ素原子を取込む
ことにより製造する。
合物も本明細書にてシアニン染料と称す。
ブローブズ・インコーボレーティッド、ニージーン、オ
レゴン(Molecular Probes、 I
nc、。
購入でき、かつ、公知の合成法を用いて入手可能な出発
物質から製造できる「ハマー、エフ・エム、ザ・シアニ
ン・タイプ・アンド・リレーティラド・カンパウンズ、
インターサイエンス・パブリッシャーズ(Hallle
r、 P、 M14 T)+e Cyanine
Dyesand Re1ated Compoun
ds、 I nterscienceP ubl
1shersX 1964 )J。
ン染料にて標識できる。本明細書にて用いられているよ
うに、「細胞」なる語は、バクテリアのような原核細胞
、白血球のような有核真核生物細胞、種々の腫瘍細胞、
哺乳動物の培養細胞、例えば、チャイニーズハムスター
卵巣細胞、酵母、赤血球および血小板のような無核細胞
を包含する。
ように本質的に増殖または機能しうる場合に生育可能で
あり、無核細胞は、それが、例えば、生育可能な赤血球
が酸素および二酸化炭素を運搬できるようなその予期さ
れる機能を発揮しうる場合に生育可能であり、生育可能
な血小板は、例えば、凝集および解離検定において予期
されるように本質的に機能する。
能な細胞標識を供給する培地中にて行なわれる。必要な
特性を該培地に付与するため、シアニン染料が、少なく
とも標識に要する間安定な溶液を形成する浸透圧調節剤
を用いる。許容可能な浸透圧調節剤は、糖、例えば、グ
ルコース、フルクトース、ソルボース、キシロース、リ
ボースのような単糖類およびシュークロースのような三
糖類、マンニトール、グリセロール、イノシトール、キ
シリトールおよびアドニトールのような糖−アルコール
、グリシンおよびアルギニンのようなアミノ酸、N−ト
リス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパン
スルホン酸のようなある種のグツド緩衝剤ならびに以下
の第2表に挙げたもののような薬剤またはその組合せを
包含する「グツド、エヌ・イーら、バイオケミストリー
(G ood 。
rr、 )、 I 5. 467〜477(1966
)、 グツド、エヌ・イーおよびニス・イザワ、メソッ
ズ・イブ・エンザイモロジー(Good、 N、E、a
nd S、 r zawa、 MethodsEnzy
mol、 )、 24 、バートI3,53(196
8)、フェグソン、ダブリュー・ジェイら、アナリティ
カル・バイオケミストリー(Feguson、 W、
J、。
)、 f Q 4 、 301〜310(1980
)J。しかしながら、いくつかの細胞系は、lまたはそ
れ以上の浸透圧調節剤、特に、糖−アルコールに対して
感受性である。したがって、標識前に標準試験を行って
、該細胞が予定した浸透圧調節剤中にて生育可能である
ということを確かめる。さらに、少量の緩衝剤を該標識
培地に加えて水素イオン濃度を調節する。
影響は、該細胞を種々の浸透圧調節剤に30分間暴露し
た後のYac細胞の倍加時間を測定することにより決定
した。Yac細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションから公に入手できるマウスリンパ腫組織
培養細胞系であり、キースリング、アール、ヨーロピア
ン・ジャーナル・イブ・イムノロジー(Kiessli
ng、 R,。
、 5. 112〜117(1975)により記載さ
れている。第1表に示したデータが示すように、リン酸
塩緩衝生理食塩水と比較した場合、シュークロース、グ
ルコースおよびグツド緩衝剤、TAPS CAPS、
EPPSSHEPPSOおよびDIPSOに対する暴露
は、細胞倍加時間に対して無視できる影響しか生じず、
暴露に関係した細胞毒性が存在しないことを示している
。
酸緩衝生理食塩水 31.0シユーク
ロース 41.0グルコース
34,5TAPS
32.7CA P
S 45.8E
P P S 3
2.2HEPPSO23,4 D I P S O36,7 3−アミノ−1−プロパンスルホン酸 99.
6a−cN−モノホリノ)プロパンスルホン酸 A
ナトリウム(MOPS) 2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパン
Bジオール 第1表(続き) 浸透圧調整剤 倍加時間(時間)2−
アミノ−2−メチル−1−プロパツール BN−
)リス(ヒドロキシメチル)メチル Bアミノエ
タンスルホン酸(TBS) N、N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−Aアミノ
エタンスルホン酸(BES) 3−(シクロへキシルアミノ)−2−ヒドロ Aキ
シ−1−プロパンスルホン酸(CAPSO)トリエタノ
ールアミン Bトリス(ヒドロキ
シメチル)アミノ Bメタ:/(TRIZMA
) ビス−トリスプロパン B2−(N
−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES) B3−
[ジメチル(ヒドロキシメチル) Aメチルア
ミノコ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(AMPS
O) N、 N−ビス(2−ヒドロキシエチル)
57.7グリシン(BICIME) 第1表(続き) 浸透圧調整剤 倍加時間(時間)3−
[(3−コラミドプロピル)ジメチル Bアンモ
ニオ]−1−プロパンスルホネート(CHAPS)3−
[N−トリス(ヒドロキシメチル) 63.
6メチルアミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸
(TAPSO) 3−(N−モルホリノ)−2−ヒドロキシ 1
78.4プロパンスルホン酸(MOPSO) 2−[2−アミノ−2−オキソエチル)アミノコ 1
038.4エタンスルホン酸(ACES) ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノ−トリ Aスー
(ヒドロキシメチル)メタン(BIS−TRIS)2−
(N−シクロへキシルアミノ)エタン 51.5
スルホン酸(CIIES) N−トリス−(ヒドロキシメチル)メチル Aグリ
シン(TRICINE) グルコサミン 288.4
イミダゾール Bグリシルグ
リシン 66.9A−非増殖また
は部分的細胞毒 B−急性細胞毒 第2表は、シアニン染料溶解性について調べた種々の浸
透圧調節剤を示している。濃度の測定は、全て、遠心分
離により沈澱を除去し、かつ、分光蛍光分析のためにシ
アニン染料を含有する浸透圧調節剤の少量をエタノール
中に溶解した後に行った。用いた染料はDiSC14(
5)およびD i OC+ 4(3)であり、かつ、該
浸透圧調節剤は等浸透圧濃度であった。エタノール溶液
標準からの蛍光濃度の減少は、シアニン染料溶解度の減
少と直接相関している。
OC,4(3)エタノール 100
100グルコース 31
100フルクトース 35 1
00ソルボース 40 100シ
ユークロース 41 100第2表
(続き) 相対蛍光強度(CDNC) ゛送圧7簡I DiSCl−(5) D
iOC3−(3)キシロース 36
19−52リボース 24
100リキソース 0.12
1.8グリシン 3193 アルギニン 17 17.2グ
リセロール 39 99.5イノシ
トール 4292 キシリトール 34 76.4
マンニトール 29* アドニトール 34 NDトリス
(ヒドロキシメチル) 18 NDチルア
ミノプロパンスルホン 酸(TAPS) 3−(シクロへキシルアミノ)4OND−1−プロパン
スルホン酸(CAPS)N−(2−ヒドロキシエチル)
18NDピペラジン−N′〜3−プロパン スルホン酸(NPPS) 第2表(続き) 相対蛍光強度(CDNC) 送圧調節剤 DiSC,4(5) DiO
C,4(3)N−2−ヒドロキシエチル 20
NDピペラジン−N′−2−ヒドロキシ プロパンスルホン酸(HEPPSO) 3−[N、N−ビス(2−ヒドロキシ 43***
NDエチル)アミノコ−2−ヒドロキシ プロパンスルホン酸(DIPSO) NACl 6 1.7
リン酸塩緩衝生理食塩水 2.1 6.5N
a、S 0. 7.4 1.6
Nal 1.1 0.
14塩化コリン ll** 6゜
3ヨウ化コリン 0.16 2.
3*:エタノール中にて沈澱し、データ得られず。
:エタノール中にて沈澱(データ疑問あり)ND:測定
せず。
スを除く糖、糖−アルコール、アミノ酸およびグツド緩
衝剤、TAPSlHEPPSOlDIPSOlCAPS
およびEPPSの存在下より古典的塩の存在下にてずっ
と溶解しにくい。さらに、グルコース、フルクトース、
リボース、ソルボース、シュークロースおよびキシロー
スのような糖、グリセロール、イノシトール、キシリト
ールおよびアドニトールのような糖−アルコールならび
にグリシンおよびアルギニンのようなアミノ酸中のD
iS C14(5)溶液の安定性を測定した。
である少なくとも20分間試験溶液中で安定であり、か
つ、多くの該薬剤において、溶液中のシアニン染料の量
は、60分では著しい減少を示さなかった。
浸透圧調節剤を含有する培地中のシアニン染料の溶解度
を調べた。等浸透圧性グルコース溶液中のDiSC,4
(5)の溶解度は、蒸留水での等浸透圧性グルコース溶
液中のDiSCl4(5)の溶解度は、約20%等浸透
圧性塩化ナトリウム溶液のみにて希釈することにより顕
著に減少した。
、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢
酸ナトリウム、酢酸カリウム、硫酸ナトリウム、ヨウ化
ナトリウム、塩化コリンまたはヨウ化コリンのような古
典的塩の極く少量を含有する培地中にて行うことができ
、好ましくは、古典的塩を用いずに浸透圧を調節した培
地中にて行う。
て細胞生育力に対する標識の影響を測定した。アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロヅクビル、
メリーランド(theAmerican Type
Cu1ture Co11ection、。
き、かつ、ブレスコツト、ディー・エム、アナルズ・イ
ブ・ニューヨーク・アカデミ−・イブ・サイエンシーズ
(Sci、)、397.101〜109(1982)に
記載されているV79細胞を、10−5または4×10
−5Mの濃度にてDiOC14(3)を含有する溶液を
用いて標識し、該染色細胞の増殖動力学を、染色細胞な
らびに染色および非染色細胞の等m混合物と比較した。
った。すなわち、標識は、細胞増殖に影響しなかった。
のようないくつかの池の細胞生育力の標準試験は、前記
方法によるシアニン染料標識の細胞生育力に対する影響
の欠如を確認した。
赤血球脆性を測定することにより分析した。標識および
非標識赤血球を、塩濃度を変えることにより浸透圧強度
を変えた塩化ナトリウム培地中に懸濁した。該細胞の容
積分布は、チャネライザ−アタッチメントを有するコー
ルタ−・カウンター0を用いて測定した。平均容積を測
定し、それぞれの塩濃度に対してプロットした。容積は
、該容積が急激な低下を示す約0.59/ 100xQ
まで塩化ナトリウム濃度が減少するにつれて増加した。
積変化は、該細胞がシアニン染料にて標識されると否と
にかかわらず同じであった。
て溶血をモニターした。赤血球を約2〜3分間塩化ナト
リウム中に置いた後、該溶液を遠心分離していずれもの
未溶解細胞をベレットにした。ついで上清溶液を分光蛍
光分析に付してヘモグロビン濃度を測定した。全溶血対
照に対するそれぞれの試料のヘモグロビン濃度を比較す
ることにより溶血百分率を測定する。1QOif2当た
り塩化ナトリウム約0.59に達するまで遊離ヘモグロ
ビン濃度は相対的に低く、ついで、ヘモグロビンが直ち
に放出される。赤血球脆性結果と比較すると、容積変化
は、ヘモグロビン放出と直接相関していた。さらに、ヘ
モグロビン放出は、標識および非標識細胞において同じ
であった。
vivo安定性を試験するため、ウサギ赤血球を採取し
、DiSCI4(5)にて標識し、再注入した。その後
定期的に血液試料を採取し、標識細胞百分率および該標
識細胞の蛍光強度を分析した。
測定した標識細胞の52日の寿命は、ウサギ赤血球につ
いて報告されている40〜60日の平均寿命と密接に相
関していた。すなわち、シアニン染料標識は、赤血球の
クリアランス率に影響を及ぼさなかった。
染色細胞の蛍光強度は、標識および再注入後60日の間
実質的に未変化であった。5番目の動物においては、該
シアニン染料の20%以下が、ウサギの循環において6
0日後に該標識細胞から移動した。これらのデータは、
標識細胞から非標識細胞への染料の移動がないことを示
す組織培養からのデータと合わせて、該細胞が該染料に
て安定に標識されるということを示している。
胞は、細胞の母集団の多数の部分母集団を識別する能力
を必要とする多くの応用に用いられる。例えば、赤血球
輸血後、ヘマトクリットの減少が出血または該輸血細胞
に対する免疫反応に起因するかどうかを決定するために
、輸血前に該細胞の一部を本発明により標識し、かつ、
輸血後直ちに循環中の標識赤面味の両分の測定を行う。
の両分を輸血直後のそれと比較し、標識および非標識細
胞についての減少の相対速度の評価を行う。標識および
非標識細胞における同等の減少は、出血に起因する血液
減少を示し、一方、標識細胞のより大きな減少は、輸血
細胞に対する免疫反応を示している。同様の方法論を用
いれば、血小板輸血後の出血に起因する血小板数の減少
を、該輸血血小板に対する免疫反応から識別できる。
するために用いられる。標識培養細胞が分割する度に、
該シアニン染料を娘細胞間に等しく分布させる。その結
果、フローサイトメトリー法を用いである増殖期後の該
細胞の蛍光強度と標識直後の蛍光強度を比較して細胞分
裂の数、すなわち増殖率を測定できる。
、これらに限定されるものではない。
沈管に入れる。
びマグネシウム不含リン酸塩緩衝生理食塩水溶液にて付
着細胞を洗浄して、該フラスコから血清タンパクを除去
しなければならない。トリプシン−EDTA溶液(ギブ
コ・ラボラトリーズ、グランド・アイランド、ニューヨ
ーク(Gibc。
nd、 New York)#61O〜5300)を
加えて該フラスコの底をおおい、該細胞単層が移動し、
かつ、分離するまで室温にてインキュベートする。得ら
れた細胞懸濁液をポリプロピレン遠沈管に移し、lO%
胎児ウシ血清(FBS)(ハラエルトンHazelto
n))を含有する等容量の培地を加えてトリプシンの酵
素作用を抑制する。細胞を室温にて10分間400×9
にて遠心分離する。上清を吸収し、等容量の等浸透圧性
マンニトールを該細胞ベレットの再懸濁のために取り替
える。このマンニトール洗浄は、血漿タンパクを該細胞
懸濁液から除去し、かつ、染色用細胞を調製するためで
ある。再度、細胞を室温にて10分間400X9にて遠
心分離する。
IO”’細胞/zQの濃度にてマンニトール溶液中で再
懸濁する。しかし、いくつかの細胞系は、糖−アルコー
ル(マンニトール)の使用に対して感受性であり、その
ような場合、等浸透圧性グルコース溶液(MW180.
+6.54.059/Q)を用いることができる。
ル中にて調製する。
600巧/屑Q)D iS −C、−(5)
MW814(1,628仄g/酎)D io −01g
(3) MW936(1,872119/酎)D
i r −0,4(5) MW850(1,
700o/d)全ての染料は、モレキュラー中プローブ
ス、ニージーン、オレゴン(Molecular Pr
obes、 Eugene。
、かつ管に対する付着を最小限にする。
試料の溶解性を観察できる。しかし、水性雰囲気下にお
けるシアニン染料は、ポリスチレンと比較した場合ポリ
プロピレンに対する付着がずっと少ないためポリプロピ
レン管を用いて細胞を染色する。
濃度に調整する。細胞を染色するために、2XIO−’
M貯蔵染料溶液を細胞懸濁液IJ!ρ当たり染料5μρ
にて該染色溶液に加える。染色する試料をピペットで分
注するか、または撹拌して該試料を十分に混合する。細
胞と該染料を10分間インキュベートし、その後蛍光顕
微鏡下での試験用に少量を取って強く、かつ、均一な染
色が生じていることを確実にする。DiO染料系列は、
488nm励起光に対して選択的な顕微鏡フィルターを
用い、一方、DiSおよびDi!染料系列は、蛍光観察
のために575nm付近にて励起を必要とする。
食塩水(PBS)を該染色細胞懸濁液に加える。該細胞
を20℃にて10分間400X9にて遠心分離する。該
上清を吸引し、ベレットをPBS中で再懸濁する。該遠
心分離操作を繰り返し、染料の存在について得られた上
清を観察する。染料が上清中に見られる場合、分光蛍光
計により測定した時に該上清が遊離染料を有しなくなる
まで洗浄を繰り返す。最終洗浄後、上清を除去し、ベレ
ットを適当な培地中にて所望の濃度に再懸濁する。全て
の操作は、滅菌条件下にて行なう。
0.2069NaHtP0
4 0.1409グルコース
1.619前記成分を蒸留水63x
Qに溶解し、該溶液をpH5、6に調整する。最終溶液
を滅菌のため0.22ミクロンフィルターに通す。
し、要すれば、320mOs+*に調整する。
1 、628 z9/zQを無水エタノール中に溶解す
ることにより調製する。該染料を完全に溶解するために
は音波処理を必要とする。
リンジの全容量の1/10に等しい量の調製クエン酸塩
抗凝血剤を含有するシリンジを用いて全血を無菌的に収
集する。フローサイトメトリーまたは機能性試験のため
に少量を保存しておく。該血液を室温にて10分間11
00Xにて遠心分離して赤血球をペレットにする。血小
板含有血漿を除去し、保存し、充填赤血球ペレットの容
積の5倍に等しい量の等浸透圧性グルコースを加えるこ
とにより該赤血球を洗浄する。該細胞を再度室温にて1
0分間1ooxvにて遠心分離し、上清を吸引する。血
漿タンパクを除去し、かつ、より強く、かつ、均一な染
色を可能とするこの洗浄を再度繰り返す。最終遠心分離
および上清の吸引後、該赤血球を等浸透圧性グルコース
中4XIQal胞/*Qの濃度に再懸濁する。
撹拌して沈降が生じないことを確実にする。
aM)を、それぞれ1xQの赤血球懸濁液に加える。該
試料を直ちに混合して溶液中の迅速かつ均一な該染料の
分散を確実にする。約5分後、少量を顕微鏡観察のため
に取る。ワックスペンを用いて顕微鏡スライドグラス上
に環を描き、染色溶液中の細胞の小試料を該ワックス環
内に置く。該スライド上にカバーグラスを置き、該試料
を観察する。該ワックス環の使用は、スライドグラスお
よびカバーグラスによるディスコサイトーエキノサイト
形質転換を減少させる。プラスチック製のスライドおよ
びカバーの使用もこの形質転換を抑制する。この方法に
て、強く、かつ、均一な染色が生じることを確実にしな
がら該染色方法の間該赤血球構造を維持することが保証
されうる。細胞は、5分後に均一に染色され、10分以
上の暴露時間は必要としない。
積のリン酸塩緩衝生理食塩水を該染色懸濁液に加える。
清を除去する。通常、遠心分離後肢上清中に目に見える
遊離染料の痕跡が存在するので、該上清が分光蛍光計に
より測定した時遊離染料を有しなくなるまでカルシウム
およびマグネシウム含有リン酸緩衝生理食塩水を用いた
洗浄方法を繰り返さなければならない。
中に再注入するための血小板欠乏血漿中のいずれかに懸
濁する。再注入のための一般的方法は、収集した全面の
最初の遠心分離から回収し、かつ、4000 ×9にて
遠心分離して血小板を除去した血漿の体積中に該染色赤
血球を再懸濁するものである。全ての操作は、滅菌方法
を用いて行なわれる。
リンジの全容量の!/IOに等しい虫の調製クエン酸ナ
トリウム抗凝血剤を含有するシリンジを用いて全血を収
集する。該細胞を室温にて10分間f00Xyにて遠心
分離して血小板の豊富な血漿を得る。活性化を抑制する
ため血小板を含有する全操作についてプラスチック製ピ
ペットおよびポリプロピレン遠沈管を用いる。
で、該血小板を20℃にて10分間1000×9にて遠
心分離することにより血漿を用いてペレットにする。つ
いで、血漿を収集し、機能性試験または再注入用懸濁培
地としての使用のいずれかのために保存する。この血漿
を10分間4000 X9にて遠心分離し、再懸濁培地
として用いる前にいずれの残留血小板の除去を確実にし
、血小板欠乏血漿(PPP)と称する。
レットを少量のクエン酸塩抗凝血剤中に穏やかに懸濁し
て濃厚均一懸濁液を得る。これを実施した後、等浸透圧
性グルコースを希釈剤として最初から存在する血漿に等
容量にて加える。ついで、該血小板を5分間300 X
9にて遠心分離し、上清を吸引する。このグルコース洗
浄は、残留血漿タンパクを除去し、均一、かつ、より強
い染色を可能にする。該血小板ベレットをグルコース溶
液中に再懸濁し、染色の準備をする。
懸濁液1z(l当たり15μ(J貯蔵DiOC++(3
)(無水エタノール中2mM)を加える。該懸濁液を直
ちに、しかし、穏やか、かつ十分に混合して該染料の均
一分散を確実にする。蛍光顕微鏡を用いて血小板を観察
して均一染色が生じていることを確実にし、そうである
場合、懸濁液中の遊離染料からの分離の準備ができる。
0カラムの使用 セファロース2Bは、血小板の豊富な血漿からの血小板
の単離に従来から用いられている。本発明者らは、セフ
ァデックスG−100が、また、血小板の単離に十分使
用できることを見出した。
される。該血小板−染料懸濁液を該カラム上に付す。小
分子量染料分子は該粒子内にトラップされるが、大きな
血小板は、該カラムを素通りする。この方法にて、セフ
ァデックスG−100を用いて蛍光的に標識した血小板
を懸濁液中の遊離染料から分離できる。
ーズ、ピスカタウエイ、ニュージャージ(Pharma
cia Laboratories、 Piscata
way、NevJ ersey))を製造者の指示に従
って水和し、アセトン(100%)中で洗浄し、血小板
用分離培地として用いる準備をする。該洗浄操作は、該
セファデックスを室温にて10分間300X9にて遠心
分離し、該上清を除去し、ハンクス液中に再懸濁するこ
とにより行う。アセトン臭がもはや検出できなくなるま
で該セファデックスを繰り返しハンクス液にて洗浄する
。得られた溶液を沸騰水浴中に入れるか減圧下NIQ気
する。
。プランジャーを除去した10ccシリンジをカラム支
持体として用いる。シリコーンチューブを該シリンジの
受口に取付け、小型の調節可能なチューブクランプを用
いてカラムを通過する流体流量を調節する。47μナイ
ロンメツシユを支持体として該シリンジの底にて用い、
セファデックスビーズを保持する。フリット化グラスフ
ィルター支持体を有する従来のガラスカラムは、これら
が血小板を活性化するのに役立つため避けるべきである
。該カラムをハンクス液で満たし、少量のセファデック
ススラリーを該カラムに加える。
に十分開放する。この方法は、セファデックスを平滑か
つ均一に充填し、溝または泡からの空隙を防止する。所
望の大きさの充填カラムを得るまでHBSSおよびセフ
ァデックススラリーの添加操作を繰り返す。該カラムは
、使用する前にHBSS(2気孔率)にて完全にフラッ
シュすべきである。
く加層する。該カラムの底部のクランプを開け、カラム
中の液面が、該セファデックス流体の上端に達するまで
低下させる。流動を再開して該懸濁液を該セファデック
スに浸透させる。液面がセファデックスの上端に達した
時流動を再び減じる。セファデックスを乱すことなく追
加のI(BSSを容易に加えることができるように十分
なHB S Sを注意深く該カラムの上端に加えて緩衝
部を形成する。再度、該カラムの流動を再開する。
ないバンドにし、カラムの長さの間十分均−な速度にて
移動させる。
カラムを継続的に流し、0.5〜1.0酎の画分を収集
する。該血小板含有画分は、その不透明性により認識で
き、合して貯蔵してよい。ついで、該貯蔵画分を300
X9にて10分間遠心分離する。該上清を吸引し、該ベ
レットを実験もしくは分析のため適当な媒質中に再懸澗
し、または、血小板欠乏血漿を機能性分析もしくは再注
入のために用いる。
ション
Claims (28)
- (1)細胞生育力に顕著な影響を与えず、かつ、再現可
能な細胞標識を提供する浸透圧調節剤を含有する培地中
にて生育可能細胞をシアニン染料と接触させることを特
徴とするシアニン染料を用いた生育可能細胞の標識方法
。 - (2)該浸透圧調節剤が糖、糖−アルコール、アミノ酸
もしくはグッド緩衝剤またはそれらの組合せである前記
第(1)項の方法。 - (3)該培地が等浸透圧性である前記第(2)項の方法
。 - (4)該細胞が赤血球である前記第(3)項の方法。
- (5)該細胞が白血球である前記第(3)項の方法。
- (6)該細胞が血小板である前記第(3)項の方法。
- (7)該浸透圧調節剤が糖である前記第(3)項の方法
。 - (8)該糖がグルコースである前記第(7)項の方法。
- (9)該浸透圧調節剤が糖−アルコールである前記第(
3)項の方法。 - (10)該糖−アルコールがマンニトールである前記第
(9)項の方法。 - (11)該浸透圧調節剤がアミノ酸である前記第(3)
項の方法。 - (12)該アミノ酸がグリシンである前記第(11)項
の方法。 - (13)該浸透圧調節剤がグッド緩衝剤である前記第(
3)項の方法。 - (14)該グッド緩衝剤がHEPPSOである前記第(
13)項の方法。 - (15)該グッド緩衝剤がEPPSである前記第(13
)項の方法。 - (16)該グッド緩衝剤がTAPSである前記第(13
)項の方法。 - (17)該グッド緩衝剤がCAPSである前記第(13
)項の方法。 - (18)該グッド緩衝剤がDIPSOである前記第(1
3)項の方法。 - (19)該シアニン染料がDiSC_1_4(5)であ
る前記第(3)項の方法。 - (20)該シアニン染料がDiOC_1_4(3)であ
る前記第(3)項の方法。 - (21)細胞生育力に顕著な影響を及ぼさない浸透圧調
節剤に溶解したシアニン染料からなることを特徴とする
組成物。 - (22)該浸透圧調節剤が糖、糖−アルコール、アミノ
酸もしくはグッド緩衝剤またはその組合せである前記第
(21)項の組成物。 - (23)該糖がグルコースである前記第(22)項の組
成物。 - (24)該糖−アルコールがマンニトールである前記第
(23)項の組成物。 - (25)該アミノ酸がグリシンである前記第(23)項
の組成物。 - (26)該グッド緩衝剤がHEPPSO、EPPS、T
APS、CAPSまたはDIPSOである前記第(22
)項の組成物。 - (27)該シアニン染料がDiSC_1_4(5)また
はDiOC_1_4(3)である前記第(22)項の組
成物。 - (28)該細胞が組織培養細胞である前記第(3)項の
方法。
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