JPH08510387A - 突然変異体ルシフェラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、甲虫ルシフェラーゼの非天然活性突然変異体及びかかる突然変異体をコードするＤＮＡを提供する。本発明の突然変異ルシフェラーゼは、野生型酵素によって生成される生物発光のピーク強度の波長から少なくとも１ｎｍは異なるピーク強度の波長を有する生物発光を生じることで対応野生型ルシフェラーゼとは異なる。本発明の突然変異ルシフェラーゼ及びＤＮＡは種々のバイオ検出に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 突然変異体ルシフェラーゼ 技術的分野 本発明は全体として、ホタルに由来するような、発光を生起するルシフェラー ゼ酵素に係わる。本発明は特に、甲虫類の突然変異体ルシフェラーゼに係わる。 本発明の突然変異体ルシフェラーゼは遺伝子操作によって製造され、天然には生 じず、いずれにせよ、発光の色の変化を惹起するように改変されている。本発明 のルシフェラーゼは対応する天然のルシフェラーゼ同様、様々な物質または現象 に関する試験またはアッセイにおいて発光信号を提供するべく用いられ得る。発明の背景 分子事象を定性的または定量的に監視するのにリポーター分子またはラベルを 用いることは広く行なわれている。リポーター分子またはラベルの使用は、医学 的診断のためのアッセイ、工業的環境内で毒素その他の物質を検出するためのア ッセイ、並びに生物学、生物医学及び生化学の基礎及び応用研究のためのアッセ イにおいて認められる。これらのアッセイには、イムノアッセイ、核酸プローブ ハイブリダイゼーションアッセイ、及びリポーター酵素または 他のタンパク質が特定プロモーターの制御下での発現によって産生されるアッセ イが含まれる。このようなアッセイシステムのリポーター分子またはラベルは、 放射性同位体、蛍光物質、酵素及び化学発光物質を包含している。 当該事象の監視または測定に化学発光を利用するアッセイシステムに含まれる ものに、生物発光酵素ルシフェラーゼの活性を測定するアッセイが有る。 発光系は、細菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、魚類、多足類、有翅昆虫類 （ｆｌｉｅｓ）、菌類、蠕形動物、甲殻類及び甲虫類、特にＰｙｒｏｐｈｏｒｕ ｓ 属のコメツキムシ並びにＰｈｏｔｉｎｕｓ属、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ属及びＬｕｃ ｉｏｌａ 属のホタルを含めた多くの発光生物から知られ、かつ単離されている。 上記のような生物の多くでは、酵素が一原子酸素添加（ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａ ｔｉｏｎ）を触媒し、その結果生じる自由エネルギーを用いて分子を高エネルギ ー状態へと励起する。励起された分子が自然に基底状態に戻る時可視光が発せら れる。このようにして発せられる光は“生物発光”と呼称される。本明細書では 以後この光を、単に“発光”とも呼称する。 天然の生物発光が限定的にしか生起しないことは、ルシ フェラーゼ酵素を分子事象監視のためのリポーター分子として用いるうえでの利 点となる。天然の生物発光は稀であるので、他の生物学的過程に由来する発光が 生物系に導入されたルシフェラーゼの活性を妨害するとは考えにくい。 従って、たとえ複雑な環境にあっても、光の検出がルシフェラーゼ活性を明瞭に 示すことになる。 ルシフェラーゼは、この酵素を（生物系の特性の解明にリポーター系を用いる ）バイオセンシングのためのリポーター分子として特に有用なものとする付加的 な特徴を有する。バイオセンサー（生物由来の構成要素を含むセンサー）におけ る信号変換は通常、生物由来の構成要素による信号発生と、電気的構成要素によ る信号の変換及び増幅とから成る二段階プロセスを含む。信号発生は典型的には 、結合または触媒作用によって行なわれる。これらの生化学的事象の電気信号へ の変換は、典型的には電気化学的検出法または熱量検出法に基づき、これらの検 出法は生化学反応の自由エネルギー変化によって制約される。ほとんどの反応に おいて上記変化は、２個のＡＴＰ分子の加水分解のエネルギー、即ち約７０ｋＪ ／ｍｏｌより小さい。しかし、ルシフェラーゼによって惹起される発光ははるか に大きいエ ネルギー量をもたらす。ホタルルシフェラーゼによって触媒された反応から発せ られる光子（５６０ｎｍ）は２１４ｋＪ／アインシュタインのエネルギーを有す る。そのうえ、ルシフェラーゼによって触媒される反応は、０．９に近い量子収 量を有するきわめて効率的な公知の生物発光反応の一つである。従ってこの酵素 は、化学エネルギーのきわめて効率的なトランスデューサーである。 ごく初期の研究以来、甲虫類ルシフェラーゼ、特に一般的な北米産ホタル種で あるＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓに由来するルシフェラーゼは生物発光理 解のための範例として役立ってきた。ルシフェラーゼの基礎知識及び応用は、“ ホタルルシフェラーゼ”と呼称されるＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来の ただ１種の酵素に基づいている。しかし、世界中にはおよそ１８００種の発光甲 虫類が存在する。即ち、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼは 多種多様な甲虫類ルシフェラーゼ群の単なる一例にすぎない。いずれの甲虫類ル シフェラーゼも同じ基質、即ち高エネルギー分子に変換される多複素環式有機酸 のＤ−（−）−２−（６′−ヒドロキシ−２′−ベンゾチアゾリル）−Δ²−チ アゾリン−４−カルボン酸（以 後、特に断らないかぎり“ルシフェリン”と呼称）の反応を触媒することが知ら れている。触媒される反応はいずれも同じ機構を伴うと考えられる。 甲虫類の生物発光機構に関連する一般的システムは、ルシフェリンの酸化的脱 炭酸後に酸化されたルシフェリンと上記酵素との相互作用によって発光を生起さ せるものであると考えられる。光の色は明らかに、酸化されたルシフェリンと相 互作用する酵素アミノ酸の空間配置によって決定される。 生物発光をもたらすルシフェラーゼ触媒反応（以後、単に“ルシフェラーゼ− ルシフェリン反応”と呼称）は、ルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ） 及び分子状酸素が関与する二段階プロセスとして説明されている。最初の反応で は、次の反応式 Ｅ＋ＬＨ₂＋ＡＴＰ→Ｅ・ＬＨ−ＡＭＰ＋ＰＰ_i 〔式中Ｅはルシフェラーゼであり、ＬＨ₂はルシフェリンであり、ＰＰ_iはピロリ ン酸である〕に示すようにルシフェリンとＡＴＰとが反応してルシフェリルアデ ニル酸を形成し、無機のピロリン酸が排除される。ルシフェリルアデニル酸ＬＨ₂ −ＡＭＰはルシフェラーゼの触媒部位に固く結 合したままとなる。この状態の酵素が分子状酸素に暴露されると、酵素に結合し たルシフェリルアデニル酸は酸化されて、電子励起状態のオキシルシフェリン（ Ｌ＝Ｏ）となる。励起された酸化ルシフェリンは、次の反応式 に示すように、基底状態に戻る際に光を発する。酸化ルシフェリン１分子につき １個の光量子が発せられる。酸化ルシフェリンの電子励起状態は、甲虫類ルシフ ェラーゼのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の特徴的状態である。同じルシフ ェリンを有する様々な甲虫種が異なる色の光を発するという事実によって証明さ れるように、酸化ルシフェリンが基底状態に戻る際に発せられる光の色（と従っ てエネルギーと）は酵素によって決定される。 ルシフェラーゼは様々なソースから直接単離されている。様々な甲虫種のルシ フェラーゼをコードするｃＤＮＡが報告されている。（ｄｅ Ｗｅｔ等，Ｍｏｌ ｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７ ，ｐｐ．７２５−７３７，１９８７； Ｍａｓｕ ｄａ等，Ｇｅｎｅ ７７，ｐｐ． ２６５−２７０，１９８９；Ｗｏｏｄ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，ｐｐ．７０ ０−７０２，１９８９参照）。甲虫類ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが手 近に存在するので、そのようなｃＤＮＡを発現させるように形質転換した細菌（ 例えば大腸菌）、酵母、哺乳動物の培養細胞等からの単離によって大量のルシフ ェラーゼを調製することは当業者には全く容易なことである。あるいは他の場合 には、上記のような細胞において適当なプロモーターその他の発現制御シグナル の制御下に有るｃＤＮＡを用いて、ルシフェラーゼ、及び究極的にはルシフェラ ーゼによって触媒される生物発光をプロモーターの活性を示す信号として生じさ せ得る。プロモーターの活性はそれ自体、プロモーターの活性を誘導または抑制 する物質の濃度などの、監視が求められる別のファクターを反映し得る。甲虫類 ルシフェラーゼの製造には、タンパク質をコードする核酸から当該タンパク質を 製造するのに最近使用可能となった様々な無細胞系を用いることも可能である。 更に、甲虫類ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡの使用可能性、及びルシフ ェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒する酵素をコードするｃＤＮＡを迅速にスク リーニングす る能力（ｄｅ Ｗｅｔ等の上掲書及びＷｏｏｄ等の上掲書参照）は、ルシフェラ ーゼ−ルシフェリン反応によって生物発光を触媒する活性を保持する他のルシフ ェラーゼを当業者が大量に調製及び取得することも可能にする。上記他のルシフ ェラーゼを調製すること、及びそれらのルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを 前段に示したように用いることも可能である。本発明の開示において“甲虫（類 ）ルシフェラーゼ”または“ルシフェラーゼ”という語は、先に概説したように ルシフェリンの酸化を触媒して生物発光を実現し得る酵素を意味する。 甲虫類ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが容易に使用可能であることによ り、そのようなｃＤＮＡの発現と、従って甲虫類ルシフェラーゼの産生とを転写 及び翻訳に関連する遺伝子事象に結び付けることによって前記遺伝子事象を告知 、監視または測定するべく用いられるアッセイにおいて甲虫類ルシフェラーゼを リポーターとして用いることが可能となる。 ホタルルシフェラーゼは、真核生物におけるプロモーター活性の検出に広く用 いられている。この酵素は原核生物でも用いられているが、細菌においてホタル ルシフェラー ゼを遺伝子リポーターとして用いることは通常認められることではない。甲虫類 ルシフェラーゼは遺伝子リポーターとして特に有用であり、なぜならこの酵素は 単一遺伝子のモノマー産物であるからである。加えて、酵素活性が翻訳後修飾を 必要とせず、また上記酵素は補欠分子族や、結合補因子や、ジスルフィド結合を 有しない。ホタルルシフェラーゼの遺伝子を保持する大腸菌からの発光は、増殖 培地に基質のルシフェリンを添加することによって惹起され得る。ルシフェリン は直ちに生体膜に浸透するが、大腸菌によって炭素または窒素源として用いられ ることはあり得ない。生物発光反応に必要なその他の基質の酸素及びＡＴＰは、 生きた細胞内に使用可能に存在する。しかし、リポーター（信号発生体）として 二つ以上の異なるルシフェラーゼを用いる系にとっては、ルシフェラーゼに起因 する測定可能な発光色変化が必要となろう。 生物発光リポーター系では、特に単一の属または種に由来する異なる甲虫類ル シフェラーゼのクローンを一緒に用い得る。上記ルシフェラーゼ同士の間で外因 性宿主での発現にさほどの差は無いはずであり、なぜなら互いの配列が相当に類 似するからである。即ち、特にコメツキムシルシ フェラーゼは、単一の宿主内で二つ以上の異なるプロモーターの活性を監視する こと、または異なる細胞集団を同時に観察することを可能にし得る多リポーター 系を提供し得る。しかし、混合物中の各ルシフェラーゼをそれらがもたらす発光 のスペクトル幅で区別することには限界が有る。 発光色変化の最も著しい例の一つが、カリブ海地方に固有の大型コメツキムシ であるＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓにおいて認め られる。この甲虫は、前胸背面の１対と、腹部の腹側襞（ｖｅｎｔｒａｌ ｃｌ ｅｆｔ）内の単独器官との２組の発光器官を有する。腹部の器官から四つの異な るルシフェラーゼクローンが単離された。これらの酵素によって触媒されるルシ フェラーゼ−ルシフェリン反応により、緑色から橙色までの光が発せられる。 上記４種のルシフェラーゼによって触媒されるルシフェラーゼ−ルシフェリン 反応から得られたスペクトルデータは、緑色（ピーク強度：５４６ｎｍ）、黄緑 色（ピーク強度：５６０ｎｍ）、黄色（ピーク強度：５７８ｎｍ）及び橙色（ピ ーク強度：５９３ｎｍ）の発光に対応するほぼ等 間隔の四つの重複ピークを示す。各タンパク質はそれぞれＬｕｃＰｐ１ＧＲ、Ｌ ｕｃＰｐ１ＹＧ、ＬｃｕＰｐ１ＹＥ及びＬｕｃＰｐ１ＯＲと呼称される。これら のルシフェラーゼによる発光のピーク強度波長は５０ｎｍ近くにわたって様々で あるが、発光スペクトル同士の間にはピークが５４６ｎｍと５９３ｎｍとである 場合でさえなお著しい重複が存在する。即ち、ピーク強度波長の差を増大させる ことは、２種以上のルシフェラーゼを用いる系において測定精度を高めるうえで 有用であろう。 上記腹部器官由来の４種のルシフェラーゼのアミノ酸配列はきわめて類似する 。配列同士の比較から、これらのルシフェラーゼは９５〜９９％同等であること が判明している。 多リポーター系に用いるべく甲虫類ルシフェラーゼの有用性を高めるには、ル シフェラーゼをコードするｃＤＮＡを突然変異させ、それによって、ルシフェラ ーゼ−ルシフェリン反応において現在使用可能なルシフェラーゼを用いた場合に 得られるピーク強度波長差より大きいピーク強度波長差を伴う発光を実現する突 然変異体ルシフェラーゼを調製することが望ましい。 甲虫類ルシフェラーゼは上記のような突然変異体ルシフェラーゼの調製に特に 適し、なぜなら発光色変化はアミノ酸配列の変化の直接の結果であるからである 。 Ｌｕｃｉｏｌａ属のホタルの突然変異体ルシフェラーゼは当業者に公知である 。Ｋａｊｉｙａｍａ等の米国特許第５，２１９，７３７号及び同第５，２２９， ２８５号。 バイオセンシングのために真核細胞でのルシフェラーゼ発現を用いる場合は、 ルシフェラーゼのペルオキシソームへの移動を低減することが望ましい。Ｓｏｍ ｍｅｒ等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ３，ｐｐ．７４９−７５９，１９９２ には、ルシフェラーゼのペルオキシソーム標的化を著しく低減する、Ｐ．ｐｙｒ ａｌｉｓルシフェラーゼの３個のカルボキシ末端アミノ酸の突然変異が述べられ ている。 表Ｉに示した、様々な甲虫類ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡの配列、及 びｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列が公知である。 コメツキムシＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓの、 緑色発光を実現するルシフェラーゼＬｕｃＰｐ１ＧＲのｃＤＮＡ配列及びアミノ 酸配列を配列寿に、配列番号１を付して示す。発明の概要 本発明は、甲虫類の突然変異体ルシフェラーゼ、及び該突然変異体ルシフェラ ーゼをコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、上記突然変異体ルシフェラー ゼは対応する野生型ルシフェラーゼとは異なる色の発光を生起し、この色の相違 は好ましくは、突然変異体の発光ピーク強度波長が野生型酵素のものと少なくと も１ｎｍ相違することによる。 本発明の突然変異体ルシフェラーゼは対応する野生型ルシフェラーゼから、１ 個以上の、しかし典型的には２個以下のアミノ酸の置換によって相違する。本発 明のルシフェラーゼは、３個のカルボキシ末端アミノ酸のうちの１個以上を改変 してペルオキシソーム標的化を低減することも可能である。 本発明の驚くべき一構成では、それぞれ単独で生物発光の色の変化（ピーク強 度波長シフト）を惹起する二つのアミノ酸置換を１個の突然変異体において組み 合わせると、突然変異体は単一のアミノ酸置換によって惹起されるシフトのいず れよりも大きいピーク強度波長シフトを惹起するようになることを発見した。 本発明の突然変異体ルシフェラーゼをコードするｃＤＮ Ａは、対応する野生型酵素または別の突然変異体をコードするｃＤＮＡに関して 行なわれる任意の標準的な部位特異的突然変異誘発操作によって容易に取得可能 である。本発明の突然変異体ルシフェラーゼは、該ルシフェラーゼをコードする ｃＤＮＡを原核細胞または真核細胞において発現させる標準的操作によって製造 できる。 本発明についての以下の詳細な説明を検討すれば、本発明をより良く理解する ことができる。発明の詳細 以下の説明及び実施例において方法実施及び濃度測定は、特に記載のない限り は室温（約２０℃〜２５℃）及び大気圧で行った。 本明細書において参照される全てのアミノ酸は、非鏡像構造グリシンを除き、 特に記載のない限りはＬ−アミノ酸である。アミノ酸は、下記の表IIに示す１文 字または３文字の記号を使用して参照することができる。 “Ｘ”は、表IIに挙げた２０個のアミノ酸のいずれか１つを意味する。 ペプチドまたはポリペプチド配列は、番号“１”が付される最初のメチオニン からカルボキシ末端アミノ酸に向かって書かれ、番号付けされる。 ポリペプチド中のある位置での置換は、［元のアミノ酸の記号］_位置番号［置 換アミノ酸の記号］で表わされる。 例えば、ポリペプチドの位置１００にあるアラニンがグルタミン酸で置換されて いることは、Ａｌａ₁₀₀ＧｌｕまたはＡ₁₀₀Ｅと表わされる。通常は、置換表示の 前にそれが生じたポリペプチドを表示する。例えば、“Ｌｕｃｋ”と名付ける仮 想タンパク質に置換Ａ₁₀₀Ｅが存在する場合、置換はＬｕｃｋ−Ａｌａ₁₀₀Ｇｌｕ またはＬｕｃｋ−Ａ₁₀₀Ｅと表わされる。ポリペプチド中に２つ以上の置換があ る場合、置換表示はスラッシュ（／）によって区切られる。例えば、仮想タンパ ク質“Ｌｕｃｋ”において、位置１００のアラニンがグルタミン酸で置換され、 位置１５０のリシンがアスパラギンで置換されている場合、置換を有するポリペ プチドはＬｕｃｋ−Ａｌａ₁₀₀Ｇｌｕ／Ｌｙｓ₁₅₀ＡｓｎまたはＬｕｃｋＡ₁₀₀Ｅ ／Ｋ_l50Ｎと表わされる。ポリペプチド中の１つの位置に異なる置換があること を示すためには、置換アミノ酸の記号をコンマ（,）で区切る。例えば仮想タン パク質が、位置１００でアラニンに代わってグルタミン酸、グリシンまたはリシ ンで置換されている場合、表示はＬｕｃｋ−Ａｌａ₁₀₀／Ｇｌｕ,Ｇｌｙ,Ｌｙｓ またはＬｕｃｋ−Ａ₁₀₀／Ｅ,Ｇ,Ｋとなる。 標準的な１文字コード“Ａ”、“Ｃ”、“Ｇ”及び“Ｔ ”は、本明細書においてはそれぞれヌクレオチド アデニル酸、シチジル酸、グ アニル酸及びチミジル酸に対して使用される。当業者は、ＤＮＡにおいてはヌク レオチドは２′−デオキシリボヌクレオチド−５′−リン酸（または５′末端に は三リン酸）であり、ＲＮＡにおいてはヌクレオチドはリボヌクレオチド−５′ −リン酸（または５′末端には三リン酸）であって、Ｔの代わりにウリジル酸（ Ｕ）が存在することを理解しよう。“Ｎ”は４種のヌクレオチドのうちのいずれ か１つを意味する。 オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は５′末端から３′末端に向 かって書かれる。 「突然変異（体）ルシフェラーゼ」なる用語は本明細書においては、天然には 存在せず、天然ルシフェラーゼとは異なるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ を指して使用される。 その態様の１つにおいて本発明は、対応する野生型ルシフェラーゼによって生 成される生物発光のピーク強度の波長から少なくとも１ｎｍはピーク強度の波長 がシフトしており、１か所または２か所で置換されていることで対応する野生型 ルシフェラーゼとは異なるアミノ酸配列を有する、 生物発光を生じる（即ち生物発光を生じるべくルシフェリンの酸化を触媒する） 突然変異甲虫ルシフェラーゼであって、１か所に置換がある場合、その位置はＬ ｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列における位置２１４、２１５、２２３、２２４、 ２３２、２３６、２３７、２３８、２４２、２４４、２４５、２４７、２４８、 ２８２、２８３及び３４８からなる群から選択される位置に対応し、２か所に置 換がある場合は、その少なくとも一方の位置は、ＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配 列における位置２１４、２１５、２２３、２２４、２３２、２３６、２３７、２ ３８、２４２、２４４、２４５、２４７、２４８、２８２、２８３及び３４８か らなる群から選択される位置に対応しており、また突然変異体は必要によっては カルボキシ末端にペルオキシソーム標的回避配列を有する突然変異甲虫ルシフェ ラーゼに係わる。 本発明の突然変異ルシフェラーゼの例としては下記のものがある： 下記の表IIIは、上記及び他の突然変異ルシフェラーゼの例のスペクトル特性 を示す。 ＬｕｃＰｐｌＧＲ以外のルシフェラーゼにおける「対応位置」は、当分野にお いて既知であるアミノ酸レベルでの一致（ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）（例えばＷｏ ｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，７００−７０２（１９８９）；Ｄｅｖｉｎｅ ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７３，１２１−１ ３２（１９９３））から、または、同一または保存性をもって置換されている残 基を最も多く一致するようにアミノ酸レベルで単純に並べ、ＬｕｃＰｐｌＧＲ配 列中のアミノ酸１９５〜２０５は全ての甲虫ルシフェラーゼにおいて極めて高度 に保存されており、全ての甲虫ルシフェラーゼアミノ酸配列においてその高度に 保存されている１１−ｍｅｒ以降の３００を超える位置にギャップはないことに 特に留意することにより決定し得る。 「カルボキシ末端にあるペルオキシソーム標的回避配列」とは、（１）対応野 生型ルシフェラーゼの３つのカルボキシ末端アミノ酸が突然変異体からは完全に 欠失している、または（２）対応野生型ルシフェラーゼの３つのカルボキシ末端 アミノ酸が、Ｓｏｍｍｅｒら（前出）によれば、ペルオキシソーム標的到達を少 なくとも５０％低下させる１、 ２または３つのアミノ酸からなる配列で置換されていることを意味する。突然変 異体において野生型ルシフェラーゼの３つのカルボキシ末端アミノ酸が３つのア ミノ酸からなるペルオキシソーム標的回避配列で置換されており、突然変異体の その配列をＸ₁Ｘ₂Ｘ₃（ここでＸ₃はカルボキシ末端である）とするならば、Ｘ₁ は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｔ及びＳを除く上記２０個のアミノ酸のうち のいずれかであり、Ｘ₂は、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＫを除く上記２０個の アミノ酸のうちのいずれかであり、Ｘ₃は、Ｉ、Ｍ、Ｙ及びＬを除く上記２０個 のアミノ酸のうちのいずれかである。更に、Ｘ₁、Ｘ₂及びＸ₃のうちの任意の１ つもしくは２つ、または３つ全部が突然変異体に存在せずともよい（即ち該位置 に対応するアミノ酸はない）。最も好ましいペルオキシソーム標的回避配列はＩ ＡＶ（ここでＶはカルボキシ末端にある）である。 別の態様においては本発明は、細胞中（真核細胞または原核細胞）、溶液中（ 遊離状態または、抗体、抗体フラグメント、核酸プローブなどにリポーターとし て結合した状態）、必要によっては抗体、抗体フラグメントまたは核酸を介して 固体表面に固定され、且つ溶液に暴露された状態 のルシフェラーゼの組合せであって、少なくとも一方のルシフェラーゼは突然変 異体であり、両ルシフェラーゼは、生物発光を生じることにおいて活性を維持し ており、ルシフェラーゼのアミノ酸配列がＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列の位 置２１４、２１５、２２３、２２４、２３２、２３６、２３７、２３８、２４２ 、２４４、２４５、２４７、２４８、２８２、２８３及び３４８に対応する位置 の少なくとも１つで異なるが故に、ルシフェラーゼの生物発光のピーク強度の波 長が異なり、ルシフェラーゼの一方または両方は必要によってはペルオキシソー ム標的回避配列を有するルシフェラーゼの組合せに係わる。 別の態様においては本発明は、本発明の突然変異甲虫ルシフェラーゼをコード する配列を有するセグメントを含む、真核細胞または原核細胞発現ベクターとな り得るＤＮＡ分子に係わる。 本発明のＤＮＡのなかで最も好ましいのは、好ましい本発明突然変異ルシフェ ラーゼをコードするセグメントを含むものである。 上述の本発明の説明から、当業者には本発明の範囲内で上述したものの多数の 変更及び変形が認識されるであろう。 そのような変更及び変形も本発明の一部として理解されるものとする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１か所または２か所で置換していることで対応する野生型ルシフェラーゼと は異なるアミノ酸配列を有する突然変異甲虫ルシフェラーゼであって、１か所に 置換がある場合、その位置はＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列における位置２１ ４、２１５、２２３、２２４、２３２、２３６、２３７、２３８、２４２、２４ ４、２４５、２４７、２４８、２８２、２８３及び３４８からなる群から選択さ れる位置に対応しており、２か所に置換がある場合は、その少なくとも一方の位 置は、ＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列における位置２１４、２１５、２２３、 ２２４、２３２、２３６、２３７、２３８、２４２、２４４、２４５、２４７、 ２４８、２８２、２８３及び３４８からなる群から選択される位置に対応してい る前記突然変異甲虫ルシフェラーゼ。 ２．１つのアミノ酸置換がある請求項１に記載の突然変異ルシフェラーゼ。 ３．２つのアミノ酸置換がある請求項１に記載の突然変異ルシフェラーゼ。 ４．各アミノ酸置換が、ＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列 における位置２１４、２１５、２２３、２２４、２３２、２３６、２３７、２３ ８、２４２、２４４、２４５、２４７、２４８、２８２、２８３及び３４８から なる群から選択される位置に対応する位置にある請求項３に記載の突然変異ルシ フェラーゼ。 ５．対応する野生型ルシフェラーゼが、ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、 ＬｕｃＰｐｌＹＥ、ＬｕｃＰｐｌＯＲ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのル シフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉ ｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇ ｒｅｌｉｃａのルシフェラーゼからなる群から選択される請求項１に記載の突然 変異ルシフェラーゼ。 ６．対応する野生型ルシフェラーゼが、ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、 ＬｕｃＰｐｌＹＥ、ＬｕｃＰｐｌＯＲ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのル シフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉ ｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇ ｒｅｌｉｃａのルシフェラーゼからなる群から選択される請求項２に記載の突然 変異ルシ フェラーゼ。 ７．対応する野生型ルシフェラーゼが、ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、 ＬｕｃＰｐｌＹＥ、ＬｕｃＰｐｌＯＲ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのル シフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉ ｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇ ｒｅｌｉｃａのルシフェラーゼからなる群から選択される請求項３に記載の突然 変異ルシフェラーゼ。 ８．対応する野生型ルシフェラーゼが、ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、 ＬｕｃＰｐｌＹＥ、ＬｕｃＰｐｌＯＲ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのル シフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉ ｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇ ｒｅｌｉｃａのルシフェラーゼからなる群から選択される請求項４に記載の突然 変異ルシフェラーゼ。 ９．対応する野生型ルシフェラーゼが、ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、 ＬｕｃＰｐｌＹＥ、及びＬｕｃＰｐｌＯＲからなる群から選択される請求項５に 記載の突然変異 ルシフェラーゼ。 １０．対応する野生型ルシフェラーゼが、ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ 、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、及びＬｕｃＰｐｌＯＲからなる群から選択される請求項６ に記載の突然変異ルシフェラーゼ。 １１．対応する野生型ルシフェラーゼが、ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ 、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、及びＬｕｃＰｐｌＯＲからなる群から選択される請求項７ に記載の突然変異ルシフェラーゼ。 １２．対応する野生型ルシフェラーゼが、ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ 、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、及びＬｕｃＰｐｌＯＲからなる群から選択される請求項８ に記載の突然変異ルシフェラーゼ。 １３．対応する野生型ルシフェラーゼがＬｕｃＰｐｌＧＲである請求項９に記載 の突然変異ルシフェラーゼ。 １４．対応する野生型ルシフェラーゼがＬｕｃＰｐｌＧＲである請求項１０に記 載の突然変異ルシフェラーゼ。 １５．対応する野生型ルシフェラーゼがＬｕｃＰｐｌＧＲである請求項１１に記 載の突然変異ルシフェラーゼ。 １６．対応する野生型ルシフェラーゼがＬｕｃＰｐｌＧＲ である請求項１２に記載の突然変異ルシフェラーゼ。 １７．突然変異体が、 からなる群から選択される請求項１３に記載の突然変異ルシフェラーゼ。 １８．１か所または２か所で置換していることで対応する野生型ルシフェラーゼ とは異なるアミノ酸配列を有する突然変異甲虫ルシフェラーゼをコードする配列 を有するセグメントを含むＤＮＡ分子であって、１か所に置換がある場合、その 位置はＬｕｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列における位置２１４、２１５、２２３、 ２２４、２３２、２３６、２３７、２３８、２４２、２４４、２４５、２４７、 ２４８、２８２、２８３及び３４８からなる群から選択される位置に対応してお り、２か所に置換がある場合は、その少なくとも一方の位置は、ＬｕｃＰｐｌＧ Ｒのアミノ酸配列 における位置２１４、２１５、２２３、２２４、２３２、２３６、２３７、２３ ８、２４２、２４４、２４５、２４７、２４８、２８２、２８３及び３４８から なる群から選択される位置に対応している前記ＤＮＡ分子。 １９．コードされる突然変異ルシフェラーゼが１つのアミノ酸置換を有する請求 項１８に記載のＤＮＡ分子。 ２０．コードされる突然変異ルシフェラーゼが２つのアミノ酸置換を有する請求 項１８に記載のＤＮＡ分子。 ２１．コードされる突然変異ルシフェラーゼにおいて、各アミノ酸置換が、Ｌｕ ｃＰｐｌＧＲのアミノ酸配列における位置２１４、２１５、２２３、２２４、２ ３２、２３６、２３７、２３８、２４２、２４４、２４５、２４７、２４８、２ ８２、２８３及び３４８からなる群から選択される位置に対応する位置にある請 求項２０に記載のＤＮＡ分子。 ２２．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼが、 ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、ＬｕｃＰｐｌＯＲ、 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕ ｃｉａｔａのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉ ｃａのルシフェラーゼからなる群から選択される請求項１８に記載のＤＮＡ分子 。 ２３．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼが、 ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、ＬｕｃＰｐｌＯＲ、 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕ ｃｉａｔａのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェラ ーゼ、及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａのルシフェラーゼからなる群 から選択される請求項１９に記載のＤＮＡ分子。 ２４．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼが、 ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、ＬｕｃＰｐｌＯＲ、 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕ ｃｉａｔａのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのルシフェ ラーゼ、及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａのルシフェラーゼからなる 群から選択される請求項２０に記載のＤＮＡ分子。 ２５．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生 型ルシフェラーゼが、ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、ＬｕｃＰｐｌＹＥ 、ＬｕｃＰｐｌＯＲ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、Ｌ ｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａのルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅ ｒａｌｉｓのルシフェラーゼ、及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａのル シフェラーゼからなる群から選択される請求項２１に記載のＤＮＡ分子。 ２６．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼが、 ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、及びＬｕｃＰｐｌＯ Ｒからなる群から選択される請求項２２に記載のＤＮＡ分子。 ２７．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼが、 ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、及びＬｕｃＰｐｌＯ Ｒからなる群から選択される請求項２３に記載の突然変異ルシフェラーゼ。 ２８．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼが、 ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、及びＬｕｃＰｐｌＯ Ｒからなる群から選択される請求項２４に記載のＤＮＡ分子。 ２９．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼが、 ＬｕｃＰｐｌＧＲ、ＬｕｃＰｐｌＹＧ、ＬｕｃＰｐｌＹＥ、及びＬｕｃＰｐｌＯ Ｒからなる群から選択される請求項２５に記載のＤＮＡ分子。 ３０．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼがＬ ｕｃＰｐｌＧＲである請求項２６に記載のＤＮＡ分子。 ３１．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼがＬ ｕｃＰｐｌＧＲである請求項２７に記載のＤＮＡ分子。 ３２．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼがＬ ｕｃＰｐｌＧＲである請求項２８に記載のＤＮＡ分子。 ３３．コードされるアミノ酸配列に対して、対応する野生型ルシフェラーゼがＬ ｕｃＰｐｌＧＲである請求項２９に記載のＤＮＡ分子。 ３４．コードされる突然変異ルシフェラーゼが、 からなる群から選択される請求項３０に記載のＤＮＡ分子。