JPS63290899A - ヒトＩｇＥＦｃ蛋白質のフラグメントおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 痩１上立机肛立夏 本発明はアレルギー治療薬として有用なヒトＩｇＥ　（
ヒト免疫グロブリンＥ）Ｆｃ蛋白質のフラグメントを含
有する蛋白質、およびその製造法に関する。

来の　術および　日が　決しようとする問題点ＩｇＥは
免疫グロブリンＩｇの一種であり、工ｇの基本構造たる
Ｙ字型の多重鎖構造のＹ字の幹の部分に当るＦｃ部にお
いて、通常肥満細胞および好塩基球の膜上に存在するＦ
ｃレセプターに結合している。Ｙ字の枝の部分たるＦａ
ｂは抗原と反応することにより、それらの細胞からヒス
タミンなどの生物活性を有する物質を放出させ、即時型
アレルギーなどを引き起す、一方、Ｆａｂ部分を有さず
、Ｆｃ部分のみからなるＦｃ部ＣＣＨ２゜Ｃ：ｌ＋３．
ＣＨ４，から構成される）はＦｃレセプターへの結合能
を有するので、Ｆａｂ部およびＦｃ部を有する完全なＩ
ｇＥとＦｃレセプターへの結合において競合し、しかも
このものはＦａｂ部を有さないため抗原と反応をしない
ので、細胞からのヒスタミンなどの遊離を阻害し、その
結果、即時型アレルギーなどを引き起こすことがないこ
とが知られている。

一方、Ｆｃの材料となるヒトＩｇＥ　は正常人血清中に
は極めて微量にしか存在せず、ＩｇＥ　　が高濃度に含
有されている骨髄腫患者血清から調製されており、随時
、同一種の標品を任意の量取得することは不可能である
０本発明者らの一部は株化ヒト骨髄腫細胞を培養して培
養液上清から高度に純化されたヒトＩｇＥ　　を大量に
取得する途を開いた（特開昭５８−９６０２８号公報）
、シかしながら、ＩｇＥ　　を蛋白分解酵素で消化して
Ｆｃ部を取得することは難しく極めて微量のＦｃ　Ｌか
取得できず実用的な手法となるに至っていない。

分子生物学の最近の進歩によりＦｃ部分をコードするＤ
ＮＡを細菌に導入し、発現させることが可能になってき
た。この遺伝子組み換えの技術を応用し、Ｆｃ　ＤＮＡ
を細菌内で発現させることができれば、Ｆｃ蛋白質を大
量に調製することが可能になり、アレルギー治療薬とし
て実用化への道が開かれる。

骨髄腫患者ＮＤから株化された骨髄腫細胞のＩｇＥ遺伝
子の塩基配列が決定され〔プロシージング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）７９６６６
１（１９８２）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）旦７１９（１９
８３））、Ｆｃフラグメントの大腸菌内での発現が報告
されている〔ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ、）旦３０７７、プロ
シージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）８１２９５５（１９８４））、　Ｌ／か
じながら、Ｆｃ蛋白質は単鎖あたり９個のシスティン残
基を有するため、還元条件下にある大腸菌体から抽出さ
れたＦｃ蛋白質は正しい高次構造を構築していない。

組み換えＤＮＡ技術を用いて生産された蛋白質を正しい
高次構造へ構築する技術はまだ確立されておらず今後に
残された課題である。

上記課題を解決する一つの方法として宿主に動物細胞を
用い蛋白質を細胞外へ分泌させる方法がある。ＩＬ−２
のリーダー配列を用いてヒトＩｇＥＦｃ蛋白質ＤＮＡを
動物細胞で発現せしめＦｃ蛋白質を培養培地中に効率よ
く分泌蓄積させる技術が完成され〔特願昭６１−１８２
４５７号〕、さらに培地中に蓄積されたＦｃ蛋白質を効
率よく単離精製する技術も完成した（特願昭６１−２８
１８７１号）。

本発明者らは大腸菌でのＦｃ蛋白質の発現を可能にすべ
く研究を行ない、上記の動物細胞で成功した手法〔ヒト
ＩｇＥ蛋白質のＦｃ部分全部（アミノ酸２″＠からアミ
ノ酸１＠まで）をコードするＤＮＡ含有プラスミドを用
いている〕を大腸菌に試みたが、抗ヒトＩｇＥ抗体と強
い反応性を示すＦｃ蛋白質を得ることはできなかった。

４　点を解　するための そこで本発明者等はＦｃ［白［ＤＮＡを修飾し大腸菌に
とって好都合なフラグメントを発現する組み換え体が得
られれば、修飾フラグメントを大量に調製することが可
能になり、しかもこのものがアレルギーの治療に多大の
貢献をすることが期待できる点に着目し、Ｆｃ蛋白質の
一部欠けたものをコードする塩基配列を有するＤＮＡで
形質転換させた組み換え大腸菌を作成し、このものを培
養して蛋白質を製造させたところ、抗ヒトＩｇＥ抗体と
強く反応する蛋白質が見つかった。具体的にはＦｃ蛋白
質のカルボキシ末端７６アミノ酸残基に相当するＤＮＡ
をコードしていない組み換え大腸菌２９４／　ｐ　Ｇ　
Ｅ　Ｔｔｒｐ７１２　　（アミノ酸２２′からアミノ酸
４＃０までをコードするＤＮＡを有するもの）（アミノ
酸番号については第１図参照）〔ハイブリドーマ±、　
４７（１９８５））の生産するＦｃ蛋白質のフラグメン
トがヒトＩｇＥＩｌｌ定用キット（ＩｇＥリアジオツギ
（塩野義製薬）〕に強く反応することを見出した。すな
わち、上記組み換え菌体を培養し菌体内に当該蛋白質を
蓄積せしめ、このものを塩酸グアニジンを含む抽出液を
用いて抽出したのち、イムノアフィニテイーグロマトグ
ラフィー処理を含む精製処理をせしめた所、ヒトＩｇＥ
のＣ末端側で切断除去されているが、リンカ−ペプチド
：　Ｍｅｔ　−ＬｅｕのＣ末端側にヒトＩｇＥのＦｃ蛋
白質の一部 Ａｓｐ”’　−Ａｓｎ　−−−−−Ａｒｇ　−Ａｌａ”
’が結合した蛋白質が得られたのである。上記組み換え
大腸菌はＡｓｐ”’−Ｐｒｏ”’までのアミノ酸をコー
ドするＤＮＡを含有しているにもかかわらず、Ｃ末端側
の一部アミノ酸が欠損したＡｓｐ”＠−−−Ａｌａ”’
を含有する新規な蛋白質を産生じたのである。

このようにして本発明者等は、リンカ−ペプチドのＣ末
端側にヒトＩｇＥのＦｃ蛋白質の全部ではなくて一部が
結合しているもの、具体的にはヒトＩｇＥ蛋白質の２２
６番目のアミノ酸から始まって３６５ないし４００番目
のアミノ酸で終るフラグメントが結合した新規な蛋白質
が、抗ヒトＩｇＥ抗体と強い反応性を示すことを見出し
、本発明に到達したものである。

すなわち、本発明は（１）リンカ−ペプチドと、そのＣ
末端に結合したヒトＩｇＥ蛋白質の２２６番目のアミノ
酸から始まって３６５ないし４００番目のアミノＭ（第
１図参照）で終るフラグメントとからなる蛋白質（１）
、（２）　ｆｆｌ白質（１）を生産する能力を有する組
換え大腸菌体を培養し、培養物中に蓄積された該蛋白質
を採取することを特徴とする該蛋白質の製造法、（３）
イムノアフィニティークロマトグラフィーを含む方法で
蛋白質の採取を行なう上記（２）の蛋白質の製造法、（
４）イムノアフィニティークロマトグラフィーにおいて
モノクローナル抗体を用いる上記（３）記載の蛋白質の
製造法に関するものである。

本発明の蛋白質（１）は新規な物質であり、従来、この
ような蛋白質は得られたことがなかったのである１本発
明の蛋白質（１）においてヒトＩｇＥＦｃ蛋白質のフラ
グメントのＮ末端側についているリンカ−ペプチドは大
腸菌での本蛋白質の発現が順調に行われるものであれば
どのようなものでも構わないが、具体的にはＭｅｔ−Ｌ
ｓｕのようなものが挙げられる。

本発明の蛋白質（１）を生産する能力を有する組換え大
腸菌体としては前述の大腸菌２９４／　ｐ　ＧＥＴｔｒ
ｐ７１２が具体的には挙げられるが、これに限定される
ことはない。

例えば、蛋白質（１）をコードする塩基配列を有するＤ
ＮＡで形質転換された大腸菌であって、蛋白質（１）を
生産する組み換え大腸菌体、あるいはリンカ−ペプチド
をコードする塩基配列とその３′−末端に結合したヒト
ＩｇＥ蛋白質の一部をコードする塩基配列とを有するＤ
ＮＡで形質転換された大腸菌であって、大腸菌内のプロ
セッシングにより蛋白’Ｊｔ　（１）を生産する組み換
え大腸菌体などのいずれを用いてもよい。

本発明の蛋白質（１）を製造する方法としては。

上記の蛋白質（１）を生産する能力を有する組換え大腸
菌体の培養、生成物の精製の他、リンカ−ペプチドとそ
のＣ末端に結合したヒトＩｇＥＦ。

蛋白質またはそのフラグメントとからなる蛋白質のＣ末
端側からアミノ酸を切除して、所望のアミノ酸を有する
フラグメントとすることもできる。

なお１本発明の蛋白質においては、一部のアミノ酸が削
除されていたり、他のアミノ酸に置換されていても、本
発明と同様の作用を有するものは本発明の蛋白質に含ま
れる。

本発明で用いられる形質転換大腸菌体の培養は。

自体公知の培地１例えばＭ−９培地中、１５〜４０℃、
好ましくは２４〜３７℃で３〜４８時間、好ましくは５
〜１２時間行い、必要により通気や撹拌を加えることも
できる。

培養後、公知の方法で菌体を集め、菌体を尿素、塩酸グ
アニジンなどの蛋白変性剤を含む緩衝液に懸濁し、冷所
で撹拌したのち、遠心分離により当該蛋白質を含む上澄
液を得る方法、あるいは緩衝液に懸濁し、超音波処理、
リゾチームおよび／または凍結融解によって菌体を破壊
したのち、遠心分離により当該蛋白質を含む上澄液を得
る方法などが適宜用い得るが、例えば菌体を集めて塩酸
グアニジン（３〜７Ｍ）を含む緩衝液を加え撹拌（０〜
１０℃で０．５〜８時間）後、遠心分離して上澄を得る
方法が好ましい。

上記抽出液からのＦｃ蛋白質のフラグメントの分離、精
製は自体公知の分離精製法を適切に組み合わせて分離精
製することができる。すなわち、例えばモノクローナル
抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー
、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマ
トグラフィーなどの分離、精製手段から適宜選択し、組
み合わせて使用することができるが、とりわけ上記記載
のこれらの手段をこの順番に用いるのがよい。

イムノアフィニティークロマトグラフィーのリガンドと
して抗ヒトＩｇＥ　ポリクローナル抗体を用いることが
できるが、とりわけＦｃ部分を認識するモノクローナル
抗体を用いることが好ましい。

Ｆｃ部分を認識するモノクローナル抗体としてＥ　２３
５　Ｉ　６３．　Ｅ　１２０．０２など〔ハイブリドー
マ（ｌｌｙｂｒｉｄｏｍａ）４，４７（１９８５））が
挙げられるが、とりわけＥ１２０．０２が好ましい。

イムノアフィニティークロマトグラフィーの担体として
アフィゲル−１０（バイオラッド社）、ＣＮＢｒ−活性
化セファローズ４Ｂ（ファルマシア社）、フォルミルセ
ルロファイン（生化学工業）などが用いられ、とりわけ
アフィゲル−１０が好ましい。

Ｆｃ？Ｉｆ白質のフラグメントをＥ　１２０．０２をリ
ガンドとするイムノアフィニティークロマトグラフィー
により精製するには、前Ｆｃ蛋白質のフラグメント含有
抽出液を緩衝液（りん酸緩衝液など）に対してあらかじ
め充分に透析し、不溶物を遠心分離により除去した上澄
液を上記緩衝液で平衡化した上記カラムに吸着させ、緩
衝液で溶出する。該緩衝液に蛋白変性剤（尿素など）な
どを適量加えて使用でき、これら添加物の種類や濃度、
緩衝液のｐＨを組合せ、適切な溶出液として用いること
ができる。得られたＦｃ蛋白質のフラグメントを含む両
分の濃縮には限外ろ過膜などを用いることができる。

ゲルろ過クロマトグラフィーは、例えばセファクリル５
−ｚｏｏ（ファルマシャ社）カラムを用いて公知の手段
を適用して実施される。

イオン交換クロマトグラフィーは、例えばＤＥＡＥ−ト
ヨバール６５０Ｍ　（東洋曹達工業）カラムを用いて公
知の手段を適用して実施される。

かくして生成されるヒトＩｇＥＦｃ蛋白質のフラグメン
トの純度の測定（比活性）には、市販のヒトＩｇＥ測定
用キット、例えばＩｇＥリアジオツギ（ジオツギ製薬）
を用いて行なうことができる。

本発明の製造法によれば、高度に精製された、医薬品等
として使用しうるヒトＩｇＥＦｃ蛋白質のフラグメント
含有蛋白質を得ることができる。

例えば、ヒトＩｇＥＦｃ蛋白質の一部をコードする塩基
配列を有するＤＮＡで形質転換された大腸菌体の産生じ
たＦｃ蛋白質のフラグメント含有蛋白質を本発明の方法
により精製することにより下記の性状を有する高度に精
製されたヒトＩｇＥＦｃ蛋白質のフラグメント含有蛋白
質を得ることができる。

（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元
条件下）で２本のバンドを示し、これによる分子量測定
値はそれぞれ２０，０００±１　、０００ダルトンおよ
び１８，０００±１　、０００ダルトンである。

（２）アミノ末端アミノ酸としてメチオニン（もしくは
そのホルミル体）を有する。

（３）カルボキシ末端アミノ酸としてアラニンを有する
。

（４）ＩＸＩＯ’ユニット／■以上の比活性を有する。

本発明において蛋白質純度決定のためのＦｃ蛋白質のフ
ラグメント含有蛋白質の活性の（比活性）測定はＩｇＥ
リアジオツギキットを用いるラジオイムノアッセイ法で
行なった。

本発明の蛋白質の毒性は低く、ＩｇＥによってひきおこ
されるアレルギーの治療作用を有する。

したがって、本発明の蛋白質は、たとえば、アレルギー
性鼻炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息などのアレルギ
ーの治療薬として用いることができる０本発明の蛋白質
をアレルギーの治療薬として用いるには、ヒトに、たと
えば噴震用液剤、軟膏剤、クリーム剤などとして噴霧、
塗布することにより非経口的に、または錠剤などとして
経口的に投与される。投与量は、性状、投与経路により
異なるが、およそ１回あたり、１０ｎｇ〜１００μｇで
あり、１日約３回投与される。

なお、本願明細書および図面において、塩基やアミノ酸
などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ　Ｂ　
Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａｉｃａ
ｌ　Ｎｏｍａｎｃｌａ−ｔｕｒｅによる略号、あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例
を次に挙げる。

またアミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に
明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　　デオキシリボ核酸 Ａ　　　アデニン Ｔ　　　チミン Ｇ　　　グアニン Ｃシトシン ＳＤＳ　　　ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ　　グリシン Ａｌａ　　　アラニン Ｖａｌ　　　バリン Ｌｅｕ　　　ロイシン １１ａ　　　イソロイシン Ｓｅｒ　　　セリン Ｔｈｒ　　　スレオニン Ｃｙｓ　　　システィン １／２Ｃｙｓ　　　ハーフシスチン Ｍｅｔ　　　メチオニン Ｇｌｕ　　　グルタミン酸 Ａ　ｇ　ｐ　　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　　リジン Ａ　ｒ　ｇ　　　アルギニン Ｈｉｓ　　　ヒスチジン Ｐｈｅ　　　フェニルアラニン Ｔｙｒ　　　チロシン Ｔｒｐ　　　トリプトファン Ｐｒｏ　　　プロリン Ａｓｎ　　　アスパラギン Ｇｌｎ　　　グルタミン ヌ】０乳 以下に、参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具
体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。

なお、以下の参考例２に記載のｐ　Ｇ　Ｅ　Ｔ　ｔｒｐ
３０２を用いて、大腸菌２９４（Ｉ　Ｆ　０−１４１７
１）をＣｏｈｅｎら［プロシーディンゲス・オフ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニー・ニス・
ニーＪ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾、）６１．２１１０（１
９７２）に記載の方法により形質転換させて得られた形
質転換体大腸菌２９４／ｐＧ　Ｅ　Ｔｔｒｐ３０２は、
財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）　Ｌ：　Ｉ　ＦＯ−１４
２８５トＬテ寄Ｉｆｃ！レテイル。

また、同じく参考例２に記載のｐ　Ｇ　Ｅ　Ｔｔｒｐ７
１２を用いて、大腸菌２９４（Ｉ　Ｆ　０−１４１７１
）をＣｏｈｅｎら「プロシーディンゲス・オフ・ナショ
ナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニー・ニス・ニ
ー」（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ
、Ａ、）６１．２１１０（１９７２）に記載の方法によ
り形質転換させて得られた形質転換体大腸菌２９４／ｐ
Ｇ　Ｅ　Ｔｔｒｐ７１２は、財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）にＩＦＯ−１４６０９として、また昭和６２年５月
２１日から通商産業省微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）
にＦＥＲＭ　　Ｐ−９３８２として寄託されている。

参考例Ｉ　　Ｅ　１２０．０２アフイゲル１０カラムの
製造抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体、Ｅ　１２０．０
２（ハイブリドーマ、土、　４７（１９８５））３６０
ｓ＋ｇを含むＰＢＳ（１３７ｍＭ　ＮａＣ１，２，７ｍ
Ｍ　ＫＣＩ、　８．１ｍＭ　Ｎａ、ＨＰＯ，、１，５ｍ
ＭＫ１．ＰＯ，、ｐ）１７．４）溶液７５ｍ１を２Ｑの
０．ＩＭ　Ｎａ＋ｌＣＯ。

溶液に対して一晩４℃で透析したのち、アフィゲル１０
（バイオラッド社）　７５ｍΩに加えて混和し５℃で２
日間振とうした。混合液をガラスフィルター上に移して
ゲルをＰＢＳで洗いアフィゲル１０に結合しなかった蛋
白質を除いた。この操作でのモノクローナル抗体への結
合率は約８７％で７フイゲル１０１ｍＱ当り約４．２脂
ｇのモノクローナル抗体の結合したＥ　１２０．０２−
アフィゲル１０７５ｍＱが得られた０本ゲルをＰＢＳ、
３Ｍ尿素、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む０．２Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ４，０）、　０．１５ＭＮａ
（：１を含む０．２Ｍ酢酸、ＰＢＳで順次洗浄したのち
内径２．６１のカラムに詰めＥ　１２０．０２−アフィ
ゲルＩＯカラムを製造した。

参考例２　　カルボキシ末端欠損Ｆｃ蛋白質発現プラス
ミドｐ　Ｇ　Ｅ　Ｔｔｒｐ７１２の構築ヒトＩｇＥのＣ
，−Ｃ４領域のポリペプチドが大腸菌において発現する
ように構築されたプラスミドｐ　Ｇ　Ｅ　Ｔｔｒｐ３０
２　［Ｋｕｒｏｋａｗａ、ら、ヌクＩ／イック・アシッ
ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
）旦、３０７７−３０８５（１９８３）　；特開昭５９
−４４３９９号公報］を制限酵素ＭｓｔＩＩで切断し、
生じた粘着末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■ラージフ
ラグメントでうめた後。

５０ｎＨの５′末端をリン酸化した翻訳停止コドンを含
むＥｃ＊ＲＩリンカ−ｄＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧをＴ
４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａｂｓ社）を用いて結合させた。両端に結合したリンカ
一部分をＥｃｏＲＩで切断したのち、ＤＮＡを再結合さ
せたヒトＩｇＥ　蛋白質の４８０番目のアミノ酸までを
コードするプラスミドｐ　Ｇ　Ｅ　Ｔｔｒｐ７１２を構
築した。このプラスミドを用いて、Ｃｏｈｅｎ　らの方
法ｒ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ
、Ａ、）６９．２１１０（１９７２）Ｊに従って大腸菌
２９４（ＩＦＯ−１４１７１）を形質転換させることに
より形質転換体大腸菌２９４／ｐＧ　Ｅ　Ｔｔｒｐ７１
２を得た（第２図参照）。

実施例１　形質転換体の培養 形質転換体大腸菌！菌２９４／　ｐＧ　Ｅ　Ｔｔｒｐ７
１２　（第２図参照）を１．０％グルコース、０．２％
カザミノ酸を含むＭ−９培地で３７℃、６時間培養した
後、菌体を集めた。

実施例２　菌体からの抽出 実施例１記載の方法で培養し、−２０℃で凍結して得た
凍結保存菌体６５ｇを７Ｍ塩酸グアニジン。

２０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳ　　
（ｐ　Ｈ７，４）　２００ｍＡに懸濁し５℃で４時間撹
拌した。

この懸濁液にＰ　Ｂ　８２６７■Ｑを加えてさらに１時
間撹拌を続けたのち３０，１００Ｘ　ｇで１時間遠心分
離して上清を得、ついでＰＢＳ　　４Ωに対して５℃で
２日間透析した。なお、途中で３回ＰＢＳを交換した。

透析内液を遠心分離して上清４’ｌＯｗａ　Ｑ　　（２
１１５Ｂ；９８．７Ｘ１０’ユニツト）を得た。

実施例３　　Ｆｃ蛋白質のフラグメントの製造■　イム
ノアフィニティークロマトグラフィー参考例１で調製し
たＥ　１２０．０２−アフィゲル１０カラム（２，６Ｘ
１３．６ｍ）をＰＢＳにより平衡化して、実施例２で得
られた透析内液の一部１５ｆｕｊｌを同カラムにかけた
のち、同緩衝液１，０００ｍＱ、　０．１５ＭＮａＣＱ
を含む０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）６
０ｍ　Ｑ　、　３　Ｍ尿素、　０．１５Ｍ　ＮａＣＱを
含む０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）　１
００ｍＱ　、　Ｐ　ＢＳ　２００■Ωで順次洗った。３
Ｍ尿素を含む緩衝液で溶出された活性画分約８０ｍ　Ｑ
をＰＢＳ２Ｑに対して５℃で２４時間透析した。なお、
途中で１回ＰＢＳを交換した。３回のクロマトグラフィ
ー操作により得られた透析内液を遠心分離して上清２４
１■Ｑ（３１，３＋＊ｇ；　５５，４　Ｘ　１０”ユニ
ット）を得た。

■　セファクリルＳ−２００を用いたゲルろ過クロマト
グラフィー ■で得られた遠心上清をＹＭ−５メンプラン（アミコン
社製、アメリカ）を用いて濃縮した。

得られた濃縮液全量をあらかじめＰＢＳで平衡化したセ
ファクリルＳ−２００カラム（１，６Ｘ１０５ｍ）にか
け、同緩衝液を用いてＦｃ蛋白質のフラグメントを溶出
した。活性画分２４．７ｍＡ　（９，４ｍｇ；　１９．
３×１０１ユニツト）を得た。

■　ＤＥＡＥ−トヨパール６５０　Ｍを用いたイオン交
換クロマトグラフィー ■で得られた活性画分を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　
（ｐＨ８゜２）緩衝液５００ｍ　Ｑに対して２４時間透
析した。なお途中で１回緩衝液を交換した。透析内液を
遠心分離したのち、上清をあらかじめｌｏｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ｔｉｃ　！１　（ｐＨ８，２）緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（０，７２Ｘ１７
ｃｍ）にかけ、同緩衝液ｌＯ履ρで洗った。カラムに結
合した蛋白質は１０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ８
，２）緩衝液１００ｍ　Ｑに０．３Ｍ　ＮａＣＱを含む
同緩衝液１００ｍΩを連続的に加えるＮａＣＱの直線濃
度勾配グラジェントにより溶出した。ＮａＣＱ濃度１４
０■Ｈ付近に溶出された高比活性画分１７．２ｉＱ（１
，８ｍｇ；　６−５Ｘ１０’ユニツト）を集めた。

上記方法で製造した実質的に純粋なＦｃ蛋白質のフラグ
メントは下記の性状を有していた。

（１）単一性： 実施例３で得られたＦｃ蛋白質のフラグメントの純度を
ラエムリの方法〔「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　Ｊ　
＋亜６８０（１９７０））に準じて５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドスラブゲル電気泳動を行った結果、Ｆｃ蛋白質
のフラグメントは還元条件下で主に２本のバンドを示し
た（第３図参照）。

（２）分子量： Ｆｃ￥Ｘ白質のフラグメントの分子量は５ＤＳ−ポリア
クリルアミドスラブゲル電気泳動から還元条件下では２
０，０００±１，０００および１８，０００±ｉ　、　
ｏｏｏダルトンと算出された。

（３）アミノ酸組成： 実施例３で得られたＦｃ蛋白質のフラグメント１５．６
μｇをガラス製加水分解用試験管にとり、４％チオグリ
コール酸を含む定沸点塩酸を加えて。

減圧下に封管したのち、１１０℃で２４．４８．７２時
間加水分解した。加水分解後、開管し、減圧下に塩酸を
除去し、残渣を０．０２Ｎ塩酸に溶解して日立製８３５
型アミノ酸分析計によりアミノ酸分析を実施した。シス
チンおよびシスティンはハースの方法〔メソッズインエ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
、）旦、　１９７（１９６７））に従い、Ｆｃ蛋白質の
フラグメントを過ギ酸酸化したのち、減圧下、定沸点塩
酸中で２４時間加水分解して、アミノ酸分析計によりシ
スティン酸として定量した。

アミノ酸分析値は、　２４．４８および７２時間の加水
分解で得られた値を平均して求めた。但し、セリンおよ
びスレオニンの値は加水分解時間を０時間に外挿して求
めた。その結果を第１表に示す。

第　　１　　表 アミノ酸　　　　　　　　　モル％ Ａｓｐ／Ａｓｎ　　　　　　　　　　　９．８Ｔｈｒ　
　　　　　　　　　　　　１３．５Ｓｅｒ　　　　　　
　　　　　　　９．４Ｇｌｕ／Ｇｌｎ　　　　　　　　
　　１１．３Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　３．８
ａｔｙ　　　　　　　　　　　　　７．２Ａｌａ　　　
　　　　　　　　　　４・９１／２Ｃｙｓ　　　　　　
　　　　　３．２Ｖ　ａ　ｌ　　　　　　　　　　　　
　５　、６Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　１．６Ｉ
　ｌｅ　　　　　　　　　　　　　３．４Ｌａｕ　　　
　　　　　　　　　　９．８Ｔｙｒ２．７ Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．３Ｌ
ｙｓ４．０ Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２・４Ａ
ｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　、２．４Ｔｒ
ｐ　　　　　　　　　　　　　　　　１．５（４）ＮＨ
，末端アミノ酸配列： 実施例３で得られたＦｃ蛋白質のフラグメント２４μｇ
に気相プロテインシークエネーター（アプライド・バイ
オシステムズ社製４７０Ａ型、アメリカ）を用いる自動
エドマン分解法を適用して。

ＮＨ２末端アミノ酸配列を分析した。フェニルチオヒダ
ントインアミノ酸（ＰＴＨ＝アミノ酸）はミクロパック
Ｃ１８−３カラム（パリアン社製、アメリカ）を用いる
高速液体クロマトグラフィーにより同定した。各ステッ
プで検出されたＰＴＨ−アミノ酸を第２表に示す。

第２表 ステップ　　　検出されたＰＴＨ−アミノ酸１　　　　
　　　　　メチオニン ２　　　　　　　　　ロイシン ３　　　　　　　　　アスパラギン酸 ４　　　　　　　　　アスパラギン ５　　　　　　　　　リジン ６　　　　　　　　　スレオニン ７　　　　　　　　　フェニルアラニン８　　　　　　
　　セリン ９　　　　　　　バリン １０　　　　　　　　　　　Ｘ傘 １１　　　　　　　　セリン １２　　　　　　　　　アルギニン １３　　　　　　　　　アスパラギン酸１４　　　　　
　　　　　フェニルアラニン１５　　　　　　　　　ス
レオニン 串：同定出来ず （５）ＣＯＯＨ末端アミノ酸 実施例３で得られたＦｃ蛋白質のフラグメント９０μｇ
をガラス製ヒドラジン分解用試験管にとり、無水ヒドラ
ジンＯ，１ｒｎＱを加えて減圧下に封管したのち、１０
０℃で６時間加熱した。得られたヒドラジン分解物をス
ピードバックコンセードレータ−（サーバント社製、ア
メリカ）を用いて乾固したのち、蒸留水に溶解した。こ
の溶液にベンズアルデヒドを添加し、室温１時間撹拌し
、遠心分離を行ったのち、上清を得た。この上清を乾固
し、日立ｆＩＢ８３５型アミノ酸分析計によりアミノ酸
分析を実施した。その結果、１．Ｉｎ　ｍｏｌｅのアラ
ニンが検出された。

光」４蔓碩艮 本発明により製造されるヒトＩｇＥＦｃ蛋白質のフラグ
メント含有蛋白質はＩｇＥによって引きおこされるアレ
ルギーの治療に有用な新規物質であり、また本発明によ
って該蛋白質の大量生産が可能となり、産業上の有用性
は大である。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドＰ　Ｇ　Ｅ　Ｔｔｒｐ７１２に含ま
れるリンカ−およびＩｇＥのＦｃ部分の塩基配列をアミ
ノ酸配列に翻訳して示した図である。 第２図は本発明で用いられるプラスミドＰＧＥＴｔｒｐ
７１２の横築図である。 第３図は本発明で得られた蛋白質の５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドスラブゲル電気泳動の結果を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）リンカーペプチドと、そのＣ末端に結合したヒト
   ＩｇＥ蛋白質の２２６番目のアミノ酸から始まって３６
   ５ないし４００番目のアミノ酸で終るフラグメントとか
   らなる蛋白質。
2. （２）リンカーペプチドと、そのＣ末端に結合したヒト
   ＩｇＥ蛋白質の２２６番目のアミノ酸から始まって３６
   ５ないし４００番目のアミノ酸で終るフラグメントとか
   らなる蛋白質を生産する能力を有する組換え大腸菌体を
   培養し、培養物中に蓄積された該蛋白質を採取すること
   を特徴とする該蛋白質の製造法。
3. （３）イムノアフィニティークロマトグラフィーを含む
   方法で蛋白質の採取を行なう、特許請求の範囲第２項記
   載の蛋白質の製造法。
4. （４）イムノアフィニティークロマトグラフィーにおい
   てモノクローナル抗体を用いる特許請求の範囲第３項記
   載の蛋白質の製造法。