JP2515551B2 - 新規な過酸化水素の定量方法 - Google Patents
新規な過酸化水素の定量方法Info
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- JP2515551B2 JP2515551B2 JP62142467A JP14246787A JP2515551B2 JP 2515551 B2 JP2515551 B2 JP 2515551B2 JP 62142467 A JP62142467 A JP 62142467A JP 14246787 A JP14246787 A JP 14246787A JP 2515551 B2 JP2515551 B2 JP 2515551B2
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- measuring
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、キサンチンオキシダーゼ（以下、XODと略
称する。）の作用を介して生成する過酸化水素を定量す
ることにより行う、例えば核酸代謝に関与する物質の改
善された定量方法に関する。
称する。）の作用を介して生成する過酸化水素を定量す
ることにより行う、例えば核酸代謝に関与する物質の改
善された定量方法に関する。
［発明の背景］ 核酸代謝に関与する酵素であるグアナーゼ，アデノシ
ンデアミナーゼ，プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
等、或はそれらの酵素による代謝産物であるイノシン，
ヒポキサンチン，キサンチン等、又はプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼの基質となる無機リン等は、臨床検査
の分野に於いては、重要な測定項目の一つであり、これ
らの正確で簡便な測定法の確立は近時重要な課題となっ
てきている。
ンデアミナーゼ，プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
等、或はそれらの酵素による代謝産物であるイノシン，
ヒポキサンチン，キサンチン等、又はプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼの基質となる無機リン等は、臨床検査
の分野に於いては、重要な測定項目の一つであり、これ
らの正確で簡便な測定法の確立は近時重要な課題となっ
てきている。
これら核酸代謝に関与する物質の測定法としては、例
えばグアナーゼの場合には基質プリンの減少を紫外部吸
光度変化で測定する方法（Arch.Biochem.,29,124頁,195
0）、生成物であるアンモニアを測定する方法（Cancer
Res.,12,524頁,1952）、生成物であるキサンチンにXO
Dを作用させて生じる尿酸を測定するか（J.Biol.Chem.,
167,461頁,1947）、或は過酸化水素を測定する方法（Ch
em.Pharm.Bull.,29,426頁,1981）等が知られている。ま
た、アデノシンデアミナーゼの測定については、生成物
であるアンモニアを測定する方法（J.Biol.Chem.,167,4
45頁,1947）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びX
ODを介在させることにより生成物のイノシンを尿酸と過
酸化水素に変換させ、生じた過酸化水素を測定する方法
（Chem.Pharm.Bull.,29,426頁,1981）等が知られてい
る。
えばグアナーゼの場合には基質プリンの減少を紫外部吸
光度変化で測定する方法（Arch.Biochem.,29,124頁,195
0）、生成物であるアンモニアを測定する方法（Cancer
Res.,12,524頁,1952）、生成物であるキサンチンにXO
Dを作用させて生じる尿酸を測定するか（J.Biol.Chem.,
167,461頁,1947）、或は過酸化水素を測定する方法（Ch
em.Pharm.Bull.,29,426頁,1981）等が知られている。ま
た、アデノシンデアミナーゼの測定については、生成物
であるアンモニアを測定する方法（J.Biol.Chem.,167,4
45頁,1947）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びX
ODを介在させることにより生成物のイノシンを尿酸と過
酸化水素に変換させ、生じた過酸化水素を測定する方法
（Chem.Pharm.Bull.,29,426頁,1981）等が知られてい
る。
しかし、アンモニアを測定する方法、基質プリンの減
少を紫外部吸光度変化で測定する方法或は生成物である
尿酸を測定する方法では試料中の内因性アンモニア、紫
外吸光物質或は尿酸の影響を受けるため試料ブランク値
の測定を実施しても、測定結果が不正確となる場合があ
る。
少を紫外部吸光度変化で測定する方法或は生成物である
尿酸を測定する方法では試料中の内因性アンモニア、紫
外吸光物質或は尿酸の影響を受けるため試料ブランク値
の測定を実施しても、測定結果が不正確となる場合があ
る。
一方、ヒポキサンチン（或はキサンチン）を基質とし
て、XODの作用により生成する過酸化水素を測定する方
法に於いては、過酸化水素のほかにもスーパーオキサイ
ドアニオン（▲Ｏ− ▼）が同時に生成し、しかも過酸
化水素とスーパーオキサイドアニオンの生成比はpH或は
基質濃度によって変化し（J.Biol.chem.,245,4053頁,19
70）、過酸化水素とスーパーオキサイドアニオンが直接
反応して過酸化水素が分解されたり、或は過酸化水素と
パーオキシダーゼ（以下、PODと略称する。）の反応を
介して生成する色素をスーパーオキサイドアニオンが還
元したりするために、実測された過酸化水素生成量は紫
外部吸光度測定により求めた基質減少量から算出した過
酸化水素の理論的生成量よりも低かったり、生成する色
素量が過酸化水素の理論的生成量に比例しないと言う現
象が生じ、しかもこのような現象は測定条件により変化
するため、この反応を利用して物質の定量を行った場合
には低濃度域での測定しか信頼性がない等の問題があっ
た。
て、XODの作用により生成する過酸化水素を測定する方
法に於いては、過酸化水素のほかにもスーパーオキサイ
ドアニオン（▲Ｏ− ▼）が同時に生成し、しかも過酸
化水素とスーパーオキサイドアニオンの生成比はpH或は
基質濃度によって変化し（J.Biol.chem.,245,4053頁,19
70）、過酸化水素とスーパーオキサイドアニオンが直接
反応して過酸化水素が分解されたり、或は過酸化水素と
パーオキシダーゼ（以下、PODと略称する。）の反応を
介して生成する色素をスーパーオキサイドアニオンが還
元したりするために、実測された過酸化水素生成量は紫
外部吸光度測定により求めた基質減少量から算出した過
酸化水素の理論的生成量よりも低かったり、生成する色
素量が過酸化水素の理論的生成量に比例しないと言う現
象が生じ、しかもこのような現象は測定条件により変化
するため、この反応を利用して物質の定量を行った場合
には低濃度域での測定しか信頼性がない等の問題があっ
た。
その為、XODの作用により生成する過酸化水素を測定
する方法に於いてはこれらの問題点を解決すべく種々の
方法、例えばスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）を
共存させ、反応後に液性を酸性とする方法（特公昭59-6
6899号公報）、或は反応液の液性を一旦酸性とした後に
発色試薬を加えて比色定量する方法（特公昭59-2280号
公報）等が報告されている。しかしながら、これらの方
法は測定のステップ数が増加する為操作が繁雑となる
し、酵素活性を測定するための所謂レイト法には適用で
きないものであった。また、これら以外にも微生物由来
の特別なXODを使用することにより上記問題点を回避し
ている報告（特公昭55-108298号公報）もあるがこれに
使用できる酵素（XOD）は限定されており、更なる改良
が望まれていた。
する方法に於いてはこれらの問題点を解決すべく種々の
方法、例えばスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）を
共存させ、反応後に液性を酸性とする方法（特公昭59-6
6899号公報）、或は反応液の液性を一旦酸性とした後に
発色試薬を加えて比色定量する方法（特公昭59-2280号
公報）等が報告されている。しかしながら、これらの方
法は測定のステップ数が増加する為操作が繁雑となる
し、酵素活性を測定するための所謂レイト法には適用で
きないものであった。また、これら以外にも微生物由来
の特別なXODを使用することにより上記問題点を回避し
ている報告（特公昭55-108298号公報）もあるがこれに
使用できる酵素（XOD）は限定されており、更なる改良
が望まれていた。
また、無機リンの測定方法としては、Fiske-SubbaRow
法（J.Biol.Chem.,66,375頁,1925）が一般に用いられて
いるが、強酸を使用している為に、自動分析装置の使用
材料への影響が懸念され、新規な、自動分析装置への応
用が可能な測定法の確立が望まれていた。
法（J.Biol.Chem.,66,375頁,1925）が一般に用いられて
いるが、強酸を使用している為に、自動分析装置の使用
材料への影響が懸念され、新規な、自動分析装置への応
用が可能な測定法の確立が望まれていた。
［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、
XODの作用を介して生成する過酸化水素の定量方法に於
いて、従来より改善が求められていた種々の問題点をす
べて解決した、正確で簡便な定量方法を提供することを
目的とする。
XODの作用を介して生成する過酸化水素の定量方法に於
いて、従来より改善が求められていた種々の問題点をす
べて解決した、正確で簡便な定量方法を提供することを
目的とする。
［発明の構成］ 本発明の目的を達成する為に、本発明は次の構成より
なる。
なる。
「XODの作用を介して生成する過酸化水素の測定方法に
於いて、過酸化水素生成系にスーパーオキサイドアニオ
ン消去剤としてのヒドロキシルアミン及び／又はその誘
導体を加えて、これを行うことを特徴とする過酸化水素
の定量方法。」 即ち、本発明者らは、例えばヒポキサンチン、或はキ
サンチンにXODが作用して生ずる過酸化水素を測定する
に当り、過酸化水素と同時に生成するスーパーオキサイ
ドアニオンに起因して生ずる種々の問題点を解決すべ
く、スーパーオキサイドアニオンのみを選択的に分解す
るが、生成した過酸化水素及びその測定には何ら影響を
及ぼさない物質について鋭意研究を重ねた結果、ヒドロ
キシルアミン及びその誘導体（以下、ヒドロキシルアミ
ン類と称す。）が、その目的を達成し得るものであるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
於いて、過酸化水素生成系にスーパーオキサイドアニオ
ン消去剤としてのヒドロキシルアミン及び／又はその誘
導体を加えて、これを行うことを特徴とする過酸化水素
の定量方法。」 即ち、本発明者らは、例えばヒポキサンチン、或はキ
サンチンにXODが作用して生ずる過酸化水素を測定する
に当り、過酸化水素と同時に生成するスーパーオキサイ
ドアニオンに起因して生ずる種々の問題点を解決すべ
く、スーパーオキサイドアニオンのみを選択的に分解す
るが、生成した過酸化水素及びその測定には何ら影響を
及ぼさない物質について鋭意研究を重ねた結果、ヒドロ
キシルアミン及びその誘導体（以下、ヒドロキシルアミ
ン類と称す。）が、その目的を達成し得るものであるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
ヒドロキシルアミン類は、これまで、チトクローム
Ｃ、テトラゾリウム塩類（ニトロテトラゾリウムブルー
等）、ピロガロール等と同様に、SOD測定時に於けるス
ーパーオキサイドアニオンの検出剤として、或は生体内
のスーパーオキサイドアニオンの検出剤として用いられ
ている例はあるが、本発明の如くXODの作用を介して生
成する過酸化水素の定量方法に於いてスーパーオキサイ
ドアニオンを消去する目的でこれが用いられた例はこれ
までに未だない。また、ヒドロキシルアミン類と同様に
SOD測定時に於けるスーパーオキサイドアニオンの検出
剤として、或は生体内のスーパーオキサイドアニオンの
検出剤として用いられているチトクロームＣ、テトラゾ
リウム塩類（ニトロテトラゾリウムブルー等）、ピロガ
ロール等をスーパーオキサイドアニオンの消去剤として
用いた場合には、これらは全てスーパーオキサイドアニ
オンとの反応が（スーパーオキサイドアニオンの消去速
度が）遅く、しかもスーパーオキサイドアニオンとの反
応により着色することもあって、これらをスーパーオキ
サイドアニオン消去剤として、XODを介して生成する過
酸化水素を測定すると、一様に検量線が湾曲するという
現象が見られるのに対し、本発明に係わるヒドロキシル
アミン類をスーパーオキサイドアニオン消去剤として用
いた場合には、スーパーオキサイドアニオンを速やかに
且つ殆ど完全に消去し、過酸化水素測定に於いて、良好
な直線性を有する検量線が得られることということは極
めて意外なことであった。
Ｃ、テトラゾリウム塩類（ニトロテトラゾリウムブルー
等）、ピロガロール等と同様に、SOD測定時に於けるス
ーパーオキサイドアニオンの検出剤として、或は生体内
のスーパーオキサイドアニオンの検出剤として用いられ
ている例はあるが、本発明の如くXODの作用を介して生
成する過酸化水素の定量方法に於いてスーパーオキサイ
ドアニオンを消去する目的でこれが用いられた例はこれ
までに未だない。また、ヒドロキシルアミン類と同様に
SOD測定時に於けるスーパーオキサイドアニオンの検出
剤として、或は生体内のスーパーオキサイドアニオンの
検出剤として用いられているチトクロームＣ、テトラゾ
リウム塩類（ニトロテトラゾリウムブルー等）、ピロガ
ロール等をスーパーオキサイドアニオンの消去剤として
用いた場合には、これらは全てスーパーオキサイドアニ
オンとの反応が（スーパーオキサイドアニオンの消去速
度が）遅く、しかもスーパーオキサイドアニオンとの反
応により着色することもあって、これらをスーパーオキ
サイドアニオン消去剤として、XODを介して生成する過
酸化水素を測定すると、一様に検量線が湾曲するという
現象が見られるのに対し、本発明に係わるヒドロキシル
アミン類をスーパーオキサイドアニオン消去剤として用
いた場合には、スーパーオキサイドアニオンを速やかに
且つ殆ど完全に消去し、過酸化水素測定に於いて、良好
な直線性を有する検量線が得られることということは極
めて意外なことであった。
本発明に用いられるヒドロキシルアミン及びその誘導
体としては、例えばヒドロキシルアミン、Ｎ−メチルヒ
ドロキシルアミン、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン及び
これらの鉱酸塩（塩酸塩，硫酸塩等）等が挙げられる
が、スーパーオキサイドアニオンの消去剤として使用で
き、かつXODを介して生成する過酸化水素を測定する反
応を阻害しないヒドロキシルアミン類であれば特にこれ
らに限定することなく用いることができる。また、これ
らヒドロキシルアミン類は夫々単独で用いてもよいし、
適宜２種以上組み合わせて用いてもよく、その使用量と
しては、過酸化水素生成系内に合計で少なくとも0.001m
M以上存在させることが最低必要条件であるが、通常0.0
1〜0.2mMの範囲が好ましく用いられる。
体としては、例えばヒドロキシルアミン、Ｎ−メチルヒ
ドロキシルアミン、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン及び
これらの鉱酸塩（塩酸塩，硫酸塩等）等が挙げられる
が、スーパーオキサイドアニオンの消去剤として使用で
き、かつXODを介して生成する過酸化水素を測定する反
応を阻害しないヒドロキシルアミン類であれば特にこれ
らに限定することなく用いることができる。また、これ
らヒドロキシルアミン類は夫々単独で用いてもよいし、
適宜２種以上組み合わせて用いてもよく、その使用量と
しては、過酸化水素生成系内に合計で少なくとも0.001m
M以上存在させることが最低必要条件であるが、通常0.0
1〜0.2mMの範囲が好ましく用いられる。
本発明の方法により測定可能な物質としては、例えば
XODの基質となるキサンチン，ヒポキサンチン等、或は
適当な酵素反応によりこれらの物質に変換されるアデノ
シン，イノシン，グアニン等，又は上記した如き物質を
産生するアデノシンデアミナーゼ，プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ，グアナーゼ等の酵素類及び無機リン等
が挙げられるが、最終的にXODの作用により過酸化水素
を発生させる反応系に導けるものであれば特に限定され
ない。
XODの基質となるキサンチン，ヒポキサンチン等、或は
適当な酵素反応によりこれらの物質に変換されるアデノ
シン，イノシン，グアニン等，又は上記した如き物質を
産生するアデノシンデアミナーゼ，プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ，グアナーゼ等の酵素類及び無機リン等
が挙げられるが、最終的にXODの作用により過酸化水素
を発生させる反応系に導けるものであれば特に限定され
ない。
本発明に用いられるXODは牛乳由来及び微生物由来の
いずれのものでもよい。
いずれのものでもよい。
本発明の定量方法は、過酸化水素生成系にヒドロキシ
ルアミン類を加えること以外は、XODの作用を介して生
成する過酸化水素をPODと被酸化性呈色試薬を用いて比
色定量する自体公知の方法に従ってこれは行えばよく、
用いられる測定試薬も、自体公知の測定法に於いて用い
られる試薬を用いることで足りる。即ち、PODは植物由
来、動物由来、微生物由来のいずれにてもよいが、通常
は西洋ワサビ由来のものが好ましく用いられる。被酸化
性呈色試薬としては通常過酸化水素−POD系で用いられ
ている、例えば４−アミノアンチピリンと、フェノール
系化合物又はN,N−ジ置換アニリン系化合物とを組み合
わせた被酸化性呈色試薬、３−メチルベンゾチアゾリノ
ンヒドラゾン（MBTH）とアニリン系化合物との組み合わ
せ試薬、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン
誘導体、ｏ−トリジン誘導体、ジフェニルアミン誘導
体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブ
ルー誘導体、ｏ−フェニレンジアミン、2,2′−アジノ
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
又はその塩などが挙げられるが、これらに限定されるも
のではない。また、測定試薬の液性の調整に用いられる
緩衝剤も通常使用されるものであれば特に限定されない
が、例えばリン酸塩緩衝剤，トリス緩衝剤，グッド緩衝
剤等が挙げられる。但し、無機リンの測定には、リン酸
塩緩衝剤以外の緩衝剤を使用しなくてはならないことは
言うまでもない。測定試薬の液性（pH）は、測定対象物
質、XODと共役して用いられる酵素等の至適pH等の考慮
が必要であるが、通常はpH6〜10の範囲が好ましく用い
られる。測定時の温度としては、目的とする反応が進行
する温度であれば特に限定されないが、通常25〜40℃の
範囲が好ましく用いられる。尚、本発明に用いられる測
定試薬中には、測定対象物質に応じて必要な基質や共役
酵素が必要濃度添加されることは言うまでもない。
ルアミン類を加えること以外は、XODの作用を介して生
成する過酸化水素をPODと被酸化性呈色試薬を用いて比
色定量する自体公知の方法に従ってこれは行えばよく、
用いられる測定試薬も、自体公知の測定法に於いて用い
られる試薬を用いることで足りる。即ち、PODは植物由
来、動物由来、微生物由来のいずれにてもよいが、通常
は西洋ワサビ由来のものが好ましく用いられる。被酸化
性呈色試薬としては通常過酸化水素−POD系で用いられ
ている、例えば４−アミノアンチピリンと、フェノール
系化合物又はN,N−ジ置換アニリン系化合物とを組み合
わせた被酸化性呈色試薬、３−メチルベンゾチアゾリノ
ンヒドラゾン（MBTH）とアニリン系化合物との組み合わ
せ試薬、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン
誘導体、ｏ−トリジン誘導体、ジフェニルアミン誘導
体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブ
ルー誘導体、ｏ−フェニレンジアミン、2,2′−アジノ
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
又はその塩などが挙げられるが、これらに限定されるも
のではない。また、測定試薬の液性の調整に用いられる
緩衝剤も通常使用されるものであれば特に限定されない
が、例えばリン酸塩緩衝剤，トリス緩衝剤，グッド緩衝
剤等が挙げられる。但し、無機リンの測定には、リン酸
塩緩衝剤以外の緩衝剤を使用しなくてはならないことは
言うまでもない。測定試薬の液性（pH）は、測定対象物
質、XODと共役して用いられる酵素等の至適pH等の考慮
が必要であるが、通常はpH6〜10の範囲が好ましく用い
られる。測定時の温度としては、目的とする反応が進行
する温度であれば特に限定されないが、通常25〜40℃の
範囲が好ましく用いられる。尚、本発明に用いられる測
定試薬中には、測定対象物質に応じて必要な基質や共役
酵素が必要濃度添加されることは言うまでもない。
本発明の方法に於いて、アスコルビン酸，ビリルビン
等の測定妨害物質を含むものを試料とする場合には、ア
スコルビン酸オキシダーゼ，ビリルビンオキシダーゼ等
の酵素を用いる方法や、沃素酸塩，過沃素酸塩を用いる
方法など従来から良く知られた方法で処理してもよい
し、また、特開昭60-262599号公報に記載の方法、即
ち、銅イオン及びPODとアニリン系化合物，フェノール
系化合物,4−アミノアンチピリン等を併用することによ
って処理してもよく、これらのうちの適当な方法に従っ
て処理することによりこれらの影響を軽減することがで
きる。
等の測定妨害物質を含むものを試料とする場合には、ア
スコルビン酸オキシダーゼ，ビリルビンオキシダーゼ等
の酵素を用いる方法や、沃素酸塩，過沃素酸塩を用いる
方法など従来から良く知られた方法で処理してもよい
し、また、特開昭60-262599号公報に記載の方法、即
ち、銅イオン及びPODとアニリン系化合物，フェノール
系化合物,4−アミノアンチピリン等を併用することによ
って処理してもよく、これらのうちの適当な方法に従っ
て処理することによりこれらの影響を軽減することがで
きる。
本発明の方法は、通常１ステップの操作で測定可能で
あるが、妨害物質の除去を行う前処理操作等を加えて２
ステップの操作としてもよいし、また、測定対象物質を
酵素とした場合には、反応停止液を用いた２ステップの
操作、或は前述の如き前処理操作を加えて３ステップの
操作として行ってもよい。
あるが、妨害物質の除去を行う前処理操作等を加えて２
ステップの操作としてもよいし、また、測定対象物質を
酵素とした場合には、反応停止液を用いた２ステップの
操作、或は前述の如き前処理操作を加えて３ステップの
操作として行ってもよい。
本発明の方法は、従来この分野で用いられてきた測定
方法に比べて測定のステップ数が少なく、ホルマザン色
素の様な染着性を有する色素を使用することもなく、ま
た、金属に対する腐食力の強い酸類も使用しないので、
自動分析装置への適用が可能である。また、本発明の方
法は簡便な試験紙法や、反応試薬を含有させた多層分析
シート（多層一体型定量分析フィルム）を使用する所謂
乾式定量方法にも応用することができる。
方法に比べて測定のステップ数が少なく、ホルマザン色
素の様な染着性を有する色素を使用することもなく、ま
た、金属に対する腐食力の強い酸類も使用しないので、
自動分析装置への適用が可能である。また、本発明の方
法は簡便な試験紙法や、反応試薬を含有させた多層分析
シート（多層一体型定量分析フィルム）を使用する所謂
乾式定量方法にも応用することができる。
以下に実施例により、本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。
［実施例］ 実施例1.ヒポキサンチンの定量 （測定試薬） 0.1M N−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスル
ホン酸（ACES）・NaOH緩衝液に下記物質を下記濃度とな
るように溶解して測定試薬とした。
ホン酸（ACES）・NaOH緩衝液に下記物質を下記濃度とな
るように溶解して測定試薬とした。
XOD 0.04U/ml POD 4U/ml Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS） 0.35mg/ml ４−アミノアンチピリン 0.1mg/ml ヒドロキシルアミン塩酸塩 0.1mM （試料） ヒポキサンチンを夫々3.2,6.4,9.6,12.8mM含む水溶液
を調製し試料とした。
ル）−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS） 0.35mg/ml ４−アミノアンチピリン 0.1mg/ml ヒドロキシルアミン塩酸塩 0.1mM （試料） ヒポキサンチンを夫々3.2,6.4,9.6,12.8mM含む水溶液
を調製し試料とした。
（操作法） 試料を20μｌとり、測定試薬2.5mlを加えてよく混合
し、37℃で５分間反応させた後、600nmに於ける吸光度
Ｅsを測定した。
し、37℃で５分間反応させた後、600nmに於ける吸光度
Ｅsを測定した。
試料の代りに精製水を用いて同様の操作を行い試薬ブ
ランクＥB1を測定した。
ランクＥB1を測定した。
（結果） 横軸のヒポキサンチン濃度（mM）に対して得られた吸
光度（Ｅs−ＥB1）を縦軸に沿ってプロットした点を結
んで得られる検量線を第１図に示す（−○−）。
光度（Ｅs−ＥB1）を縦軸に沿ってプロットした点を結
んで得られる検量線を第１図に示す（−○−）。
比較例1. 実施例１の測定試薬からヒドロキシルアミン塩酸塩を
除いたものを測定試薬とした以外は実施例１と同様の測
定試薬を用い、実施例１と同様の操作により実施例１と
同じ試料について測定を行って検量線を作成した。
除いたものを測定試薬とした以外は実施例１と同様の測
定試薬を用い、実施例１と同様の操作により実施例１と
同じ試料について測定を行って検量線を作成した。
結果を第１図に併せて示す（−△−）。
比較例2. 比較例１の測定試薬にスーパーオキシドジスムターゼ
（SOD）を50U/mlとなるように添加したものを測定試薬
とした以外は実施例１と同様の測定試薬を用い、実施例
１と同様の操作により実施例１と同じ試料について測定
を行って検量線を作成した。
（SOD）を50U/mlとなるように添加したものを測定試薬
とした以外は実施例１と同様の測定試薬を用い、実施例
１と同様の操作により実施例１と同じ試料について測定
を行って検量線を作成した。
結果を第１図に併せて示す（−×−）。
第１図から明らかな如く、本発明の方法による実施例
１に於いて得られた検量線は、比較例１又は２に於いて
得られたそれと比べ、直線性において優れていることが
わかる。
１に於いて得られた検量線は、比較例１又は２に於いて
得られたそれと比べ、直線性において優れていることが
わかる。
実施例2. 実施例１の測定試薬中のヒドロキシルアミン塩酸塩の
代りにＮ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩を0.1mM含
むものを測定試薬とした以外は実施例１と同様の測定試
薬を用い、実施例１と同様の操作により実施例１と同じ
試料について測定を行って検量線を作成した。
代りにＮ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩を0.1mM含
むものを測定試薬とした以外は実施例１と同様の測定試
薬を用い、実施例１と同様の操作により実施例１と同じ
試料について測定を行って検量線を作成した。
結果を第２図に示す。
第２図から明らかな如く、実施例１と同様に良好な直
線性を示す検量線が得られた。
線性を示す検量線が得られた。
実施例3.無機リンの定量 （測定試薬） 0.1M Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンス
ルホン酸（ACES）・NaOH緩衝液に下記物質を下記濃度と
なるように溶解して測定試薬とした。
ルホン酸（ACES）・NaOH緩衝液に下記物質を下記濃度と
なるように溶解して測定試薬とした。
XOD 0.04U/ml POD 4U/ml Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS） 0.35mg/ml ４−アミノアンチピリン 0.1mg/ml ヒドロキシルアミン塩酸塩 0.1mM プリンヌクレオシドホスホリラーゼ 0.4U/ml イノシン 2mM （試料） 無機リンを夫々10,20,30,40mg/dl含む水溶液を調製し
試料とした。
ル）−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS） 0.35mg/ml ４−アミノアンチピリン 0.1mg/ml ヒドロキシルアミン塩酸塩 0.1mM プリンヌクレオシドホスホリラーゼ 0.4U/ml イノシン 2mM （試料） 無機リンを夫々10,20,30,40mg/dl含む水溶液を調製し
試料とした。
（操作法） 試料を20μｌとり、測定試薬2.5mlを加えてよく混合
し、37℃で５分間反応させた後、600nmに於ける吸光度
ＥSを測定した。
し、37℃で５分間反応させた後、600nmに於ける吸光度
ＥSを測定した。
試料の代りに精製水を用いて同様の操作を行い試薬ブ
ランクＥB1を測定した。
ランクＥB1を測定した。
（結果） 横軸の無機リン濃度（mg/dl）に対して得られた吸光
度（ＥS−ＥB1）を縦軸に沿ってプロットした点を結ん
で得られる検量線を第３図に示す。
度（ＥS−ＥB1）を縦軸に沿ってプロットした点を結ん
で得られる検量線を第３図に示す。
第３図から明らかな如く、得られた検量線は、原点を
通る直線となり良好な定量性を示した。
通る直線となり良好な定量性を示した。
実施例4.血清中の無機リンの定量 （測定試薬） 実施例３と同じ。
（試料） 人血清10検体を試料とした。
（操作法） 試料を20μｌとり、測定試薬2.5mlを加えてよく混合
し、37℃で５分間反応させた後、600nmに於ける吸光度
ＥSを測定した。
し、37℃で５分間反応させた後、600nmに於ける吸光度
ＥSを測定した。
試料の代りに精製水及び無機リン標準液（無機リン10
mg/dl含有）を用いて同様の操作を行い試薬ブランクＥ
B1及び標準液吸光度ＥStdを測定した。
mg/dl含有）を用いて同様の操作を行い試薬ブランクＥ
B1及び標準液吸光度ＥStdを測定した。
得られた吸光度を用いて次式により試料中の無機リン
濃度Ｐ（mg/dl）を算出した。
濃度Ｐ（mg/dl）を算出した。
Ｐ（mg/dl）＝｛（ＥS−ＥB1）÷（ＥStd−ＥB1）｝×1
0 （結果） 測定結果を表−１に示す。
0 （結果） 測定結果を表−１に示す。
参考例1.従来法による血清中の無機リンの定量 市販の無機リン測定試薬［無機リンＣ−テストワコー
（和光純薬工業（株）製）］を用い、実施例４と同じ試
料について無機リンの定量を行った。尚、操作法は、同
測定試薬の現品説明書に従って行った。
（和光純薬工業（株）製）］を用い、実施例４と同じ試
料について無機リンの定量を行った。尚、操作法は、同
測定試薬の現品説明書に従って行った。
（結果） 測定結果を表−１に併せて示す。
相関関数：γ＝0.999 回帰直線式:Y＝0.993X＋0.02 表−１から明らかな如く実施例４で得られた値と参考
例１で得られた値とは良く一致しておりその間に有意差
は認められなかった。
例１で得られた値とは良く一致しておりその間に有意差
は認められなかった。
［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明はXODを介して生成する過酸
化水素の、正確、且つ簡便で、しかも自動分析機に応用
可能な測定方法を提供するものであり、これにより例え
ば該酸代謝に関与する物質等を容易に且つより正確に測
定することが可能となった点に顕著な効果を奏する。
化水素の、正確、且つ簡便で、しかも自動分析機に応用
可能な測定方法を提供するものであり、これにより例え
ば該酸代謝に関与する物質等を容易に且つより正確に測
定することが可能となった点に顕著な効果を奏する。
第１図は、実施例１、比較例１及び比較例２により得ら
れた検量線を示し、横軸のヒポキサンチン濃度（mM）に
対して得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を
結んだものである。ここで、−○−は実施例１で得られ
た結果を、−△−は比較例１で得られた結果を、−Ｘ−
は比較例２で得られた結果を各々示す。 第２図は、実施例２により得られた検量線を示し、横軸
のヒポキサンチン濃度（mM）に対して得られた吸光度を
縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第３図は、実施例３により得られた検量線を示し、横軸
の無機リン濃度（mg/dl）に対して得られた吸光度を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。
れた検量線を示し、横軸のヒポキサンチン濃度（mM）に
対して得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を
結んだものである。ここで、−○−は実施例１で得られ
た結果を、−△−は比較例１で得られた結果を、−Ｘ−
は比較例２で得られた結果を各々示す。 第２図は、実施例２により得られた検量線を示し、横軸
のヒポキサンチン濃度（mM）に対して得られた吸光度を
縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第３図は、実施例３により得られた検量線を示し、横軸
の無機リン濃度（mg/dl）に対して得られた吸光度を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。
Claims (1)
- 【請求項１】キサンチンオキシダーゼの作用を介して生
成する過酸化水素の定量方法に於いて、過酸化水素生成
系にスーパーオキサイドアニオン消去剤としてのヒドロ
キシルアミン及び／又はその誘導体を加えて、これを行
うことを特徴とする過酸化水素の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62142467A JP2515551B2 (ja) | 1987-06-08 | 1987-06-08 | 新規な過酸化水素の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62142467A JP2515551B2 (ja) | 1987-06-08 | 1987-06-08 | 新規な過酸化水素の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63304998A JPS63304998A (ja) | 1988-12-13 |
| JP2515551B2 true JP2515551B2 (ja) | 1996-07-10 |
Family
ID=15315993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62142467A Expired - Lifetime JP2515551B2 (ja) | 1987-06-08 | 1987-06-08 | 新規な過酸化水素の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2515551B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2019711A1 (en) * | 1989-06-28 | 1990-12-28 | Takashi Ikegami | Sensitization of assays |
| US6312917B1 (en) * | 1998-12-04 | 2001-11-06 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Method of screening candidate compounds for susceptibility to oxidative metabolism |
-
1987
- 1987-06-08 JP JP62142467A patent/JP2515551B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63304998A (ja) | 1988-12-13 |
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