JPH0513629B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
〔技術の分野〕
本発明は、変異型エクオリン遺伝子ならびに変
異型エクオリン蛋白の製造法に関する。 更に詳しくは、合成オリゴヌクレオチドを用い
た塩基特異的変異法により作成した変異エクオリ
ン遺伝子とこれを用いた上記蛋白の製造法に関す
るものであり、エクオリン分子中の2つ以上のシ
ステイン残基をセリン残基へ変換した遺伝子に係
る。該蛋白は、診断薬などの検出測定に用いられ
る。 〔従来の技術とその問題点〕 天然に存在するエクオリンは、海洋に生息する
発光オワンクラゲから分離、精製して得られるい
わゆる発光蛋白であり、高い利用価値を持つた生
体微量活性物質として知られている。すなわち、
エクオリンはCa2+,Sr2+等の金属イオンで発光
することから、、微量のCa2+(10-9M)の検出試薬
として利用され、特に細胞間のCa2+の測定には、
有効であることが認められている。しかし、その
生産量は極めて少なく、研究用試薬としてすら不
足している状態である。 そこで先づ我々は、発光オワンクラゲより、
cDNA遺伝子を分離同定し、pAQ440と名付けた
(特開昭61−135586号)。さらに組換えDNA技術
を用いて大腸菌内でエクオリンを産生せしめるこ
とにも成功し、(特願昭60−280259号)、このエク
オリン蛋白を用いてCa2+等の金属イオンの検出
に利用できることも示した(特願昭61−103849
号)。 また、その発光のメカニズムに関して、部位特
異的変異法により、その構造と機能の解析も行つ
て来た(特願昭61−245108,61−245109)。 しかし、エクオリンの再生過程すなわち、アポ
エクオリン、基質セレンテラジン、分子状酸素、
2−メルカプトエタノールの存在で、カルシユウ
ムによる発光可能なエクオリンが再構成される
が、この過程で還元剤である2−メルカプトエタ
ノールが高濃度に必要であることが知られてい
る。 2−メルカプトエタノールが何故必要なのかは
不明であるが、エクオリン蛋白(アポエクオリ
ン)の−S−S−結合を−SH,HS−に変換する
可能性が示唆される。 そこで、組換えDNAの技術を用いてエクオリ
ン再生時に還元剤である2−メルカプトエタノー
ルの存在を必要としない、変異エクオリン蛋白を
製造することは非常に意味がありそれはエクオリ
ンの再生メカニズムの解明につながり、さらには
蛋白工学的に意義の深いことであり、該理解は学
術、産業的にも利用価値がある。 エクオリン蛋白に係る以上の技術的事情にかん
がみ、本発明者らは組換えDNA技術を用い、天
然型エクオリン遺伝子(pAQ440)の変異体を作
成し、この遺伝子を利用して大腸菌内で変異型エ
クオリン遺伝子を産生せしめることに成功した。 そして、2−メルカプトエタノールの存在を必
要とすることなく、エクオリンへの再成が可能で
あるアポエクオリンを、後述の本発明に係る変異
型エクオリン遺伝子を用いて、可能にすることが
できた。該変異型エクオリン遺伝子は、エクオリ
ン遺伝子上で、システイン残基となりうる塩基配
列、TGCのGCに変換し、セリン残基に変換を行
い、アポエクオリン分子内よりシステイン残基を
除去をすることにより得ることができた。 後述の本発明に係る変異型エクオリン蛋白は、
その発光を指標として、高感度検出技術に応用さ
れ得る。より具体的には、最近の抗原抗体反応を
利用した免疫測定法、核酸のハイブリツド形成を
利用したDNAプローブ法などと組合せることに
よる診断薬の検出測定用などである。また、勿論
Ca2+の微量定量に使用できる。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、下記(1)の構成を有する。 (1) エクオリン遺伝子pAQ440の下記塩基配列に
おいて、 【表】 【表】 変異を導入して得られた下記(イ)〜(ニ)のいずれか
一つの変異遺伝子 (イ) 590番目の塩基GをCに、674番目の塩基Gを
Cに変換した変異遺伝子。 (ハ) 674番目の塩基GをCに、569番目の塩基Gを
Cに、変換した変異遺伝子、もしくは (ニ) 569番目の塩基GをCに、、590番目の塩基G
をCに、674番目の塩基GをCに変換した変異
遺伝子。 本発明の変異型遺伝子は、添付図に示すような
工程によつて製造できる。本発明の方法では、合
成オリゴヌクレオチドを用い、塩基特異的変異法
によりエクオリン遺伝子へ後述する変異を導入し
た。該変異法としては、限定されないが例えば、
ギヤツプーデユプレツクス法(Morinaga et al,
Bio/Techonology2巻638−639(1984))を採用
できる。同法は、例えば後述の表1に示すよう
に、変異源として合成オリゴヌクレオチドを用い
る。かゝる合成オリゴヌクレオチドは市販の自動
DNA合成装置を用いて合成でき、精製は好まし
くは高速液体クロマトグラフイーを用いて行う。
精製品は、公知方法で末端リン酸化を行い、プラ
スミド作成のためのプライマーとする。 他方、図に示すプラスミドpAQ440のEcoRI−
HindフラグメントとAatフラグメントを用
い、Aatフラグメントについては、公知方法で
脱リン酸化処理する。 以上のようにして得られたpAQ440に基づく二
つのフラグメントを前述の末端リン酸化されたプ
ライマーと共に、例えば、三段階の処理(所定温
度、所定時間処理)を行つて、アニーリングを行
う。該段階とは、例えば(100℃、5分)、(30℃、
30分)および(4℃、30分)のような順序からな
る組合せである。 次に、得られた変異pAQ440遺伝子を用いて次
のようにE.coliへのトランスフオーメーシヨンを
行う。すなわち、例えば上述のようにして得られ
たdXTP(X=G.A.T.C)とKlenowフラグメント
(大腸菌ポリメレース)とをT4−リガーゼの存在
下に反応させ、二重鎖を作成する。かくして生成
したプラスミド二重鎖を公知方法によつて、E.
coliにトランスフオーメーシヨンを行う。そして
上述のそれぞれの変異源プライマーをプローグと
して変異体プラスミド(pAQ440の変異体)をコ
ロニ−ハイブリダイゼーシヨンによりスクリーニ
ングを行う。変異体の確認法としては限定されな
いが、例えばHattori et al,Anal.Biochem.152
232−238,1986のdideoxy法により、塩基配列を
決定し、変異塩基の検出を行う。この方法で得ら
れた、1カ所変異を有する変異プラスミドを用い
て上述の操作をくり返すことにより、2カ所、及
び3カ所変異を有する変異プラスミドを作成し
た。 次に、本発明では、上述の変異エクオリン遺伝
子を用いてエクオリン蛋白の大腸菌内での産生を
行う。 すなわち、その概要としては、変異pAQ440遺
伝子のHind−EcoRのcDNAフラグメント
断片をlacのプロモーターを有するプラスミド
pUC9−2のHind−EcoR部分にクローニ
ングを行い得られたプラスミドを大腸菌例えば
HB101(D1210lac8)株にトランスホーメーシ
ヨンし、この大腸菌と発現誘導体例えばIPTGを
用いて変異エクオリン蛋白を大腸菌内で産生させ
る。 該産生方法ならびに集菌方法は、公知方法に従
う。集菌された菌体は、適当な公知のバツフアー
液に溶解させ、公知方法(例えば超音波処理)で
菌体を破壊し、遠心処理して上清を取得し、測定
酵素溶液とする。 この溶液に対する発光の測定方法は、該溶液の
所定量に基質(セレンテラジン)と還元剤(2−
メルカプトエタノール)の所定量を混合したもの
と、2−メルカプトエタノールを加えない未混合
の溶液を、2〜3時間氷冷下に熟成して得られた
測定液を光電管測定装置中の反応セルに移し、さ
らに該セルに所定量のCaCl2溶液を注入し、生成
する発光を測定する。 測定対象となつた本発明の合成オリゴヌクレオ
チド(プライマー)を後述実施例1の表1に、プ
ライマーのエクオリン活性を同じく表2に示す。
表1,2により、エクオリン遺伝子の塩基配列を
変異することにより、2−メルカプトエタノール
未添加においてもエクオリンが再成することが明
白である。 とくに、3カ所すべてのシステイン残基をセリ
ン残基に変換したC1+2+3Sでは、ほとんど完
全に再成されることが明らかである。 以下実施例によつて本発明を説明する。 〔実施例〕 (1) 合成オリゴヌクレオチドを用いた塩基特異的
変異法によるエクオリン遺伝子(pAQ440)へ
の変異の導入(図に示す) 塩基特異的変異法は、Morinagaら(Bio/
Technology2巻636−639(1984)のギヤツプ−デ
イプレツクス法により行つた。すなわち、表1に
示すように、変異源として合成オリゴヌクレオチ
ド(プライマーとして)を用いた。合成オリゴヌ
クレオチドは、ABI社の自動DNA合成装置で合
成し、高速液体クロマトグラフイーで精製し、
T4−キナーゼで末端リン酸化を行い用いた。プ
ラスミドpAQ440のEcoR−Hindフラグメ
ントとAatフラグメントを用い、Aatフラグ
メントはアルカリフオスフアターゼ処理し脱リン
酸化を行つた。この2つのフラグメントとプライ
マーとともに、100℃、5min処理後、30℃、
3min、4℃、30minと放置し、アニーリングを
行い、12℃、12時間でdXTP(X=G.A.T.C)と
Klenowフラグメント(大腸菌ポリメレース)と
T4−リガーゼの存在下、反応させ、二重鎖を作
成する。 生成したプラスミド二重鎖を常法によりE.coli
にトランスフオーメーシヨンを行い、それぞれの
変異源プライマーをプローブとして変異体プラス
ミド(pAQ440の変異体)をコロニーハイブリタ
イゼーシヨンによりスクリーニングを行い、変異
体の確認は、Hattoriら(Anal.Biochem.152 232
−238,1986)のdideoxy法により、塩基配列を
決定し、変異塩基の検出を行つた。 (2) 種々の変異エクオリン遺伝子を用いて大腸菌
内での産生 変異PAQ440遺伝子のHind−EcoRの
CDNAフラグメント断片をlacのプロモーターを
有するプラスミドpUC9−2のHind−EcoR
部分にクローニングを行い、大腸菌HB101
(D1210lac8)株にトランスフオーメーシヨン
を行い、発現誘導体IPTGにより大腸菌内で産生
させた。 すなわち、変異遺伝子を含むpUC9−2プラス
ミドの12時間培養菌体の1/100量を50μg/ml
のアンピシリンを含む10mlのL−broth培地に添
加後、37℃で2時間培養し、IPTGを最終濃度
1mMになるように添加し、さらに37℃で2時間
培養後、集菌を行い、該菌体を5mlのM9塩溶液
で洗浄する。この洗浄物を10mM EDTAを含む
2.5mlの20mM Tris−HClバツフアー(PH7.6)に
溶解させた後、超音波処理(60秒)で菌体を破壊
し、10000rpmで10分間遠心分離後、上清を測定
酵素液として用いた。 測定方法は、該酵素溶液1mlに基質セレンテラ
ジン6μgおよび2−メルカプトエタノール10μC
を添加あるいは2−メルカプトエタノール10μ
を未添加の後、氷上で2〜3時間放置し、光電
管測定装置中の反応セル中に移し、さらに20mM
CaCl21.5mlを注入することにより、生成する発光
を測定した。 結果を表2に示した。 【表】 【表】 【表】
異型エクオリン蛋白の製造法に関する。 更に詳しくは、合成オリゴヌクレオチドを用い
た塩基特異的変異法により作成した変異エクオリ
ン遺伝子とこれを用いた上記蛋白の製造法に関す
るものであり、エクオリン分子中の2つ以上のシ
ステイン残基をセリン残基へ変換した遺伝子に係
る。該蛋白は、診断薬などの検出測定に用いられ
る。 〔従来の技術とその問題点〕 天然に存在するエクオリンは、海洋に生息する
発光オワンクラゲから分離、精製して得られるい
わゆる発光蛋白であり、高い利用価値を持つた生
体微量活性物質として知られている。すなわち、
エクオリンはCa2+,Sr2+等の金属イオンで発光
することから、、微量のCa2+(10-9M)の検出試薬
として利用され、特に細胞間のCa2+の測定には、
有効であることが認められている。しかし、その
生産量は極めて少なく、研究用試薬としてすら不
足している状態である。 そこで先づ我々は、発光オワンクラゲより、
cDNA遺伝子を分離同定し、pAQ440と名付けた
(特開昭61−135586号)。さらに組換えDNA技術
を用いて大腸菌内でエクオリンを産生せしめるこ
とにも成功し、(特願昭60−280259号)、このエク
オリン蛋白を用いてCa2+等の金属イオンの検出
に利用できることも示した(特願昭61−103849
号)。 また、その発光のメカニズムに関して、部位特
異的変異法により、その構造と機能の解析も行つ
て来た(特願昭61−245108,61−245109)。 しかし、エクオリンの再生過程すなわち、アポ
エクオリン、基質セレンテラジン、分子状酸素、
2−メルカプトエタノールの存在で、カルシユウ
ムによる発光可能なエクオリンが再構成される
が、この過程で還元剤である2−メルカプトエタ
ノールが高濃度に必要であることが知られてい
る。 2−メルカプトエタノールが何故必要なのかは
不明であるが、エクオリン蛋白(アポエクオリ
ン)の−S−S−結合を−SH,HS−に変換する
可能性が示唆される。 そこで、組換えDNAの技術を用いてエクオリ
ン再生時に還元剤である2−メルカプトエタノー
ルの存在を必要としない、変異エクオリン蛋白を
製造することは非常に意味がありそれはエクオリ
ンの再生メカニズムの解明につながり、さらには
蛋白工学的に意義の深いことであり、該理解は学
術、産業的にも利用価値がある。 エクオリン蛋白に係る以上の技術的事情にかん
がみ、本発明者らは組換えDNA技術を用い、天
然型エクオリン遺伝子(pAQ440)の変異体を作
成し、この遺伝子を利用して大腸菌内で変異型エ
クオリン遺伝子を産生せしめることに成功した。 そして、2−メルカプトエタノールの存在を必
要とすることなく、エクオリンへの再成が可能で
あるアポエクオリンを、後述の本発明に係る変異
型エクオリン遺伝子を用いて、可能にすることが
できた。該変異型エクオリン遺伝子は、エクオリ
ン遺伝子上で、システイン残基となりうる塩基配
列、TGCのGCに変換し、セリン残基に変換を行
い、アポエクオリン分子内よりシステイン残基を
除去をすることにより得ることができた。 後述の本発明に係る変異型エクオリン蛋白は、
その発光を指標として、高感度検出技術に応用さ
れ得る。より具体的には、最近の抗原抗体反応を
利用した免疫測定法、核酸のハイブリツド形成を
利用したDNAプローブ法などと組合せることに
よる診断薬の検出測定用などである。また、勿論
Ca2+の微量定量に使用できる。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、下記(1)の構成を有する。 (1) エクオリン遺伝子pAQ440の下記塩基配列に
おいて、 【表】 【表】 変異を導入して得られた下記(イ)〜(ニ)のいずれか
一つの変異遺伝子 (イ) 590番目の塩基GをCに、674番目の塩基Gを
Cに変換した変異遺伝子。 (ハ) 674番目の塩基GをCに、569番目の塩基Gを
Cに、変換した変異遺伝子、もしくは (ニ) 569番目の塩基GをCに、、590番目の塩基G
をCに、674番目の塩基GをCに変換した変異
遺伝子。 本発明の変異型遺伝子は、添付図に示すような
工程によつて製造できる。本発明の方法では、合
成オリゴヌクレオチドを用い、塩基特異的変異法
によりエクオリン遺伝子へ後述する変異を導入し
た。該変異法としては、限定されないが例えば、
ギヤツプーデユプレツクス法(Morinaga et al,
Bio/Techonology2巻638−639(1984))を採用
できる。同法は、例えば後述の表1に示すよう
に、変異源として合成オリゴヌクレオチドを用い
る。かゝる合成オリゴヌクレオチドは市販の自動
DNA合成装置を用いて合成でき、精製は好まし
くは高速液体クロマトグラフイーを用いて行う。
精製品は、公知方法で末端リン酸化を行い、プラ
スミド作成のためのプライマーとする。 他方、図に示すプラスミドpAQ440のEcoRI−
HindフラグメントとAatフラグメントを用
い、Aatフラグメントについては、公知方法で
脱リン酸化処理する。 以上のようにして得られたpAQ440に基づく二
つのフラグメントを前述の末端リン酸化されたプ
ライマーと共に、例えば、三段階の処理(所定温
度、所定時間処理)を行つて、アニーリングを行
う。該段階とは、例えば(100℃、5分)、(30℃、
30分)および(4℃、30分)のような順序からな
る組合せである。 次に、得られた変異pAQ440遺伝子を用いて次
のようにE.coliへのトランスフオーメーシヨンを
行う。すなわち、例えば上述のようにして得られ
たdXTP(X=G.A.T.C)とKlenowフラグメント
(大腸菌ポリメレース)とをT4−リガーゼの存在
下に反応させ、二重鎖を作成する。かくして生成
したプラスミド二重鎖を公知方法によつて、E.
coliにトランスフオーメーシヨンを行う。そして
上述のそれぞれの変異源プライマーをプローグと
して変異体プラスミド(pAQ440の変異体)をコ
ロニ−ハイブリダイゼーシヨンによりスクリーニ
ングを行う。変異体の確認法としては限定されな
いが、例えばHattori et al,Anal.Biochem.152
232−238,1986のdideoxy法により、塩基配列を
決定し、変異塩基の検出を行う。この方法で得ら
れた、1カ所変異を有する変異プラスミドを用い
て上述の操作をくり返すことにより、2カ所、及
び3カ所変異を有する変異プラスミドを作成し
た。 次に、本発明では、上述の変異エクオリン遺伝
子を用いてエクオリン蛋白の大腸菌内での産生を
行う。 すなわち、その概要としては、変異pAQ440遺
伝子のHind−EcoRのcDNAフラグメント
断片をlacのプロモーターを有するプラスミド
pUC9−2のHind−EcoR部分にクローニ
ングを行い得られたプラスミドを大腸菌例えば
HB101(D1210lac8)株にトランスホーメーシ
ヨンし、この大腸菌と発現誘導体例えばIPTGを
用いて変異エクオリン蛋白を大腸菌内で産生させ
る。 該産生方法ならびに集菌方法は、公知方法に従
う。集菌された菌体は、適当な公知のバツフアー
液に溶解させ、公知方法(例えば超音波処理)で
菌体を破壊し、遠心処理して上清を取得し、測定
酵素溶液とする。 この溶液に対する発光の測定方法は、該溶液の
所定量に基質(セレンテラジン)と還元剤(2−
メルカプトエタノール)の所定量を混合したもの
と、2−メルカプトエタノールを加えない未混合
の溶液を、2〜3時間氷冷下に熟成して得られた
測定液を光電管測定装置中の反応セルに移し、さ
らに該セルに所定量のCaCl2溶液を注入し、生成
する発光を測定する。 測定対象となつた本発明の合成オリゴヌクレオ
チド(プライマー)を後述実施例1の表1に、プ
ライマーのエクオリン活性を同じく表2に示す。
表1,2により、エクオリン遺伝子の塩基配列を
変異することにより、2−メルカプトエタノール
未添加においてもエクオリンが再成することが明
白である。 とくに、3カ所すべてのシステイン残基をセリ
ン残基に変換したC1+2+3Sでは、ほとんど完
全に再成されることが明らかである。 以下実施例によつて本発明を説明する。 〔実施例〕 (1) 合成オリゴヌクレオチドを用いた塩基特異的
変異法によるエクオリン遺伝子(pAQ440)へ
の変異の導入(図に示す) 塩基特異的変異法は、Morinagaら(Bio/
Technology2巻636−639(1984)のギヤツプ−デ
イプレツクス法により行つた。すなわち、表1に
示すように、変異源として合成オリゴヌクレオチ
ド(プライマーとして)を用いた。合成オリゴヌ
クレオチドは、ABI社の自動DNA合成装置で合
成し、高速液体クロマトグラフイーで精製し、
T4−キナーゼで末端リン酸化を行い用いた。プ
ラスミドpAQ440のEcoR−Hindフラグメ
ントとAatフラグメントを用い、Aatフラグ
メントはアルカリフオスフアターゼ処理し脱リン
酸化を行つた。この2つのフラグメントとプライ
マーとともに、100℃、5min処理後、30℃、
3min、4℃、30minと放置し、アニーリングを
行い、12℃、12時間でdXTP(X=G.A.T.C)と
Klenowフラグメント(大腸菌ポリメレース)と
T4−リガーゼの存在下、反応させ、二重鎖を作
成する。 生成したプラスミド二重鎖を常法によりE.coli
にトランスフオーメーシヨンを行い、それぞれの
変異源プライマーをプローブとして変異体プラス
ミド(pAQ440の変異体)をコロニーハイブリタ
イゼーシヨンによりスクリーニングを行い、変異
体の確認は、Hattoriら(Anal.Biochem.152 232
−238,1986)のdideoxy法により、塩基配列を
決定し、変異塩基の検出を行つた。 (2) 種々の変異エクオリン遺伝子を用いて大腸菌
内での産生 変異PAQ440遺伝子のHind−EcoRの
CDNAフラグメント断片をlacのプロモーターを
有するプラスミドpUC9−2のHind−EcoR
部分にクローニングを行い、大腸菌HB101
(D1210lac8)株にトランスフオーメーシヨン
を行い、発現誘導体IPTGにより大腸菌内で産生
させた。 すなわち、変異遺伝子を含むpUC9−2プラス
ミドの12時間培養菌体の1/100量を50μg/ml
のアンピシリンを含む10mlのL−broth培地に添
加後、37℃で2時間培養し、IPTGを最終濃度
1mMになるように添加し、さらに37℃で2時間
培養後、集菌を行い、該菌体を5mlのM9塩溶液
で洗浄する。この洗浄物を10mM EDTAを含む
2.5mlの20mM Tris−HClバツフアー(PH7.6)に
溶解させた後、超音波処理(60秒)で菌体を破壊
し、10000rpmで10分間遠心分離後、上清を測定
酵素液として用いた。 測定方法は、該酵素溶液1mlに基質セレンテラ
ジン6μgおよび2−メルカプトエタノール10μC
を添加あるいは2−メルカプトエタノール10μ
を未添加の後、氷上で2〜3時間放置し、光電
管測定装置中の反応セル中に移し、さらに20mM
CaCl21.5mlを注入することにより、生成する発光
を測定した。 結果を表2に示した。 【表】 【表】 【表】
第1図は、本発明の実施例に係る塩基特異的変
異法を示す。
異法を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 エクオリン遺伝子pAQ440の下記塩基配列に
おいて、 【表】 【表】 変異を導入して得られた下記(イ)〜(ニ)のいずれか
一つの変異遺伝子。 (イ) 590番目の塩基Gおよび、674番目の塩基Gが
それぞれCに変換されている。 (ハ) 674番目の塩基Gおよび、569番目の塩基Gが
それぞれCに変換されている、もしくは (ニ) 569番目の塩基G、590番目の塩基Gおよび、
674番目の塩基GがそれぞれをCに変換されて
いる。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12637487A JPS63291586A (ja) | 1987-05-23 | 1987-05-23 | 変異型エクオリン遺伝子 |
US07/105,602 US5093240A (en) | 1986-10-15 | 1987-10-08 | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins |
EP87115044A EP0264819B1 (en) | 1986-10-15 | 1987-10-14 | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins |
DE8787115044T DE3776857D1 (de) | 1986-10-15 | 1987-10-14 | Aequoringen-varianten und verfahren zur herstellung von entsprechenden aequorinproteinen. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12637487A JPS63291586A (ja) | 1987-05-23 | 1987-05-23 | 変異型エクオリン遺伝子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63291586A JPS63291586A (ja) | 1988-11-29 |
JPH0513629B2 true JPH0513629B2 (ja) | 1993-02-23 |
Family
ID=14933588
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP12637487A Granted JPS63291586A (ja) | 1986-10-15 | 1987-05-23 | 変異型エクオリン遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63291586A (ja) |
-
1987
- 1987-05-23 JP JP12637487A patent/JPS63291586A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS63291586A (ja) | 1988-11-29 |
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