JPS62104596A - 体液中のグアナ−ゼ活性測定法 - Google Patents
体液中のグアナ−ゼ活性測定法Info
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- JPS62104596A JPS62104596A JP24320085A JP24320085A JPS62104596A JP S62104596 A JPS62104596 A JP S62104596A JP 24320085 A JP24320085 A JP 24320085A JP 24320085 A JP24320085 A JP 24320085A JP S62104596 A JPS62104596 A JP S62104596A
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- Japan
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- guanase
- measuring
- reaction
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
「産業上の利用分野」
本発明は、体液、例えば血清中のグアナーゼ(以下、G
UAと略称する。)の活性測定法に関する。
UAと略称する。)の活性測定法に関する。
「発明の背景」
GUAは核酸代謝にあずかシ、グアニンを脱アミノ化し
てキサンチンとアンモニア全生成させる酵素であって、
肝臓、腎臓、脳などに於て強い活性が認められるもので
ある。臨床的には、正常血清、赤血球、白血球に於ては
ほとんど活性が認められないことから、体液中のGUA
を測定することは肝細胞障害の櫃めて敏感な指標になる
といわれている。
てキサンチンとアンモニア全生成させる酵素であって、
肝臓、腎臓、脳などに於て強い活性が認められるもので
ある。臨床的には、正常血清、赤血球、白血球に於ては
ほとんど活性が認められないことから、体液中のGUA
を測定することは肝細胞障害の櫃めて敏感な指標になる
といわれている。
GUAの活性測定法として、これまで種々の方法が発表
されているが、実用的なものとしては、GUA グアニン+H20キサンチン+NH。
されているが、実用的なものとしては、GUA グアニン+H20キサンチン+NH。
の反応で生成したキサンチンを測定する方法(特開昭6
0−102199号公報;特開昭59−66899号公
報: Sugiura at al、 Chem、 P
harm、 Bullす29 e4 2 6〜4 29
(1981) :N15hikava at
aLclln、chsm、。
0−102199号公報;特開昭59−66899号公
報: Sugiura at al、 Chem、 P
harm、 Bullす29 e4 2 6〜4 29
(1981) :N15hikava at
aLclln、chsm、。
27.560〜56](1981)等)とNH,を測定
する方法(伊東ら、臨床病理、23巻、733〜736
゜1975年等)とがある。
する方法(伊東ら、臨床病理、23巻、733〜736
゜1975年等)とがある。
NH3’を測定する方法としては、インドフェノール反
応を利用したものが主流であるが、血清タンパクが類似
の発色をするため、検体ブランク測定を実施しなければ
ならず、しかもその値が高いため測定結果に誤差を生じ
やすいなどの欠点も有する。
応を利用したものが主流であるが、血清タンパクが類似
の発色をするため、検体ブランク測定を実施しなければ
ならず、しかもその値が高いため測定結果に誤差を生じ
やすいなどの欠点も有する。
一方、GUAによってグアニンから生成したキサンチン
(以下、XAと略称する。〕を測定する方法としては、
例えば、これにキサンチンオキシダーゼ(以下、XOD
と略称する。)t−作用させて生成するスーパーオキジ
ドアニオ/(0□7)全測定する方法(第24回日本臨
床化学会年会抄録、104頁。
(以下、XAと略称する。〕を測定する方法としては、
例えば、これにキサンチンオキシダーゼ(以下、XOD
と略称する。)t−作用させて生成するスーパーオキジ
ドアニオ/(0□7)全測定する方法(第24回日本臨
床化学会年会抄録、104頁。
1984年)或いは0″を経由して生成するH20□を
測定する方法、生成したXAにXODとウリガーゼを作
用させ、nから生成した尿酸からもH20□を生成させ
て、XAからのH2O2と尿酸からのH20□の合計量
を測定する方法などがある。しかしながら、02′を測
定する方法は感度が低いため血清量を多く必要とし、ま
た試薬盲検が必要であるなどの欠点があり、H20□を
測定する方法ではXA −XODの反応によシ同時に生
成する0□”t−H2O□へ変換する必要があるため、
スーパーオキシドジスムターゼ(以下、SODと略称す
る。)を共存させたシ、クエン酸を加えて酸性にしたシ
しなければならず、ステップ数が多く操作が繁雑である
。即ち、いずれにしても、未だ充分満足し得るグアナー
ゼ活性測定法は見出されていない。
測定する方法、生成したXAにXODとウリガーゼを作
用させ、nから生成した尿酸からもH20□を生成させ
て、XAからのH2O2と尿酸からのH20□の合計量
を測定する方法などがある。しかしながら、02′を測
定する方法は感度が低いため血清量を多く必要とし、ま
た試薬盲検が必要であるなどの欠点があり、H20□を
測定する方法ではXA −XODの反応によシ同時に生
成する0□”t−H2O□へ変換する必要があるため、
スーパーオキシドジスムターゼ(以下、SODと略称す
る。)を共存させたシ、クエン酸を加えて酸性にしたシ
しなければならず、ステップ数が多く操作が繁雑である
。即ち、いずれにしても、未だ充分満足し得るグアナー
ゼ活性測定法は見出されていない。
「発明の目的」
本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、キサ
ンチンを測定することによりGUA活性を測定する方法
に於て、従来よシ改善が求められていた測定感度の問題
、検体盲検の問題、共存物質による誤差の問題等をすべ
て解決したGUA活性の新規で且つ精度の高い定量法を
提供することを目的とする。
ンチンを測定することによりGUA活性を測定する方法
に於て、従来よシ改善が求められていた測定感度の問題
、検体盲検の問題、共存物質による誤差の問題等をすべ
て解決したGUA活性の新規で且つ精度の高い定量法を
提供することを目的とする。
「発明の構成」
本発明は、グアニンを基質とし、体液中のグアナーゼ(
GUA)の作用によシ生成したキサンチン(XA)に、
キサンチンオキシダーゼ(XOD) 、ウリガーゼ、還
元型補酵素、ペルオキシダーゼ、フェノール類(又はナ
フトール類)又はアミン類、及び被還元性呈色試薬を作
用させて、生成する色素を比色定量することによシその
活性値を求めることを特徴とする、グアナーゼ活性測定
法である。
GUA)の作用によシ生成したキサンチン(XA)に、
キサンチンオキシダーゼ(XOD) 、ウリガーゼ、還
元型補酵素、ペルオキシダーゼ、フェノール類(又はナ
フトール類)又はアミン類、及び被還元性呈色試薬を作
用させて、生成する色素を比色定量することによシその
活性値を求めることを特徴とする、グアナーゼ活性測定
法である。
本発明の方法は、以下の(1)〜(3)の反応式で示さ
れる。
れる。
グアニン キサンチン
ホルマデン又ハジホルマデン十NAD(P) ・曲曲
(3)尚、(2)式は、詳しくは下記の2つの式から成
る。
(3)尚、(2)式は、詳しくは下記の2つの式から成
る。
(キサンチン)
このように、本発明は、GUA Kよジグアニンから生
成したキサンチンにXODとウリガーゼを作用させ、生
成した尿酸を更K、ウリガーゼによシ)f、02とアラ
ントイン及び炭酸ガスに分解させ、キサンチンからXO
Dにより生成したH20□と、尿酸からウリガーゼによ
り生成したH2O2との総量を、還元型補酵素、ベルオ
キシメーゼ、フェノール類(す7トール類)又はアミン
類の存在下、被還元性呈色試薬を用いて測定しているの
で、従来法に比べ感度が2倍に向上する。
成したキサンチンにXODとウリガーゼを作用させ、生
成した尿酸を更K、ウリガーゼによシ)f、02とアラ
ントイン及び炭酸ガスに分解させ、キサンチンからXO
Dにより生成したH20□と、尿酸からウリガーゼによ
り生成したH2O2との総量を、還元型補酵素、ベルオ
キシメーゼ、フェノール類(す7トール類)又はアミン
類の存在下、被還元性呈色試薬を用いて測定しているの
で、従来法に比べ感度が2倍に向上する。
酵素反応により生成したH20□は、本発明者らが先に
特許出願した方法(特願昭60−071632号)。
特許出願した方法(特願昭60−071632号)。
即ち還元型補酵素、POD、フェノール類(又はナフト
ール類)又はアミン類、及び被還元性呈色試薬を用いる
H20□の定量法を適用することによシ、測定が可能で
、これによシ共存物質の影響の少ない測定値を得ること
ができる。
ール類)又はアミン類、及び被還元性呈色試薬を用いる
H20□の定量法を適用することによシ、測定が可能で
、これによシ共存物質の影響の少ない測定値を得ること
ができる。
また、本発明を行なうにあたり、検体(血清)中に存在
する尿酸、キサンチンなどによる誤差は、予メXOD、
ウリガーゼ、イルオキシダーゼ、及びアミン類又はフェ
ノール類(又はナフトール類)を検体中に存在させ、一
定時間反応させることKより消去できるので、検体盲検
の測定が不必要である。
する尿酸、キサンチンなどによる誤差は、予メXOD、
ウリガーゼ、イルオキシダーゼ、及びアミン類又はフェ
ノール類(又はナフトール類)を検体中に存在させ、一
定時間反応させることKより消去できるので、検体盲検
の測定が不必要である。
また、本発明の方法では、0□′をH2O2Vc完全に
変換するために反応停止剤を用いて、酵素反応を一旦停
止させなければならないというようなことも准い。
変換するために反応停止剤を用いて、酵素反応を一旦停
止させなければならないというようなことも准い。
即ち、(2a)式に於ける反応では、02″:を経由し
てH20□に変換されるが、この反応を完全に行なわせ
るには、通常、液性を酸性にしたり、或はスーパーオキ
シドジスムターゼ(S(]))令磨咄横H←−4=F+
を添加する必要があるが、本発明の方法では、このよう
な処理は全く必要ない。更に、グアニン−GUAの酵素
反応と同時に呈色反応が行なえるので、レイト法による
測定も可能である。また。
てH20□に変換されるが、この反応を完全に行なわせ
るには、通常、液性を酸性にしたり、或はスーパーオキ
シドジスムターゼ(S(]))令磨咄横H←−4=F+
を添加する必要があるが、本発明の方法では、このよう
な処理は全く必要ない。更に、グアニン−GUAの酵素
反応と同時に呈色反応が行なえるので、レイト法による
測定も可能である。また。
エンド法で測定を行なう場合、反応停止剤としては従来
から用いられている塩酸、クエン酸等の酸類を用いても
よいが、中性のドデシル硫酸塩を用いれば、自動分析装
置の材質をいためる恐れもなく、よシ好ましい。
から用いられている塩酸、クエン酸等の酸類を用いても
よいが、中性のドデシル硫酸塩を用いれば、自動分析装
置の材質をいためる恐れもなく、よシ好ましい。
本発明に用いる還元型補酵素としては、例えば、還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)や
、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
(NADPH)等が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)や
、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
(NADPH)等が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。
また、ペルオキシダーゼは、植物由来、動物由来、微生
物由来のペルオキシダーゼがいずれも使用できるが、通
常は西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましく用い
られる。
物由来のペルオキシダーゼがいずれも使用できるが、通
常は西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましく用い
られる。
本発明に用いる被還元性呈色試薬としては、既存のもの
未知のものを問わず、還元されて呈色する化合物は全て
挙げられる。既存のもので一般によく用いられるものと
しては、例えば、ニトロテトラゾリウムブルー(以下、
NTBと略称する。)2−(4−ヨードフェニル)−3
−(4−二トロフェニル)−5−7エニルテトラゾリウ
ム クロリド(以下、rNTと略称する。)、3− (
4,5−ジメチルチアゾリル−2) −2,5−ジフェ
ニルテトラゾリウム プロミド(以下、MTTと略称す
る。X2−(2−ベンゾチアゾリル)−3−(2−カル
ボキシフェニル)−5−(4−(ヒドロキシポリ(オキ
シ−1,2−エタンジイル)〕フェニル)−2Hテトラ
ゾリウム クロリド(以下、 BCRTと略称する。)
等のテトラゾリウム塩が挙げられる。
未知のものを問わず、還元されて呈色する化合物は全て
挙げられる。既存のもので一般によく用いられるものと
しては、例えば、ニトロテトラゾリウムブルー(以下、
NTBと略称する。)2−(4−ヨードフェニル)−3
−(4−二トロフェニル)−5−7エニルテトラゾリウ
ム クロリド(以下、rNTと略称する。)、3− (
4,5−ジメチルチアゾリル−2) −2,5−ジフェ
ニルテトラゾリウム プロミド(以下、MTTと略称す
る。X2−(2−ベンゾチアゾリル)−3−(2−カル
ボキシフェニル)−5−(4−(ヒドロキシポリ(オキ
シ−1,2−エタンジイル)〕フェニル)−2Hテトラ
ゾリウム クロリド(以下、 BCRTと略称する。)
等のテトラゾリウム塩が挙げられる。
本発明に用いるフェノール類としては、フェノールその
ものの他、例えば、メチル、エチル、ゾロぜル等アルキ
ル置換フェノール、例、tば、メトキシ、エトキシ、プ
ロポキシ等アルコキシ置換hノール、塩素、臭素、弗素
、沃素等ハロrン置換フェノール等各種誘導体が使用で
きる。また、ナフトール類としては、ナフトールそのも
のの他、例えは、ナフトールスルホン酸類、ナフトール
カルボン酸類等のナフトール誘導体が使用できる。
ものの他、例えば、メチル、エチル、ゾロぜル等アルキ
ル置換フェノール、例、tば、メトキシ、エトキシ、プ
ロポキシ等アルコキシ置換hノール、塩素、臭素、弗素
、沃素等ハロrン置換フェノール等各種誘導体が使用で
きる。また、ナフトール類としては、ナフトールそのも
のの他、例えは、ナフトールスルホン酸類、ナフトール
カルボン酸類等のナフトール誘導体が使用できる。
アミン類としては、通常の有機アミンがいずれも使用で
き、−級、二級、三級を問わない。また、一般に脂肪族
アミンに比べ芳香族アミンの方が、少ない使用量で効果
がある。これらのアミン類の具体例としては、例えば、
アニリン、N−メチルアニリン、N−エチルアニリン、
N、N−ジメチルアニリン、 N、N−ジエチルアニリ
ン、N、N−ジエチル−m−トルイジン、N−エチル−
N−(β−ヒドロキシエチル)−m−)ルイジン、3#
5−ゾメトキシ−N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−
3−ソジウムスルホプロビル)アニリン、N−エチル−
N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロビル)−m−)
ルイジンナトリウム等が挙げられるが、これらに限定さ
れるものでないことは勿論である。
き、−級、二級、三級を問わない。また、一般に脂肪族
アミンに比べ芳香族アミンの方が、少ない使用量で効果
がある。これらのアミン類の具体例としては、例えば、
アニリン、N−メチルアニリン、N−エチルアニリン、
N、N−ジメチルアニリン、 N、N−ジエチルアニリ
ン、N、N−ジエチル−m−トルイジン、N−エチル−
N−(β−ヒドロキシエチル)−m−)ルイジン、3#
5−ゾメトキシ−N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−
3−ソジウムスルホプロビル)アニリン、N−エチル−
N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロビル)−m−)
ルイジンナトリウム等が挙げられるが、これらに限定さ
れるものでないことは勿論である。
これらアミン類、フェノール類及びナフトール類は夫々
巣独で用いても、任意に二種以上組み合せて用いてもか
まわない。また例えば]−]N、N−ジメチルアミノー
4−ナフトール4−N、N−ジエチルアミノサリチル酸
のように、1つの化合物がフェノール類でもあり、アミ
ン類でもある化合物を使用することもできる。
巣独で用いても、任意に二種以上組み合せて用いてもか
まわない。また例えば]−]N、N−ジメチルアミノー
4−ナフトール4−N、N−ジエチルアミノサリチル酸
のように、1つの化合物がフェノール類でもあり、アミ
ン類でもある化合物を使用することもできる。
本発明の方法は、通常エンド法では3ステツプ、レイト
法では2ステツプになる。即ち、第1ステツプでは、試
料中に共存するキサンチン、ヒIキサンチン、尿酸、及
び必要であればアスコルビン酸やビリルビン等の分解処
理を行ない、第2ステツプでは基質のグアニン金倉む試
液が用いられ、GUAの酵素反応と呈色反応が同時に行
なわれる。
法では2ステツプになる。即ち、第1ステツプでは、試
料中に共存するキサンチン、ヒIキサンチン、尿酸、及
び必要であればアスコルビン酸やビリルビン等の分解処
理を行ない、第2ステツプでは基質のグアニン金倉む試
液が用いられ、GUAの酵素反応と呈色反応が同時に行
なわれる。
レイト法では、この呈色反応の単位時間当りの呈色の増
加を測定する。エンド法では、第2ステツプでのGUA
酵素反応を一定時間行なわせた後に反応停止剤を加えて
酵素反応を止め、吸光度を測定する。H20□と被還元
性呈色試薬との反応は、還元型補酵素、POD 、及び
フェノール類(又はナフトール類)又はアミン類の共存
下で進行するので、第1ステツプの試薬(以下、第1試
液と略称する。)中に被還元性呈色試薬又は還元型補酵
素のいずれか一方を存在させることは何等差支えない。
加を測定する。エンド法では、第2ステツプでのGUA
酵素反応を一定時間行なわせた後に反応停止剤を加えて
酵素反応を止め、吸光度を測定する。H20□と被還元
性呈色試薬との反応は、還元型補酵素、POD 、及び
フェノール類(又はナフトール類)又はアミン類の共存
下で進行するので、第1ステツプの試薬(以下、第1試
液と略称する。)中に被還元性呈色試薬又は還元型補酵
素のいずれか一方を存在させることは何等差支えない。
アスコルビン酸を含む試料の場合は、第1試液との反応
で生成したH2O。が、PODの存在下でアスコルビン
1!!ヲ始め、その他の還元性物質を競合的に分解する
ので通常はほとんど問題はないが、その量が異常に多い
ときは、この第1試液中に銅イオンを共存させれば、本
発明者らが先に開示した特開昭59−230161号又
は特願昭59−118601号の発明に示される如く、
アスコルビン酸は分解除去できるし、ビリルビンの影響
も低減できる。
で生成したH2O。が、PODの存在下でアスコルビン
1!!ヲ始め、その他の還元性物質を競合的に分解する
ので通常はほとんど問題はないが、その量が異常に多い
ときは、この第1試液中に銅イオンを共存させれば、本
発明者らが先に開示した特開昭59−230161号又
は特願昭59−118601号の発明に示される如く、
アスコルビン酸は分解除去できるし、ビリルビンの影響
も低減できる。
また、アスコルビン酸オキシダーゼを第1試液中に共存
させてもよい。更に、ビリルビンはビリルビンオキシダ
ーゼを第1試液に共存させることにより分解除去できる
。
させてもよい。更に、ビリルビンはビリルビンオキシダ
ーゼを第1試液に共存させることにより分解除去できる
。
第1試液に含まれるXOD、ウリガーゼ、POD、フェ
ノール類(又はナフトール類)又はアミン類の量は、試
料中のヒデキサンチン、キサンチン、及び尿酸を分解で
きる量であれば特に限定されないが、第2ステツプの反
応に支障のない量が望ましいことはいうまでもない。ま
た、第2ステツプの試薬(以下、第2試液と略称する。
ノール類(又はナフトール類)又はアミン類の量は、試
料中のヒデキサンチン、キサンチン、及び尿酸を分解で
きる量であれば特に限定されないが、第2ステツプの反
応に支障のない量が望ましいことはいうまでもない。ま
た、第2ステツプの試薬(以下、第2試液と略称する。
)中に、更にXOD 、ウリガーゼ、POD、フェノー
ル類(又はナフトール類)又はアミン類、のいずれか又
は全てを存在させることは何等差支えない。
ル類(又はナフトール類)又はアミン類、のいずれか又
は全てを存在させることは何等差支えない。
第1試液の液性は、XOD、ウリガーゼ、PODが作用
する範囲であれば特に限定されないが、通常はpH5〜
9の範囲が好ましく用いられる。
する範囲であれば特に限定されないが、通常はpH5〜
9の範囲が好ましく用いられる。
第2試液の液性は、第1試液と混合してGUAの酵素反
応をさせるときの液性がpH5〜9になるように調製す
る。第2試液中のクアニンケの濃度は、第1試液と混合
して第2ステップ反応を行なうとき、0.05〜5 m
noνlの範囲になるように調製する。
応をさせるときの液性がpH5〜9になるように調製す
る。第2試液中のクアニンケの濃度は、第1試液と混合
して第2ステップ反応を行なうとき、0.05〜5 m
noνlの範囲になるように調製する。
XODは第2ステツプの反応液中1〜100U/J、ウ
リガーゼは1〜300U/i PODは100〜10,
000U//、フェノール類(又はナフトール類)又は
アミン類は0.1〜500 m mol/l 、 NA
D(P) Hは0.01〜20 m mol/lの範囲
が好ましく用いられるが、これらに限定されるものでは
ない。
リガーゼは1〜300U/i PODは100〜10,
000U//、フェノール類(又はナフトール類)又は
アミン類は0.1〜500 m mol/l 、 NA
D(P) Hは0.01〜20 m mol/lの範囲
が好ましく用いられるが、これらに限定されるものでは
ない。
第1試液、第2試液の液性の調整に用いる緩衝剤は、通
常用いられている緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液、グツド緩衝液などが使用できるが、これ
に限定されるものではない。
常用いられている緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液、グツド緩衝液などが使用できるが、これ
に限定されるものではない。
酵素反応又は呈色反応を円滑に行なわせるため、界面活
性剤を第1試液又は/及び第2試液に加えることは何等
差支えない。
性剤を第1試液又は/及び第2試液に加えることは何等
差支えない。
反応停止剤としてドデシル硫酸塩を用いる場合は、最終
呈色液中、] m mall1以上の濃度になるように
する。反応停止剤として塩酸、クエン酸等の酸類を用い
る場合は、最終呈色液の液性がpi−13以下になるよ
うにする。
呈色液中、] m mall1以上の濃度になるように
する。反応停止剤として塩酸、クエン酸等の酸類を用い
る場合は、最終呈色液の液性がpi−13以下になるよ
うにする。
以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
「実施例」
実施例 1゜
〔試液の調製〕
■ 第1試液
0、1 Mリン酸塩緩衝fi(pH7,0)中に、XO
D 1&:60 U/l、ウリガーゼ’kloOU/i
PODを3.000U/l及びフェノール′f!:o
、01%の濃度になるように溶解した。
D 1&:60 U/l、ウリガーゼ’kloOU/i
PODを3.000U/l及びフェノール′f!:o
、01%の濃度になるように溶解した。
■ 第2試液
0、1 Mリン酸塩緩衝液(pH7,0)中に、グアニ
ン’k O,8m mol/l 、 NADPHt”
1.25 m mol/l、NTBを0.04%及びト
リトンX−100t−0,1係の濃度になるように溶解
した。
ン’k O,8m mol/l 、 NADPHt”
1.25 m mol/l、NTBを0.04%及びト
リトンX−100t−0,1係の濃度になるように溶解
した。
■ 反応停止液
ドデシル硫酸ナトリウムの0.2チ水溶液を調製した。
ゾール血清に、S i gma社製グアナーゼ(Fro
mRabbit Liver )を夫々10.20,3
0,40.50U/7!になるように添加し、これを試
料とした。
mRabbit Liver )を夫々10.20,3
0,40.50U/7!になるように添加し、これを試
料とした。
試料50μlt−とり、第1試液1.0Wllft加え
、37℃で5分間加温後、第2試液1.0−を加えて、
37℃で正確に30分間加温した。反応停止液1.04
を加え混和した後、試薬ブランクを対照として。
、37℃で5分間加温後、第2試液1.0−を加えて、
37℃で正確に30分間加温した。反応停止液1.04
を加え混和した後、試薬ブランクを対照として。
波長560 nmの吸光度を測定した。
第1図にグアナーゼ(GUA)濃度と吸光度との関係を
示す。第1図より明らかな如く、各GUA活性値(U/
l)に対してプロットした吸光度を結ぶ検量線は良好な
定量性を示している。
示す。第1図より明らかな如く、各GUA活性値(U/
l)に対してプロットした吸光度を結ぶ検量線は良好な
定量性を示している。
実施例 2゜
〔試液の調製〕
■ 第1試液
実施例1.に同じ。
■ 第2試液
実施例1.に同じ。
■ 反応停止液
実施例1.に同じ。
血清、及び血清°に尿酸、キサンチン、ヒポキサンチン
を夫々加えたものを試料とした。
を夫々加えたものを試料とした。
実施例1.に同じ。
測定結果を表1に示す。
表 1
表1から明らかなように、本発明の方法では、血清中の
尿酸、キサンチン、ヒポキサンチンの影響を全く受けな
かった。
尿酸、キサンチン、ヒポキサンチンの影響を全く受けな
かった。
実施例 3゜
〔試液の調製〕
■ 第1試液
実施例1.に同じ。
■ 第2試液
実施例1.に同じ。
■ 反応停止液
実施例1.に同じ。
血清10検体、及びグアナーゼ(GUA) 20U/l
を含む標準液を試料とした。
を含む標準液を試料とした。
実施例1.に同じ。
測定結果を表2及び表3に示す。
参考例 1
〔試液の調製〕
■ 基質液
0、1 Mリン酸塩緩衝液(pH6,5)中に、グアニ
ンを0.8 m mol/lの濃度になるように溶解し
た。
ンを0.8 m mol/lの濃度になるように溶解し
た。
■ 発色試液
0.1Mリン酸塩緩衝液(p)16゜5)中に、キサン
チンオキシダーゼt−60U/1. NTB’t”0.
04%、 ]−メトキシフェナジンメトサルフェート
をO,OOS優、β−シクロデキストリン’i 0.4
%及びトリトンX−100t0.2%の濃度になるよ
うに溶解した。
チンオキシダーゼt−60U/1. NTB’t”0.
04%、 ]−メトキシフェナジンメトサルフェート
をO,OOS優、β−シクロデキストリン’i 0.4
%及びトリトンX−100t0.2%の濃度になるよ
うに溶解した。
■ 反応停止液
0.1チドリトンX−100を含む0. I N塩酸を
調製した。
調製した。
実施例3.に同じ。
基質液0.517と発色試液0.5 mを混和し、37
℃で3分間加温した。これに試料(血清)50μlを加
えて、37℃で30分間加温後、反応停止液2.0m1
−加えて、水を対照として波長560 nmの吸光度を
測定した(PI: t>。
℃で3分間加温した。これに試料(血清)50μlを加
えて、37℃で30分間加温後、反応停止液2.0m1
−加えて、水を対照として波長560 nmの吸光度を
測定した(PI: t>。
基質液の代シに0.1 Mリン酸塩緩衝fi (pH6
,5)を用いて同様に操作し、血清ブランクの吸光度を
測定した(”tl)。
,5)を用いて同様に操作し、血清ブランクの吸光度を
測定した(”tl)。
基質t 0.5 d、発色試液0.51を用い、血清5
0μlの代シに蒸留水を用いて、血清と同様に操作し、
試薬ブランクを測定した(FBI)。
0μlの代シに蒸留水を用いて、血清と同様に操作し、
試薬ブランクを測定した(FBI)。
GUA 20 U//を含む標準液を試料として用い、
血清と同様に操作して吸光度を測定した(”5td)。
血清と同様に操作して吸光度を測定した(”5td)。
測定結果を表2及び表3に示す。
(1)本発明(実施例3)と従来法(参考例1)の感度
を比較したものt−表2に示す。
を比較したものt−表2に示す。
表 2
表2から明らかなように、本発明の方法は、02″:を
測定する参考例1.に比べて、約2倍の感度を有する。
測定する参考例1.に比べて、約2倍の感度を有する。
(iD 血清]0検体を用いて、実施例3.と参考例
16で測定した結果を表3に示す。
16で測定した結果を表3に示す。
表3の結果についてt検定を行なった結果、有意水準5
憾で実施例3.と参考例1.の間には差が認められなか
っ九。
憾で実施例3.と参考例1.の間には差が認められなか
っ九。
表 3
Y = 0.949X十0.3 (r=0.999 )
「発明の効果」 以上述べた如く、本発明は、GUAの新規で且つ有用な
定量法を提供するものであり、 ■ 従来法に比べ感度が高い点。
「発明の効果」 以上述べた如く、本発明は、GUAの新規で且つ有用な
定量法を提供するものであり、 ■ 従来法に比べ感度が高い点。
■ ニトロテトラゾリウムブルー等のテトラゾリウム塩
を発色試薬として用いて還元系で測定するため、アスコ
ルビン酸等還元性を有する共存物質の影響の少ない測定
値が得られる点。
を発色試薬として用いて還元系で測定するため、アスコ
ルビン酸等還元性を有する共存物質の影響の少ない測定
値が得られる点。
■ 検体中に共存する、キサンチン、ヒポキサンチン、
尿酸等による影響は、予め検体中にXOD、ウリガーゼ
、ペルオキシダーゼ、及びアミン類又はフェノール類(
又はナフトール類)を添加して一定時間反応させること
により消去できるので、検体盲検の測定が不必要となっ
た点。
尿酸等による影響は、予め検体中にXOD、ウリガーゼ
、ペルオキシダーゼ、及びアミン類又はフェノール類(
又はナフトール類)を添加して一定時間反応させること
により消去できるので、検体盲検の測定が不必要となっ
た点。
等に顕著な効果を奏する発明でちゃ、斯業に貢献すると
ころ大なるものである。
ころ大なるものである。
第1図は、実施例1.に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各グアナーゼ活性値(U/l )について得られ
た吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもので
ある。 特許出願人 和光純薬工業株式会社葛 t 田 グ°アナー仁゛殉・a71L (切倹)昭和61年7
月30H 昭和60年 特許願 第243200号2、発明の名
称 体液中のグアナーセ活性測定法 3、補正をする者 ゛財ノ1との関係 特許出願人 郵便番号 541 住所 大阪ttS大阪市東区道修町3丁目10番地連絡
先 特許課(東京) TEl、 0:l−270〜8
571名称 和光純薬工業株式会社 5、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 6、補正の内容 fi+ 明細、!F 4 y73行目に記載の「或い
は」を「或は」と補正する。 「 0
キサンチン 」キリンチン 」 「0
キサンチン 」キサンチン 」 以上
横軸の各グアナーゼ活性値(U/l )について得られ
た吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもので
ある。 特許出願人 和光純薬工業株式会社葛 t 田 グ°アナー仁゛殉・a71L (切倹)昭和61年7
月30H 昭和60年 特許願 第243200号2、発明の名
称 体液中のグアナーセ活性測定法 3、補正をする者 ゛財ノ1との関係 特許出願人 郵便番号 541 住所 大阪ttS大阪市東区道修町3丁目10番地連絡
先 特許課(東京) TEl、 0:l−270〜8
571名称 和光純薬工業株式会社 5、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 6、補正の内容 fi+ 明細、!F 4 y73行目に記載の「或い
は」を「或は」と補正する。 「 0
キサンチン 」キリンチン 」 「0
キサンチン 」キサンチン 」 以上
Claims (4)
- (1)グアニンを基質とし、体液中のグアナーゼ(GU
A)の作用により生成したキサンチン(XA)に、キサ
ンチンオキシダーゼ(XOD)、ウリガーゼ、還元型補
酵素、ペルオキシダーゼ、フェノール類(又はナフトー
ル類)又はアミン類、及び被還元性呈色試薬を作用させ
て、生成する色素を比色定量することによりその活性値
を求めることを特徴とする、グアナーゼ活性測定法。 - (2)体液中に存在するキサンチン、ヒポキサンチン、
尿酸を、キサンチンオキシダーゼ、ウリガーゼ、ペルオ
キシダーゼ、フェノール類(又はナフトール類)又はア
ミン類を用いて分解後、体液中のグアナーゼ活性の測定
を行なう、特許請求の範囲第1項に記載の測定法。 - (3)還元型補酵素が、還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド(NADH)又は還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)である、
特許請求の範囲第1項又は第2項に記載の測定法。 - (4)被還元性呈色試薬がテトラゾリウム塩である、特
許請求の範囲第1項〜第3項のいずれかに記載の測定法
。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24320085A JPS62104596A (ja) | 1985-10-30 | 1985-10-30 | 体液中のグアナ−ゼ活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24320085A JPS62104596A (ja) | 1985-10-30 | 1985-10-30 | 体液中のグアナ−ゼ活性測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62104596A true JPS62104596A (ja) | 1987-05-15 |
Family
ID=17100320
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP24320085A Pending JPS62104596A (ja) | 1985-10-30 | 1985-10-30 | 体液中のグアナ−ゼ活性測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62104596A (ja) |
-
1985
- 1985-10-30 JP JP24320085A patent/JPS62104596A/ja active Pending
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