CN112521461B - 甲型肝炎病毒重组蛋白的制备及其快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种甲型肝炎病毒重组蛋白的制备及其快速检测方法。本发明挑选了甲型肝炎病毒抗原两段优势表位，通过一段柔性片段(四个甘氨酸)作为连接短肽序列，将两段优势表位经重复串联后，组成一个重组蛋白。并采用CHO细胞偏爱密码子将该重组抗原氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体，从而提高该重组抗原在CHO细胞中的表达量。另外，采用并基于该重组蛋白建立了高特异性和高灵敏度的胶体金诊断平台。

Description

甲型肝炎病毒重组蛋白的制备及其快速检测方法

技术领域：本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种甲型肝炎病毒重组抗原及其制备方法、该重组抗原多抗的制备，以及用该重组抗原建立甲型病毒性肝炎的快速诊断平台。

背景技术：甲型病毒性肝炎，简称甲型肝炎、甲肝，是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的，以肝脏炎症病变为主的传染病。甲肝是临床上常见的一种传染病，一般甲肝只是一种普通的肝炎，少数情况下会发展成重症肝炎。所以在甲肝的早期进行准确的诊断，就能及时对甲肝进行相应的治疗，防止进一步发展成重症肝炎。因此，早期快速诊断是防治该病的关键和重点。

目前，常用的甲型病毒性肝炎的诊断方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、以天然病毒建立的胶体金法和聚合酶链式反应技术等。其中，酶联免疫吸附试验(ELISA)利用抗原和抗体特异性结合的原理，通过酶标显色进行抗原或抗体的检测。虽然可以通过ELISA 方法可以检测针对甲型肝炎病毒的IgM抗体，从而判断是否感染甲型病毒性肝炎。但酶联免疫吸附试验(ELISA)检测耗时，操作繁琐，相对来说限制了其大规模生产与投放。并且传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)使用的原料是甲型肝炎病毒的天然抗原或者疫苗，这导致了检测时特异性低下。同样，市面上常见的胶体金检测方法，都是以天然病毒或疫苗为原料建立的胶体金检测手段，也存在特异性低下的现象，这容易导致对病症的误判，接受不必要的治疗手段。聚合酶链式反应技术，是通过对特定基因扩增的手段来进行检测的手段，这种方法选择了甲型肝炎病毒的一段高度保守序列，虽然聚合酶链式反应技术具有灵敏度高、特异性强的特点，但是操作复杂且费时。

因此，建立一种快速、操作简便、高特异性的针对甲型病毒性肝炎感染诊断的方法有重大意义。

发明内容：

本发明目的之一是提供甲型肝炎病毒重组蛋白AV56的DNA序列。

本发明目的之二是提供一种由CHO细胞高效表达的甲型肝炎病毒重组蛋白AV56，为后续建立甲型病毒性肝炎的快速检测方法提供特异性抗原。

本发明目的之三是提供一种可以特异性识别该重组蛋白的多抗。

本发明目的之四是提供一种快速，操作简单，高特异性的甲型病毒性肝炎感染的诊断方法。

本发明通过以下实验方案实现：

1)通过目前已知的甲型肝炎病毒基因序列，与其它同源病原微生物的特征表位进行比对，经过计算机模拟甲型肝炎病毒的优势表位，最终选择甲型肝炎病毒的两段优势抗原表位序列通过一段柔性片段(四个甘氨酸)作为连接，经重复串联后获得的序列作为目的序列，并采用CHO细胞偏爱密码子合成对应的核苷酸序列。

2)将合成后的核苷酸序列定向***真核表达载体构建得到重组真核表达载体。

3)将步骤2)中得到的重组真核表达载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过筛选鉴定得到重组表达质粒。

4)选取步骤3)中得到的重组表达质粒瞬转CHO细胞，7天后收集细胞上清。

5)将步骤4)中得到的细胞上清通过纯化得到重组蛋白AV56。

6)将步骤5)纯化得到的AV56重组蛋白免疫山羊，制备多克隆抗体，并且将制备好的多克隆抗体进行纯化。

7)将步骤5)纯化得到的AV56重组蛋白标记胶体金颗粒。

8)将步骤6)纯化后的多克隆抗体作为C线进行包被。

9)分别将鼠抗人IgM单克隆抗体(杭州贤至生物科技有限公司)作为T线进行包被。

10)组装胶体金试纸条，利用胶体金试纸检测待测血清。根据胶体金颜色变化确定其临床使用。

本发明所涉及到的质粒载体为分子生物学领域应用最广泛的载体工具，CHO细胞为生物学领域重要的表达生产***。操作方便，对环境及操作人员无安全隐患，且表达所得的融合抗原，不存在致病性与传染性，将两个优势抗原表位进行多次重复，不仅提高了多抗制备过程中的免疫源性，而且增加了胶体金的标记效果。同时，通过对鼠抗人IgM单克隆抗体进行包被，可以实现对甲型病毒性肝炎急性感期染期的检测，方便及时对甲肝进行相应的治疗，防止进一步发展成重症肝炎。

具体实施方案:以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。

实施例1：甲型肝炎病毒优势抗原表位序列选择

以甲型肝炎病毒为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，兼顾其特异性与灵敏度，最终选择两段优势抗原表位序列，该优势抗原表位序列为甲型肝炎病毒蛋白特有序列，与其他蛋白序列无明显同源性。

实施例2：甲型肝炎病毒优势抗原表位序列串联与优化

为提高胶体金标记效果及该蛋白多抗制备效价的要求，将两段甲型肝炎病毒优势抗原表位通过一段柔性片段进行连接，再通过一段柔性片段将前述连接序列进行3次重复，为了提高重组蛋白在CHO细胞中的表达量，采用CHO细胞偏爱密码子合成对应的核苷酸序列，得到重组蛋白氨基酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No:1所示。将连接后的重组蛋白氨基酸序列转化为对应核苷酸序列，具体编码序列如序列表SEQ ID No:2所示，在该段序列上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。

实施例3：构建重组蛋白表达载体

用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pTT5载体12小时，将酶切片段通过1％琼脂糖凝胶电泳富集后进行胶回收(目的基因回收与酶切产物回收均采用宁波中鼎生物技术有限公司胶回收试剂盒)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因片段和pTT5载体片段按一定的比例于4℃连接12小时，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃恒温过夜培养。

将在平板上挑取的单克隆菌株接种至含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养5小时后，对菌株质粒进行提取(使用宁波中鼎生物技术有限公司质粒纯化试剂盒)，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体pTT5-AV56。

DH5α感受态细胞制备：取大肠杆菌DH5α菌液100μl加至LB培养基(2mL)中，37℃恒温摇床培养3-4小时至OD600＝0.6，取100μl活化后的菌液加至LB培养基(6mL)中，37℃恒温摇床培养1.5小时至OD600＝0.6，取1ml菌液，低温离心后弃上清，沉淀中加入160μl含CaCl₂-甘油溶液，吹匀5000rpm，4℃离心3min，弃上清，加入160μl含CaCl₂-甘油溶液，吹匀则得到DH5α感受态细胞。

CaCl₂-甘油溶液配方：CaCl₂终浓度1mol/L，甘油终体积10％

实施例4：重组表达载体转染真核动物细胞及纯化

将构建好的重组表达载体pTT5-AV56转染CHO-K1细胞。转染前一天将CHO-K1细胞按照1×10⁶/ml的密度传代以保证转染时细胞活力，转染当天将细胞密度调整为2×10⁶/ml进行转染。根据转染体系每毫升中加入3.2μg重组表达载体，再根据转染体系每毫升中加入4.8μg转染试剂PEI(Polyscience),边加边摇匀。37℃，6％二氧化碳摇床转速120rpm 培养4小时后，加入1％500mM VPA(sigma)以及1％30g/L L-盐酸半胱氨酸(索莱宝生物科技有限公司)，32℃，6％二氧化碳摇床转速120rpm培养6天后离心收集上清通过镍琼脂糖亲和层析柱(常州天地人和生物科技有限公司),20mM咪唑溶液去除杂蛋白，300mM 咪唑溶液洗脱目的蛋白，收液后，4℃静置30分钟，转至截留分子量为10kD-12kD的透析袋中，于PBS(10mmol/L,pH7.4)中过夜透析。透析后立即取出并分装，于-20℃保存备用。

20mM咪唑配制：咪唑1.36g，加10mmol/L,pH7.4 PBS溶液溶解定容至1000mL。

300mM咪唑配制：咪唑10.2g，加10mmol/L,pH7.4 PBS溶液溶解定容至500mL。

实施例5：ELISA检测

取纯化后的AV56经包被液稀释至终浓度为1μg/mL，以100μL/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)中，4℃过夜包被，通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次，洗板后加入封闭液200μl进行封闭，37℃孵育1小时后，用洗涤液洗涤1次。再分别加入临床已确诊的甲型病毒性肝炎阴性血清和甲型病毒性肝炎 IgM阳性血清，37℃孵育35分钟后用洗涤液洗涤3次，分别加入HRP标记的兔抗人IgM 抗体(杭州贤至生物科技有限公司)，37℃孵育35分钟后用洗涤液洗涤4次。加入A液与B液后加入终止液，空白对照孔调零后，进行OD值测量，结果表明IgM阳性血清孔OD 值为阴性血清孔的2.8倍。

包被液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g,加超纯水定容至1000mL(pH9.6)。

封闭液：取伊利脱脂奶粉3g，加10mmol/L,pH7.4 PBS溶液溶解定容至100mL。

洗涤液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.68g,NaH₂PO₄.2H₂O 0.39g,NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加超纯水定容至1000mL(pH7.4)。

显色液A:200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加超纯水定容至1000mL。

显色液B:柠檬酸2.1g,Na₂HPO₄.12H₂O 71g,加超纯水定容至1000mL。

使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H₂O₂

终止液：2M H₂SO₄,21.7mL浓H₂SO₄加超纯水定容至1000mL。

实施例6：重组蛋白AV56羊多抗制备

取AV56重组蛋白300μg，用弗氏完全佐剂进行乳化(共1ml)，皮内多点注射至一只绵羊中，进行第一次基础免疫。20天后进行第二次免疫(加强免疫)，即取AV56重组蛋白150μg，用弗氏不完全佐剂进行乳化(共1ml)，皮内多点注射。之后每隔15天加强免疫一次，方法与第二次免疫相同，第4次加强免疫后第10天，耳动脉采血5ml，纯化得到AV56多克隆抗体，通过ELISA检测其效价。具体操作与实施例6中相同，AV56多克隆抗体作为一抗添加，类似实施例6中甲型病毒性肝炎IgM阳性血清。第五次加强免疫后10 天，颈动脉采血。

实施例7：重组蛋白AV56兔多抗纯化

琼脂糖亲和介质Protein G层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)平衡至室温，电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)预热20分钟，用10mmol/L，pH＝7.4的PBS溶液过柱洗涤至电脑核酸蛋白检测仪吸光度A显示为0。羊血清12000rpm离心5分钟后，取上清过0.45μm滤膜后上样，随后加10mmol/L，pH＝7.4的PBS溶液过柱洗涤至电脑核酸蛋白检测仪吸光度A显示为0。用0.1mol/L，pH＝3.0的甘氨酸溶液洗脱。收集洗脱液后，加入0.5mol/L，pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液中和至pH＝7.0，即为重组蛋白AV56羊多克隆抗体。

甘氨酸溶液配制：甘氨酸7.5g，加超纯水溶解，定容至800ml，加浓HCl 6-8滴调pH＝3.0 Tris-HCl缓冲液配制：Tris 75.4g，加超纯水搅拌溶解，定容至1000ml，加浓HCl约10ml，调pH＝8.5。

实施例8：重组蛋白AV56标记胶体金颗粒

取5ml 0.01％胶体金溶液加入0.2mol/L碳酸钾溶液10μL，充分混匀后加入100μg甲型肝炎病毒重组蛋白AV56，混匀，室温静置2小时后，加入500μl 10％BSA(牛血清白蛋白)溶液进行封闭，室温静置1小时，离心(10000rpm、20min)，弃上清后，沉淀用500 μl复溶液充分溶解。溶解后的金溶液采用喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将按照 10μl/cm均匀喷涂于6mm宽的玻纤上，后置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃鼓风干燥1小时。

相关溶液配方如下:

0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。

1％氯金酸溶液：AuCL₃.HCl.4H₂O粉末1g加超纯水溶解并定容至100ml。

1％柠檬酸溶液：柠檬酸晶体1g加超纯水溶解并定容至100ml。

复溶液：Tris碱6.057g溶解于800ml超纯水中，用适量HCL调节pH至8.0，加超纯水定容到1000ml。

实施例9：甲型病毒性肝炎诊断试纸条制备

将甲型肝炎病毒重组蛋白AV56多抗用包被液稀释至终浓度为1mg/ml，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1μl/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius，CN140)上，为C线。

将鼠抗人IgM单抗(杭州贤至生物科技有限公司)用包被液稀释至终浓度为1mg/ml，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1μl/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜 (Sartorius，CN140)上，为T线。

划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司) 中37℃鼓风干燥30分钟。

依次将硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫、吸水纸在PVC垫板上组装后切成宽4mm长条，装入卡壳后压紧。

包被液：Na₂HPO_4.12H₂O 17.9g，加双蒸水定容至1000mL(pH8.0)。

实施例10：甲型病毒性肝炎诊断试纸条操作步骤及标准

取甲型病毒性肝炎患者临床IgM阳性血清10份和阴性临床30份，用生理盐水稀释1000 倍后，100μL/孔上样，室温放置10min后，通过胶体金读数仪(杭州唯赞科技有限公司)读取C，T两线的颜色深度值，并且计算T/(T+C)。读数结果如附表一所示。如实验结果显示，基于本发明所制备的甲型肝炎病毒重组抗原AV56所建立的胶体金试纸条可快速有效鉴别诊断甲型病毒性肝炎的患者和正常人群。

实施案例11：试纸的特异性实验

按照甲型肝炎病毒试纸条操作方法，使用本发明试纸条检测100份阴性血清(临床已确定)，均未出现假阳，符合率为100％。

按照甲型肝炎病毒试纸条操作方法，使用本发明试纸条分别检测10份乙型肝炎病毒阳性血清标本，10份丙型肝炎病毒阳性血清样本，10份艾滋病毒阳性血清等，10份幽门螺旋杆菌病毒阳性血清，均无阳性产生。

结果表明，利用甲型肝炎病毒重组抗原AV56所制备的胶体金快速检测试纸条与人常见的基础疾病及其他病毒性疾病不会造成交叉反应，特异性良好。

附表一

SEQ ID No:1：甲型肝炎病毒重组蛋白氨基酸序列

SEQ ID No:2：甲型肝炎病毒重组蛋白核苷酸序列

序列表

<110> 杭州贤至生物科技有限公司

<120> 甲型肝炎病毒重组蛋白的制备及其快速检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Thr Pro Leu Ser Thr Gln Met Met Arg Asn Glu Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Glu Gly Pro Leu Lys Met Glu Glu Lys Ala Thr Tyr Val His Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Leu Thr Pro Leu Ser Thr Gln Met Met Arg Asn Glu Gly

35 40 45

Gly Gly Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Met Glu Glu Lys Ala Thr Tyr

50 55 60

Val His Gly Gly Gly Gly Leu Thr Pro Leu Ser Thr Gln Met Met Arg

65 70 75 80

Asn Glu Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Met Glu Glu Lys

85 90 95

Ala Thr Tyr Val His

100

<210> 2

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgaccccgc tgagcaccca gatgatgcgc aacgaaggcg gcggcggcag cgaaggcccg 60

ctgaaaatgg aagaaaaagc cacctatgtg catggcggcg gcggcctgac cccgctgagc 120

acccagatga tgcgcaacga aggcggcggc ggcagcgaag gcccgctgaa aatggaagaa 180

aaagccacct atgtgcatgg cggcggcggc ctgaccccgc tgagcaccca gatgatgcgc 240

aacgaaggcg gcggcggcag cgaaggcccg ctgaaaatgg aagaaaaagc cacctatgtg 300

cat 303

Claims (5)

1.一种甲型肝炎病毒重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.一种能编码权利要求1所述甲型肝炎病毒重组抗原的核苷酸，其序列如SEQ ID No:2所示。

3.一种含有权利要求2所述核苷酸的质粒载体。

4.一种含有权利要求3所述质粒载体的菌株。

5.权利要求1所述的甲型肝炎病毒重组抗原在制备甲型病毒性肝炎诊断试纸条中的应用。