JPH03206896A

JPH03206896A - 体液中の微量成分定量法

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Publication number: JPH03206896A
Application number: JP23722690A
Authority: JP
Inventors: Takao Uchida; 高雄内田
Original assignee: SHINOTESUTO KK; Shino Test Corp
Current assignee: SHINOTESUTO KK; Shino Test Corp
Priority date: 1989-09-11
Filing date: 1990-09-10
Publication date: 1991-09-10
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: JP3036806B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は体液中の微量成分の定量法及びこれに使用する
定量用組成物に関するものである。

〔従来の技術〕

昨今、ますます臨床検査における体液中の微量成分の測
定法で酵素学的分析法が普及し、注目されている。これ
は、例えば血液中の定量すべき目的成分の尿酸、グルコ
ース、コレステロール、コリンエステラーゼ、トランス
アミナーゼ、トリグリセライド、遊離脂肪酸等に特異的
に作用する酵素を用いて酵素反応を行い、これによる生
成物を測定して目的成分を定量するものである。就中、
過酸化水素生成酵素としての酸化酵素を作用させて過酸
化水素を生成させ、これをバーオキダーゼの存在下で発
色剤と共に反応させて、その呈色を定量することにより
目的成分量を求める方法が普及している。

従来、このような発色反応系には、主として４−アミノ
アンチビリンとの縮合対象物としてフェノールもしくは
その誘導体又はアニリンもしくはその誘導体等が用いら
れている。ところが、この反応による発色系は微量成分
の定量に際しては感度か低く、かつ極大吸収波長が５０
０〜６００ｎｍであり、ビリルビン、ヘモグロビン等の
色素の影響を受ける欠点がある。

近年、このような欠点を解消する発色剤としてトリフェ
ニルメタン系もしくはジフェニルナフチルメタン系のロ
イコ色素を用いる方法が数多く報告されている〔特開昭
５６−２６１９９号、特開昭５６−３１６４１号、特開
昭６０−１９４３６３号、特開昭６０−２１８０６９号
、特開昭６０−２５６０５６号、特開昭６２−２９６号
、特開昭６２９３２６１号等〕。

しかしながら、それらのロイコ色素は発色系に用いた場
合、次の問題点を有している。

■　現在普及している自動分析機における使用測定波長
か固定式であり、殆どの機種が６００ｎｍ、　６６０ｎ
ｍ、　７００ｎｍであるのに対して、それらロイコ色素
を用いる発色系は極大吸収波長が６３０ｎｍ付近もしく
は７５０ｎｍ付近であるため、感度的に不利であり、吸
収スペクトルの肩で測定すること。

■　ｐＨによって測定感度が大きく変化すること。

■　水溶性が不充分であること。

■　ヘモグロビン、タンパク、尿酸等の血中共存物質の
影響を受けること。

また、同様の目的でトリフェニルメタン系のトリアミノ
誘導体としてロイコクリスタルバイオレットも報告され
ているが、この色素は中性付近では水に難溶であり、所
望の濃度に溶解させるのが困難なため、微量成分の測定
には適当でない（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ、、
　Ｖｏｌ、４２．　Ｎｏ、３　ｐ４１０〜４１１゜（１
９７０））。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記のような従来のロイコ色素が有する問題点を解決す
べく、本発明者は種々検討を重ねた結果、トリフェニル
メタン系のトリアミノ誘導体に親水基を導入することで
、それらの問題が解決されることを見い出し、本発明を
完成させるに到った。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は下記の式（Ｉ）：〔式中、Ｈは、水素を示し、Ｒ１−Ｒ６は同一もしくは
異なってよく、水素、置換フェニル基、整数１〜５のア
ルキル基又は置換アルキル基を示し、Ａ〜Ｃは同一もし
くは異なってよく、スルホン基、カルボキシル基、水酸
基１、ニトロ基、ハロゲン、整数１〜５のアルキル基又
はアルコキシ基を示し、ｎは０，１．２．３又は４を示
す。〕で表される化合物を発色剤として用いることを特徴とす
る体液中の微量成分の定量法である。更に、本発明は、
式（Ｉ）の化合物を含有する体液中の微量成分の定量用
組成物にある。

本発明の原理は式（Ｉ）で示される化合物〔還元体〕と
過酸化水素がパーオキシダーゼ存在下に化学量論的に反
応し、色素〔酸化体〕を生成し、この色素の生成量は過
酸化水素の含有量に比例することに基づくものである。

本発明によれば定量すべき目的成分が基質である場合に
は、これを分解して過酸化水素を生成するのに必要な酵
素を、目的成分が酵素活性である場合には、その酵素の
基質及び過酸化水素を生成するのに必要な酵素を、パー
オキシダーゼの存在下に式（Ｉ）で示される化合物の発
色剤と共に反応させ、その呈色を測定することにより目
的物質を定量することができる。更に、酵素免疫測定法
（Ｅ　ＴＡ法）において抗原もしくは抗体がパーオキシ
ダーゼで標識されている場合には、過剰の過酸化水素の
存在下に式（Ｉ）で示される化合物の発色剤と共に反応
させ、その呈色を測定することにより目的成分を定量す
ることができる。

本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、トリフェニルメ
タントリアミノ誘導体であり、これらの化合物はＡｃ１
ｄ　Ｖｉｏｌｅｔ　６ＢあるいはＢｒｉ　１ｌｉａｎｔ
Ｂｌｕｅ　Ｇなどの市販色素を水、素化ホウ素ナトリウ
ム等を用いて還元し、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーにより精製して得るか、あるいはカラーインデック
ス記載のｐ−アミノベンズアルデヒド誘導体とアニリン
誘導体との縮合反応もしくは４゜４′−ジアミノベンズ
ヒドロール誘導体とアニリン誘導体との縮合反応等の合
成法により得ることかできる。

このようにして得られる化合物を第１表に例示するが、
これらの例示に限定されるものではない。

なお、第１表中の記号は下記定義を存し、○内の数字は
置換基の位置を示す。

ＭニーＣＨ３ＣＭ：Ｅ　ニーＣ２Ｈ３ＣＥ　：Ｐ　：ｎ−Ｃ３Ｈ７ｃｐ　：Ｓニー５Ｏ３ＨＳＰ：ＣニーＣ０ＯＨＨ３Ｐ　：ＣＨ２Ｃ００ＨＣ２Ｈ４ＣＯＯＨｎ−Ｃ，Ｈ６Ｃ００Ｈｎ−Ｃ３ＨｓＳＯ３Ｈ −ＣＨ２ＣＨＣＨ２ＳＯ，ＨＨ −ＣＨ２ＣＨＣＨ２０ＨＨＨＥ：〜Ｃ２Ｈ４ＯＨＤ　ＨＰ　：ＨＰ　：　ｎ　ＣｓＨｓＯＨこれらの化合物を発色剤として用いた場合の極大吸収波
長（λｍａｘ）、感度（分子吸光係数）及びｐｌ＋によ
る′影響（吸光度の百分率）を第２表に示す。

感度の測定は次の方法で行った。

（１）　　試薬の調製５００００／　Ａのパーオキシダーゼ及び発色剤として
の化合物Ｎｏ、１〜４２をそれぞれ各０．４ｍｍｏ　ｌ
／　ｉずつ、また比較例として公知発色剤Ｎｏ、　１〜
４（但し、Ｎ００４のみ０．１％トリトンＸ−１００含
有）をそれぞれ各０．０２５ｍｍｏｌ／Ａずツ５０ｍｍ
ｏｌ＃’　Ｐ［ＰＥ５−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７，０）に
溶解し、試薬液とした。なお、ｐＨの影響は上記試薬液
の緩衝液を５０ｍｍｏｌ＃７クエン酸−リン酸−ホウ酸
緩衝液（ｐＨ５，０，ｐＨ７，０及びｐＨ９，０）に代
えて調製した。

（２）測定方法上記にて調製した化合物Ｎｏ、　１〜４２の試薬液をそ
れぞれ各３ｍｌ、また比較例Ｎｏ、　１〜４の試薬液を
それぞれ各３ｍｌを別々に試験管に取り、これに０．６
２ｍｍ０１／Ｉ！過酸化水素水溶液５０μｌを加え、混
合後３７°Ｃて５分間加温し、発色させる。同時に、蒸
留水（試薬盲検用）を用いて同様の操作を行う。発色後
、試薬盲検を対照として吸光度を測定する。

（本頁以下余白）第２表（１）第表（２）オ比較例の１及び２は羽併冒石６−３１６４１号記載の
カラ−インデックス４２０４５還元型及び４２０９０還
元型、３及び４は特開昭６２−２９６号記載の化合上へ
ｏ、　２７及ｒＪＮｏ、　３である。

また、本発明の式（Ｉ）で表される代表的な化合物の溶
解性について、従来の発色剤と比較した結果を表３に示
す。この実験は次の方法で行った。

各化合物の６０ｍＭ　ＤＭＦ溶解液０．０５７７１１を
５０ｍＭクエン酸−リン酸−ホウ酸緩衝液（ｐＨ４〜９
）３艷に添加し、混合後、該緩衝液を対照に波長８００
ｎｍで吸光度を測定した。各化合物及びその酸化体の該
緩衝液は波長８００ｎｍには吸収をもたないため、濁度
のみが吸光度に反映する。

第表（本頁以下余白）本発明の方法により測定可能な生体試料中の成分として
は、酵素反応により生成する過酸化水素を測定すること
によって定量が可能な生体成分あるいは酵素免疫測定法
における標識酵素の酵素活性を測定することによって定
量か可能な生体成分は全て定量可能であるが、特に微量
の生体成分の定量に有利である。

このような微量の生体成分としては、例えばコレステロ
ール、胆汁酸、グルコース、トリグリセライド、遊離脂
肪酸、尿酸、リン脂質、シアル酸、ピルビン酸、無機リ
ン、クレアチニン、クレアチン、ポリアミン、尿素窒素
、アンモニア、ＧＯＴ、ＧＰＴ、モノアミンオキシダー
ゼ、グアナーゼ、コリンエステラーゼ、ＨＢウィルス、
α−ＦＰ。

ＣＥＡ、ＣＲＰ等が挙げられる。

本発明による生体成分の定量において、過酸化水素を生
成させる酵素として用いられる酸化酵素及びその他の目
的で用いられる酵素類並びに酵素反応に関与する基質及
びその他の物質の種類及び使用量は、上記の測定対象に
応じた被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の定量法に準
じて適宜選択すればよい。

本発明による式（Ｉ）で表される化合物、ツク−オキシ
ダーゼの使用量及びパーオキシダーゼ活性測定の際の過
酸化物、例えば過酸化水素の使用量は、測定対象物質の
種類、量、各種の測定法、即ち単位時間当たりの吸光度
変化を測定するレートアッセイ法あるいは一定時間後の
吸光度を測定するエンドポイント法等によりそれぞれ異
なり、それらに応じて適宜選択し決定される。−射的に
は、本発明の式（Ｉ）で表される化合物は０．００１〜
１０ｍＭ、好ましくは０．０１〜１ｍＭであり、パーオ
キシダーゼはＱ、　Ｑｌ〜１００Ｕ／　ｍｌ、好、まし
くは１〜２００／ｍｊ’の範囲である。また、パーオキ
シダーゼについては、その起源、由来に特に限定はなく
植物、動物、微生物起源のパーオキシダーゼ又はパーオ
キシダーゼ様物質がどれでも使用し得るが、通常は西洋
ワサビ由来が用いられる。パーオキシダーゼ様物質とし
ては、ヘモグロビンその他のヘム化合物等が挙げられる
。

本発明によるｐＨは４〜１０の広範囲の域で実施可能で
あり、被検体中の各種の測定対象物質の至適ｐＨあるい
は測定方法の至適ｐＨに合わせて測定することができる
。用いられる緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢
酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス、グツド緩衝液などが
挙げられるが、特にこれらに限定されない。また、必要
に応じてトリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いる。

〔作用〕

本発明によれば、式（Ｉ）で表される化合物は微量生体
成分の定量用の発色剤として使用すれば次のような利点
がある。

■　極大吸収波長が６００ｎｍ近辺にあり、かつ非常に
高感度であり、従来の発色剤と比へて汎用の自動分析機
を用いる場合に特に有利である。

■　ｐＨによる影響が少なく、広範囲のｐＨ域で高感度
に測定できる。

■　従来の発色剤と比べて、発色剤の濃度を増大しても
発色感度の低下は見られず、直線性も良好であり、使用
濃度範囲は非常に広く、それ故、製造上非常に有利であ
る。

■　ヘモグロビン、タンパク、尿酸等の血中共存物質の
影響を殆ど受けない。

■　水溶性が優れている。

以下、本発明を参考例及び実施例によって説明する。

参考例１．化合物Ｎｏ、　ｌの合成水素化ホウ素ナトリウム１０ｇを純水１００　ｍｌに溶
解し、Ａｃ１ｄ　Ｖｉｏｌｅｔ　６Ｂ　（カラーインデ
ックスＮｏ、　４２６４０）の水溶液（Ａｃｉｄ　Ｖｉ
ｏｌｅｔ　６Ｂ　１５ｇを純水８００ｍ１に溶解〕を窒
素気流下、室温で攪拌しながら滴下して加えた。滴下後
、窒素気流下、室温で３時間攪拌を行い、Ａｃ１ｄ　Ｖ
ｉｏｌｅ、ｔ　６Ｂを還元した。反応後、窒素気流下、
５Ｎ塩酸を徐々に加えてｐＨとし過剰の水素化ホウ素ナ
トリウムを分解した。５ＮＮａＯＨを加えてｐＨ７とし
、減圧下、濃縮乾固した。シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー、展開溶媒エタノール：アセトニトリル−１：
１．５により化合物Ｎｏ、　１を含有するフラクション
を集め、減圧下、濃縮乾固して目的物を得た。

収量　３．０ｇ、　　収率２０％融点　３１５°Ｃ（分解）参考例２．化合物Ｎｏ、　４の合成りｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ（カラーインデック
スＮｏ、　４２６６０）　１５ｇを用いて化合物Ｎｏ、
　１の合成と同様に行って合成した。

収量　３．８ｇ、　　収率２５％融点　２２５°Ｃ（分解）参考例３．化合物Ｎｏ、　５の合成りｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｇ　（カラーインデッ
クスＮｏ、　４２６５５）　１５ｇを用いて化合物Ｎｏ
、　Ｉの合成と同様に行って合成した。

収量　３．０ｇ、　　収率２０％融点　２１５°Ｃ（分解）参考例４．化合物Ｎｏ、　２０の合成〔参考文献：Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　５ｃａｎｄ、、　
Ｖｏｌ、１９．　Ｎｏ、６゜ｐ１３８１〜１３９０．　
（１９６５）、　）３６％（ｗ／ｗ）塩酸１．３ｍｌ、
　エタノール３０ｒｎｌの混液に尿素０．３０ｇ（５ｍ
ｍｏｌ）、　Ｐ−ジエチルアミノベンズアルデヒド０．
８９ｇ（５ｍｍｏｌ）、　Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピルアニリンナトリウム塩４．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）を
順次加えて溶解した。窒素気流下、９０〜１００°Ｃで
２４時間攪拌しながら還流した。反応後、純水５０ｍ１
を加え希ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ７とし、減圧下、
濃縮乾固した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー展
開溶媒エタノール：クロロホルム＝５：１により化合物
Ｎｏ、　２０を含有するフラクションを集め、減圧下、
濃縮乾固して目的物を得た。

収量　２．４ｇ、　　収率７０％融点　２１７−２２３℃ 参考例５．化合物Ｎｏ、　４０の合成Ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド０．７５ｇ（５ｍ
ｍ。

ｌ）を用いて化合物Ｎｏ、　２０の９合成（参考例４）
と同様に行って合成した。

収量　２．６ｇ、　　収率７８％融点２２０−２２５　　℃ 参考例６．化合物Ｎｏ、４１の合成４−ジプロピルアミノ−２−フルオロベンズアルデヒド
１．　ｌ１ｇ（５ｍｍｏｌ）を用いて化合物Ｎｏ、　２
０の合成（参考例４）と同様に行って合成した。

収量　１．６ｇ、　　収率４５％融点　２２８−２３３℃ 参考例７−化合物Ｎｏ、　４２の合成４−ジプロピルアミノ−２−メチルベンズアルデヒドｌ
、　０９ｇ（５ｍｍｏｌ）を用いて化合物Ｎｏ、　２０
の合成（参考例４）と同様に行って合成した。

収量　１．３ｇ、　　収率３７％融点　２０８−２１６℃ 参考例８１発色後の吸収スペクトル（１）試薬の調製５００００／Ａ’のパーオキシダーゼ及び発色剤として
の化合物Ｎｏ、　１．２０．４１．４２をそれぞれ各０
．５ｍｍｏｌ／　１２ずつ、また比較例として公知発色
剤Ｎｏ、　１．４．　（但し、Ｎｏ、　４のみ０．１％
トリトンＸ−１００含有）をそれぞれ各０、０２５ｍｍ
ｏｌ／　ｌずツ５０ｍｍｏｌ／　ＩＩ　Ｂ１５−Ｔｒｉ
ｓ緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、試薬液とした。

（２）測定方法上記にて調製した化合物Ｎｏ、　１．２０．４１．４２
の試薬液をそれぞれ各３ｍｌ、また比較例Ｎｏ、１．４
の試薬液をそれぞれ各３ｍｌを別々に試験管に取り、こ
れに０．６２ｍｍｏｌ／　Ｉ！過酸化水素水溶液５ｏ１
ｔｉを加え、混合後３７°Ｃで５分間加温し、発色させ
る。同時に、蒸留水（試薬盲検用）を用いて同様の操作
を行う。

発色後、試薬盲検を対照として吸収スペクトルを測定す
る。この測定結果を第１図に示す。

実施例１．遊離脂肪酸の定量（１）試薬の調製 ■　ＭｇＣＬ　１ｍｍｏｌ＃！、ＡＴＰ　１ｍｍｏｌ／
４７　、　ＣｏＡ　Ｏ，１ｍｍｏｌ／Ｉ！、アシルＣｏ
Ａシンセターゼ４００Ｕ／ｊ’、パーオキシダーゼ１０
０００Ｕ／１１トライトンＸ−１０００，０３％の濃度
になるように５０ｍｍｏｌ／　４７　ＰＩＰＥＳ−ＫＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、試薬ｌとした。

■　ＦＡＤ　４　μｍｏｌ＃７、アシルＣｏＡオキシダ
ーゼ５０００Ｕ＃’、トリトンＸ−１００℃、０３％、
発色剤として化合物Ｎｏ、　１．２０．３９．４２をそ
れぞれ各０．８ｍｍｏ　ｌ／　ＩＩずツ５０ｍｍｏｌ／
　ＩＩ　ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７，０）に溶
解し、試薬２とした。

（２）測定操作試験管に血清２０μｌを取り、これに上記試薬１を１．
３ｍｌ加え、混合後、３７°Ｃで５分間加温し、その後
、上記化合物Ｎｏ、　１．２０．３９．４２の試薬２を
それぞれ各１．３ｍｌ’を別々に加え、混合後３７°Ｃ
で５分間加温し、発色させる。同時に蒸留水（試薬盲検
用）及び標準液を用いて同様の操作を行う。発色後、試
薬盲検を対照として波長６００ｎｍで吸光度を測定し、
予め作成した検量線（第２図に示す）より血清中の遊離
脂肪酸濃度を求める。この測定結果を従来法の値と併せ
て第３．４．５．６図に示す。

実施例２．尿酸の定量（１）試薬の調製 ■ＫＣＩ　５０ｍｍｏｌ／Ｃ）ライドンＸ−１０００，
０３％、発色剤として化合物Ｎｏ、　２．４０．４１を
それぞれ各０．５ｍｍｏｌ＃ずツ５０ｍｍｏｌ／　Ｉ！
　ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（１）Ｈ７，Ｏ）に溶解し
、試薬ｌとした。

■ＫＣＩ　５０ｍｍｏｌ／　ｌ　、パーオキシダーゼ１
２５００Ｌｌ／ｌ、ウリカーゼ２５００Ｕ／　ｌ、トラ
イトンＸ−１０００゜０３％の濃度になるように５０ｍ
ｍｏｌ／　４７　Ｐ［ＰＥ５−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７，
０）に溶解し、試薬２とした。

（２）測定操作試験管に血清２０μｌを取り、これに上記化合物Ｎｏ、
　２．４０．４１の試薬１をそれぞれ各２．０ｍｌを別
々に加え、混合後３７°Ｃで５分間加温し、その後上記
で調製した試薬２を０．５ｍｌ加え、混合後３７°Ｃで
５分間加温し、発色させる。同時に蒸留水（試薬盲検用
）及び標準液を用いて同様の操作を行う。発色後、試薬
盲検を対照として波長６００ｎｍで吸光度を測定し、予
め作成した検量線（第７図に示す）より血清中の尿酸濃
度を求める。この測定結果を従来法の値と併せて第８．
９．１０図に示す。

実施例３．ＨＢｓ抗原の測定（１）　　試薬の調製 ■　抗ＨＢｓ抗体感作９６穴平底プレートの調製ＰＢＳ
で５μｇ／ｍｌに調製し、た精製抗ＨＢｓマウスモノク
ロナール抗体を５０μβずつ９６穴平底マイクロプレー
ト（ヌンク社製）の各式に分注した。これを３７°Ｃで
３時間放置後、ＰＢＳで洗浄し、０．５％（Ｗ／ｖ）カ
ゼインを含む５０ｍｍｏｌ／　Ａ’　トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）　３００μｌを加え、４°Ｃで１晩放
置し、抗ＨＢｓ抗体感作９６穴平底プレートを調製した
。

■　パーオキシダーゼ標識抗ＨＢｓ抗体の調製パーオキ
シダーゼ５ｍｇを１ｍｌの０．３ｍｏｌ／　Ｉ！の炭酸
水素ナトリウムに溶解し、これに０．２艷の１％２．４
−ジニトロフルオロベンゼンを加えて１時間攪拌した後
、１ｍｌの０．０６ｍｏｌ／　Ｉ！過ヨウ素酸ナトリウ
ムを加え、３０分攪拌、さらに１ｍｌの０．１６ｍｏｌ
／Ｒエチレングリコールを加えて１時間攪拌する。これ
を炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）で−昼夜透析する。これを
炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解した抗ＨＢｓモノクロ
ナール抗体（５ｍｇ／ｍｊ）　１ｒｎｌと混合し、室温
で３時間反応後、（ＰＢＳ透析）セファクリルＳ−２０
０でゲル濾過してパーオキシダーゼ標識抗ＨＢｓ抗体を
得る。

■　基質−発色液の調製過酸化水素１．４５ｍｍｏｌ／　ｌ、化合物Ｎｏ、１０
．５ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるように０．１ｍｏｌ／　
１リン酸緩衝液（１）Ｈ７，０）に溶解し、基質−発色
液とした。

（２）測定操作抗ＨＢｓ抗体感作９６穴平底プレートに２００ｎｇ／ｍ
１４００ｎｇ／ｍ１．６００ｎｇ／ｍｊ、　８００ｎｇ
／ｍ１．１１０００ｎ／　ｍｌ、　１２００ｎｇ／ｍｌ
の各濃度のＨＢｓ抗原含有試料５０μｌを取り、３７°
Ｃで３時間加温し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、パーオ
キシダーゼ標識抗ＨＢｓ抗体５０μｌを加え、３７°Ｃ
で２時間加温し、ＰＢＳで洗浄した。その後、基質−発
色液１００μｌを加え、３７°Ｃで３０分間加温し、発
色させる。同時に抗ＨＢｓ抗体を感作してない９６穴平
底プレートを用いて同様の操作を行う（盲検用）。発色
後、盲検を対照として波長６００ｎｍでマイクロプレー
トリーダー（コロナ電気社製ＭＴＰ−３２）を用いて吸
光度を測定した。この結果を第１１図に示す。

〔発明の効果〕

上記の如く、本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、い
ずれもその呈色時の極大吸収波長が６００ｎｍ付近にあ
るため、汎用の自動分析機に特別適しており、ｐＨによ
る影響が少な°く広範囲のｐｌ域で高感度に測定が可能
になり、かつ水溶解性が極めて良好である等、微量の生
体成分の測定の発色剤として用いた場合、その効果は顕
著なるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、参考例８における吸収スペクトルを表し、第
２図及び第３．　４．　５．　６．図は実施例１におけ
る検量線及び相関図を表し、第７図及び第８．　９．１
０図は、実施例２における検量線及び相関図を表し、第
１１図は、実施例３における検量線を表すものである。

Claims

【特許請求の範囲】１、次式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）〔式中、Ｈは、水素を示し、Ｒ＿１〜Ｒ＿６は同一もし
くは異なってよく、水素、置換フェニル基、整数１〜５
のアルキル基又は置換アルキル基を示し、Ａ〜Ｃは同一
もしくは異なってよく、スルホン基、カルボキシル基、
水酸基、ニトロ基、ハロゲン、整数１〜５のアルキル基
又はアルコキシ基を示し、ｎは０、１、２、３又は４を
示す。〕で表される化合物を発色剤として用いることを
特徴とする体液中の微量成分の定量法。２、式（Ｉ）で表される化合物を含有することを特徴と
する体液中の微量成分の定量用組成物。