JPS6398387A - 変異型エクオリン遺伝子 - Google Patents
変異型エクオリン遺伝子Info
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- JPS6398387A JPS6398387A JP24510886A JP24510886A JPS6398387A JP S6398387 A JPS6398387 A JP S6398387A JP 24510886 A JP24510886 A JP 24510886A JP 24510886 A JP24510886 A JP 24510886A JP S6398387 A JPS6398387 A JP S6398387A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔技術の分野〕
本発明は、変異型エクオリン遺伝子と変異型エクオリン
蛋白の製造法に関する。更に詳しくは、合成オリゴヌク
レオチドを用いた塩基特異的変異法により作成した変異
エクオリン遺伝子とこれを用いた」二記蛋白の製造法に
関する。
蛋白の製造法に関する。更に詳しくは、合成オリゴヌク
レオチドを用いた塩基特異的変異法により作成した変異
エクオリン遺伝子とこれを用いた」二記蛋白の製造法に
関する。
天然に存在するエクオリンは、海洋に生息する発光オワ
ンクラゲから分離、精製して得られるいわゆる発光蛋白
であり、高い利用価値を持った生体微量活性物質として
知られている。すなわち、エクオリンはＣａ”、 Ｓｒ
２“等の金属イオンで発光することから、微量のＣａ２
・（１０−９Ｍ）の検出試薬として利用され、特に細胞
間のＣａ２・の測定には、有効であることが認められて
いる。しかし、その生産量は極めて少なく、研究用試薬
としてすら不足している状態である。
ンクラゲから分離、精製して得られるいわゆる発光蛋白
であり、高い利用価値を持った生体微量活性物質として
知られている。すなわち、エクオリンはＣａ”、 Ｓｒ
２“等の金属イオンで発光することから、微量のＣａ２
・（１０−９Ｍ）の検出試薬として利用され、特に細胞
間のＣａ２・の測定には、有効であることが認められて
いる。しかし、その生産量は極めて少なく、研究用試薬
としてすら不足している状態である。
そこで先づ我々は、発光オワンクラゲより、ｃＤＮ＾遺
伝子を分離同定し、ｐＡ０４４０と名付けた（特開昭６
１−１３５５８８号）。さらに組換えＤＮＡ技術を用い
て大腸菌内でエクオリンを産生せしめることにも成功し
く特願昭８０−２８０２５９号）、このエクオリン蛋白
を用いてＣａ２・等の金属イオンの検出に利用できるこ
とも示した（特願昭８１−１０３８４９号）。
伝子を分離同定し、ｐＡ０４４０と名付けた（特開昭６
１−１３５５８８号）。さらに組換えＤＮＡ技術を用い
て大腸菌内でエクオリンを産生せしめることにも成功し
く特願昭８０−２８０２５９号）、このエクオリン蛋白
を用いてＣａ２・等の金属イオンの検出に利用できるこ
とも示した（特願昭８１−１０３８４９号）。
しかし、その発光機構については、未だ不明な点が多い
。エクオリン蛋白の発光メカニズムを解明し、正確に理
解することは、エクオリン蛋白の具体的応用の可能性を
拡大する。より詳細には、有用性のある機能蛋白として
のエクオリンを蛋白質の構造と機能の面から理解するこ
とは、エクオリンの発光メカニズムの解明につながり、
さらには蛋白質工学的に意義の深いことであり、該理解
は産業的にも利用価値がある。
。エクオリン蛋白の発光メカニズムを解明し、正確に理
解することは、エクオリン蛋白の具体的応用の可能性を
拡大する。より詳細には、有用性のある機能蛋白として
のエクオリンを蛋白質の構造と機能の面から理解するこ
とは、エクオリンの発光メカニズムの解明につながり、
さらには蛋白質工学的に意義の深いことであり、該理解
は産業的にも利用価値がある。
エクオリン蛋白に係る以上の技術的事情にかんがみ、本
発明者らは組換えＤＮＡ技術を用い、天然型エクオリン
遺伝子（ＰＡＱ４４０）の変異体を作成し、この遺伝子
を利用して大腸菌内で変異型エクオリン遺伝子を産生せ
しめることに成功した。そしてこれらの変異型エクオリ
ン遺伝子の構造と機能をｐＡＱ４４０のそれと比較する
ことにより、後者についてのより深い発光メカニズムの
解析を可能にすることができた。
発明者らは組換えＤＮＡ技術を用い、天然型エクオリン
遺伝子（ＰＡＱ４４０）の変異体を作成し、この遺伝子
を利用して大腸菌内で変異型エクオリン遺伝子を産生せ
しめることに成功した。そしてこれらの変異型エクオリ
ン遺伝子の構造と機能をｐＡＱ４４０のそれと比較する
ことにより、後者についてのより深い発光メカニズムの
解析を可能にすることができた。
以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、上述
の解析を可能にするために有用な、特定の多種類の変異
型エクオリン遺伝子を提供することである。
の解析を可能にするために有用な、特定の多種類の変異
型エクオリン遺伝子を提供することである。
本発明は、下記（１）の構成を有する。
（１）エクオリン遺伝子ｐＡＱ４４０の下記塩基配列に
おいて ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧ
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ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ下記（ア）〜（ス）に示すいづれかの
塩基を他の塩基に変換若しくは欠失した変異体。
おいて ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧ
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ＡＡＴＴＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＡＡＴＣＧＡＡＴＧ
ＡＴＴＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴｃＡＡＣＡＧＡ
ＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ下記（ア）〜（ス）に示すいづれかの
塩基を他の塩基に変換若しくは欠失した変異体。
（ア）２２０番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（４）２３８番目の塩基ＧをＡに変換した変異体。
（つ）３０７番目の塩基ＣをＴに、３０８番目の塩基Ａ
をＴに変換した変異体。
をＴに変換した変異体。
（１）４９９番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（ｔ）５６８番目の塩基ＴをＣに変換した変異体。
（Ｊ）５６９番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（キ）５９０番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（り）６０７番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
（ケ）６２５番目の塩基ＧをＡに変換した変異体。
（コ）６１６番目の塩基ＧをＣに、６２５番目の塩基Ｇ
をＡに変換した変異体。
をＡに変換した変異体。
（す）６７４番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。
０）２０５番目から２０７番目の塩基ＧＡＴを欠失せし
めた変異体。
めた変異体。
（ス）５９２番目から５９４番目の塩基ＧＡＴを欠失せ
しめた変異体。
しめた変異体。
木発の変異型遺伝子は、添付図に示すような工程によっ
て製造できる。本発明の方法では、合成オリゴヌクレオ
チドを用い、塩基特異的変異法によりエクオリン遺伝子
へ後述する変異を導入した。該変異法としては、限定さ
れないが例えば、ギー？−／プーデュブＬ／、クス法（
Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ。
て製造できる。本発明の方法では、合成オリゴヌクレオ
チドを用い、塩基特異的変異法によりエクオリン遺伝子
へ後述する変異を導入した。該変異法としては、限定さ
れないが例えば、ギー？−／プーデュブＬ／、クス法（
Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ。
Ｂｉｏ／ＴｅｃｂｏｎｏｌｏｇＹ Ａ羞Ｂ３Ｂ−８３Ｅ
ｌ（１８８４））を採用できる。同法は、例えば後述の
表１に示すように、変異源として合成オリゴヌクレオチ
ドを用いる。
ｌ（１８８４））を採用できる。同法は、例えば後述の
表１に示すように、変異源として合成オリゴヌクレオチ
ドを用いる。
か−る４４オリゴヌクレオチドは市販の自動ＤＮＡ合成
装置を用いて合成でき、精製は好ましくは高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行う、精製品は、公知方法で末
端リン酸化を行い、プラスミド作成のためのプライマー
とする。
装置を用いて合成でき、精製は好ましくは高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行う、精製品は、公知方法で末
端リン酸化を行い、プラスミド作成のためのプライマー
とする。
他方１図に示すプラスミド ｐＡＱ４４０の…Ｒ１−Ｈ
ｉｎｄｍフラグメントとＡａｔ ＩＩフラグメントを用
い、Ａａｔ ＩＩフラグメントについては、公知方法で
脱リン酸化処理する。
ｉｎｄｍフラグメントとＡａｔ ＩＩフラグメントを用
い、Ａａｔ ＩＩフラグメントについては、公知方法で
脱リン酸化処理する。
以上のようにして得られたｐＡＱ４４０に基づく二つの
フラグメントな前述の末端リン酸化されたプライマーと
共に、例えば、三段階の処理（所定温度、所定時間処理
）を行って、アニーリングを行う。該段階とは、例えば
（１００℃、５分）、（３０℃、３０分）および（４℃
、３０分）のような順序からなる組合せである。
フラグメントな前述の末端リン酸化されたプライマーと
共に、例えば、三段階の処理（所定温度、所定時間処理
）を行って、アニーリングを行う。該段階とは、例えば
（１００℃、５分）、（３０℃、３０分）および（４℃
、３０分）のような順序からなる組合せである。
次に、得られた変異ｐＡＱ遺伝子を用いて次のようにＥ
、岨１ｉへのトランスフォーメーションヲ行う。すなわ
ち、例えば上述のようにして得られたｄＸＴＰ（Ｘ＝Ｇ
、Ａ、Ｔ、Ｃ）とＫｌｅｎｏｗ；ｙラグメント（大腸菌
ポリメレース）とをＴ４−リガーゼの存在下に反応させ
、二重鎖を作成する。かくして生成したプラスミド作成
鎖を公知方法によって、旦、肥旦にトランスフォーメー
ションを行う。そして上述のそれぞれの変異源ブライマ
ーをプローグとして変異体プラスミド（ＴＩＡＱ４４０
の変異体）をコロニー／＼イブリダイゼーションにより
スクリーニングを行う。
、岨１ｉへのトランスフォーメーションヲ行う。すなわ
ち、例えば上述のようにして得られたｄＸＴＰ（Ｘ＝Ｇ
、Ａ、Ｔ、Ｃ）とＫｌｅｎｏｗ；ｙラグメント（大腸菌
ポリメレース）とをＴ４−リガーゼの存在下に反応させ
、二重鎖を作成する。かくして生成したプラスミド作成
鎖を公知方法によって、旦、肥旦にトランスフォーメー
ションを行う。そして上述のそれぞれの変異源ブライマ
ーをプローグとして変異体プラスミド（ＴＩＡＱ４４０
の変異体）をコロニー／＼イブリダイゼーションにより
スクリーニングを行う。
変異体の確認法としては限定されないが、例えば（Ｈａ
ｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ、 Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 １５２２３２−２３８ 、１９８８のｄｉｄｅｏ
ｘｙ法により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行
う。
ｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ、 Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 １５２２３２−２３８ 、１９８８のｄｉｄｅｏ
ｘｙ法により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行
う。
次に、本発明（製造法の発明）では、上述の変異エクオ
リン遺伝子を用いてエクオリン蛋白の大腸菌内での産生
を行う。
リン遺伝子を用いてエクオリン蛋白の大腸菌内での産生
を行う。
すなわち、その概要としては、変異ｐＡＱ４４０遺伝子
のＨｉｎｄｍ −ＥｃｏＲＩのｃＤＮＡフラグメント断
片をＩａｃのプロモーターを有するプラスミドｐＵＣ９
−２（７） Ｈｉｎｄｍ−■１１部分にクローニングラ
行い得られたプラスミドを大腸菌例えばＨＢＩＯＩ（Ｄ
１２１０ｉＱ）株にトランスホーメーシミンし、この大
腸菌と発現誘導体例えばＩＰＴ（ｉを用いて変異エクオ
リン蛋白を大腸菌内で産生させる。
のＨｉｎｄｍ −ＥｃｏＲＩのｃＤＮＡフラグメント断
片をＩａｃのプロモーターを有するプラスミドｐＵＣ９
−２（７） Ｈｉｎｄｍ−■１１部分にクローニングラ
行い得られたプラスミドを大腸菌例えばＨＢＩＯＩ（Ｄ
１２１０ｉＱ）株にトランスホーメーシミンし、この大
腸菌と発現誘導体例えばＩＰＴ（ｉを用いて変異エクオ
リン蛋白を大腸菌内で産生させる。
該産生方法ならびに集菌方法は、公知方法に従う。集菌
された菌体は、適当な公知のバッファー液に溶解させ、
公知方法（例えば超音波処理）で菌体を破壊し、遠心処
理して上清を取得し、測定酵素溶液とする。
された菌体は、適当な公知のバッファー液に溶解させ、
公知方法（例えば超音波処理）で菌体を破壊し、遠心処
理して上清を取得し、測定酵素溶液とする。
この溶液に対する発光の測定方法は、該溶液の所定量に
基質（セレンテラジン）と還元剤（２−メルカプトエタ
ノール）の所定量を混合し、２〜３時間水冷下に熟成し
て得られた測定液を光電管測定装置中の反応セルに移し
、さらに該セルに所定量のＣａＣｌ２溶液を注入し、生
成する発光を測定する。
基質（セレンテラジン）と還元剤（２−メルカプトエタ
ノール）の所定量を混合し、２〜３時間水冷下に熟成し
て得られた測定液を光電管測定装置中の反応セルに移し
、さらに該セルに所定量のＣａＣｌ２溶液を注入し、生
成する発光を測定する。
測定対象となった本発明の合成オリゴヌクレオチド（ブ
ライマー）を後述実施例１の表１に、ブライマーのエク
オリン活性を同じく表２に示す。
ライマー）を後述実施例１の表１に、ブライマーのエク
オリン活性を同じく表２に示す。
表１．２により、エクオリン遺伝子の塩基配列を変異ま
たは欠落せしめた位置如何によってエクオリン活性が変
化し、または消滅する程度が明白である。
たは欠落せしめた位置如何によってエクオリン活性が変
化し、または消滅する程度が明白である。
以下実施例によって本発明を説明する。
１〕合成オリゴヌクレオチドを用いた塩基特異的変異法
によるエクオリン遺伝子（ｐＡＱ４４０）への変異の導
入（図に示す） 塩基特異的変異法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈ−ｎｏ１ｏｇｙ２巻８３Ｂ−８３９（１９８４）
）のギー？−／ブーディブレックス法により行った。
によるエクオリン遺伝子（ｐＡＱ４４０）への変異の導
入（図に示す） 塩基特異的変異法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈ−ｎｏ１ｏｇｙ２巻８３Ｂ−８３９（１９８４）
）のギー？−／ブーディブレックス法により行った。
すなわち、表１に示すように、変異源として合成オリゴ
ヌクレオチド（ブライマーとして）を用いた。合成オリ
ゴヌクレオチドは、ＡＢＩ社の自動ＤＮＡ合成装置で合
成し、高速液体クロマトグラフィーで精製し、Ｔ４−キ
ナーゼで末端リン酸化を行い用いた。プラスミドｐＡＱ
４４０の…Ｒ１−ＨｉｎｄｍフラグメントとＡａｔ Ｉ
Ｉフラグメントを用い、Ａａｔ Ｈフラグメントはアル
カリフォスファターゼ処理し脱リン酸化を行った。この
２つのフラグメントとブライマーとともに、 １００℃
、５ｍ１ｎ処理後、３０℃、３ｍ１ｎ、４℃、 ３０ｍ
１ｎと放置し、アニーリングを行い、１２℃、１２時間
でｄｘＴＰ（Ｘ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、ＩＣ）とＫＩｅｎｏｗ７
ラグメント（大腸菌ボリメレース）とＴ４−リガーゼの
存在下、反応させ、二重鎖を作成する。
ヌクレオチド（ブライマーとして）を用いた。合成オリ
ゴヌクレオチドは、ＡＢＩ社の自動ＤＮＡ合成装置で合
成し、高速液体クロマトグラフィーで精製し、Ｔ４−キ
ナーゼで末端リン酸化を行い用いた。プラスミドｐＡＱ
４４０の…Ｒ１−ＨｉｎｄｍフラグメントとＡａｔ Ｉ
Ｉフラグメントを用い、Ａａｔ Ｈフラグメントはアル
カリフォスファターゼ処理し脱リン酸化を行った。この
２つのフラグメントとブライマーとともに、 １００℃
、５ｍ１ｎ処理後、３０℃、３ｍ１ｎ、４℃、 ３０ｍ
１ｎと放置し、アニーリングを行い、１２℃、１２時間
でｄｘＴＰ（Ｘ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、ＩＣ）とＫＩｅｎｏｗ７
ラグメント（大腸菌ボリメレース）とＴ４−リガーゼの
存在下、反応させ、二重鎖を作成する。
生成したブラスミドニ重鎖を常法によりＥ、ｃｏｌｉに
トランスフォーメーションを行い、それぞれの変異源ブ
ライマーをプローブとして変異体プラスミド（ｐＡＱ４
４０の変異体）をコロニーハイブリタイゼーションによ
りスクリーニングを行い、変異体の確認は、Ｈａｆｆｏ
ｒｉ ら（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
トランスフォーメーションを行い、それぞれの変異源ブ
ライマーをプローブとして変異体プラスミド（ｐＡＱ４
４０の変異体）をコロニーハイブリタイゼーションによ
りスクリーニングを行い、変異体の確認は、Ｈａｆｆｏ
ｒｉ ら（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
１５２２３２−２３８．１８８Ｂ）のｄｉｄｅｏｘｙ法
により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行った。
により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行った。
２）種々の変異エクオリン遺伝子を用いて大腸菌内での
産生 変異ｐＡＱ４４０遺伝子の）ｌｉｎｄｍ−…Ｒ１のｃＤ
ＮＡフラグメント断片をｌａｃのプロモーターを有する
プラスミドｐＵｃ９−２の…ｄＩＩ［−ＥｃｏＲ１部分
にクローニングを行い、大腸菌■８１０１（ＤＩ２１０
ｉＱ）株にトランスフォーメーションを行い、発現誘導
体ＩＰＴＧにより大腸菌内で産生させた。
産生 変異ｐＡＱ４４０遺伝子の）ｌｉｎｄｍ−…Ｒ１のｃＤ
ＮＡフラグメント断片をｌａｃのプロモーターを有する
プラスミドｐＵｃ９−２の…ｄＩＩ［−ＥｃｏＲ１部分
にクローニングを行い、大腸菌■８１０１（ＤＩ２１０
ｉＱ）株にトランスフォーメーションを行い、発現誘導
体ＩＰＴＧにより大腸菌内で産生させた。
すなわち、変異遺伝子を含むｐＵＧ９−２プラスミドの
１２時間培養菌体の１／１００量を５０ｍｇ１１のアン
ピシリンを含む１０層文のＬ−ｂｒｏｔｈ培地に添加後
、３７℃で２時間培養し、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭに
なるように添加し、さらに３７℃で２時間培養後、集菌
を行い、該菌体を５肩文のＭ９塩溶液で洗浄する。この
洗浄物を１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２．５＋Ｊｌｊの２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＭＣＩバッファー（ｐＨ７，８）に
溶解させた後、超音波処理（６０秒）で菌体を破壊し、
１０，０ＯＯｒｐ閣で１０分間遠心分離後、上清を測定
酵素液として用いた。
１２時間培養菌体の１／１００量を５０ｍｇ１１のアン
ピシリンを含む１０層文のＬ−ｂｒｏｔｈ培地に添加後
、３７℃で２時間培養し、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭに
なるように添加し、さらに３７℃で２時間培養後、集菌
を行い、該菌体を５肩文のＭ９塩溶液で洗浄する。この
洗浄物を１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２．５＋Ｊｌｊの２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＭＣＩバッファー（ｐＨ７，８）に
溶解させた後、超音波処理（６０秒）で菌体を破壊し、
１０，０ＯＯｒｐ閣で１０分間遠心分離後、上清を測定
酵素液として用いた。
測定方法は、該酵素溶液１層文に基質セレンテラジン８
Ｉ１ｇおよび２−メルカプトエタノール１０μ１文を添
加後、氷上で２〜３時間放置し、光電管測定装置中の反
応セル中に移し、さらに２０ｍＭ ＣａＣｌ２１．５■
文を注入することにより、生成する発光を測定した。
Ｉ１ｇおよび２−メルカプトエタノール１０μ１文を添
加後、氷上で２〜３時間放置し、光電管測定装置中の反
応セル中に移し、さらに２０ｍＭ ＣａＣｌ２１．５■
文を注入することにより、生成する発光を測定した。
結果を表２に示した。
５′ ３゛２２
０番目 ＧＩＲＡＣＣＡＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＴＣ４
４９ｔｔ Ｇ２ＲＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＡＧＣＣＡ
ＴＴ６０７／／ Ｇ３ＲＴＧＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡ
ＡＣＴＣＧ５６９／／ ＣＩＳ ＣＡ
ＧＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡ５６８／／ ＣＩ
ＲＣＡＧＡＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＧＡＡ５９０／／
Ｃ２Ｓ ＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＡＴＡ
ＴＴＧ６７４／／ Ｃ３Ｓ ＴＣＣＴ
ＧＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＧＣ２３８／／ Ｅ３５Ｋ
ＴＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴ６２
５／／ Ｅ１６４Ｋ ＴＧＴＴＧＡＴＧＡＧ
ＡＴＧＡＣＡＡ−； 変異位置 、； 脱落位置
表２．変異エクオリンの大腸菌での産生（測定ｌ） エクオリン ３８．９ ＧＩＲＱ Ｇ２Ｒ１９、２ Ｇ３Ｒ３７，９ ＨＦ ０ Ｅ３５Ｋ ０ Ｅ１６４Ｋ ０ ０１６１Ｈ＋Ｋ Ｏ ２４ΔＤ ０ １５３ΔＤ Ｏ （測定２） Ｘ １０−８ Ｑｕａｎｔａ／ｓｅｅ。
０番目 ＧＩＲＡＣＣＡＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＴＣ４
４９ｔｔ Ｇ２ＲＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＡＧＣＣＡ
ＴＴ６０７／／ Ｇ３ＲＴＧＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡ
ＡＣＴＣＧ５６９／／ ＣＩＳ ＣＡ
ＧＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡ５６８／／ ＣＩ
ＲＣＡＧＡＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＧＡＡ５９０／／
Ｃ２Ｓ ＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＡＴＡ
ＴＴＧ６７４／／ Ｃ３Ｓ ＴＣＣＴ
ＧＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＧＣ２３８／／ Ｅ３５Ｋ
ＴＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴ６２
５／／ Ｅ１６４Ｋ ＴＧＴＴＧＡＴＧＡＧ
ＡＴＧＡＣＡＡ−； 変異位置 、； 脱落位置
表２．変異エクオリンの大腸菌での産生（測定ｌ） エクオリン ３８．９ ＧＩＲＱ Ｇ２Ｒ１９、２ Ｇ３Ｒ３７，９ ＨＦ ０ Ｅ３５Ｋ ０ Ｅ１６４Ｋ ０ ０１６１Ｈ＋Ｋ Ｏ ２４ΔＤ ０ １５３ΔＤ Ｏ （測定２） Ｘ １０−８ Ｑｕａｎｔａ／ｓｅｅ。
エクオリン ２２．９
ＣＩＳ １５．４
ＣＩＲ１１、０
Ｃ２Ｓ １３．６
Ｃ３Ｓ ６．８
図は、本発明の実施例に係る塩基特異的変異法を示す。
以」−
Claims (1)
- （１）エクオリン遺伝子ｐＡＱ４４０の下記塩基配列に
おいて 【遺伝子配列があります】 下記（ア）〜（ス）に示すいづれかの塩基を他の塩基に
変換若しくは欠失した変異体。 （ア）２２０番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （イ）２３８番目の塩基ＧをＡに変換した変異体。 （ウ）３０７番目の塩基ＣをＴに、３０８番目の塩基Ａ
をＴに変換した変異体。 （エ）４９９番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （オ）５６８番目の塩基ＴをＣに変換した変異体。 （カ）５６９番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （キ）５９０番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （ク）６０７番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （ケ）６２５番目の塩基ＧをＡに変換した変異体。 （コ）６１６番目の塩基ＧをＣに、６２５番目の塩基Ｇ
をＡに変換した変異体。 （サ）６７４番目の塩基ＧをＣに変換した変異体。 （シ）２０５番目から２０７番目の塩基ＧＡＴを欠失せ
しめた変異体。 （ス）５９２番目から５９４番目の塩基ＧＡＴを欠失せ
しめた変異体。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24510886A JPS6398387A (ja) | 1986-10-15 | 1986-10-15 | 変異型エクオリン遺伝子 |
| US07/105,602 US5093240A (en) | 1986-10-15 | 1987-10-08 | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins |
| EP87115044A EP0264819B1 (en) | 1986-10-15 | 1987-10-14 | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins |
| DE8787115044T DE3776857D1 (de) | 1986-10-15 | 1987-10-14 | Aequoringen-varianten und verfahren zur herstellung von entsprechenden aequorinproteinen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24510886A JPS6398387A (ja) | 1986-10-15 | 1986-10-15 | 変異型エクオリン遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6398387A true JPS6398387A (ja) | 1988-04-28 |
Family
ID=17128737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24510886A Pending JPS6398387A (ja) | 1986-10-15 | 1986-10-15 | 変異型エクオリン遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6398387A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008026298A (ja) * | 2006-07-24 | 2008-02-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | ハイスループット発光活性測定のためのセレンテラジン（ウミシイタケルシフェリン）溶液の安定化組成物および安定化法 |
-
1986
- 1986-10-15 JP JP24510886A patent/JPS6398387A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008026298A (ja) * | 2006-07-24 | 2008-02-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | ハイスループット発光活性測定のためのセレンテラジン（ウミシイタケルシフェリン）溶液の安定化組成物および安定化法 |
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