JPS6076666A - 分析用サイトロジ−における特定の細胞分布の除去法 - Google Patents
分析用サイトロジ−における特定の細胞分布の除去法Info
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- JPS6076666A JPS6076666A JP59149282A JP14928284A JPS6076666A JP S6076666 A JPS6076666 A JP S6076666A JP 59149282 A JP59149282 A JP 59149282A JP 14928284 A JP14928284 A JP 14928284A JP S6076666 A JPS6076666 A JP S6076666A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は試料中の他の粒子類に妨害されることなく、試
料中の粒子類の複数のサブポピユレーションを区別し同
定する方法および装置に関するものである9更に詳しく
は、目的の細胞の定量を妨害する性質を有する他の細胞
からの妨害なしに細胞試料中の目的の細胞の複数のサブ
ポピユレーションを区別し蛍量するための方法及び装置
に関するものである。
料中の粒子類の複数のサブポピユレーションを区別し同
定する方法および装置に関するものである9更に詳しく
は、目的の細胞の定量を妨害する性質を有する他の細胞
からの妨害なしに細胞試料中の目的の細胞の複数のサブ
ポピユレーションを区別し蛍量するための方法及び装置
に関するものである。
粒子や細胞等の検出に有用な、現在知られており入手可
能カフロースルーサイトメーター類は通常、混合物中の
細胞の1種あるいは1種以上(普通は2種)のサブポピ
ユレーションの検出のための2つのチャンネルを有する
。例えば、各々のケイ光チャンネルに対応する2つの免
疫ケイ党則で特異的に標識した細胞を検出しうる2つの
ケイ光チャンネルを有する装置が知られている。これら
の既知の装置では、分析試料中の細胞類の混合物中から
検出するケイ光色素で処理したそれぞれの種類の細胞ご
とに、回路部品およびケイ光検出器を含む完全なケイ光
チャンネルが使用されている。
能カフロースルーサイトメーター類は通常、混合物中の
細胞の1種あるいは1種以上(普通は2種)のサブポピ
ユレーションの検出のための2つのチャンネルを有する
。例えば、各々のケイ光チャンネルに対応する2つの免
疫ケイ党則で特異的に標識した細胞を検出しうる2つの
ケイ光チャンネルを有する装置が知られている。これら
の既知の装置では、分析試料中の細胞類の混合物中から
検出するケイ光色素で処理したそれぞれの種類の細胞ご
とに、回路部品およびケイ光検出器を含む完全なケイ光
チャンネルが使用されている。
従って、試料中の細胞のhaのサフボピュレーシヨンを
フロースルーサイトメトリーを用いて検出するには、同
じ数だけのケイ光チャンネルが使用される。レーサーの
ような光源を別々に用いて標識されたそれぞれ異なる型
のケイ光色素またはケイ光染色剤が励起される。
フロースルーサイトメトリーを用いて検出するには、同
じ数だけのケイ光チャンネルが使用される。レーサーの
ような光源を別々に用いて標識されたそれぞれ異なる型
のケイ光色素またはケイ光染色剤が励起される。
物理的かつ形態的類似性のために、単核白血球(モノザ
イトつと1〜て知られているもう1つの単核白血球はし
ばしはリンパ球類と混同されろうこの混同に1リンパ球
のサブクラスの計測の不明確さの原因となり、調べたい
細胞や粒子についての正確さおよび再現性を多いに減じ
ることに々る。一つの試料中の2つの異なる免疫ケイ光
性染色剤を分析・定量するには、著しく異なった波長に
励起エネルギーな有する2つのレーサーまたは単一の光
源で励起てきるけれども異なった放出特性を有する2つ
のケイ光色素を用いる。2つの免疫ケイ光性染色剤の分
析に2つのレーサーを用いる装置が米国特許第3,82
6,364号および第4,282,412号に記載され
ている。
イトつと1〜て知られているもう1つの単核白血球はし
ばしはリンパ球類と混同されろうこの混同に1リンパ球
のサブクラスの計測の不明確さの原因となり、調べたい
細胞や粒子についての正確さおよび再現性を多いに減じ
ることに々る。一つの試料中の2つの異なる免疫ケイ光
性染色剤を分析・定量するには、著しく異なった波長に
励起エネルギーな有する2つのレーサーまたは単一の光
源で励起てきるけれども異なった放出特性を有する2つ
のケイ光色素を用いる。2つの免疫ケイ光性染色剤の分
析に2つのレーサーを用いる装置が米国特許第3,82
6,364号および第4,282,412号に記載され
ている。
血液学一般の分野において、また特に免疫血液学の分野
において、末梢抑液中を循環する種々の細胞、の数を測
定することが望まれる。細胞のサブクラスの同定を行な
い、サブクラスの計測を行なうことが、最近認識された
アクワイアード・インミューン・デフイシエンシイ・シ
ンi・ローム(AIDS)のような免疫に関連した疫病
の診断において大変興味を持たれている。とシわけ、血
液学の単核型白血球細胞であるリンパ球のサブクラスが
診療上重要性を増している。
において、末梢抑液中を循環する種々の細胞、の数を測
定することが望まれる。細胞のサブクラスの同定を行な
い、サブクラスの計測を行なうことが、最近認識された
アクワイアード・インミューン・デフイシエンシイ・シ
ンi・ローム(AIDS)のような免疫に関連した疫病
の診断において大変興味を持たれている。とシわけ、血
液学の単核型白血球細胞であるリンパ球のサブクラスが
診療上重要性を増している。
試料中の分析すべき細胞の異なった複数のサブポピユレ
ーションを直接測定しうろことが望捷れるが、しかし、
試料が目的の細胞に似た特徴を有する他の細胞を含むと
きには、このような直接の測定は妨害はれる例が多々あ
る。例えば、血液についである種のテストを行なうに蟲
たり、血液試料中のリンパ球細胞の全体のポピユレーシ
ョンを測定・定量し1、リンパ球のポピユレーションの
百分率としてT細胞やB卸j胞のポピユレーションを決
定することが望ましいであろう。しかし々から、リンパ
球細胞は単核細胞でるり、他の単核細胞、特に学核白抑
球、も血液試料中に存在している。
ーションを直接測定しうろことが望捷れるが、しかし、
試料が目的の細胞に似た特徴を有する他の細胞を含むと
きには、このような直接の測定は妨害はれる例が多々あ
る。例えば、血液についである種のテストを行なうに蟲
たり、血液試料中のリンパ球細胞の全体のポピユレーシ
ョンを測定・定量し1、リンパ球のポピユレーションの
百分率としてT細胞やB卸j胞のポピユレーションを決
定することが望ましいであろう。しかし々から、リンパ
球細胞は単核細胞でるり、他の単核細胞、特に学核白抑
球、も血液試料中に存在している。
このような他の単核細胞はT−細胞やB−細胞の直接分
析を妨害する。同様に、T細胞のヘルパー細胞/サプレ
ッザー細胞ザブセットおよびT 、1.111胞のサプ
レッサー細胞/ナチュラルキラー細胞サブセットのよう
なリンパ球の他の異なる型の検出および定量が望まれる
場合もある。単核白血球はこのようなサブセットの分析
をも捷た妨害する。本発明はこれを考慮に人わて、イリ
た特性を有する他の細胞からの妨害なしに試料混合物中
の目的の細胞のサブポピユレーションを直接測定するの
に望丑れる要件を満足しつつ、上述した問題点の解決を
意図したものである。
析を妨害する。同様に、T細胞のヘルパー細胞/サプレ
ッザー細胞ザブセットおよびT 、1.111胞のサプ
レッサー細胞/ナチュラルキラー細胞サブセットのよう
なリンパ球の他の異なる型の検出および定量が望まれる
場合もある。単核白血球はこのようなサブセットの分析
をも捷た妨害する。本発明はこれを考慮に人わて、イリ
た特性を有する他の細胞からの妨害なしに試料混合物中
の目的の細胞のサブポピユレーションを直接測定するの
に望丑れる要件を満足しつつ、上述した問題点の解決を
意図したものである。
リンパ球および単核白血球のそれぞれの数を計6111
することが望ましいであろう。このような各々の数を測
定するこれまでの技術(r、1、群全体としては単核白
血球は一般にリンパ球よシも大きいという事実にたけ注
目してきた。しかし々から、リンパ球と単核白血球の間
の大きさには、かなりの重複があり、このよう々大きさ
の差による方法は成功してい々い。いくつかの疫病にお
いては小さい単核白血球が末梢血液中に豊富に存在して
おり、大きさに基づく考え方は児全に無効である。単核
白血球の同定の別法として、単核白血球に限られる酵素
反応の測定に依るものがある。しかし々から、単核nn
o球の分類および同定のためのこの方法はリンパ球サブ
セットの識別において(げ役立たない。
することが望ましいであろう。このような各々の数を測
定するこれまでの技術(r、1、群全体としては単核白
血球は一般にリンパ球よシも大きいという事実にたけ注
目してきた。しかし々から、リンパ球と単核白血球の間
の大きさには、かなりの重複があり、このよう々大きさ
の差による方法は成功してい々い。いくつかの疫病にお
いては小さい単核白血球が末梢血液中に豊富に存在して
おり、大きさに基づく考え方は児全に無効である。単核
白血球の同定の別法として、単核白血球に限られる酵素
反応の測定に依るものがある。しかし々から、単核nn
o球の分類および同定のためのこの方法はリンパ球サブ
セットの識別において(げ役立たない。
本発明の別の一様態は同定を妨害する他の粒子を含む試
料中の目的の粒子の複数のザブポピユレーションを同定
する装置である。これらの粒子(d、区別でき定量でき
る励起されうる特性を有する異なった標識剤で選択的に
標識される。本装置は流路に実質的に一度に1個の標識
した粒子を流す手段を備えている。との流路を流れる粒
子」二の標識剤を励起する手段も備えている。このよう
な励起の手段は標識された粒子上の2つあるいはそれ以
上の異なった標識剤の特性を励起することができる。励
起した標識剤が示す特性を検知する手段、検知した、定
量できる標識剤の異々る特性にょって粒子のサブポピユ
レーションを区別す乙手段、このよう々検出・標識手段
に基づく分析結果を保存し、保存された分析結果を以前
のあるいは次の分析に連用する手段も備えているり 本発明の原理によりは、数多くの利点および目的が達成
される。主として、本発明は試料中の目的とし々い粒子
あるいは細胞の妨害を受けずに試料中の粒子や細胞の複
数のサブポピユレーションの検出および同定を可能にす
る。す々わち、分析すベキ細胞のザブポピユレーション
を、2つの調製した試料を2つのレーザーフローサイト
メーターを通して流すことにより決定できる。異なる特
性を示すようにケイ光波長には十分々隔りがあるが、励
起されるスペクトル幅が単一の光源で励起されるに十分
に狭いケイ光レベルを選択することにより、2つのレー
サー励起メカニズムに匹敵する2色の免疫ケイ光結果が
得られる。
料中の目的の粒子の複数のザブポピユレーションを同定
する装置である。これらの粒子(d、区別でき定量でき
る励起されうる特性を有する異なった標識剤で選択的に
標識される。本装置は流路に実質的に一度に1個の標識
した粒子を流す手段を備えている。との流路を流れる粒
子」二の標識剤を励起する手段も備えている。このよう
な励起の手段は標識された粒子上の2つあるいはそれ以
上の異なった標識剤の特性を励起することができる。励
起した標識剤が示す特性を検知する手段、検知した、定
量できる標識剤の異々る特性にょって粒子のサブポピユ
レーションを区別す乙手段、このよう々検出・標識手段
に基づく分析結果を保存し、保存された分析結果を以前
のあるいは次の分析に連用する手段も備えているり 本発明の原理によりは、数多くの利点および目的が達成
される。主として、本発明は試料中の目的とし々い粒子
あるいは細胞の妨害を受けずに試料中の粒子や細胞の複
数のサブポピユレーションの検出および同定を可能にす
る。す々わち、分析すベキ細胞のザブポピユレーション
を、2つの調製した試料を2つのレーザーフローサイト
メーターを通して流すことにより決定できる。異なる特
性を示すようにケイ光波長には十分々隔りがあるが、励
起されるスペクトル幅が単一の光源で励起されるに十分
に狭いケイ光レベルを選択することにより、2つのレー
サー励起メカニズムに匹敵する2色の免疫ケイ光結果が
得られる。
第1図は流路を流れる粒子の複数のサブポピユレーショ
ンに関するケイ光および粒子の光散乱パラメーターの測
定に特に有用なフローサイトメトリー装置の光学要素お
よび光の経路の好捷しい実施例の略図である。
ンに関するケイ光および粒子の光散乱パラメーターの測
定に特に有用なフローサイトメトリー装置の光学要素お
よび光の経路の好捷しい実施例の略図である。
第2図は血液試料のグイ光一体積相関により得られた結
果のグラフ図であり、妨害細胞の大きさが重複する事実
を示している。
果のグラフ図であり、妨害細胞の大きさが重複する事実
を示している。
第3図は本発明による第1の分析のり27図であり、第
4図−第6図は本発明の原理によってフローサイトメー
ターを通過させ測定した、試料中のリンパ球の3つのサ
ブポピユレーションの検出および定量のグラフ図である
。
4図−第6図は本発明の原理によってフローサイトメー
ターを通過させ測定した、試料中のリンパ球の3つのサ
ブポピユレーションの検出および定量のグラフ図である
。
本発明は多くの異々つだ形において実施されうるが、図
に示したものおよびここで詐しく述べるものは本発明の
好ましい態様の一例であり、本発明の原理を例示するた
めにここに記載するものであり、本発明を制限するもの
ではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲およびそれに
均等の範囲により決定されるものであるととを理解され
たい。
に示したものおよびここで詐しく述べるものは本発明の
好ましい態様の一例であり、本発明の原理を例示するた
めにここに記載するものであり、本発明を制限するもの
ではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲およびそれに
均等の範囲により決定されるものであるととを理解され
たい。
本発明はより詳しい研究が必要である細胞の共存下に妨
害細胞の効果を調べ、その効果を除々1する方法を提供
する。同定を妨害すると思われる他の細胞を含む試料中
の目的の細胞の複数のサブポピユレーションを区別する
本発明の方法において(d、目的の細胞のザブポピユレ
ーションおよび他の妨害細胞を含む試料を少なくとも2
つの部に分ける。目的の細胞を妨害する仙の細胞の第1
の分析は、まず笛1の標識剤で他の細胞の各々を、また
第2の標識剤で他の粒子の各々を標識することにより行
なわれる(各々の4F ii&剤は別個の放出スペクト
ルを有する9つ標識された他の妨害細胞を含むこの試料
を実質的に一度に1つの細胞を、他の妨害細胞上の2つ
の異々る標識剤の放出特性を検知するために連続的に検
知領域を通過させる。
害細胞の効果を調べ、その効果を除々1する方法を提供
する。同定を妨害すると思われる他の細胞を含む試料中
の目的の細胞の複数のサブポピユレーションを区別する
本発明の方法において(d、目的の細胞のザブポピユレ
ーションおよび他の妨害細胞を含む試料を少なくとも2
つの部に分ける。目的の細胞を妨害する仙の細胞の第1
の分析は、まず笛1の標識剤で他の細胞の各々を、また
第2の標識剤で他の粒子の各々を標識することにより行
なわれる(各々の4F ii&剤は別個の放出スペクト
ルを有する9つ標識された他の妨害細胞を含むこの試料
を実質的に一度に1つの細胞を、他の妨害細胞上の2つ
の異々る標識剤の放出特性を検知するために連続的に検
知領域を通過させる。
第1の分析は、2種類の放出されたケイ光を測定し、他
の妨害細胞を計測し、分析すべき細胞のサブポピユレー
ションから他の妨害細胞を区別するために実施される。
の妨害細胞を計測し、分析すべき細胞のサブポピユレー
ションから他の妨害細胞を区別するために実施される。
この第1の分析で得られた情報は次いで徒での使用に備
えて保存される。
えて保存される。
試料の第2の部については、分析すべき細胞のサブポピ
ユレーション中の一方の型の細胞を他方の粒子を標識す
るのに用いた第1の標識剤で標識゛する。分析すべき細
胞のサブポピユレーションのもう一方の型の細胞は、次
いで他方の細胞の標識に用いた第2の標識剤で標識する
っ試料の第2の部においては同時に、他方の型の妨害細
胞、も第1の分析で先に述べたように2つの標識剤で再
び碇識される9次いで、第2の部の標識細胞を、実質的
に一個づつ検知領域に通して標識細胞の特性を検知する
。次いで、各々の細胞を分析し、各々の型の細胞を区別
するために放出されるケイ光を測定することにより第2
の分析を行なう。第1の分析の保存した情報を次に適用
し、別の型の妨害細胞の効果を除去し、目的の細胞のザ
ブポピユレーションの直接的比例分析を行ない、他の型
の細胞の効果を除外する。
ユレーション中の一方の型の細胞を他方の粒子を標識す
るのに用いた第1の標識剤で標識゛する。分析すべき細
胞のサブポピユレーションのもう一方の型の細胞は、次
いで他方の細胞の標識に用いた第2の標識剤で標識する
っ試料の第2の部においては同時に、他方の型の妨害細
胞、も第1の分析で先に述べたように2つの標識剤で再
び碇識される9次いで、第2の部の標識細胞を、実質的
に一個づつ検知領域に通して標識細胞の特性を検知する
。次いで、各々の細胞を分析し、各々の型の細胞を区別
するために放出されるケイ光を測定することにより第2
の分析を行なう。第1の分析の保存した情報を次に適用
し、別の型の妨害細胞の効果を除去し、目的の細胞のザ
ブポピユレーションの直接的比例分析を行ない、他の型
の細胞の効果を除外する。
各標識剤は2つの色の検出が可能なように十分に波長の
異なる放出スペク)/Lを有するケイ光色素が好ましい
。適切々1組の標識剤としてフィコエリスリン(570
nmにケイ光を放出するフィコビリ蛋白質)およびフル
オレツセイン(530nmの波長に放出する)を見い出
した0第1図にフローサイトメ) IJ−装置10の光
学および1や子フロー要素が示しである。第1図の光学
およびフロー要素は、これらの粒子の特有な性質を分析
するために実質的に一度に1つずつ液体流、中に粒子を
流すためのフローサイトメトリー装置の主な部分を示し
ている。第1図の装置の各要素は例えばFAC8(商標
)ケイ光励起ソーク−(カリフォルニア州すニーベイル
のベクトン、テイッキンソンカンパニーのFACSシス
テムデイビションにより製造販売されている)に含捷れ
ている。
異なる放出スペク)/Lを有するケイ光色素が好ましい
。適切々1組の標識剤としてフィコエリスリン(570
nmにケイ光を放出するフィコビリ蛋白質)およびフル
オレツセイン(530nmの波長に放出する)を見い出
した0第1図にフローサイトメ) IJ−装置10の光
学および1や子フロー要素が示しである。第1図の光学
およびフロー要素は、これらの粒子の特有な性質を分析
するために実質的に一度に1つずつ液体流、中に粒子を
流すためのフローサイトメトリー装置の主な部分を示し
ている。第1図の装置の各要素は例えばFAC8(商標
)ケイ光励起ソーク−(カリフォルニア州すニーベイル
のベクトン、テイッキンソンカンパニーのFACSシス
テムデイビションにより製造販売されている)に含捷れ
ている。
このFAC8勿類装置は研究室において幅広く応用され
ており、光分散およびケイ光に基づいて細胞ポピユレー
ションを分析し、分離する。本発明において史に詳しく
述へられる光学的およびフロー要素およz;FAcs細
胞分類装置のような装置。
ており、光分散およびケイ光に基づいて細胞ポピユレー
ションを分析し、分離する。本発明において史に詳しく
述へられる光学的およびフロー要素およz;FAcs細
胞分類装置のような装置。
において実施されているものに加えて、本発明に関連し
て有用な細胞分か装置のその他の詳細(d米□国特許第
3.826,364号に記載されている。本発明は多く
の異なった型のフローサイトメーター装置、即チザンブ
ルの粒子のサブポピユレーションの同定寸たけ定量のた
めに、光散乱、粒子体積1、ケイ光あるいは他の任意の
パラメーターを泪1するものにおいても有用である。
て有用な細胞分か装置のその他の詳細(d米□国特許第
3.826,364号に記載されている。本発明は多く
の異なった型のフローサイトメーター装置、即チザンブ
ルの粒子のサブポピユレーションの同定寸たけ定量のた
めに、光散乱、粒子体積1、ケイ光あるいは他の任意の
パラメーターを泪1するものにおいても有用である。
第1図に示すように、光エネルギー−レーザーのよう々
適切な光源12および14によってフローサイトメトリ
ー装置に供給される。記載の実施例においては、異なっ
たケイ光特性を有する粒子の複数の異なる型を検知し定
量できるように、2つの光源がフローサイトメト1J−
ifIQに設けであるっしかしながら、第1図に示す具
体例における2つのレーザーの設置は、単に好ましい態
様のひとつであり、本発明において1つより多くの光エ
ネルギー源および分析要素を使用する態様の1例に過ぎ
ない。更に、フローサイトメトリー装置において唯一つ
の光源が使用されている場合でも、本発明の要素は十分
に満足に利用できうる。
適切な光源12および14によってフローサイトメトリ
ー装置に供給される。記載の実施例においては、異なっ
たケイ光特性を有する粒子の複数の異なる型を検知し定
量できるように、2つの光源がフローサイトメト1J−
ifIQに設けであるっしかしながら、第1図に示す具
体例における2つのレーザーの設置は、単に好ましい態
様のひとつであり、本発明において1つより多くの光エ
ネルギー源および分析要素を使用する態様の1例に過ぎ
ない。更に、フローサイトメトリー装置において唯一つ
の光源が使用されている場合でも、本発明の要素は十分
に満足に利用できうる。
捷だ、必すしもレーサーのようなコヒーレント光源が必
要でないことも理商されるべきである。水銀蒸気ランプ
のような他の光源も適当でるり、いくつかの応用例では
好ましい。同様に、もし実行てき実用的ならは2つより
多くの光源が利用されるであろう。
要でないことも理商されるべきである。水銀蒸気ランプ
のような他の光源も適当でるり、いくつかの応用例では
好ましい。同様に、もし実行てき実用的ならは2つより
多くの光源が利用されるであろう。
本発明で、レーザー12および]、4Hスペクトル領域
の互いに離れた特定の波長にコヒーレント光の一次放出
を生ずるように選択される。例えば、レーサー12は好
ましく+d青/緑のスペクトル領域、に発光特性を有す
るように選択される。これにより、レーサー12により
発生された光の中を流れる粒子に結合したケイ光色素が
、特定波長の光学的刺激により照射された時に励起され
る。本発明に有用女このよう寿レーザ′−の1つは48
8ナノノークー(n+η)に−水放出を廟するアルコン
イオンレーサーである。レーザー14は好まl、 <
id、レーザー12から離れた異かった波長にて働くよ
うに選択される。レーサー14の波長の光学的刺激によ
り照射した時にケイ光を発するケイ光色素を有する粒子
は、これらの粒子がレーザー14により発生した光の中
を通って流れる時に励起される。レーザー14の%l:
、レーv−12のスぺ視スペクトルの黄色/赤色領Jj
?を包含する。どの要求を満たすレーザーの1つは、5
95 n+ηに一次放出を有するローダミン6−G染料
レーデ−である。2つのレーザーの波長の差は、各々の
レーザーで少々くとも2つのケイ光色素を励起するのに
スペクトル領域の十分に外側に必ることが望ましい。7
5から1100nの2つのレーザー間の波長の差が上述
の好ましい結果を与えることが見い出された。もちろん
、ケイ光色素あるいはその他の定量できる標識剤の選択
は、2つまでのケイ光色素が各々のレーザーにより供給
される光エネルギーにより励起されるように、本発明に
使用されるレーサーと適合させなければならない。
の互いに離れた特定の波長にコヒーレント光の一次放出
を生ずるように選択される。例えば、レーサー12は好
ましく+d青/緑のスペクトル領域、に発光特性を有す
るように選択される。これにより、レーサー12により
発生された光の中を流れる粒子に結合したケイ光色素が
、特定波長の光学的刺激により照射された時に励起され
る。本発明に有用女このよう寿レーザ′−の1つは48
8ナノノークー(n+η)に−水放出を廟するアルコン
イオンレーサーである。レーザー14は好まl、 <
id、レーザー12から離れた異かった波長にて働くよ
うに選択される。レーサー14の波長の光学的刺激によ
り照射した時にケイ光を発するケイ光色素を有する粒子
は、これらの粒子がレーザー14により発生した光の中
を通って流れる時に励起される。レーザー14の%l:
、レーv−12のスぺ視スペクトルの黄色/赤色領Jj
?を包含する。どの要求を満たすレーザーの1つは、5
95 n+ηに一次放出を有するローダミン6−G染料
レーデ−である。2つのレーザーの波長の差は、各々の
レーザーで少々くとも2つのケイ光色素を励起するのに
スペクトル領域の十分に外側に必ることが望ましい。7
5から1100nの2つのレーザー間の波長の差が上述
の好ましい結果を与えることが見い出された。もちろん
、ケイ光色素あるいはその他の定量できる標識剤の選択
は、2つまでのケイ光色素が各々のレーザーにより供給
される光エネルギーにより励起されるように、本発明に
使用されるレーサーと適合させなければならない。
レーザー12および14から出た各々のビーム16と1
8は、その平行関係を保持しぬから各ビームを拡大する
ための模式的に示したビームエキスパンダー20.22
を通って進行する。ビームエキスパンダーー(本発明の
操作上好捷しいが、これは必ずしも必要ではない〕から
出て来た各々の光は、フローサイトメトリー装置の小型
化を図る必要上、一般Vcは光の方向を変えなければ汝
らない。このために、ビーム16はプリズム24と25
により反射され、ビーム18はプリズム26と28によ
り反射される。これらのプリズムのすへてid、操作中
にビームの照準を正しく合わせられるように調節できる
。
8は、その平行関係を保持しぬから各ビームを拡大する
ための模式的に示したビームエキスパンダー20.22
を通って進行する。ビームエキスパンダーー(本発明の
操作上好捷しいが、これは必ずしも必要ではない〕から
出て来た各々の光は、フローサイトメトリー装置の小型
化を図る必要上、一般Vcは光の方向を変えなければ汝
らない。このために、ビーム16はプリズム24と25
により反射され、ビーム18はプリズム26と28によ
り反射される。これらのプリズムのすへてid、操作中
にビームの照準を正しく合わせられるように調節できる
。
ビーム16と18がブリスムを通過した後、これらのビ
ームは粒子の流れ上にビームの焦点を合わせるためにレ
ンズ30および32に向かって進む。レンズ30および
32な」、もし使用されるならば、使用するフローサイ
トノドl)−装置の型((尾、して]鵠択されるか、こ
れらのレンズ゛は、1982年3月25日に出願され/
ζ本願と同一譲受人の米国特許出願第361,672号
の記載に従って選択はれる。
ームは粒子の流れ上にビームの焦点を合わせるためにレ
ンズ30および32に向かって進む。レンズ30および
32な」、もし使用されるならば、使用するフローサイ
トノドl)−装置の型((尾、して]鵠択されるか、こ
れらのレンズ゛は、1982年3月25日に出願され/
ζ本願と同一譲受人の米国特許出願第361,672号
の記載に従って選択はれる。
レーザービームはレンズ30および32を通過後粒子流
38に向かう。本発明のフローサイトメトリー装置内に
組み込まれたノズル40は、粒子41を液体流38に流
すのを促進する。この型のノズルの利用は良く知られて
おり、例えは、米国特許第3,826,364号に記載
されている。第1図かられかるように、レーサービーム
16は光散乱チャネルの光学軸上にあり、粒子の光散乱
検出に使用される。しかしながら、ことで)ホべた光散
乱の特性は、光ビームの中を通過する粒子からの情報を
得るために光散乱に基づく典型的なフローサイトメトリ
ーの特徴を述べるために単に含めたに過ぎないっ 従って光ビーム16はノズル40から出て流れ38内を
流れる粒子に当たる最初の光ビームである。この後、ビ
ーム16は光散乱チャネルの光学軸上の光散乱遮蔽(o
bscuration ) ノ< −42に達する。レ
ンズ44により集められた散乱光は、集めた散乱光の最
大角度を測定する第一の絞り45を通過するっ第一の絞
り45に引き続いて、入射光線の一部を散乱検出器48
に向けて反射し、残りの入射光を光アブソーバ−(図示
せず)ニ送るビームスプリリティックミラ−46がある
。第2の絞シ49は、散乱光の光源をレーサービーム1
6と流れ38の交差点に制脈する絞シとして働く。散乱
光は、フィルター50を通過後検知器48で検出される
。この検出器は、周知の技術により流体流中を帷れる粒
子の大きさを評価するよう市1気的に働く。
38に向かう。本発明のフローサイトメトリー装置内に
組み込まれたノズル40は、粒子41を液体流38に流
すのを促進する。この型のノズルの利用は良く知られて
おり、例えは、米国特許第3,826,364号に記載
されている。第1図かられかるように、レーサービーム
16は光散乱チャネルの光学軸上にあり、粒子の光散乱
検出に使用される。しかしながら、ことで)ホべた光散
乱の特性は、光ビームの中を通過する粒子からの情報を
得るために光散乱に基づく典型的なフローサイトメトリ
ーの特徴を述べるために単に含めたに過ぎないっ 従って光ビーム16はノズル40から出て流れ38内を
流れる粒子に当たる最初の光ビームである。この後、ビ
ーム16は光散乱チャネルの光学軸上の光散乱遮蔽(o
bscuration ) ノ< −42に達する。レ
ンズ44により集められた散乱光は、集めた散乱光の最
大角度を測定する第一の絞り45を通過するっ第一の絞
り45に引き続いて、入射光線の一部を散乱検出器48
に向けて反射し、残りの入射光を光アブソーバ−(図示
せず)ニ送るビームスプリリティックミラ−46がある
。第2の絞シ49は、散乱光の光源をレーサービーム1
6と流れ38の交差点に制脈する絞シとして働く。散乱
光は、フィルター50を通過後検知器48で検出される
。この検出器は、周知の技術により流体流中を帷れる粒
子の大きさを評価するよう市1気的に働く。
レーサービーム18もまた流れ38に向いているが、流
れの垂直軸に漕ってレーザービーム16ど隔てられてい
る。粒子により散乱されたビーム18からの光は散乱チ
ャネル光学要素によって拾われるが、しかし好ましくは
散乱チャネル内に置かれた遮断フィルター(ジエレクト
リックフィルター〕により検知器48からは妨げである
。
れの垂直軸に漕ってレーザービーム16ど隔てられてい
る。粒子により散乱されたビーム18からの光は散乱チ
ャネル光学要素によって拾われるが、しかし好ましくは
散乱チャネル内に置かれた遮断フィルター(ジエレクト
リックフィルター〕により検知器48からは妨げである
。
ケイ光チャネルに関しては、レーザーの異在る波長特性
により供給される照射で、予め定1つだ別々の放出スペ
クトルを有するケイ先回を順次励起することが可能であ
る。予め定められた、別々の放出スペクトルを有する2
っ1でのケイ先回を、各々のレーサーの光エネルギーに
より供給される励起エネルギーで励起する。第1図に見
られるように、2つの独立したレーサービーム1.6.
18ザーピーム18を横切るように垂直に間隔を置い
て流れ38を横切る。従って、光ビームを通過する粒子
((よって、2絹の光学信号が牛じるであろう。これら
の組の信号は好まシ、くけ粒子が最初のビームを横切る
点から次のビームを横切る点まで移動するのに必要な時
間までに間に合うよう間隔をあけるの力j良い。この時
間的間隔により2組の信号を別々に分析でき、2つの異
なる励起波長で励起された粒子のケイ光放出に比例した
信号を得ることができる。粒子から放出されたケイ光信
号は、別のビームからの屈折光を妨げる遮蔽バー54の
まわシに導かれる。すべてのケイ光信号は、好寸しくは
特定の波長の光だけを通過させる第1のフィルター56
を通して、レンズ55により焦点に集められる。
により供給される照射で、予め定1つだ別々の放出スペ
クトルを有するケイ先回を順次励起することが可能であ
る。予め定められた、別々の放出スペクトルを有する2
っ1でのケイ先回を、各々のレーサーの光エネルギーに
より供給される励起エネルギーで励起する。第1図に見
られるように、2つの独立したレーサービーム1.6.
18ザーピーム18を横切るように垂直に間隔を置い
て流れ38を横切る。従って、光ビームを通過する粒子
((よって、2絹の光学信号が牛じるであろう。これら
の組の信号は好まシ、くけ粒子が最初のビームを横切る
点から次のビームを横切る点まで移動するのに必要な時
間までに間に合うよう間隔をあけるの力j良い。この時
間的間隔により2組の信号を別々に分析でき、2つの異
なる励起波長で励起された粒子のケイ光放出に比例した
信号を得ることができる。粒子から放出されたケイ光信
号は、別のビームからの屈折光を妨げる遮蔽バー54の
まわシに導かれる。すべてのケイ光信号は、好寸しくは
特定の波長の光だけを通過させる第1のフィルター56
を通して、レンズ55により焦点に集められる。
光ビーム16により励起された粒子により放出されたケ
イ光は、フィルター56を通過後、次に二色性ミラー5
8に入る。二色性ミラー58の目的はケイ光の光路を通
過してきた2つの異なった右かX谷tel −シ七 ζ
ルI+4II p、 Iyム珀−芥= z y 久1r
ネることである。例えは、二色性ミラー58は例えばレ
ーザー12によってだ1丁発生する光ビーム16によシ
励起された粒子の異なる色波長を分離するように選択さ
れるであろう。例えば、青い領域の波長幻二色性ミラー
56を通して、次いでただ一色の範IJ+1(この例で
rJ青)の波長を通過するようテザインされたバリヤー
フィルター59を通して通過するでろろう。青い光は次
いでケイ光検出器60に入る。
イ光は、フィルター56を通過後、次に二色性ミラー5
8に入る。二色性ミラー58の目的はケイ光の光路を通
過してきた2つの異なった右かX谷tel −シ七 ζ
ルI+4II p、 Iyム珀−芥= z y 久1r
ネることである。例えは、二色性ミラー58は例えばレ
ーザー12によってだ1丁発生する光ビーム16によシ
励起された粒子の異なる色波長を分離するように選択さ
れるであろう。例えば、青い領域の波長幻二色性ミラー
56を通して、次いでただ一色の範IJ+1(この例で
rJ青)の波長を通過するようテザインされたバリヤー
フィルター59を通して通過するでろろう。青い光は次
いでケイ光検出器60に入る。
緑色の領)埃の二色性ミラーに入った光は、1ったけの
合(この場合は緑〕の領域の波長を通過させるバリヤー
フィルター61を通して二色性ミラーに」:り反射され
る。ケイ光検出器62が次いてこの緑色の光を受け入れ
る。
合(この場合は緑〕の領域の波長を通過させるバリヤー
フィルター61を通して二色性ミラーに」:り反射され
る。ケイ光検出器62が次いてこの緑色の光を受け入れ
る。
光ビームJ8も捷/ζ、光ビーム16にょシ励起される
ケイ光電とは異なった2つ才でのケイ光電を励起するの
に十分な単一の波長の励起エネルギーを供給する。光ビ
ーム18にょシ励起された粒子から放出されたケイ光は
レンズ55およヒ第1のフィルター56を通過した後、
この光はもう一方の二合性ミラー64に達する。二色性
ミラー58についてのべe載と同様に、この様2の二色
性ミラー64は色スペクトルの異なる2つの領域の波長
を分離するために選択される。例えば、レーサー14か
ら発した光ビーム18により供給される単一の励起源の
結果として黄および赤の信号が生じた場合、黄色領域の
波長は二色性ミラー64、次いで、黄色の領域の波長だ
けを通過するよう設計されているバリヤーフィルター6
5を通して通過する。この光は、次にケイ光検出器66
に向かう。赤の領域の波長は二色性ミラーにより反射さ
れ、バリヤーフィルター68を通してその後この光はケ
イ光検出器69に入る。従って、各々の発光特性の対応
する波長で2つ捷での異なるケイ光色素を励起しうる2
つのレーサーからの光は、上述のよう々フローサイトメ
トリー装置に試料を一度流す間にその試料中の粒子の複
数のザブポピユレーションの検出および定量を可能にす
る。
ケイ光電とは異なった2つ才でのケイ光電を励起するの
に十分な単一の波長の励起エネルギーを供給する。光ビ
ーム18にょシ励起された粒子から放出されたケイ光は
レンズ55およヒ第1のフィルター56を通過した後、
この光はもう一方の二合性ミラー64に達する。二色性
ミラー58についてのべe載と同様に、この様2の二色
性ミラー64は色スペクトルの異なる2つの領域の波長
を分離するために選択される。例えば、レーサー14か
ら発した光ビーム18により供給される単一の励起源の
結果として黄および赤の信号が生じた場合、黄色領域の
波長は二色性ミラー64、次いで、黄色の領域の波長だ
けを通過するよう設計されているバリヤーフィルター6
5を通して通過する。この光は、次にケイ光検出器66
に向かう。赤の領域の波長は二色性ミラーにより反射さ
れ、バリヤーフィルター68を通してその後この光はケ
イ光検出器69に入る。従って、各々の発光特性の対応
する波長で2つ捷での異なるケイ光色素を励起しうる2
つのレーサーからの光は、上述のよう々フローサイトメ
トリー装置に試料を一度流す間にその試料中の粒子の複
数のザブポピユレーションの検出および定量を可能にす
る。
ケイ光検出器60.62.66および69け好ましくは
それぞれ4つの分けられた青、緑、黄および赤の光を受
け入れるようになっているへこれらのケイ光検出器は光
学的信刊を電気的信号に変換する低ノイズ光電倍増管あ
るいはそれと同等な装置である。これらの電気的信号は
次いで、分析また幻その他の目的のためにフローサイト
メトリー装置のエレクトロニクス(図示せず)に電気的
に供給され処理される。種々の表示、情報取り出し、テ
ータ蓄粕あるいは記録法がフローサイトメトリー装置に
おいて行なわ、lするであろう。本発明の1つの態様に
よれは、コンピューター71が、第1の分析の結果を保
存し、細胞のサブポピユレーションの直接同定を行う−
N(、第2の分析に応用するために用意されている。
それぞれ4つの分けられた青、緑、黄および赤の光を受
け入れるようになっているへこれらのケイ光検出器は光
学的信刊を電気的信号に変換する低ノイズ光電倍増管あ
るいはそれと同等な装置である。これらの電気的信号は
次いで、分析また幻その他の目的のためにフローサイト
メトリー装置のエレクトロニクス(図示せず)に電気的
に供給され処理される。種々の表示、情報取り出し、テ
ータ蓄粕あるいは記録法がフローサイトメトリー装置に
おいて行なわ、lするであろう。本発明の1つの態様に
よれは、コンピューター71が、第1の分析の結果を保
存し、細胞のサブポピユレーションの直接同定を行う−
N(、第2の分析に応用するために用意されている。
本発明の操作を単に例示のために以下の実施例として記
載するっこの具体例は、試料中の粒子類の複数のザブポ
ピユレーションを検出し、区別し、および/捷たは定量
するための技術を例示するためのものであり、限定的な
ものでは々い。
載するっこの具体例は、試料中の粒子類の複数のザブポ
ピユレーションを検出し、区別し、および/捷たは定量
するための技術を例示するためのものであり、限定的な
ものでは々い。
実施例1
本実施例において(q、リンパ球の2棟の成分ちるいは
副成分(サブセット)、すなわぢT細胞およびB細胞の
量がヒトの血液中の全リンパ球に対する百分率で直接決
定される。
副成分(サブセット)、すなわぢT細胞およびB細胞の
量がヒトの血液中の全リンパ球に対する百分率で直接決
定される。
単核白血球上の細胞表面マーカーに特異的な抗体である
抗−leuM3の同じ割合を使用し、夫々励起された場
合、可視スペクトルのオレンジ色領域またはその付近で
ある570ナノメートルのケイ光を放射する免疫ケイ光
染色剤であるフィコエリスリン(PE)及び励起された
場合、色スペクトルの緑色領域内に位置する530ナノ
メートルの波長のケイ光を放射する免疫ケイ光染色剤で
あるフルオレセイン・インチオシアネー)(FITC)
により標識し′Pcつこの試薬として、最初に抗体をP
Eで標識した後、通常の方法で精製し次にFITCで再
び標識した後、最後の精製を行々つて二重に標識された
一つの抗体を調製してもよい。
抗−leuM3の同じ割合を使用し、夫々励起された場
合、可視スペクトルのオレンジ色領域またはその付近で
ある570ナノメートルのケイ光を放射する免疫ケイ光
染色剤であるフィコエリスリン(PE)及び励起された
場合、色スペクトルの緑色領域内に位置する530ナノ
メートルの波長のケイ光を放射する免疫ケイ光染色剤で
あるフルオレセイン・インチオシアネー)(FITC)
により標識し′Pcつこの試薬として、最初に抗体をP
Eで標識した後、通常の方法で精製し次にFITCで再
び標識した後、最後の精製を行々つて二重に標識された
一つの抗体を調製してもよい。
本実施例においては、抗体はLeuM3 として知られ
ている単核白血球に対するモノクローナル抗体であり、
二重に標識された試薬はダブルI、euM3 (DLM
3 ) と表示される。
ている単核白血球に対するモノクローナル抗体であり、
二重に標識された試薬はダブルI、euM3 (DLM
3 ) と表示される。
非凝固全面サンプルを次のようにして準備した。
単核細胞分画(it 、たとえばフィコルーバク(Fi
col 1−Paque)(ファルマシア ファインケ
ミカルズ社の商品名)のような密度勾配溶液上に全血液
サンプルを注意深く層状にのせ、その層状のサンプルを
400XG(重力加速度)で30分から40分間遠心分
離した後、溶液界面の細胞の層を分離することによシ調
製したりこの単核細胞分画を細胞か生存できるようにバ
ランスされ、緩衝化された塩溶液(BSS) により繰
り返し洗浄した。洗浄は最初BSSを加えてから遠心分
離し、上澄を除去した後、新たなりSSに細胞を再懸濁
することにより行なった。
col 1−Paque)(ファルマシア ファインケ
ミカルズ社の商品名)のような密度勾配溶液上に全血液
サンプルを注意深く層状にのせ、その層状のサンプルを
400XG(重力加速度)で30分から40分間遠心分
離した後、溶液界面の細胞の層を分離することによシ調
製したりこの単核細胞分画を細胞か生存できるようにバ
ランスされ、緩衝化された塩溶液(BSS) により繰
り返し洗浄した。洗浄は最初BSSを加えてから遠心分
離し、上澄を除去した後、新たなりSSに細胞を再懸濁
することにより行なった。
最後の洗浄が終わった後、細胞を再び@濁させ、十分な
量のBSSを加えてlωあたり約百万個の#j胞が存在
するようにした。少なくとも2つの分画が再懸濁したサ
ンプルから作られ、しかもこれらは分析前に調製された
。
量のBSSを加えてlωあたり約百万個の#j胞が存在
するようにした。少なくとも2つの分画が再懸濁したサ
ンプルから作られ、しかもこれらは分析前に調製された
。
最初の分析のため、懸濁した細胞のうち0.02cc(
20マイクロリツトル〕をDLM3試薬0.02CCと
溶合する。細胞と鄭゛薬の両方を、混合時およびそれよ
りV2時間の間O0々いし4℃に保持する0し2時間の
インキュベーション後、1チのホルムアルデヒドを5マ
イクロリットルさらに加乏てからサンプルを混合し2、
角び」一連したように洗浄した。このようにして、分析
用の最初のサンプルがTh &jされるう 最初のサンプルを主に488 nmで照射するフローサ
イトメトリー装置の中をj山し2だ。フローサイトメト
リー装置の中を実質上一度に一細胞づつ辿珈する細胞に
よシ与えられる光学的信号が検知され、この信号を第3
図に示されるようにプリントアウトした。
20マイクロリツトル〕をDLM3試薬0.02CCと
溶合する。細胞と鄭゛薬の両方を、混合時およびそれよ
りV2時間の間O0々いし4℃に保持する0し2時間の
インキュベーション後、1チのホルムアルデヒドを5マ
イクロリットルさらに加乏てからサンプルを混合し2、
角び」一連したように洗浄した。このようにして、分析
用の最初のサンプルがTh &jされるう 最初のサンプルを主に488 nmで照射するフローサ
イトメトリー装置の中をj山し2だ。フローサイトメト
リー装置の中を実質上一度に一細胞づつ辿珈する細胞に
よシ与えられる光学的信号が検知され、この信号を第3
図に示されるようにプリントアウトした。
第3図で示されるように、この最初の分析の結果は細胞
類の2つのポピユレーションの分離である。1つのポピ
ユレーション(第3図中、A2を伺i−た細波)は、抗
−LeuM3抗体がこのポピユレーションと反応した事
実から、単核白血球を表わしている。この試薬はDLM
、3であり、生じる単核白血球ポピユレーションは、緑
色のケイ光を示ずF’LIと赤かのケイ光を示すFl、
2の両方で(票61スされている。こわと対照的に、細
胞類の主な部分は完全に:+uF染色のA4を付した領
域内に存在干る。こわ粛リンパ球のポピユレーションで
ある。
類の2つのポピユレーションの分離である。1つのポピ
ユレーション(第3図中、A2を伺i−た細波)は、抗
−LeuM3抗体がこのポピユレーションと反応した事
実から、単核白血球を表わしている。この試薬はDLM
、3であり、生じる単核白血球ポピユレーションは、緑
色のケイ光を示ずF’LIと赤かのケイ光を示すFl、
2の両方で(票61スされている。こわと対照的に、細
胞類の主な部分は完全に:+uF染色のA4を付した領
域内に存在干る。こわ粛リンパ球のポピユレーションで
ある。
一方あるいは41し方のみのグイ光fh素で神漉された
紳胞類r/ゴ5チJン下しか存在しない。たとえば、単
核白面=が単核細胞中の184%を占め、A4領域内に
見らJ″Lるリンパ球が788%であると決定された。
紳胞類r/ゴ5チJン下しか存在しない。たとえば、単
核白面=が単核細胞中の184%を占め、A4領域内に
見らJ″Lるリンパ球が788%であると決定された。
2回目の分析のために調製された細胞懸濁液の第二分画
を第二の抗体試薬と処理する。この第二の抗体試薬はT
細胞全体に対するモノクローナル抗体の混合物すなわち
PEで標静された抗−Let12aと抗−Leu3Bと
の混合物、さらに表面の免疫グロブリンに対するポリク
ローナル抗体、すなわちFITCで標5216された抗
−IgMと抗−IgD、およO・、A’+i述したよう
な抗単核白血球試薬であるDLM 3から成り立ってい
る。第二分画のインキュベーション、固定および洗浄の
工程は最初の分画を処理した工程と同一である。こうし
て第二分画サンプルが分析のために準備され、フローサ
イトメトリー装置を通すことにより分析されて第4に示
す分析プロットを与えた。
を第二の抗体試薬と処理する。この第二の抗体試薬はT
細胞全体に対するモノクローナル抗体の混合物すなわち
PEで標静された抗−Let12aと抗−Leu3Bと
の混合物、さらに表面の免疫グロブリンに対するポリク
ローナル抗体、すなわちFITCで標5216された抗
−IgMと抗−IgD、およO・、A’+i述したよう
な抗単核白血球試薬であるDLM 3から成り立ってい
る。第二分画のインキュベーション、固定および洗浄の
工程は最初の分画を処理した工程と同一である。こうし
て第二分画サンプルが分析のために準備され、フローサ
イトメトリー装置を通すことにより分析されて第4に示
す分析プロットを与えた。
第4図に示されるように、単核白血球のポピユレーショ
ンは、やはり赤色および緑色の両方のケイ光が陽性の領
域、すなわちB2を付した領域に見られる。単核白血球
((加えてそれ以外の細胞類も壕だ時々このB2領域内
に見られる。これらはT=+胞試薬およびB細胞試薬の
両方で標識される細胞類である。これらのゴ十B+細胞
プηの個数は最初の分画でA2領域内に存在する単核白
血球の個数を第二分画のB2領域内に数えられる細胞類
の全個数から差し引くことにより決定されるであろう。
ンは、やはり赤色および緑色の両方のケイ光が陽性の領
域、すなわちB2を付した領域に見られる。単核白血球
((加えてそれ以外の細胞類も壕だ時々このB2領域内
に見られる。これらはT=+胞試薬およびB細胞試薬の
両方で標識される細胞類である。これらのゴ十B+細胞
プηの個数は最初の分画でA2領域内に存在する単核白
血球の個数を第二分画のB2領域内に数えられる細胞類
の全個数から差し引くことにより決定されるであろう。
第4図からさらにゎ力・るように、Bll職域も細胞類
が存在しておp、これらはT細胞としてのみ標識された
細胞類でるる。B3領域にも細胞類が存在しており、こ
れらVi B fla胞としてのみ標識された細胞類で
ある。
が存在しておp、これらはT細胞としてのみ標識された
細胞類でるる。B3領域にも細胞類が存在しており、こ
れらVi B fla胞としてのみ標識された細胞類で
ある。
表1は同一の単核細胞サンプルの第一および第二分画の
測定、分類および計測を行々うことにより得られる数値
結果を示している。
測定、分類および計測を行々うことにより得られる数値
結果を示している。
表 1
分画A 分画B 分画”と3
の相関
領域 全数 条 全数 係 全数 係
1 228 2.3 6665 68.2 6665
77.52 1、]、82 12.1 1359 1.
3.9 176 2.03 18 0.2 251 2
.6 251 2.94 8309 85.3 1.5
02 15.4 1502 17.5計 9737 9
777 8594 表1の3欄目は次に示すような方法による分画Aの結果
と分画Bとの相関関係を示している。A2領域内に認め
られる単核白血球数を分画A内の9737という全細胞
数から差し引くことにより、リンパ球の全数である85
55が得られる。この数8555は計は結果の分母とな
る。A2における単核白血球の数をB2領域における細
胞数から差し引くことにより、T細胞およびB細胞とし
て標識された単核白血球ではない細胞の数(1,359
−1183)すなわち176が得られる。それぞれの型
の細胞の割合が、8594という分母(相関全数)をも
とにして再計算される。従って、リンパ球だけに対する
割合として表わj〜だ場合には、T細胞の割合は775
係、B細胞の割合は29係となる。この相関計算をしな
い場合には、T細胞は682チ、B細胞け26弼となる
。このような相違が認められたことは単核白血球の存在
が無視された場合、即わち現在性なわれている分析/ス
テムでは誤差の可能性があることを示している。
77.52 1、]、82 12.1 1359 1.
3.9 176 2.03 18 0.2 251 2
.6 251 2.94 8309 85.3 1.5
02 15.4 1502 17.5計 9737 9
777 8594 表1の3欄目は次に示すような方法による分画Aの結果
と分画Bとの相関関係を示している。A2領域内に認め
られる単核白血球数を分画A内の9737という全細胞
数から差し引くことにより、リンパ球の全数である85
55が得られる。この数8555は計は結果の分母とな
る。A2における単核白血球の数をB2領域における細
胞数から差し引くことにより、T細胞およびB細胞とし
て標識された単核白血球ではない細胞の数(1,359
−1183)すなわち176が得られる。それぞれの型
の細胞の割合が、8594という分母(相関全数)をも
とにして再計算される。従って、リンパ球だけに対する
割合として表わj〜だ場合には、T細胞の割合は775
係、B細胞の割合は29係となる。この相関計算をしな
い場合には、T細胞は682チ、B細胞け26弼となる
。このような相違が認められたことは単核白血球の存在
が無視された場合、即わち現在性なわれている分析/ス
テムでは誤差の可能性があることを示している。
別の例として、準備した単核細胞の第三分画を第三の試
薬と混合する。第三の試薬はサプレッサー細胞の表面マ
ーカーである抗−Lel12aをPEで標識した抗体、
およびへ・ルバー細胞の表面マーカーである抗−Leu
3aをFITCで標識した抗体にさらに第一分画で用い
られたD L M 3の溶液からなる。混合、インキュ
ベーション、固定、洗浄および計測を既述したように行
なう。結果を図5に示し、表2に1とめた。
薬と混合する。第三の試薬はサプレッサー細胞の表面マ
ーカーである抗−Lel12aをPEで標識した抗体、
およびへ・ルバー細胞の表面マーカーである抗−Leu
3aをFITCで標識した抗体にさらに第一分画で用い
られたD L M 3の溶液からなる。混合、インキュ
ベーション、固定、洗浄および計測を既述したように行
なう。結果を図5に示し、表2に1とめた。
さらにもう1つの例として、準備した単核細胞の第四分
画を第四の試薬と混合する。第四の試薬はPEで標識さ
れた抗−Leu2aとナチュラルキラー細胞の表面マー
カーに対するモノクローナル抗体である抗−Leu7か
FTTCで標識された抗体、さらにDLM3の溶液から
なる。混合、インキユベーシヨン、固定、洗浄および計
測を既述したように行なう。結果を第6図に示し、表2
にまとめた。
画を第四の試薬と混合する。第四の試薬はPEで標識さ
れた抗−Leu2aとナチュラルキラー細胞の表面マー
カーに対するモノクローナル抗体である抗−Leu7か
FTTCで標識された抗体、さらにDLM3の溶液から
なる。混合、インキユベーシヨン、固定、洗浄および計
測を既述したように行なう。結果を第6図に示し、表2
にまとめた。
表2
分画C分画AとCの相関
領域 全数 チ 全数 係
1 3418 35.2 3418 40.12 15
22 15.7 34.8 4.13 2865 29
.5 ’2865 33.64 1896 19.5
1896 22.2計 9701 8527 表 2(続き) 分画D 分画AとDの相関 領域 全数 係 全数 係 ] 1296 13.5 1296 15.32 36
1.5 37.6 2’4.51. 293 11.2
8 1+、7 1.128 13.34 3584 3
7.2 3584 42.3計 9623 84.59 さらに計算することにより、サプレッサー細胞の全フラ
クションは442%で、そのうち41%がヘルパー細胞
としても標識されていること、また、サプレッサー細胞
の全フラクションが443係でそのうち29チがナチュ
ラルキラー細胞であることがわかる。442%と443
%の相違は方法の再現性の範囲内であり、および5回の
相関もしくは比較結果の中で、商の四捨五入を行なった
ことにより生じた誤差である。示した例の中で、細胞類
は抗−Leu ’;iaおよび抗−Leu7の両方で標
識されているように思われる。
22 15.7 34.8 4.13 2865 29
.5 ’2865 33.64 1896 19.5
1896 22.2計 9701 8527 表 2(続き) 分画D 分画AとDの相関 領域 全数 係 全数 係 ] 1296 13.5 1296 15.32 36
1.5 37.6 2’4.51. 293 11.2
8 1+、7 1.128 13.34 3584 3
7.2 3584 42.3計 9623 84.59 さらに計算することにより、サプレッサー細胞の全フラ
クションは442%で、そのうち41%がヘルパー細胞
としても標識されていること、また、サプレッサー細胞
の全フラクションが443係でそのうち29チがナチュ
ラルキラー細胞であることがわかる。442%と443
%の相違は方法の再現性の範囲内であり、および5回の
相関もしくは比較結果の中で、商の四捨五入を行なった
ことにより生じた誤差である。示した例の中で、細胞類
は抗−Leu ’;iaおよび抗−Leu7の両方で標
識されているように思われる。
B4.C4およびB4領域はリンパ球の全ポビニレ−ジ
ョンの一部分と考えられる標識されていないリンパ球を
含んでいる。
ョンの一部分と考えられる標識されていないリンパ球を
含んでいる。
実施例2
本実施例においては、2つの咽の妨害細胞が耐力゛によ
り分Ge1Fされる例を示す1.2つの!(すの妨害細
胞を17別する特徴は興味あるザブ集団の分類を行なう
間、保持される1、 本実施例(lこおける最初のザンブルはヘバリンニより
抗凝固処理した全血液であるが、gDTAや酸−クエン
酸−デギストロース溶液といった違う種モ用の抗凝固剤
でも十分である3、この液体力/プルは少なくとも2つ
の分画に分けられる。
り分Ge1Fされる例を示す1.2つの!(すの妨害細
胞を17別する特徴は興味あるザブ集団の分類を行なう
間、保持される1、 本実施例(lこおける最初のザンブルはヘバリンニより
抗凝固処理した全血液であるが、gDTAや酸−クエン
酸−デギストロース溶液といった違う種モ用の抗凝固剤
でも十分である3、この液体力/プルは少なくとも2つ
の分画に分けられる。
第一分画のための試薬(d L e u M 3に対す
る抗体(PEで標識されている)を含み、LeuMIに
対する抗体(F J T Cで標識されている)も含み
、血液pHや浸透圧に近くなるようにそれらを維持する
ため緩衝された塩溶液となっている。
る抗体(PEで標識されている)を含み、LeuMIに
対する抗体(F J T Cで標識されている)も含み
、血液pHや浸透圧に近くなるようにそれらを維持する
ため緩衝された塩溶液となっている。
Le 11 M 1とT、euM3は両方とも単核白血
球の細胞表面マーカーである。I、euMlは顆粒白血
球と単核白血球の細胞表面マーカーである。この試薬を
全血液の第一分画とともに4℃で30分間インキュベー
トスル。インキュヘーンヨンノ後、全血液中の赤血球細
胞(RBC)部分を、たとえばそれぞれの細胞の内外間
の浸透圧関係を崩すことにより消失させる。溶血の正確
な方法は白血球細胞(WBC)が適正に保持されている
限り、本実施例にとって重要ではない。ある溶血1タリ
においては、RBCを蒸留水を用いて溶血し、一方、水
に溶解した少壮のホルムアルデヒドを目的細胞類(すな
わちリンパ球)と2つの型の妨害細胞(すなわち畦核白
血球と顆粒白血球)の両方を含むWBCの保存剤として
用いる1−。
球の細胞表面マーカーである。I、euMlは顆粒白血
球と単核白血球の細胞表面マーカーである。この試薬を
全血液の第一分画とともに4℃で30分間インキュベー
トスル。インキュヘーンヨンノ後、全血液中の赤血球細
胞(RBC)部分を、たとえばそれぞれの細胞の内外間
の浸透圧関係を崩すことにより消失させる。溶血の正確
な方法は白血球細胞(WBC)が適正に保持されている
限り、本実施例にとって重要ではない。ある溶血1タリ
においては、RBCを蒸留水を用いて溶血し、一方、水
に溶解した少壮のホルムアルデヒドを目的細胞類(すな
わちリンパ球)と2つの型の妨害細胞(すなわち畦核白
血球と顆粒白血球)の両方を含むWBCの保存剤として
用いる1−。
第一分画が前述したように2色のフローザイトメトリー
装置を通され、個々の細胞類について測定される螢丸が
2色、1色、色なしのいずれであるかによって4つの成
分のうちの1つに帰属される。従って、この第1分画中
では2つの型の妨害細胞が区別して同定される。なぜ々
ら、顆粒白血球は抗−LeuMまたけで標識されておシ
、従ってケイ光は緑色だけである。一方、単核白血球は
抗−LelJMlと抗−LeuM3の両方で標識されて
おり、従ってノ1イ光は赤色と緑色の両方だからである
。4つの成分に帰属された細胞傾は別々に数えられ、数
値が保存される。
装置を通され、個々の細胞類について測定される螢丸が
2色、1色、色なしのいずれであるかによって4つの成
分のうちの1つに帰属される。従って、この第1分画中
では2つの型の妨害細胞が区別して同定される。なぜ々
ら、顆粒白血球は抗−LeuMまたけで標識されておシ
、従ってケイ光は緑色だけである。一方、単核白血球は
抗−LelJMlと抗−LeuM3の両方で標識されて
おり、従ってノ1イ光は赤色と緑色の両方だからである
。4つの成分に帰属された細胞傾は別々に数えられ、数
値が保存される。
全血液の第二分画も同様に処理され、溶血され、開側さ
れる。しかし、この第二分画では、試薬が抗−■、eu
Ml−(FIPCで標識されたもの)と抗−LeuM3
(PEで標識されたもの)以外に、T細胞のザプトンサ
ーサブセノトを認識するPEで標識されたLeu2aに
対する抗体、およびナチュラルキラー細胞・類を認識す
るFITCで標識されたl−4(■17に対する抗体も
含んでいる。このインキュ/\−ンヨ/の後、フローザ
イトメーターの中で行なわ11.た細胞類の分類による
と、サプレッサー、¥IIIINは赤色のケイ光だけを
発し、単核白血球およびサプレッサーマーカーとナチュ
ラルキラーマーカーの両方を有する細胞類は赤色と緑色
の両方のケイ光を発し、−力、顆粒白血球とナチュラル
キラー細胞類は緑色のケイ光だけを発することがわかっ
た5゜ 第一分画の数値を第二分画の数値と相関させることによ
り、顆粒白血球と単核白血球の両方からの妨害が排除さ
れ、一方、ザブレツザーa胞、ナチュラルキラー細胞お
よびサプレッサーマーカーとナチュラルキラーマーカー
の両方を有する細胞類はり73球のみに対する割合とし
て計算される。
れる。しかし、この第二分画では、試薬が抗−■、eu
Ml−(FIPCで標識されたもの)と抗−LeuM3
(PEで標識されたもの)以外に、T細胞のザプトンサ
ーサブセノトを認識するPEで標識されたLeu2aに
対する抗体、およびナチュラルキラー細胞・類を認識す
るFITCで標識されたl−4(■17に対する抗体も
含んでいる。このインキュ/\−ンヨ/の後、フローザ
イトメーターの中で行なわ11.た細胞類の分類による
と、サプレッサー、¥IIIINは赤色のケイ光だけを
発し、単核白血球およびサプレッサーマーカーとナチュ
ラルキラーマーカーの両方を有する細胞類は赤色と緑色
の両方のケイ光を発し、−力、顆粒白血球とナチュラル
キラー細胞類は緑色のケイ光だけを発することがわかっ
た5゜ 第一分画の数値を第二分画の数値と相関させることによ
り、顆粒白血球と単核白血球の両方からの妨害が排除さ
れ、一方、ザブレツザーa胞、ナチュラルキラー細胞お
よびサプレッサーマーカーとナチュラルキラーマーカー
の両方を有する細胞類はり73球のみに対する割合とし
て計算される。
実施例3
上述のそれぞれの実施例においては、第一分画は相関4
算のだめのものとして使用される1:。
算のだめのものとして使用される1:。
次に示す実施例においては、3つの異なるケイ光染色剤
が用いられ、別々に測定される。第一分画においては、
単核白血球はLeuM3(PEで標識されたもの)とL
euMl (FITCで標識されたもの)で染色され、
一方、顆粒白血球はLeuM 1. (F T T C
で標識されたもの)で染色される。
が用いられ、別々に測定される。第一分画においては、
単核白血球はLeuM3(PEで標識されたもの)とL
euMl (FITCで標識されたもの)で染色され、
一方、顆粒白血球はLeuM 1. (F T T C
で標識されたもの)で染色される。
この第一分画の測定と分類により、単核白血球1d赤色
と緑色のケイ光を発し、−方、顆粒白血球は緑色のゲイ
光だけを発することがわかる。
と緑色のケイ光を発し、−方、顆粒白血球は緑色のゲイ
光だけを発することがわかる。
第二分画に使用する試薬は、抗−Le u M 3 (
PEで標識されたもの)と抗−LeuMl(FTTCで
標識されたもの)以外に、ナチュラルキラー細胞と顆:
べi白血球を同定するもう1つのマーカーであるI、e
lf l lに対する抗体を含んでいる。杭−Leu]
1fd、’543 nmの光で励起した場合、深紅色
のノ1イ光を発するケイ光染色剤であるアロフィコシア
ニンにより標識されている。さらに、この第二分画のだ
めの試薬は、抗−Leu 2 ;] I PEで標識さ
れたもの)と抗−Leu 7 (FITCで標識された
もの)も含んでいる。三色フローサイトメトリーを通し
た後、細胞類を8種の成分に分類できる。
PEで標識されたもの)と抗−LeuMl(FTTCで
標識されたもの)以外に、ナチュラルキラー細胞と顆:
べi白血球を同定するもう1つのマーカーであるI、e
lf l lに対する抗体を含んでいる。杭−Leu]
1fd、’543 nmの光で励起した場合、深紅色
のノ1イ光を発するケイ光染色剤であるアロフィコシア
ニンにより標識されている。さらに、この第二分画のだ
めの試薬は、抗−Leu 2 ;] I PEで標識さ
れたもの)と抗−Leu 7 (FITCで標識された
もの)も含んでいる。三色フローサイトメトリーを通し
た後、細胞類を8種の成分に分類できる。
即−ち、三色とも有する場合−成分、色無しの場合−成
分、−色だけの場合三成分、二色の場合三成分の計8種
の成分に分類される。
分、−色だけの場合三成分、二色の場合三成分の計8種
の成分に分類される。
本実施例においては、単核白血球fd赤色と緑色、顆粒
白血球は深紅色と緑色、サプレッサー細胞は赤色たけ、
抗−Leu7のみで同定されるナチュラルキラー細胞は
緑色だけ、抗−Leullのみで同定されるナチュラル
キラー細胞は深紅色だけ、■、eu7マーカーも有する
サプレッサー細胞は赤色と緑色、Leu 7とLeu
l lマーカーも有するナチュラルキラー細胞は緑色と
深紅色のケイ光を発する。
白血球は深紅色と緑色、サプレッサー細胞は赤色たけ、
抗−Leu7のみで同定されるナチュラルキラー細胞は
緑色だけ、抗−Leullのみで同定されるナチュラル
キラー細胞は深紅色だけ、■、eu7マーカーも有する
サプレッサー細胞は赤色と緑色、Leu 7とLeu
l lマーカーも有するナチュラルキラー細胞は緑色と
深紅色のケイ光を発する。
さらに、3つのマーカー、Leu 2、Leu7、Le
ullをすべて有する細+a piは3色全部のケイ光
を発する。イ0し、そのような細胞類は現在のところ知
られていない。第一分画と第二分画の結果の相関により
、Leu2+リンパ球全部、Leu7→−リンパ球全部
、Leu l l −1−l)ンバ球全部がリンパ球中
でしめる割合を計算することが可能であり、サプレッサ
ーまだはナチュラルキラーマーカーのいくつかの組合せ
を有するリンパ球のしめる割合も計算することが可能で
ある。
ullをすべて有する細+a piは3色全部のケイ光
を発する。イ0し、そのような細胞類は現在のところ知
られていない。第一分画と第二分画の結果の相関により
、Leu2+リンパ球全部、Leu7→−リンパ球全部
、Leu l l −1−l)ンバ球全部がリンパ球中
でしめる割合を計算することが可能であり、サプレッサ
ーまだはナチュラルキラーマーカーのいくつかの組合せ
を有するリンパ球のしめる割合も計算することが可能で
ある。
第1図は流路を流れる粒子の複数のサブポピユレーショ
ンに関するケイ光および粒子の光散乱パラメーターの測
定に特に有用なフローサイトメトリー装置の光学要素お
よび光の経路の好捷しい実施例の略図である。 第2図は血液試料のケイ光一体積相関により得られた結
果のグラフ図であり、妨害細胞の大きさが重複する事実
を示している。 第3Mは本発明による第1の分析のグラフ図であり、第
4図〜第6図は本発明の原理によってフローサイトメト
リーを通過させ測定した、試料中のリンパ球の3つのサ
ブポピュレーショ/の検出および定性のグラフ図である
。 特許出願人 ヘクトン・デイツキンンン・アンド・カン
ノぐニー (外5名) 手続補正書(方式) 昭和、57年77月7日 昭和d年介貸願第 /L/、シュ・?工号勺−才771
羽サイ 1−ロー/゛−1−おり−る 二nグ(a 子
日刀を乙イ〃2二ン11−n住所 名11 ヘク1−/ ディッXン′/ン アンl’・カ
ン/(Z−5補正命令の日付 昭和t7年10月・)1
0日(発送日)6袖正の対象 図 面
ンに関するケイ光および粒子の光散乱パラメーターの測
定に特に有用なフローサイトメトリー装置の光学要素お
よび光の経路の好捷しい実施例の略図である。 第2図は血液試料のケイ光一体積相関により得られた結
果のグラフ図であり、妨害細胞の大きさが重複する事実
を示している。 第3Mは本発明による第1の分析のグラフ図であり、第
4図〜第6図は本発明の原理によってフローサイトメト
リーを通過させ測定した、試料中のリンパ球の3つのサ
ブポピュレーショ/の検出および定性のグラフ図である
。 特許出願人 ヘクトン・デイツキンンン・アンド・カン
ノぐニー (外5名) 手続補正書(方式) 昭和、57年77月7日 昭和d年介貸願第 /L/、シュ・?工号勺−才771
羽サイ 1−ロー/゛−1−おり−る 二nグ(a 子
日刀を乙イ〃2二ン11−n住所 名11 ヘク1−/ ディッXン′/ン アンl’・カ
ン/(Z−5補正命令の日付 昭和t7年10月・)1
0日(発送日)6袖正の対象 図 面
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)(a) 分析ずべき細胞類のサブポピユレーショ
ンを形成する少なくとも2種(第1および第2の型とい
う)の細胞および該サブポピユレーションの同定を妨害
する少なくとも1袖(第3の型という)の細胞を包含す
る試料の分析に除して、(b) 試料を少なくとも2つ
の部に分画し、(C) 第3の型の細胞に特異的である
が、前記サブポピユレーションの細胞、にけ特異的でな
い第1の抗体を、各々別々の放出スペクトルを有する少
なくとも2種のケイ光色素で標識し、 (d) 前記分画試料の第1の部と前記の異々るケイ光
色素で標識された第1の抗体との混合物を作成して、第
3の型の細胞を該第1の抗体で標識し、(e) 上記の
各型のケイ光色素を励起するために、サイトメトリー法
によって上記試料の第1の部の混合物に励起エネルギー
を与え、 (fl 各々の細胞を分析して放出されるケイ光を測定
し、第3の型の細胞を計測して、前記サブポピユレーシ
ョンから該第3の型の細胞を区別することにより第1の
分析を行ない、 (g) 該第1の分析により得た情報を保存し、(h)
前記サブポピユレーションの第1の型の細胞に特異的
々第2の抗体を、前記第1の抗体を標識するために使用
されたケイ光色素の少なくとも18Lで標識し、 (i) 前記サブポピユレーションの第2の型の細胞に
特異的な第3の抗体を、前記第1の抗体を標識するため
に使用されたケイ光色素の少なくとも別の一種で標識し
、 (j) 異なるケイ光色素で標識された前記第1の抗体
蛋白、(h)で標識された第2の抗体蛋白および(i)
で標識された第3の抗体蛋白と、分画試料の第2の部と
の混合物を作成することによって、各型の細胞に特異的
な抗体で第1、第2および第3の細胞を標識し、 (10−に?、5”試料の第2の部の混合物にサイトメ
トリー法により励起エネルギーを与え、ケイ光色素の各
々の型を励起させ、 (t)各々の細胞を分析して放出されるケイ光を測定し
、第1、第2および第3の型の細胞を計′6111し、
各々の型の細胞ケ区別することにより第2の分析を行な
い、 (n■ 前記第1の分析の保存情報を加えて、第3の凋
の細胞の効果を除き、分析すべきサブポピユレーション
の第1およO・第2の型の細胞の直接的比率を分析する
、 ことを特徴とする分析ずべき細胞のザブポピユレーショ
ンを他の細胞に妨害されることなく同定する方法。 (2)分析すべき細胞のサブポピユレーションがT細胞
およびB細胞を包含する特許請求の範囲第1項に記載の
方法、 (3)細胞のサブポピユレーションがヘルパー細胞およ
びサプレッサー細胞を包含する特許請求の範囲第1項に
記載の方法。 (4) #l胞のサブポピユレーションがサプレッサー
細胞およびナチュラルキラー細胞を包含する特許請求の
範囲第1項に記載の方法。 (5)ザブポピユレーション細胞を妨害する第3の型の
細胞が単核白血球である特許請求の範囲第1項に記載の
方法。 (6)第3の型の妨害細胞が単核白血球である特許請求
の範囲第2項に記載の方法。 (7)第3の型の妨害細胞が単核白血球である特許請求
の範囲第3項に記載の方法っ (8)第3の型の妨害細胞が単核白血球である特許請求
の範囲第4項に記載の方法。 (9)試料が末梢血液試料である特許請求の範囲第1項
に記載の方法。 (IQ 特許請求の範囲第1項の操作(b)から操作(
■を行なうのに先立って、末梢血液試料を処理して単核
白血球細胞フラクションを回収する特許請求の範囲第9
項に記載の方法。 0→ 第1の分析で得られた情報がコンピューターに保
存される特許請求の範囲第1.TIjに記載の方法。 (12第2の分析を行なって得た情報をコンピューター
に保存し、第1の分析の保存情報を該コンピューターに
より該第2の分析から得た情報に適用し、分析すべき細
胞のザブポピユレーションから第1および第2の型の細
胞の直接的比例分析値を得る特許請求の範囲第11項に
記載の方法。 03 サイトメトリー法がフローサイトメトリーである
特許請求の範囲第1項に記載の方法。 (14)分析すべき細胞のサブポピユレーション中の更
にもう1種の細胞成分が、該第2の抗体および該第3の
抗体で共に標識されることによシ同定される特許請求の
範囲第1項に記載の方法。 (l→ 第1の分析の保存情報の適用において、該更に
もう1mの細胞成分が別個に説、明される特許請求の範
囲第14項に記載の方法。 (IQ l釉より多くの型の妨害細胞が第2の分析を通
して同定はれ説明される特許請求の範囲第1項に記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/514,425 US4599307A (en) | 1983-07-18 | 1983-07-18 | Method for elimination of selected cell populations in analytic cytology |
US514425 | 1983-07-18 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6076666A true JPS6076666A (ja) | 1985-05-01 |
JPH058386B2 JPH058386B2 (ja) | 1993-02-02 |
Family
ID=24047070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59149282A Granted JPS6076666A (ja) | 1983-07-18 | 1984-07-18 | 分析用サイトロジ−における特定の細胞分布の除去法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4599307A (ja) |
EP (1) | EP0132064B1 (ja) |
JP (1) | JPS6076666A (ja) |
DE (1) | DE3484253D1 (ja) |
MY (1) | MY101371A (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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