JPS63304998A - 新規な過酸化水素の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、キサンチンオキシダーゼ（以下、ＸＯＤと略
称する。）の作用を介して生成する過酸化水素を定量す
ることにより行う、例えば核酸代謝に関与する物質の改
善された定量方法に関する。

［発明の背景］ 核酸代謝に関与する酵素であるグアナーゼ、アデノシン
デアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスポリラーゼ等、
或はそれらの酵素による代謝産物であるイノシン、ヒボ
キサンチン、キサンチン等、又はプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼの基質となる無機リン等は、臨床検査の分
野に於いては、重要な測定項目の一つであり、これらの
正確で簡便な測定法の確立は近時重要な課題となってき
ている。

これら核酸代謝に関与する物質の測定法としては、例え
ばグアナーゼの場合には基質プリンの減少を紫外部吸光
度変化で測定する方法（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
、２ｉ、　１２４頁、　１９５０）、生成物であるアン
モニアを測定する方法（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、Ｊ、
７．５２４頁、　＋９５２）、生成物であるキサンチン
にＸＯＤを作用させて生じる尿酸を測定するか（Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、−■Ｊ、４６１頁。

１９４７）、或は過酸化水素を測定する方法（Ｃｈｅｇ
ｇ、Ｐｈａｒ＋ｍ、Ｂｕｌ　１．、川、４２６頁、１９
８１）等が知られている。また、アデノシンデアミナー
ゼの測定については、生成物であるアンモニアを測定す
る方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、１６７．４４５頁、１９４７）、プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ及びＸＯＤを介在させること
によ、り生成物のイノシンを尿酸と過酸化水素に変換さ
せ、生じた過酸化水素を測定する方法（Ｃｈｅｍ、Ｐｈ
ａｒ嘗、Ｂｕｌｌ、、２９，４２６頁、１９８１）等が
知られティる。

しかし、アンモニアを測定する方法、基質プリンの減少
を紫外部吸光度変化で測定する方法或は生成物である尿
酸を測定する方法では試料中の内因性アンモニア、紫外
吸光物質或は尿酸の影響を受けるため試料ブランク値の
測定を実施しても、測定結果が不正確となる場合がある
。

一方、ヒボキサンチン（或はキサンチン）を基質として
、ＸＯＤの作用により生成する過酸化水素を測定する方
法に於いては、過酸化水素のほかにもスーパーオキサイ
ドアニオン（０蒼）が同時に生成し、しかも過酸化水素
とスーパーオキサイドアニオンの生成比はｐＨ或は基質
濃度によって変化しくＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、３Ｊ
、１．４０５３頁、１９７０）、過酸化水素とスーパー
オキサイドアニオンが直接反応して過酸化水素が分解さ
れたり、或は過酸化水素とパーオキシダーゼ（以下、Ｐ
ＯＤと略称する。）の反応を介して生成する色素をスー
パーオキサイドアニオンが還元したりするために、実測
された過酸化水素生成量は紫外部吸光度測定により求め
た基質減少量から算出した過酸化水素の理論的生成量よ
りも低かったり、生成する色素量が過酸化水素の理論的
生成量に比例しないと言う現象が生じ、しかもこのよう
な現象は測定条件により変化するため、この反応を利用
して物質の定量を行った場合には低濃度域での測定しか
信頼性がない等の問題があった。

その為、ＸＯＤの作用により生成する過酸化水素を測定
する方法に於いてはこれらの問題点を解決すべく種々の
方法、例えばスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）
を共存させ、反応後に液性を酸性とする方法（特公昭５
９−６６８９９号公報）、或は反応液の液性を一旦酸性
とした後に発色試薬を加えて比色定量する方法（特公昭
５９−２２８０号公報）等が報告されている。しかしな
がら、これらの方法は測定のステップ数が増加する為操
作が繁雑となるし、酵素活性を測定するための所謂レイ
ト法には適用てきないものであフた。また、これら以外
にも微生物由来の特別なＸＯＤを使用することにより上
記問題点を回避している報告（特公昭５５−１０８２９
８号公報）もあるがこれに使用できる酵素（ＸＯＤ）は
限定されており、更なる改良が望まれていた。

また、無機リンの測定方法としては、Ｆｉｓｋｅ−５ｕ
ｂｂａＲｏｗ法（Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、、ｆｉｆ
ｉ、３７５頁、１９２５）が一般に用いられているが、
強酸を使用している為に、自動分析装置の使用材料への
影響が懸念され、新規な、自動分析装置への応用が可能
な測定法の確立が望まれていた。

［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、Ｘ
ＯＤの作用を介して生成する過酸化水素の定量方法に於
いて、従来より改善が求められていた種々の問題点をす
べて解決（、た、正確で簡便な定量方法を提供すること
を目的とする。

［発明の構成］ 本発明の目的を達成する為に、本発明は次の構成よりな
る。

ｒＸＯＤの作用を介して生成する過酸化水素の測定方法
に於いて、過酸化水素生成系にスーパーオキサイドアニ
オン消去剤としてのヒドロキシルアミン及び／又はその
誘導体を加えて、これを行うことを特徴とする過酸化水
素の定量方法。」即ち、本発明者らは、例えばヒボキサ
ンチン、或はキサンチンにＸＯＤが作用して生ずる過酸
化水素を測定するに当り、過酸化水素と同時に生へする
スーパーオキサイドアニオンに起因して生ずる種々の問
題点を解決すべく、スーパーオキサイドアニオンのみを
選択的に分解するが、生成した過酸化水素及びその測定
には何ら影響を及ぼさない物質について鋭意研究を重ね
た結果、ヒドロキシルアミン及びその誘導体（以下、ヒ
ドロキシルアミン類と称す。）が、その目的を達成し得
るものであることを見出し、本発明を完成するに至った
。

ヒドロキシルアミン類は、これまで、チトクロームＣ、
テトラゾリウム塩類にトロテトラゾリウムブルー等）、
ピロガロール等と同様に、ＳＯＤ測定時に於けるスーパ
ーオキサイドアニオンの検出剤として、或は生体内のス
ーパーオキサイドアニオンの検出剤として用いられてい
る例はあるが、本発明の如＜　ＸＯＤの作用を介して生
成する過酸化水素の定量方法に於いてスーパーオキサイ
ドアニオンを消去する目的でこれが用いられた例はこれ
までに未だない。また、ヒドロキシルアミン類と同様に
ＳＯＤ測定時に於けるスーパーオキサイドアニオンの検
出剤として、或は生体内のスーパーオキサイドアニオン
の検出剤として用いられているチトクロームＣ、テトラ
ゾリウム塩類にトロテトラゾリウムブルー等）、ピロガ
ロール等をスーパーオキサイドアニオンの消去剤として
用いた場合には、これらは全てスーパーオキサイドアニ
オンとの反応が（スーパーオキサイドアニオンの消去速
度が）Ｎく、しかもスーパーオキサイドアニオンとの反
応により着色することもあって、これらをスーパーオキ
サイドアニオン消去剤として、ＸＯＤを介して生成する
過酸化水素を測定すると、一様に検量線が湾曲するとい
う現象が見られるのに対し、本発明に係わるヒドロキシ
ルアミン類をスーパーオキサイドアニオン消去剤として
用いた場合には、スーパーオキサイドアニオンを速やか
に且つ殆ど完全に消去し、過酸化水素測定に於いて、良
好な直線性を有する検量線が得られることということは
極めて意外なことであった。

本発明に用いられるヒドロキシルアミン及びその誘導体
としては、例えばヒドロキシルアミン、Ｎ−メチルヒド
ロキシルアミン、０−メチルヒドロキ塩 ジルアミン及びこれらの鉱酸塩（塩酸塩、ｆＩＲｉ）等
が挙げられるが、スーパーオキサイドアニオンの消去剤
として使用でき、かっＸＯＤを介して生成する過酸化水
素を測定する反応を阻害しないヒドロキシルアミン類で
あれば特にこれらに限定することなく用いることができ
る。また、これらヒドロキシルアミン類は夫々単独で用
いてもよいし、適宜２種以上組み合わせて用いてもよく
、その使用量としては、過酸化水素生成系内に合計で少
なくとも０．００１５Ｍ以上存在させることが最低必要
条件であるが、通常０．Ｏ１〜０．２ｍＭの範囲が好ま
しく用いられる。

本発明の方法により測定可能な物質としては、例えばＸ
ＯＤの基質となるキサ゛′ンチン、ヒボキサンチン等、
或は適当な酵素反応によりこれらの物質に変換されるア
デノシン、イノシン、グアニン等、又は上記した如き物
質を産生ずるアデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、グアナーゼ等の酵素類及び無機リ
ン等が挙げられるが、最終的にＸＯＤの作用により過酸
化水素を発生させる反応系に導けるものであれば特に限
定されない。

本発明に用いられるＸＯＤは牛乳由来及び微生物由来の
いずれのものでもよい。

本発明の定量方法は、過酸化水素生成系にヒドロキシル
アミン類を加えること以外は、ＸＯＤの作用を介して生
成する過酸化水素をＰＯＤと被酸化性呈色試薬を用いて
比色定量する自体公知の方法に従ってこれを行えばよく
、用いられる測定試薬も、自体公知の測定法に於いて用
いられる試薬を用いることで足りる。即ち、ＰＯＤは植
物由来、動物由来、微生物由来のいずれにてもよいが、
通常は西洋ワサビ由来のものが好ましく用いられる。

被酸化性呈色試薬としては通常過酸化水素−Ｐ。

Ｄ系で用いられている、例えば４−アミノアンチピリン
と、フェノール系化合物又はＮ、Ｎ−ジ置換アニリン系
化合物とを組み合わせた被酸化性呈色試薬、３−メチル
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン
系化合物との絹み合わせ試薬、トリフェニルメタン系ロ
イコ色素、ベンゾジン誘導体、０−トリジン誘導体、ジ
フェニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体
、ロイコメチレンブルー誘導体、０−フェニレンジアミ
ン、２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）又はその塩などが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。また、測定試東の液
性の調整に用いられる緩衝剤も通常使用されるものであ
れば特に限定されないが、例えばリン酸塩緩衝剤、トリ
ス緩衝剤、グツド緩衝剤等が挙げられる。但し、ｊ！！
機リシリン定には、リン酸塩緩衝剤以外の緩衝剤を使用
しなくてはならないことは言うまでもない。測定試薬の
液性（ｐＨ）は、測定対象物質、ＸＯＤと共役して用い
られる酵素等の至適ｐＨ等の考慮が必要であるが、通常
はｐＨ６〜１０の範囲が好ましく用いられる。測定時の
温度としては、目的とする反応が進行する温度であれば
特に限定されないが、通常２５〜４０℃の範囲が好まし
く用いられる。尚、本発明に用いられる測定試薬中には
、測定対象物質に応じて必要な基質や共役酵素が必要濃
度添加されることは言うまでもない。

本発明の方法に於いて、アスコルビン酸、ビリルビン等
の測定妨害物質を含むものを試料とする場合には、アス
コルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等の
酵素を用いる方法や、沃素酸塩、過沃素酸塩を用いる方
法など従来から良く知られた方法で処理してもよいし、
また、特開昭６０−２６２５９９号公報に記載の方法、
即ち、銅イオン及びＰＯＤとアニリン系化合物、フェノ
ール系化合物、４−アミノアンチピリン等を併用するこ
とによって処理してもよく、これらのうちの適当な方法
に従って処理することによりこれらの影響を軽減するこ
とができる。

本発明の方法は、通常ｌステップの操作で測定可能であ
るが、妨害物質の除去を行う前処理操作等を加えて２ス
テツプの操作としてもよいし、また、測定対象物質を酵
素とした場合には、反応停止液を用いた２ステツプの操
作、或は前述の如き前処理操作を加えて３ステツプの操
作として行ってもよい。

本発明の方法は、従来この分野で用いられてきた測定方
法に比べて測定のステップ数が少なく、ホルマザン色素
の様な染着性を有する色素を使用することもなく、また
、金属に対する腐食力の強い酸類も使用しないので、自
動分析装置への適用が可能である。また、本発明の方法
は簡便な試験紙法や、反応試薬を含有させた多層分析シ
ート（多層一体型定量分析フィルム）を使用する所謂乾
式定量方法にも応用することができる。

以下に実施例により、本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない
。

［実施例］ 実施例１．ヒボキサンチンの定量 （測定試薬） ０．１Ｍ　Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタン
スルホン酸（ＡＣＥＳ）・ＮａＯＨ緩衝液に下記物質を
下記濃度となるように溶解して測定試薬とした。

Ｘ　　ＯＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．０４ＵｌＩＰ　ＯＤ　　　　　
　　　　　　　　　　　４１Ｊ／ｍ１Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジ
メトキシアニリン（口ＡＯ５）　０．３５ｓ＋ｇ／ｍ１
４−アミノアンチピリン　　　　　　　０．ｂｗｇ／ｍ
ｌヒドロキシルアミン塩酸塩　　　　　０．１■ｉ（試
料） ヒボキサンチンを夫々３．２．６．４．９．６．１２．
１３＋＋Ｍ含む水溶液を調製し試料とした。

（操作法） 試料を２０μｍとり、測定試薬２．５１を加えてよく混
合し、３７℃で５公園反応させた後、６００ｎｍに於け
る吸光度ＥＳを測定した。

試料の代りに精製水を用いて同様の操作を行い試薬ブラ
ンクＥｅｌを測定した。

（結果） 横軸のヒボキサンチン濃度（ｓＭ）に対して得られた吸
光度（Ｅｓ−Ｅｅ＋）を縦軸に沿ってプロットした点を
結んで得られる検量線を第１図に示す（−〇−）。

比較例１゜ 実施例１の測定試薬からヒドロキシルアミン塩酸塩を除
いたものを測定試薬とした以外は実施例１と同様の測定
試薬を用い、実施例１と同様の操作により実施例１と同
じ試料について測定を行って検量線を作成した。

結果を第１図に併せて示す（−へ一）。

比較例２゜ 比較例１の測定試薬にスーパーオキシドジスムターゼ（
ＳＯＤ）を５０Ｕ／ｎ＋　１となるように添加したもの
を測定試薬とした以外は実施例１と同様の測定試薬を用
い、実施例１と同様の操作により実施例１と同じ試料に
ついて測定を行って検量線を作成した。

結果を第１図に併せて示す（−Ｘ−）。

第１図から明らかな如く、本発明の方法による実施例１
に於いて得られた検量線は、比較例１又は２に於いて得
られたそれと比べ、直線性において優れていることがわ
かる。

実施例２゜ 実施例１の測定試薬中のヒドロキシルアミン塩酸塩の代
りにＮ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩を０．１ｓＭ
含むものを測定試薬とした以外は実施例１と同様の測定
試薬を用い、実施例１と同様の操作により実施例１と同
じ試料について測定を行って検量線を作成した。

結果を第２図に示す。

第２図から明らかな如く、実施例１と同様に良好な直線
性を示す検量線が得られた。

実施例３．無機リンの定量 （測定試薬） ０．１Ｍ　Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタン
スルホン酸（ＡＣＥＳ）・Ｎ　ａ　Ｏｔｌ緩衝液に下記
物質を下記濃度となるように溶解して測定試薬とした。

Ｘ　　ＯＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．０４ｕ／ｍｌＰ　ＯＤ　　　　
　　　　　　　　　　　　４Ｕ／ｍ１Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジ
メトキシアニリ：／　（ＯＡＯ５＞　０．３５層ｇ／１
４−アミノアンチピリン　　　　　　　０．１ｍ３／ｎ
ｌヒドロキシルアミン塩酸塩　　　　　０．１ｍＭプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ　０．４１Ｊ／ａ＋ｌイ
ノシン　　　　　　　　　　　　　　２ｍＭ（試料） 無機リンを夫々１０．２０．３０．４０Ｂ／ｄｌ含む水
溶液を調製し試料とした。

（操作法） 試料を２０μｍとり、測定試薬２．５＊Ｉを加えてよく
混合し、３７℃で５分閏反応させた後、６００ｎｍに於
ける吸光度ＥＳを測定した。

試料の代りに精製水を用いて同様の操作を行い試薬ブラ
ンクＥｅｌを測定した。

（結果） 横軸の無機リン濃度（■ｇ／ｄ　＋　）に対して得られ
た吸光度（Ｅｓ−Ｅａｔ）を縦軸に沿ってプロットした
点を結んで得られる検量線を第３図に示す。

第３図から明らかな如く、得られた検量線は、原点を通
る直線となり良好な定量性を示した。

実施例４．血清中の無機リンの定量 （測定試薬） 実施例３と同じ。

（試料） 人血清１０検体を試料とした。

（操作法） 試料を２０μｌとり、測定試薬２．５１を加えてよく混
合し、３７℃で５分間反応させた後、６００ｎｍに於け
る吸光度ＥＳを測定した。

試料の代りに精製水及び無機リン標準液（無機リンｌ０
１ｗｇ／ｄ　ｌ含有）を用いて同様の操作を行い試薬ブ
ランクＥｅｌ及び標準液吸光度Ｅ　Ｓｌｄを測定した。

得られた吸光度を用いて次式により試料中の無機りン濃
度Ｐ　（１１８／ｄ　ｌ　）を算出した。

Ｐ　（Ｂ／旧）＝（（Ｅｓ−ＥＢ＋）÷（Ｅｓ＋ａ−Ｅ
ｎｌ））ＸＩＯ（結果） 測定結果を表−１に示す。

参考例１．従来法による血清中の無機リンの定量市販の
無機リン測定試薬［無機リンＣ−テストフコ−（和光純
薬工業（株）！り　］を用い、実施例４と同じ試料につ
いて無機リンの定量を行った。

尚、操作法は、同測定試薬の現品説明書に従って行った
。

（結果） 測定結果を表−１に併せて示す。

表−１ 相関係数：γ＝０．９９９ 回帰直線式：　Ｙ　＝０．９９３Ｘ　＋０．０２表−１
から明らかな如〈実施例４で得られた値と参考例１で得
られた値とは良く一致しておりその間に有意差は認めら
れなかった。

［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明はＸＯＤを介して生成する過酸
化水素の、正確、且つ簡便で、しかも自動分析機に応用
可能な測定方法を提供するものであり、これにより例え
ば核酸代謝に１与する物質等を容易に且つより正確に測
定することが可能となった点に顕著な効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１、比較例１及び比較例２により得ら
れた検量線を示し、横軸のヒボキサンチン濃度（ｍＭ）
に対して得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点
を結んだものである。ここで、−０−は実施例１で得ら
れた結果を、−へ一は比較例１で得られた結果を、−×
−は比較例２て得られた結果を各々示す。 第２図は、実施例２により得られた検量線を示し、横軸
のヒボキサンチン濃度（■Ｍ）に対して得られた吸光度
を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第３図は、実施例３により得られた検量線を示し、横軸
の無機リン濃度（ｓｇ／ｄ　Ｉ　）に対して得られた吸
光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである
。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 第１図 ヒポぐキプ〉チン導度　６ｍＭ） 第　２　図 ヒ討キ７ンナン１１食　（ｍＭ） 第３ｔ！ｆ ＃−機ソンｉ丈（ｍヶ嫂）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）キサンチンオキシダーゼの作用を介して生成する
   過酸化水素の定量方法に於いて、過酸化水素生成系にス
   ーパーオキサイドアニオン消去剤としてのヒドロキシル
   アミン及び／又はその誘導体を加えて、これを行うこと
   を特徴とする過酸化水素の定量方法。