JPS6076666A - 分析用サイトロジ−における特定の細胞分布の除去法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は試料中の他の粒子類に妨害されることなく、試
料中の粒子類の複数のサブポピユレーションを区別し同
定する方法および装置に関するものである９更に詳しく
は、目的の細胞の定量を妨害する性質を有する他の細胞
からの妨害なしに細胞試料中の目的の細胞の複数のサブ
ポピユレーションを区別し蛍量するための方法及び装置
に関するものである。

粒子や細胞等の検出に有用な、現在知られており入手可
能カフロースルーサイトメーター類は通常、混合物中の
細胞の１種あるいは１種以上（普通は２種）のサブポピ
ユレーションの検出のための２つのチャンネルを有する
。例えば、各々のケイ光チャンネルに対応する２つの免
疫ケイ党則で特異的に標識した細胞を検出しうる２つの
ケイ光チャンネルを有する装置が知られている。これら
の既知の装置では、分析試料中の細胞類の混合物中から
検出するケイ光色素で処理したそれぞれの種類の細胞ご
とに、回路部品およびケイ光検出器を含む完全なケイ光
チャンネルが使用されている。

従って、試料中の細胞のｈａのサフボピュレーシヨンを
フロースルーサイトメトリーを用いて検出するには、同
じ数だけのケイ光チャンネルが使用される。レーサーの
ような光源を別々に用いて標識されたそれぞれ異なる型
のケイ光色素またはケイ光染色剤が励起される。

物理的かつ形態的類似性のために、単核白血球（モノザ
イトつと１〜て知られているもう１つの単核白血球はし
ばしはリンパ球類と混同されろうこの混同に１リンパ球
のサブクラスの計測の不明確さの原因となり、調べたい
細胞や粒子についての正確さおよび再現性を多いに減じ
ることに々る。一つの試料中の２つの異なる免疫ケイ光
性染色剤を分析・定量するには、著しく異なった波長に
励起エネルギーな有する２つのレーサーまたは単一の光
源で励起てきるけれども異なった放出特性を有する２つ
のケイ光色素を用いる。２つの免疫ケイ光性染色剤の分
析に２つのレーサーを用いる装置が米国特許第３，８２
６，３６４号および第４，２８２，４１２号に記載され
ている。

血液学一般の分野において、また特に免疫血液学の分野
において、末梢抑液中を循環する種々の細胞、の数を測
定することが望まれる。細胞のサブクラスの同定を行な
い、サブクラスの計測を行なうことが、最近認識された
アクワイアード・インミューン・デフイシエンシイ・シ
ンｉ・ローム（ＡＩＤＳ）のような免疫に関連した疫病
の診断において大変興味を持たれている。とシわけ、血
液学の単核型白血球細胞であるリンパ球のサブクラスが
診療上重要性を増している。

試料中の分析すべき細胞の異なった複数のサブポピユレ
ーションを直接測定しうろことが望捷れるが、しかし、
試料が目的の細胞に似た特徴を有する他の細胞を含むと
きには、このような直接の測定は妨害はれる例が多々あ
る。例えば、血液についである種のテストを行なうに蟲
たり、血液試料中のリンパ球細胞の全体のポピユレーシ
ョンを測定・定量し１、リンパ球のポピユレーションの
百分率としてＴ細胞やＢ卸ｊ胞のポピユレーションを決
定することが望ましいであろう。しかし々から、リンパ
球細胞は単核細胞でるり、他の単核細胞、特に学核白抑
球、も血液試料中に存在している。

このような他の単核細胞はＴ−細胞やＢ−細胞の直接分
析を妨害する。同様に、Ｔ細胞のヘルパー細胞／サプレ
ッザー細胞ザブセットおよびＴ　、１．１１１胞のサプ
レッサー細胞／ナチュラルキラー細胞サブセットのよう
なリンパ球の他の異なる型の検出および定量が望まれる
場合もある。単核白血球はこのようなサブセットの分析
をも捷た妨害する。本発明はこれを考慮に人わて、イリ
た特性を有する他の細胞からの妨害なしに試料混合物中
の目的の細胞のサブポピユレーションを直接測定するの
に望丑れる要件を満足しつつ、上述した問題点の解決を
意図したものである。

リンパ球および単核白血球のそれぞれの数を計６１１１
することが望ましいであろう。このような各々の数を測
定するこれまでの技術（ｒ、１、群全体としては単核白
血球は一般にリンパ球よシも大きいという事実にたけ注
目してきた。しかし々から、リンパ球と単核白血球の間
の大きさには、かなりの重複があり、このよう々大きさ
の差による方法は成功してい々い。いくつかの疫病にお
いては小さい単核白血球が末梢血液中に豊富に存在して
おり、大きさに基づく考え方は児全に無効である。単核
白血球の同定の別法として、単核白血球に限られる酵素
反応の測定に依るものがある。しかし々から、単核ｎｎ
ｏ球の分類および同定のためのこの方法はリンパ球サブ
セットの識別において（げ役立たない。

本発明の別の一様態は同定を妨害する他の粒子を含む試
料中の目的の粒子の複数のザブポピユレーションを同定
する装置である。これらの粒子（ｄ、区別でき定量でき
る励起されうる特性を有する異なった標識剤で選択的に
標識される。本装置は流路に実質的に一度に１個の標識
した粒子を流す手段を備えている。との流路を流れる粒
子」二の標識剤を励起する手段も備えている。このよう
な励起の手段は標識された粒子上の２つあるいはそれ以
上の異なった標識剤の特性を励起することができる。励
起した標識剤が示す特性を検知する手段、検知した、定
量できる標識剤の異々る特性にょって粒子のサブポピユ
レーションを区別す乙手段、このよう々検出・標識手段
に基づく分析結果を保存し、保存された分析結果を以前
のあるいは次の分析に連用する手段も備えているり 本発明の原理によりは、数多くの利点および目的が達成
される。主として、本発明は試料中の目的とし々い粒子
あるいは細胞の妨害を受けずに試料中の粒子や細胞の複
数のサブポピユレーションの検出および同定を可能にす
る。す々わち、分析すベキ細胞のザブポピユレーション
を、２つの調製した試料を２つのレーザーフローサイト
メーターを通して流すことにより決定できる。異なる特
性を示すようにケイ光波長には十分々隔りがあるが、励
起されるスペクトル幅が単一の光源で励起されるに十分
に狭いケイ光レベルを選択することにより、２つのレー
サー励起メカニズムに匹敵する２色の免疫ケイ光結果が
得られる。

第１図は流路を流れる粒子の複数のサブポピユレーショ
ンに関するケイ光および粒子の光散乱パラメーターの測
定に特に有用なフローサイトメトリー装置の光学要素お
よび光の経路の好捷しい実施例の略図である。

第２図は血液試料のグイ光一体積相関により得られた結
果のグラフ図であり、妨害細胞の大きさが重複する事実
を示している。

第３図は本発明による第１の分析のり２７図であり、第
４図−第６図は本発明の原理によってフローサイトメー
ターを通過させ測定した、試料中のリンパ球の３つのサ
ブポピユレーションの検出および定量のグラフ図である
。

本発明は多くの異々つだ形において実施されうるが、図
に示したものおよびここで詐しく述べるものは本発明の
好ましい態様の一例であり、本発明の原理を例示するた
めにここに記載するものであり、本発明を制限するもの
ではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲およびそれに
均等の範囲により決定されるものであるととを理解され
たい。

本発明はより詳しい研究が必要である細胞の共存下に妨
害細胞の効果を調べ、その効果を除々１する方法を提供
する。同定を妨害すると思われる他の細胞を含む試料中
の目的の細胞の複数のサブポピユレーションを区別する
本発明の方法において（ｄ、目的の細胞のザブポピユレ
ーションおよび他の妨害細胞を含む試料を少なくとも２
つの部に分ける。目的の細胞を妨害する仙の細胞の第１
の分析は、まず笛１の標識剤で他の細胞の各々を、また
第２の標識剤で他の粒子の各々を標識することにより行
なわれる（各々の４Ｆ　ｉｉ＆剤は別個の放出スペクト
ルを有する９つ標識された他の妨害細胞を含むこの試料
を実質的に一度に１つの細胞を、他の妨害細胞上の２つ
の異々る標識剤の放出特性を検知するために連続的に検
知領域を通過させる。

第１の分析は、２種類の放出されたケイ光を測定し、他
の妨害細胞を計測し、分析すべき細胞のサブポピユレー
ションから他の妨害細胞を区別するために実施される。

この第１の分析で得られた情報は次いで徒での使用に備
えて保存される。

試料の第２の部については、分析すべき細胞のサブポピ
ユレーション中の一方の型の細胞を他方の粒子を標識す
るのに用いた第１の標識剤で標識゛する。分析すべき細
胞のサブポピユレーションのもう一方の型の細胞は、次
いで他方の細胞の標識に用いた第２の標識剤で標識する
っ試料の第２の部においては同時に、他方の型の妨害細
胞、も第１の分析で先に述べたように２つの標識剤で再
び碇識される９次いで、第２の部の標識細胞を、実質的
に一個づつ検知領域に通して標識細胞の特性を検知する
。次いで、各々の細胞を分析し、各々の型の細胞を区別
するために放出されるケイ光を測定することにより第２
の分析を行なう。第１の分析の保存した情報を次に適用
し、別の型の妨害細胞の効果を除去し、目的の細胞のザ
ブポピユレーションの直接的比例分析を行ない、他の型
の細胞の効果を除外する。

各標識剤は２つの色の検出が可能なように十分に波長の
異なる放出スペク）／Ｌを有するケイ光色素が好ましい
。適切々１組の標識剤としてフィコエリスリン（５７０
ｎｍにケイ光を放出するフィコビリ蛋白質）およびフル
オレツセイン（５３０ｎｍの波長に放出する）を見い出
した０第１図にフローサイトメ）　ＩＪ−装置１０の光
学および１や子フロー要素が示しである。第１図の光学
およびフロー要素は、これらの粒子の特有な性質を分析
するために実質的に一度に１つずつ液体流、中に粒子を
流すためのフローサイトメトリー装置の主な部分を示し
ている。第１図の装置の各要素は例えばＦＡＣ８（商標
）ケイ光励起ソーク−（カリフォルニア州すニーベイル
のベクトン、テイッキンソンカンパニーのＦＡＣＳシス
テムデイビションにより製造販売されている）に含捷れ
ている。

このＦＡＣ８勿類装置は研究室において幅広く応用され
ており、光分散およびケイ光に基づいて細胞ポピユレー
ションを分析し、分離する。本発明において史に詳しく
述へられる光学的およびフロー要素およｚ；ＦＡｃｓ細
胞分類装置のような装置。

において実施されているものに加えて、本発明に関連し
て有用な細胞分か装置のその他の詳細（ｄ米□国特許第
３．８２６，３６４号に記載されている。本発明は多く
の異なった型のフローサイトメーター装置、即チザンブ
ルの粒子のサブポピユレーションの同定寸たけ定量のた
めに、光散乱、粒子体積１、ケイ光あるいは他の任意の
パラメーターを泪１するものにおいても有用である。

第１図に示すように、光エネルギー−レーザーのよう々
適切な光源１２および１４によってフローサイトメトリ
ー装置に供給される。記載の実施例においては、異なっ
たケイ光特性を有する粒子の複数の異なる型を検知し定
量できるように、２つの光源がフローサイトメト１Ｊ−
ｉｆＩＱに設けであるっしかしながら、第１図に示す具
体例における２つのレーザーの設置は、単に好ましい態
様のひとつであり、本発明において１つより多くの光エ
ネルギー源および分析要素を使用する態様の１例に過ぎ
ない。更に、フローサイトメトリー装置において唯一つ
の光源が使用されている場合でも、本発明の要素は十分
に満足に利用できうる。

捷だ、必すしもレーサーのようなコヒーレント光源が必
要でないことも理商されるべきである。水銀蒸気ランプ
のような他の光源も適当でるり、いくつかの応用例では
好ましい。同様に、もし実行てき実用的ならは２つより
多くの光源が利用されるであろう。

本発明で、レーザー１２および］、４Ｈスペクトル領域
の互いに離れた特定の波長にコヒーレント光の一次放出
を生ずるように選択される。例えば、レーサー１２は好
ましく＋ｄ青／緑のスペクトル領域、に発光特性を有す
るように選択される。これにより、レーサー１２により
発生された光の中を流れる粒子に結合したケイ光色素が
、特定波長の光学的刺激により照射された時に励起され
る。本発明に有用女このよう寿レーザ′−の１つは４８
８ナノノークー（ｎ＋η）に−水放出を廟するアルコン
イオンレーサーである。レーザー１４は好まｌ、　＜　
ｉｄ、レーザー１２から離れた異かった波長にて働くよ
うに選択される。レーサー１４の波長の光学的刺激によ
り照射した時にケイ光を発するケイ光色素を有する粒子
は、これらの粒子がレーザー１４により発生した光の中
を通って流れる時に励起される。レーザー１４の％ｌ：
、レーｖ−１２のスぺ視スペクトルの黄色／赤色領Ｊｊ
？を包含する。どの要求を満たすレーザーの１つは、５
９５　ｎ＋ηに一次放出を有するローダミン６−Ｇ染料
レーデ−である。２つのレーザーの波長の差は、各々の
レーザーで少々くとも２つのケイ光色素を励起するのに
スペクトル領域の十分に外側に必ることが望ましい。７
５から１１００ｎの２つのレーザー間の波長の差が上述
の好ましい結果を与えることが見い出された。もちろん
、ケイ光色素あるいはその他の定量できる標識剤の選択
は、２つまでのケイ光色素が各々のレーザーにより供給
される光エネルギーにより励起されるように、本発明に
使用されるレーサーと適合させなければならない。

レーザー１２および１４から出た各々のビーム１６と１
８は、その平行関係を保持しぬから各ビームを拡大する
ための模式的に示したビームエキスパンダー２０．２２
を通って進行する。ビームエキスパンダーー（本発明の
操作上好捷しいが、これは必ずしも必要ではない〕から
出て来た各々の光は、フローサイトメトリー装置の小型
化を図る必要上、一般Ｖｃは光の方向を変えなければ汝
らない。このために、ビーム１６はプリズム２４と２５
により反射され、ビーム１８はプリズム２６と２８によ
り反射される。これらのプリズムのすへてｉｄ、操作中
にビームの照準を正しく合わせられるように調節できる
。

ビーム１６と１８がブリスムを通過した後、これらのビ
ームは粒子の流れ上にビームの焦点を合わせるためにレ
ンズ３０および３２に向かって進む。レンズ３０および
３２な」、もし使用されるならば、使用するフローサイ
トノドｌ）−装置の型（（尾、して］鵠択されるか、こ
れらのレンズ゛は、１９８２年３月２５日に出願され／
ζ本願と同一譲受人の米国特許出願第３６１，６７２号
の記載に従って選択はれる。

レーザービームはレンズ３０および３２を通過後粒子流
３８に向かう。本発明のフローサイトメトリー装置内に
組み込まれたノズル４０は、粒子４１を液体流３８に流
すのを促進する。この型のノズルの利用は良く知られて
おり、例えは、米国特許第３，８２６，３６４号に記載
されている。第１図かられかるように、レーサービーム
１６は光散乱チャネルの光学軸上にあり、粒子の光散乱
検出に使用される。しかしながら、ことで）ホべた光散
乱の特性は、光ビームの中を通過する粒子からの情報を
得るために光散乱に基づく典型的なフローサイトメトリ
ーの特徴を述べるために単に含めたに過ぎないっ 従って光ビーム１６はノズル４０から出て流れ３８内を
流れる粒子に当たる最初の光ビームである。この後、ビ
ーム１６は光散乱チャネルの光学軸上の光散乱遮蔽（ｏ
ｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ　）　ノ＜　−４２に達する。レ
ンズ４４により集められた散乱光は、集めた散乱光の最
大角度を測定する第一の絞り４５を通過するっ第一の絞
り４５に引き続いて、入射光線の一部を散乱検出器４８
に向けて反射し、残りの入射光を光アブソーバ−（図示
せず）ニ送るビームスプリリティックミラ−４６がある
。第２の絞シ４９は、散乱光の光源をレーサービーム１
６と流れ３８の交差点に制脈する絞シとして働く。散乱
光は、フィルター５０を通過後検知器４８で検出される
。この検出器は、周知の技術により流体流中を帷れる粒
子の大きさを評価するよう市１気的に働く。

レーサービーム１８もまた流れ３８に向いているが、流
れの垂直軸に漕ってレーザービーム１６ど隔てられてい
る。粒子により散乱されたビーム１８からの光は散乱チ
ャネル光学要素によって拾われるが、しかし好ましくは
散乱チャネル内に置かれた遮断フィルター（ジエレクト
リックフィルター〕により検知器４８からは妨げである
。

ケイ光チャネルに関しては、レーザーの異在る波長特性
により供給される照射で、予め定１つだ別々の放出スペ
クトルを有するケイ先回を順次励起することが可能であ
る。予め定められた、別々の放出スペクトルを有する２
っ１でのケイ先回を、各々のレーサーの光エネルギーに
より供給される励起エネルギーで励起する。第１図に見
られるように、２つの独立したレーサービーム１．６．
　１８ザーピーム１８を横切るように垂直に間隔を置い
て流れ３８を横切る。従って、光ビームを通過する粒子
（（よって、２絹の光学信号が牛じるであろう。これら
の組の信号は好まシ、くけ粒子が最初のビームを横切る
点から次のビームを横切る点まで移動するのに必要な時
間までに間に合うよう間隔をあけるの力ｊ良い。この時
間的間隔により２組の信号を別々に分析でき、２つの異
なる励起波長で励起された粒子のケイ光放出に比例した
信号を得ることができる。粒子から放出されたケイ光信
号は、別のビームからの屈折光を妨げる遮蔽バー５４の
まわシに導かれる。すべてのケイ光信号は、好寸しくは
特定の波長の光だけを通過させる第１のフィルター５６
を通して、レンズ５５により焦点に集められる。

光ビーム１６により励起された粒子により放出されたケ
イ光は、フィルター５６を通過後、次に二色性ミラー５
８に入る。二色性ミラー５８の目的はケイ光の光路を通
過してきた２つの異なった右かＸ谷ｔｅｌ　−シ七　ζ
ルＩ＋４ＩＩ　ｐ、　Ｉｙム珀−芥＝　ｚ　ｙ　久１ｒ
ネることである。例えは、二色性ミラー５８は例えばレ
ーザー１２によってだ１丁発生する光ビーム１６によシ
励起された粒子の異なる色波長を分離するように選択さ
れるであろう。例えば、青い領域の波長幻二色性ミラー
５６を通して、次いでただ一色の範ＩＪ＋１（この例で
ｒＪ青）の波長を通過するようテザインされたバリヤー
フィルター５９を通して通過するでろろう。青い光は次
いでケイ光検出器６０に入る。

緑色の領）埃の二色性ミラーに入った光は、１ったけの
合（この場合は緑〕の領域の波長を通過させるバリヤー
フィルター６１を通して二色性ミラーに」：り反射され
る。ケイ光検出器６２が次いてこの緑色の光を受け入れ
る。

光ビームＪ８も捷／ζ、光ビーム１６にょシ励起される
ケイ光電とは異なった２つ才でのケイ光電を励起するの
に十分な単一の波長の励起エネルギーを供給する。光ビ
ーム１８にょシ励起された粒子から放出されたケイ光は
レンズ５５およヒ第１のフィルター５６を通過した後、
この光はもう一方の二合性ミラー６４に達する。二色性
ミラー５８についてのべｅ載と同様に、この様２の二色
性ミラー６４は色スペクトルの異なる２つの領域の波長
を分離するために選択される。例えば、レーサー１４か
ら発した光ビーム１８により供給される単一の励起源の
結果として黄および赤の信号が生じた場合、黄色領域の
波長は二色性ミラー６４、次いで、黄色の領域の波長だ
けを通過するよう設計されているバリヤーフィルター６
５を通して通過する。この光は、次にケイ光検出器６６
に向かう。赤の領域の波長は二色性ミラーにより反射さ
れ、バリヤーフィルター６８を通してその後この光はケ
イ光検出器６９に入る。従って、各々の発光特性の対応
する波長で２つ捷での異なるケイ光色素を励起しうる２
つのレーサーからの光は、上述のよう々フローサイトメ
トリー装置に試料を一度流す間にその試料中の粒子の複
数のザブポピユレーションの検出および定量を可能にす
る。

ケイ光検出器６０．６２．６６および６９け好ましくは
それぞれ４つの分けられた青、緑、黄および赤の光を受
け入れるようになっているへこれらのケイ光検出器は光
学的信刊を電気的信号に変換する低ノイズ光電倍増管あ
るいはそれと同等な装置である。これらの電気的信号は
次いで、分析また幻その他の目的のためにフローサイト
メトリー装置のエレクトロニクス（図示せず）に電気的
に供給され処理される。種々の表示、情報取り出し、テ
ータ蓄粕あるいは記録法がフローサイトメトリー装置に
おいて行なわ、ｌするであろう。本発明の１つの態様に
よれは、コンピューター７１が、第１の分析の結果を保
存し、細胞のサブポピユレーションの直接同定を行う−
Ｎ（、第２の分析に応用するために用意されている。

本発明の操作を単に例示のために以下の実施例として記
載するっこの具体例は、試料中の粒子類の複数のザブポ
ピユレーションを検出し、区別し、および／捷たは定量
するための技術を例示するためのものであり、限定的な
ものでは々い。

実施例１ 本実施例において（ｑ、リンパ球の２棟の成分ちるいは
副成分（サブセット）、すなわぢＴ細胞およびＢ細胞の
量がヒトの血液中の全リンパ球に対する百分率で直接決
定される。

単核白血球上の細胞表面マーカーに特異的な抗体である
抗−ｌｅｕＭ３の同じ割合を使用し、夫々励起された場
合、可視スペクトルのオレンジ色領域またはその付近で
ある５７０ナノメートルのケイ光を放射する免疫ケイ光
染色剤であるフィコエリスリン（ＰＥ）及び励起された
場合、色スペクトルの緑色領域内に位置する５３０ナノ
メートルの波長のケイ光を放射する免疫ケイ光染色剤で
あるフルオレセイン・インチオシアネー）（ＦＩＴＣ）
により標識し′Ｐｃつこの試薬として、最初に抗体をＰ
Ｅで標識した後、通常の方法で精製し次にＦＩＴＣで再
び標識した後、最後の精製を行々つて二重に標識された
一つの抗体を調製してもよい。

本実施例においては、抗体はＬｅｕＭ３　として知られ
ている単核白血球に対するモノクローナル抗体であり、
二重に標識された試薬はダブルＩ、ｅｕＭ３　（ＤＬＭ
３　）　と表示される。

非凝固全面サンプルを次のようにして準備した。

単核細胞分画（ｉｔ　、たとえばフィコルーバク（Ｆｉ
ｃｏｌ　１−Ｐａｑｕｅ）（ファルマシア　ファインケ
ミカルズ社の商品名）のような密度勾配溶液上に全血液
サンプルを注意深く層状にのせ、その層状のサンプルを
４００ＸＧ（重力加速度）で３０分から４０分間遠心分
離した後、溶液界面の細胞の層を分離することによシ調
製したりこの単核細胞分画を細胞か生存できるようにバ
ランスされ、緩衝化された塩溶液（ＢＳＳ）　により繰
り返し洗浄した。洗浄は最初ＢＳＳを加えてから遠心分
離し、上澄を除去した後、新たなりＳＳに細胞を再懸濁
することにより行なった。

最後の洗浄が終わった後、細胞を再び＠濁させ、十分な
量のＢＳＳを加えてｌωあたり約百万個の＃ｊ胞が存在
するようにした。少なくとも２つの分画が再懸濁したサ
ンプルから作られ、しかもこれらは分析前に調製された
。

最初の分析のため、懸濁した細胞のうち０．０２ｃｃ（
２０マイクロリツトル〕をＤＬＭ３試薬０．０２ＣＣと
溶合する。細胞と鄭゛薬の両方を、混合時およびそれよ
りＶ２時間の間Ｏ０々いし４℃に保持する０し２時間の
インキュベーション後、１チのホルムアルデヒドを５マ
イクロリットルさらに加乏てからサンプルを混合し２、
角び」一連したように洗浄した。このようにして、分析
用の最初のサンプルがＴｈ　＆ｊされるう 最初のサンプルを主に４８８　ｎｍで照射するフローサ
イトメトリー装置の中をｊ山し２だ。フローサイトメト
リー装置の中を実質上一度に一細胞づつ辿珈する細胞に
よシ与えられる光学的信号が検知され、この信号を第３
図に示されるようにプリントアウトした。

第３図で示されるように、この最初の分析の結果は細胞
類の２つのポピユレーションの分離である。１つのポピ
ユレーション（第３図中、Ａ２を伺ｉ−た細波）は、抗
−ＬｅｕＭ３抗体がこのポピユレーションと反応した事
実から、単核白血球を表わしている。この試薬はＤＬＭ
、３であり、生じる単核白血球ポピユレーションは、緑
色のケイ光を示ずＦ’ＬＩと赤かのケイ光を示すＦｌ、
２の両方で（票６１スされている。こわと対照的に、細
胞類の主な部分は完全に：＋ｕＦ染色のＡ４を付した領
域内に存在干る。こわ粛リンパ球のポピユレーションで
ある。

一方あるいは４１し方のみのグイ光ｆｈ素で神漉された
紳胞類ｒ／ゴ５チＪン下しか存在しない。たとえば、単
核白面＝が単核細胞中の１８４％を占め、Ａ４領域内に
見らＪ″Ｌるリンパ球が７８８％であると決定された。

２回目の分析のために調製された細胞懸濁液の第二分画
を第二の抗体試薬と処理する。この第二の抗体試薬はＴ
細胞全体に対するモノクローナル抗体の混合物すなわち
ＰＥで標静された抗−Ｌｅｔ１２ａと抗−Ｌｅｕ３Ｂと
の混合物、さらに表面の免疫グロブリンに対するポリク
ローナル抗体、すなわちＦＩＴＣで標５２１６された抗
−ＩｇＭと抗−ＩｇＤ、およＯ・、Ａ’＋ｉ述したよう
な抗単核白血球試薬であるＤＬＭ　３から成り立ってい
る。第二分画のインキュベーション、固定および洗浄の
工程は最初の分画を処理した工程と同一である。こうし
て第二分画サンプルが分析のために準備され、フローサ
イトメトリー装置を通すことにより分析されて第４に示
す分析プロットを与えた。

第４図に示されるように、単核白血球のポピユレーショ
ンは、やはり赤色および緑色の両方のケイ光が陽性の領
域、すなわちＢ２を付した領域に見られる。単核白血球
（（加えてそれ以外の細胞類も壕だ時々このＢ２領域内
に見られる。これらはＴ＝＋胞試薬およびＢ細胞試薬の
両方で標識される細胞類である。これらのゴ十Ｂ＋細胞
プηの個数は最初の分画でＡ２領域内に存在する単核白
血球の個数を第二分画のＢ２領域内に数えられる細胞類
の全個数から差し引くことにより決定されるであろう。

第４図からさらにゎ力・るように、Ｂｌｌ職域も細胞類
が存在しておｐ、これらはＴ細胞としてのみ標識された
細胞類でるる。Ｂ３領域にも細胞類が存在しており、こ
れらＶｉ　Ｂ　ｆｌａ胞としてのみ標識された細胞類で
ある。

表１は同一の単核細胞サンプルの第一および第二分画の
測定、分類および計測を行々うことにより得られる数値
結果を示している。

表　１ 分画Ａ　分画Ｂ　分画”と３ の相関 領域　全数　条　全数　係　全数　係 １　２２８　２．３　６６６５　６８．２　６６６５　
７７．５２　１、］、８２　１２．１　１３５９　１．
３．９　１７６　２．０３　１８　０．２　２５１　２
．６　２５１　２．９４　８３０９　８５．３　１．５
０２　１５．４　１５０２　１７．５計　９７３７　９
７７７　８５９４ 表１の３欄目は次に示すような方法による分画Ａの結果
と分画Ｂとの相関関係を示している。Ａ２領域内に認め
られる単核白血球数を分画Ａ内の９７３７という全細胞
数から差し引くことにより、リンパ球の全数である８５
５５が得られる。この数８５５５は計は結果の分母とな
る。Ａ２における単核白血球の数をＢ２領域における細
胞数から差し引くことにより、Ｔ細胞およびＢ細胞とし
て標識された単核白血球ではない細胞の数（１，３５９
−１１８３）すなわち１７６が得られる。それぞれの型
の細胞の割合が、８５９４という分母（相関全数）をも
とにして再計算される。従って、リンパ球だけに対する
割合として表わｊ〜だ場合には、Ｔ細胞の割合は７７５
係、Ｂ細胞の割合は２９係となる。この相関計算をしな
い場合には、Ｔ細胞は６８２チ、Ｂ細胞け２６弼となる
。このような相違が認められたことは単核白血球の存在
が無視された場合、即わち現在性なわれている分析／ス
テムでは誤差の可能性があることを示している。

別の例として、準備した単核細胞の第三分画を第三の試
薬と混合する。第三の試薬はサプレッサー細胞の表面マ
ーカーである抗−Ｌｅｌ１２ａをＰＥで標識した抗体、
およびへ・ルバー細胞の表面マーカーである抗−Ｌｅｕ
３ａをＦＩＴＣで標識した抗体にさらに第一分画で用い
られたＤ　Ｌ　Ｍ　３の溶液からなる。混合、インキュ
ベーション、固定、洗浄および計測を既述したように行
なう。結果を図５に示し、表２に１とめた。

さらにもう１つの例として、準備した単核細胞の第四分
画を第四の試薬と混合する。第四の試薬はＰＥで標識さ
れた抗−Ｌｅｕ２ａとナチュラルキラー細胞の表面マー
カーに対するモノクローナル抗体である抗−Ｌｅｕ７か
ＦＴＴＣで標識された抗体、さらにＤＬＭ３の溶液から
なる。混合、インキユベーシヨン、固定、洗浄および計
測を既述したように行なう。結果を第６図に示し、表２
にまとめた。

表２ 分画Ｃ分画ＡとＣの相関 領域　全数　チ　全数　係 １　３４１８　３５．２　３４１８　４０．１２　１５
２２　１５．７　３４．８　４．１３　２８６５　２９
．５　’２８６５　３３．６４　１８９６　１９．５　
１８９６　２２．２計　９７０１　８５２７ 表　２（続き） 分画Ｄ　分画ＡとＤの相関 領域　全数　係　全数　係 ］　１２９６　１３．５　１２９６　１５．３２　３６
１．５　３７．６　２’４．５１．　２９３　１１．２
８　１＋、７　１．１２８　１３．３４　３５８４　３
７．２　３５８４　４２．３計　９６２３　８４．５９ さらに計算することにより、サプレッサー細胞の全フラ
クションは４４２％で、そのうち４１％がヘルパー細胞
としても標識されていること、また、サプレッサー細胞
の全フラクションが４４３係でそのうち２９チがナチュ
ラルキラー細胞であることがわかる。４４２％と４４３
％の相違は方法の再現性の範囲内であり、および５回の
相関もしくは比較結果の中で、商の四捨五入を行なった
ことにより生じた誤差である。示した例の中で、細胞類
は抗−Ｌｅｕ　’；ｉａおよび抗−Ｌｅｕ７の両方で標
識されているように思われる。

Ｂ４．Ｃ４およびＢ４領域はリンパ球の全ポビニレ−ジ
ョンの一部分と考えられる標識されていないリンパ球を
含んでいる。

実施例２ 本実施例においては、２つの咽の妨害細胞が耐力゛によ
り分Ｇｅ１Ｆされる例を示す１．２つの！（すの妨害細
胞を１７別する特徴は興味あるザブ集団の分類を行なう
間、保持される１、 本実施例（ｌこおける最初のザンブルはヘバリンニより
抗凝固処理した全血液であるが、ｇＤＴＡや酸−クエン
酸−デギストロース溶液といった違う種モ用の抗凝固剤
でも十分である３、この液体力／プルは少なくとも２つ
の分画に分けられる。

第一分画のための試薬（ｄ　Ｌ　ｅ　ｕ　Ｍ　３に対す
る抗体（ＰＥで標識されている）を含み、ＬｅｕＭＩに
対する抗体（Ｆ　Ｊ　Ｔ　Ｃで標識されている）も含み
、血液ｐＨや浸透圧に近くなるようにそれらを維持する
ため緩衝された塩溶液となっている。

Ｌｅ　１１　Ｍ　１とＴ、ｅｕＭ３は両方とも単核白血
球の細胞表面マーカーである。Ｉ、ｅｕＭｌは顆粒白血
球と単核白血球の細胞表面マーカーである。この試薬を
全血液の第一分画とともに４℃で３０分間インキュベー
トスル。インキュヘーンヨンノ後、全血液中の赤血球細
胞（ＲＢＣ）部分を、たとえばそれぞれの細胞の内外間
の浸透圧関係を崩すことにより消失させる。溶血の正確
な方法は白血球細胞（ＷＢＣ）が適正に保持されている
限り、本実施例にとって重要ではない。ある溶血１タリ
においては、ＲＢＣを蒸留水を用いて溶血し、一方、水
に溶解した少壮のホルムアルデヒドを目的細胞類（すな
わちリンパ球）と２つの型の妨害細胞（すなわち畦核白
血球と顆粒白血球）の両方を含むＷＢＣの保存剤として
用いる１−。

第一分画が前述したように２色のフローザイトメトリー
装置を通され、個々の細胞類について測定される螢丸が
２色、１色、色なしのいずれであるかによって４つの成
分のうちの１つに帰属される。従って、この第１分画中
では２つの型の妨害細胞が区別して同定される。なぜ々
ら、顆粒白血球は抗−ＬｅｕＭまたけで標識されておシ
、従ってケイ光は緑色だけである。一方、単核白血球は
抗−ＬｅｌＪＭｌと抗−ＬｅｕＭ３の両方で標識されて
おり、従ってノ１イ光は赤色と緑色の両方だからである
。４つの成分に帰属された細胞傾は別々に数えられ、数
値が保存される。

全血液の第二分画も同様に処理され、溶血され、開側さ
れる。しかし、この第二分画では、試薬が抗−■、ｅｕ
Ｍｌ−（ＦＩＰＣで標識されたもの）と抗−ＬｅｕＭ３
（ＰＥで標識されたもの）以外に、Ｔ細胞のザプトンサ
ーサブセノトを認識するＰＥで標識されたＬｅｕ２ａに
対する抗体、およびナチュラルキラー細胞・類を認識す
るＦＩＴＣで標識されたｌ−４（■１７に対する抗体も
含んでいる。このインキュ／＼−ンヨ／の後、フローザ
イトメーターの中で行なわ１１．た細胞類の分類による
と、サプレッサー、￥ＩＩＩＩＮは赤色のケイ光だけを
発し、単核白血球およびサプレッサーマーカーとナチュ
ラルキラーマーカーの両方を有する細胞類は赤色と緑色
の両方のケイ光を発し、−力、顆粒白血球とナチュラル
キラー細胞類は緑色のケイ光だけを発することがわかっ
た５゜ 第一分画の数値を第二分画の数値と相関させることによ
り、顆粒白血球と単核白血球の両方からの妨害が排除さ
れ、一方、ザブレツザーａ胞、ナチュラルキラー細胞お
よびサプレッサーマーカーとナチュラルキラーマーカー
の両方を有する細胞類はり７３球のみに対する割合とし
て計算される。

実施例３ 上述のそれぞれの実施例においては、第一分画は相関４
算のだめのものとして使用される１：。

次に示す実施例においては、３つの異なるケイ光染色剤
が用いられ、別々に測定される。第一分画においては、
単核白血球はＬｅｕＭ３（ＰＥで標識されたもの）とＬ
ｅｕＭｌ　（ＦＩＴＣで標識されたもの）で染色され、
一方、顆粒白血球はＬｅｕＭ　１．　（Ｆ　Ｔ　Ｔ　Ｃ
で標識されたもの）で染色される。

この第一分画の測定と分類により、単核白血球１ｄ赤色
と緑色のケイ光を発し、−方、顆粒白血球は緑色のゲイ
光だけを発することがわかる。

第二分画に使用する試薬は、抗−Ｌｅ　ｕ　Ｍ　３　（
ＰＥで標識されたもの）と抗−ＬｅｕＭｌ（ＦＴＴＣで
標識されたもの）以外に、ナチュラルキラー細胞と顆：
べｉ白血球を同定するもう１つのマーカーであるＩ、ｅ
ｌｆ　ｌ　ｌに対する抗体を含んでいる。杭−Ｌｅｕ］
　１ｆｄ、’５４３　ｎｍの光で励起した場合、深紅色
のノ１イ光を発するケイ光染色剤であるアロフィコシア
ニンにより標識されている。さらに、この第二分画のだ
めの試薬は、抗−Ｌｅｕ　２　；］　Ｉ　ＰＥで標識さ
れたもの）と抗−Ｌｅｕ　７　（ＦＩＴＣで標識された
もの）も含んでいる。三色フローサイトメトリーを通し
た後、細胞類を８種の成分に分類できる。

即−ち、三色とも有する場合−成分、色無しの場合−成
分、−色だけの場合三成分、二色の場合三成分の計８種
の成分に分類される。

本実施例においては、単核白血球ｆｄ赤色と緑色、顆粒
白血球は深紅色と緑色、サプレッサー細胞は赤色たけ、
抗−Ｌｅｕ７のみで同定されるナチュラルキラー細胞は
緑色だけ、抗−Ｌｅｕｌｌのみで同定されるナチュラル
キラー細胞は深紅色だけ、■、ｅｕ７マーカーも有する
サプレッサー細胞は赤色と緑色、Ｌｅｕ　７とＬｅｕ　
ｌ　ｌマーカーも有するナチュラルキラー細胞は緑色と
深紅色のケイ光を発する。

さらに、３つのマーカー、Ｌｅｕ　２、Ｌｅｕ７、Ｌｅ
ｕｌｌをすべて有する細＋ａ　ｐｉは３色全部のケイ光
を発する。イ０し、そのような細胞類は現在のところ知
られていない。第一分画と第二分画の結果の相関により
、Ｌｅｕ２＋リンパ球全部、Ｌｅｕ７→−リンパ球全部
、Ｌｅｕ　ｌ　ｌ　−１−ｌ）ンバ球全部がリンパ球中
でしめる割合を計算することが可能であり、サプレッサ
ーまだはナチュラルキラーマーカーのいくつかの組合せ
を有するリンパ球のしめる割合も計算することが可能で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は流路を流れる粒子の複数のサブポピユレーショ
ンに関するケイ光および粒子の光散乱パラメーターの測
定に特に有用なフローサイトメトリー装置の光学要素お
よび光の経路の好捷しい実施例の略図である。 第２図は血液試料のケイ光一体積相関により得られた結
果のグラフ図であり、妨害細胞の大きさが重複する事実
を示している。 第３Ｍは本発明による第１の分析のグラフ図であり、第
４図〜第６図は本発明の原理によってフローサイトメト
リーを通過させ測定した、試料中のリンパ球の３つのサ
ブポピュレーショ／の検出および定性のグラフ図である
。 特許出願人　ヘクトン・デイツキンンン・アンド・カン
ノぐニー （外５名） 手続補正書（方式） 昭和、５７年７７月７日 昭和ｄ年介貸願第　／Ｌ／、シュ・？工号勺−才７７１
羽サイ　１−ロー／゛−１−おり−る　二ｎグ（ａ　子
日刀を乙イ〃２二ン１１−ｎ住所 名１１　ヘク１−／　ディッＸン′／ン　アンｌ’・カ
ン／（Ｚ−５補正命令の日付　昭和ｔ７年１０月・）１
０日（発送日）６袖正の対象 図　面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）　分析ずべき細胞類のサブポピユレーショ
   ンを形成する少なくとも２種（第１および第２の型とい
   う）の細胞および該サブポピユレーションの同定を妨害
   する少なくとも１袖（第３の型という）の細胞を包含す
   る試料の分析に除して、（ｂ）　試料を少なくとも２つ
   の部に分画し、（Ｃ）　第３の型の細胞に特異的である
   が、前記サブポピユレーションの細胞、にけ特異的でな
   い第１の抗体を、各々別々の放出スペクトルを有する少
   なくとも２種のケイ光色素で標識し、 （ｄ）　前記分画試料の第１の部と前記の異々るケイ光
   色素で標識された第１の抗体との混合物を作成して、第
   ３の型の細胞を該第１の抗体で標識し、（ｅ）　上記の
   各型のケイ光色素を励起するために、サイトメトリー法
   によって上記試料の第１の部の混合物に励起エネルギー
   を与え、 （ｆｌ　各々の細胞を分析して放出されるケイ光を測定
   し、第３の型の細胞を計測して、前記サブポピユレーシ
   ョンから該第３の型の細胞を区別することにより第１の
   分析を行ない、 （ｇ）　該第１の分析により得た情報を保存し、（ｈ）
   　前記サブポピユレーションの第１の型の細胞に特異的
   々第２の抗体を、前記第１の抗体を標識するために使用
   されたケイ光色素の少なくとも１８Ｌで標識し、 （ｉ）　前記サブポピユレーションの第２の型の細胞に
   特異的な第３の抗体を、前記第１の抗体を標識するため
   に使用されたケイ光色素の少なくとも別の一種で標識し
   、 （ｊ）　異なるケイ光色素で標識された前記第１の抗体
   蛋白、（ｈ）で標識された第２の抗体蛋白および（ｉ）
   で標識された第３の抗体蛋白と、分画試料の第２の部と
   の混合物を作成することによって、各型の細胞に特異的
   な抗体で第１、第２および第３の細胞を標識し、 （１０−に？、５”試料の第２の部の混合物にサイトメ
   トリー法により励起エネルギーを与え、ケイ光色素の各
   々の型を励起させ、 （ｔ）各々の細胞を分析して放出されるケイ光を測定し
   、第１、第２および第３の型の細胞を計′６１１１し、
   各々の型の細胞ケ区別することにより第２の分析を行な
   い、 （ｎ■　前記第１の分析の保存情報を加えて、第３の凋
   の細胞の効果を除き、分析すべきサブポピユレーション
   の第１およＯ・第２の型の細胞の直接的比率を分析する
   、 ことを特徴とする分析ずべき細胞のザブポピユレーショ
   ンを他の細胞に妨害されることなく同定する方法。 （２）分析すべき細胞のサブポピユレーションがＴ細胞
   およびＢ細胞を包含する特許請求の範囲第１項に記載の
   方法、 （３）細胞のサブポピユレーションがヘルパー細胞およ
   びサプレッサー細胞を包含する特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 （４）　＃ｌ胞のサブポピユレーションがサプレッサー
   細胞およびナチュラルキラー細胞を包含する特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 （５）ザブポピユレーション細胞を妨害する第３の型の
   細胞が単核白血球である特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。 （６）第３の型の妨害細胞が単核白血球である特許請求
   の範囲第２項に記載の方法。 （７）第３の型の妨害細胞が単核白血球である特許請求
   の範囲第３項に記載の方法っ （８）第３の型の妨害細胞が単核白血球である特許請求
   の範囲第４項に記載の方法。 （９）試料が末梢血液試料である特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 （ＩＱ　特許請求の範囲第１項の操作（ｂ）から操作（
   ■を行なうのに先立って、末梢血液試料を処理して単核
   白血球細胞フラクションを回収する特許請求の範囲第９
   項に記載の方法。 ０→　第１の分析で得られた情報がコンピューターに保
   存される特許請求の範囲第１．ＴＩｊに記載の方法。 （１２第２の分析を行なって得た情報をコンピューター
   に保存し、第１の分析の保存情報を該コンピューターに
   より該第２の分析から得た情報に適用し、分析すべき細
   胞のザブポピユレーションから第１および第２の型の細
   胞の直接的比例分析値を得る特許請求の範囲第１１項に
   記載の方法。 ０３　サイトメトリー法がフローサイトメトリーである
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （１４）分析すべき細胞のサブポピユレーション中の更
   にもう１種の細胞成分が、該第２の抗体および該第３の
   抗体で共に標識されることによシ同定される特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 （ｌ→　第１の分析の保存情報の適用において、該更に
   もう１ｍの細胞成分が別個に説、明される特許請求の範
   囲第１４項に記載の方法。 （ＩＱ　ｌ釉より多くの型の妨害細胞が第２の分析を通
   して同定はれ説明される特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。