SU1662352A3 - Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент активатора плазминогена тканевого типа - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к активатору человеческого плазминогена и новому штамму бактерий, трансформированному плазмидой PT - PATRP12 - продуценту активатора плазминогена тканевого типа. С помощью генно-инженерных приемов конструируют плазмиду PT - PATRP12, кодирующую 1 - 110 аминокислоты плазминогена. Полученной плазмидой трансформируют штамм E.COLI К12, путем многократного пересева отбирают клон, синтезирующий до 50 пг на 1 клетку в 1 день активатора тканевого плазминогена.

Description

Изобретение относитс  к активатору человеческого плазминогена и новому штамму бактерий, трансформированному плазмидой р :-рА1:гр12-продуценту активатора плазминогена тканевого типа.

П р и м е р 1 о Клетки меланомы че- ловека культивируют в 100 мл среды Игла, дополненной бикарбонатом натри  (конечна  концентраци  0,12%), 2 мМ глютамина и 10% инактивирован- ной нагреванием сыворотки плода коровы . Клетки промывают один раз фосфатным буфером и прибавл ют 0,3 мл среды, не содержащей сыворотки и мети онина. Добавл ют 75 мкКи (353)-ме- тионина, инкубируют при 37°С в течение 3 ч, затем среду удал ют и обра- батывают или специфическим 1 gG активатором тканевого плазминогена или 1 преиммунной сывороткой дл  иммуноосаж- дени . Продукты иммуноосаждени  подвергают электрофорезу в10%-ном SDS- акриламидном геле. Пластину гел  фиксируют , сушат и подвергают флюорографии .

Из клеток меганомы экстрагируют РНТС. Клетки центрифугируют, повторно суспендируют в 10 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 1,5 мМ MgCl2, ли- зируют добавлением NP-40 (конечна  концентраци  1%), а  дра осаждают центрифугированием. Надосадочный слой, содержащий всю РНК, очищают многократными экстракци ми фенолом и хлороформом. Концентрацию соли в водной фазе довод т до 0,2 М NaCl. Осаждают РНК добавлением двух объеCft

сэ

1чЭ

СО

ел ю

CN

мов этанола и хроматографируют на оли ro-d Т-целлюлозе. Выход от 10 г культивированных клеток меланомы составл ет 5-10 мг общей РНК и 50-200 мкг полиА мРНК.

ПолиА мРНК (200 мкг) фракционируют путем электрофореза через мочеви- ноагарозный гель: 1,75% агарозы, 0,025 М цитрата натри  (рН 3,8) и

6 М мочевины в течение 7 ч при 25 мА и 4°С. Гель разрезают лезвием. Индивидуальные тонкие слои в виде ломтиков расплавл ют при 70°С и экстрагируют дважды фенолом и один раз хло- роформоМо РНК осаждают этанолом и последовательно испытывают трансл цией in vitro в системе лизата ретику Лоцитов кролика, дополненной микросомами поджелудочной железы собаки еле дующим образом. Провод т трансл цию, использу  25 мкКи (358)-метионина и 500 нг РНК из каждого тонкого сло  гел  в 30 мкл среды, содержащей 25 мМ HEPES, 48,3 мМ хлористого кали , 10 мМ креатин фосфата, 19 аминокислот по 50 мМ каждой, 1,1 мМ хлористого магни , 16,6 мМ ЭДТА, 0,16 мМ дитиотрей- тола, 8,3 мМ гемина, 16,6 мг/мл креа- тинкиназы, 0,33 мМ хлористого кальци  0,66 мМ ЕДТА, 23,3 ИМ хлористого натри  . Инкубирование провод т при 30 С в течение 90 мин. Продукты трансл ции или иммуноосажденные продукты трансл ции анализируют с помощью электрофореза в 10%-ных полиакриламид ных гел х и додецилсульфате натри . Пластинки гелей фиксируют, сушат и подвергают флюорографии.

„

Полученные в результате продукты трансл ции из каждой гель-фракции им- муноосаждают. Наблюдаетс  одна основна  полоса иммуноосажденного полипептида , имеюща  молекул рную массу приблизительно 63000 дальтон.

5 мкг фракционированной в геле мРНК используют дл  получени  двут - жевой кДНК с помощью стандартных процедур . Фракционируют кДНК по размеру и 6%-ном полиакриламидном геле. Элект роэлюируют кДНК размером больше чем 350 основных пар (125 нг). 30 нг кДНК с деокси(С)остатками трансформируют в 300 нг плазмиды pBR 322 с деокси(С)остатками по PstI участку. Смесь затем трансформируют в Е. coli Ј12 штамм 294 (АТСС-31446). Получают приблизительно 4600 трансформантов.

Q

5

.

5

Диализируют 2 мг образца активатора тканевого плазминогена против 0,01% Твина 80 в течение ночи при комнатной температуре. Затем раствор ют лиофилизованный протеин в 12 мл 0,56 М трис-HCl буфера (,6), 8 М мочевины и 5 мМ ЭДТАо Восстанавливают дисульфидные св зи добавлением О,1 мл В-меркаптоэтанола. Эту реакцию провод т в азоте в течение 2 ч при 45°Со Восстановленные дисульфиды алкилируют карбоксиметилпроизводным при добавлении 1,0 мл 1,4 М йодуксус- ной кислоты в 1 н. NaOH, через 20 мин реакцию останавливают диализом против Твина 80 и лиофилизу ют. Лиофилизованный карбоксиметилиро- ванный протеин снова раствор ют в 3 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера (рН 7,5), прибавл ют трипсин (ТРСК) в соотношении 1:50 и выдерживают при 37°Со Второе добавление трипсина провод т через 12ч. Через 24 ч наблюдаетс  полное расщепление пептида.

0,5 мл образца нанос т на колонку высокого разрешени  Альтекс С-8 ультрасфера 5 мкм с двум  циклами. Устанавливают постепенный градиент ацето- нитрила (от 1 до 5% за 5 мин, от 5 до 35% за 10 мин, 35-50% за 30 мин). Элюент контролируют по двум длинам волн (210 и 280 нм).

После определени  последовательности примерно 25 лучших возможных пептидных пика объедин ют дл  получени  предварительной модели первичной структуры активатора тканевого плазминогена ,, Так получают несколько возмож ных зондов.

Индивидуально инокулируют колонии в отверсти  пластин микротитратора, содержащие LB + 5 мкг/мл тетрациклина после добавлени  ДМСО до 7% и хран т при -20°С. Выращивают две копии фонда колоний на нитроцеллюлозных фильтрах и фиксируют ДНК каждой колонии на фильтре.

Готов т 32Р-меченый ТС/ /СА/ /ТА/т /ТСССА зонд из синтетического олиго- мера. Фильтры, содержащие 4600 трансформантов , предварительно гибридизуют в течение 2 ч при комнатной температуре в 50 мМ натрийфосфата (рН 6,8), 5XSSC, 150 мкг/мл обработанной ультразвуком ДНК спермы лосос , 5х раствора Денхардта, Н)% формамида, а затем гибридизуют с 5к106 имп/мин меченого зонда. После инкубации в течение ночи

при комнатной температуре фильтры промывают 3 раза в 6xSSC, 0,1% SDS в течение 30 мин, один раз в 2xSSC, a затем экспонируют на рентгеновской пленке.

Выдел ют плазмидную ДНК из всех колоний, показывающих положительную реакцию гибридизации. Определ ют последовательности вставок кДНК этих клонов после субклонировани  фрагментов в М13 векторе мр 7. Одна вставка кДНК в клоне 25Е10 имеет ДНК, кодирующую активатор тканевого плазми- ногена. Клон 25Е10 имеет 2304 пары оснований в длину и наиболее длинную структуру, кодирующую протеин из 508 аминокислот (Молекул рна  масса 56756) и содержит 772 п.о.З нетранслируемой области„

50 мкг рРА25Е10 расщепл ют рест- риктазой PstI и выдел ют фрагмент 376 п.о. электрофорезом в 6%-ном полиакриламидном геле. 3 мкг этого фрагмента расщепл ют рестриктазой

Ddel в течение 1 ч при 37 С, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом. Полученные в результате Ddel липкие концы обрабатывают 5 единицами ДНК полимеразы I (фраг- мент Кленова)„ После экстракции фенолом и хлороформом ДНК расщепл ют 15 единицами рестриктазы Narl в течение 2 ч и подвергают электрофорезу в 6%-ном полиакриламидном геле. Извлекают приблизительно 0,5 мкг фрагмента размером 125 п.о. с тупым концом Narl. Этот фрагмент кодирует аминокислоты с номера от 69 до 110 зрелого протеина активатора тканевого плазминогена полной длины.

30 мкг рРА25Е10 расщепл ют 30 единицами Narl и 35 единицами Bglll в течение 2 ч при 37°С и подвергают реакционную смесь электрофорезу в

6%-ном полиакриламидном геле. Выдел ют приблизительно 6 мкг 1645 и.о. Narl-Bglll фрагмента.

Плазмида рае Ita RISRC  вл етс  производной плазмиды psR Cex 16, в которой Eco RI участки, проксимальные к trp промотору и дистальные к SRC гену, удал ют репарацией ДНК по- лимеразой I и встраивают самокомплементарный олигонуклеотид AATTATGAATTCAT, синтезированный по фосфотриэфирному методу. 20 мкг этой плазмиды расщепл ют EroRI, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают эта

5 0

5

0

5

0

5

0

нолом. Затем плазмиду разрезают 100 единицами нуклеазы SI при 16°С в течение 30 мин в 25 мМ ацетата натри  (рН 4,6), 1 мМ ZnCl2 и 0,3 М NaCl дл  создани  тупого конца с последовательностью АТС. После экстракции фенолом и хлороформом и осаждени  этанолом ДНК рестрицируют BamHI, провод т электрофорез в 6%-ном полиакриламидном геле и извлекают большой (4300 п.о.) фрагмент вектора.

Экспрессионную плазмиду собирают соединением 0,2 мкг вектора, 0,06 мкг фрагмента 125 п.о. с тупым концом Narl и 0,6 мкг фрагмента 1645 п.о. Nar-Bglll с 10 единицами Т4 ДНК ли- газы в течение 7 ч при комнатной температуре и трансформируют в E.coli штамм 294 (АТСС № 31446).

Плазмидную ДНК из 26 колоний выдел ют и расщепл ют рестриктазами Xbal и EcoRI.12 из этих плазмид содержат фрагменты 415 п.о. Xbal-EcoRI и 472 п.о. EcoRI. Анализ последователь ности ДНК подтверждает, что некоторые из этих плазмид имеют АТС, начальный кодон, правильно расположенный в начале аминокислоты номер 69 (серии), Одна из этих плазмид - продуцирует активатор тканевого плазминогена .

3 мкг ДНК лимфоцитов человека полностью расщепл ют различными эндо- нуклеазами, провод т электрофорез в 1,0%-ных агарозных гел х и перенос т на нитроцеллюггозный фильтр. Готов т Р-меченую ДНК в виде зонда из вставки 5 конца кДНК клона рРА25Е10 (фрагмент 230 п.о. Hpall-RSAl) и гиб- ридизуют с нитроцеллюлозным фильтром в течение 40 ч, затем фильтр промывают . Полученные данные свидетельствуют о наличии одного гена активатора тканевого плазминогена в человеческом геноме.

Реконструкци  полной кодирующей последовательности возможна с примене нием обычного Hhal участка рестрик- ционной эндонуклеазы, разделенного на два частичных клона рРА17 и РА25Е10. Из плазмиды рРА17 выдел ют рестрик- ционный фрагмент 55 п.о. Sau 3AI- Hhal, соответствующий аминокислотам 5-23. Из плазмиды рРА25Е10 выдел ют фрагмент 263 п.о. Hhal-Narl (кодирующий аминокислоты 24-110). Конструируют два синтетических деоксиолигонукле отида, которые реконструируют кодоны

л  аминокислот 1-4, включают кодон нициировани  трансл ции АТС и создают EroRI липкое окончание,, Эти три фрагмента затем св зывают вместе с образованием 338 п.о. фрагмента, коирующего аминокислоты 1-110. Этот фрагмент и фрагмент 1645 п.о. Narl- Bglll из рРА25Е10 затем св зывают по EcoRI и Bglll участкам плазмиды pLelPAtr р 103 дл  получени  плазмиды экспрессии pt-PAtrp12.

Выращивают E.coli K12 штаммW3110 (АТСС № 27325), содержащий плазмиду pt-PAtrp12,, и готов т экстракты дл  проб на фибринолитическую активность. Количество образовавшегос  плазмина определ ют измерением степени расщеплени  фибрина на агарозной пластине, содержащей плазминоген и фибрин. Плаз- мин дает четкую зону лизиса на фибри- новой пластине и площадь этой зоны коррелируют с количеством активатора тканевого плазминогена в образце. При испытании экстрактов из pt-PA trp12 клонов на активность активатора тканевого плазминогена используют пробы с фибриновой пластиной с образованием четкой зоны лизиса. Эта фиб- ринолитическа  активность ингибирует- с  анти-т-АП IgG, но не преиммунизи- руетс  IgG или антиурокиназа IgG. Экстракт, полученный из клеток, содержащих в качестве контрол  лейко- цитно-интерферонную плазмиду pLelFtrp 103, не показывает активности. Получают приблизительно 20 единиц экстрагированной активности на 10 клеток (дл  очищенного т-АЛ 90000 единиц Плуга 1 мг)„

Полученный штамм бактерий E.coli АТС С31446 характеризуетс  следующими свойствами.

Имеет гепотип endA, Thi, hsr, hsmЈ.

Растет в среде LB (10 г бактотрип- 5 г бактодрожжевого экстракта и 10 г хлорида натри  на литр среды).

Дл  хранени  на 3 мл LB ночной культуры добавл ют 2 мл 50%-ного глицерина , размешивают и замораживают в стерилизованных бутылочках при -20°С. П р и м е р 2. Колонию E.coli, содержащую плазмиду puRIPA0, выращивают в 5 мл среды роста LB, содержащей 20 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 37 °С. Аликвоту этой культуры разбавл ют 1:100 в 300 мл М9 среды, содержащей 20 мкг/мл ампициллина, и

5

0

5

0

5

0

5

0

5

выращивают при 37°С в течение 4 ч до плотности ОЕ550 0,419. Добавл ют триптофановый аналог индолакриловой кислоты до концентрации 30 мкг/мл. Инкубируют клетки 90 мин до плотности ОБ sso - 0,628. Клетки центрифугируют и повторно суспендируют в 0,8 мл 0,01 М трис-буфера (рН 8,0), содержащего 0,01М ЭДТА. Полученную суспензию интенсивно перемешивают 18 ч при комнатной температуре. Образцы центрифугируют и провер ют надосадочный слой на активность активатора тканевого плазминогена.

В табл.1 и 2 приведены результаты, полученные при активации плазминогена соответствующими экстрактами E.coli .

Генерируема  активность зависит от наличи  плазминогена (табл.1). Эта активность не вызываетс  предим- мунной сывороткой кролика, но она четко ингибируетс  антисывороткой, котора  была получена против активатора тканевого плазминогена, происход щего из очищенных клеток меланомы (табл.1 и 2). Это показывает, что экстракты E.coli дают активность по активации плазминогена, котора  ингибируетс  антителами против активатора тканевого плазминогена.

П р и м е р 3. Продуцирование т-АП с использованием ДГФР протеина с низким св зывающим сродством к МТТ.

Последовательность, кодирующую активатор тканевого плазминогена (ттАП) встраивают в плазмиду, содержащую мутантную ДГФР с низким св зывающим сродством к МТТ. Дл  этого три фрагмента из частично перекрывающихс  т-АП штазмид, рРА25Е10 и рРА17, и PURIPA (выше) получают следующим Образом.

Расщепл ют плазмиду рРА17 рестрик- тазой Ddel, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимераэы I, расщепл ют рестриктазой PstI, выдел ют фрагмент размером приблизительно 200 п.о., содержащий 5 терминальную последовательность т-АП. Получают второй т-АП фрагмент расщеплением puRIPA с помощью PstI и Narl, выдел ют фрагмент размером 310 п.о. Третий т-АП фрагмент получают расщеплением рРА25Е10 с помощью Narl и Bglll и выдел ют фрагмент размером 1645 п.о., который, кроме того, содержит большую часть кодирующей области т-АП и некоторое

количество З7нетранслируемых последовательностей .

Плазмиду рЕ342, котора  экспресси- рует НВУ поверхностный антиген, расщепл ют с помощью Hindlll, превращают Hindlll концы 4 в EcoRI концы путем добавлени  конвертера (AGCTGATTC). Эту ДНК разрезают PvuII и добавл ют RI св зки. Последующее расщепление EcoRI приводит к выделению фрагмента 348 п.о его клонируют в pBR322. Конструируют плазмиду экспрессии рН ER 348-Е путем клонировани  фрагмента 1986 п.о. полученного в результате гидролиза HBV с помощью EcoRI и Bglll, затем линеаризуют pRI-Bgl и EcoRI и ввод т фрагмент 348 п.о., представл ющий собой исходную область SV 40, a EcoRI участок pRI-Bgl модифицируют рЕ342 частичным гидролизом EcoRI, заполн   отщепленный участок с использованием фрагмента Кленова ДНК полимеразы I и св зыва  затем части плазмиды.. Полученную в результате плазмиду pE342URI гидролизованную EcoRI, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы I и расщепл ют BamHI. Путем электрофореза в акриламидном геле получают фрагмент размером 3500 п.о., экстрагиру- ют его фенолом и хлороформом, осаждают этанолом.

Полученный таким образом вектор р342Е 3500 п.о. св зывают с т-АП фрагментами размером около 2160 п.о., использу  стандартные методики. Вы- дел ют плазмиду, содержащую три т-АП кодирующих фрагмента в нужной ориентации , характеризуют и вырезают рЕ342-т-АП. Эту плазмиду гидролизу- ют SacII и обрабатывают бактериальной щелочной фосфатазой (BRL). Дл  обеспечени  ДГФР последовательности выдел ют фрагмент приблизительно 1700 п.о гидролизом SacII pEHeR (pEHeR  вл етс  плазмидой, экспрессирующей мутант ДГФР). Этот фрагмент встраивают в рЕ342-т-АП плазмиду дл  создани  pEdPAER 400 плазмиды, котора   вл етс  аналогичной pEHER за исключением того, что HBS Ag кодирующа  область заменена кДНК последовательност ми от т-АП.

Провод т трансфекцию рЕТРАЕ 400 XpETPER) в dhfr-CHO ДИХ В11 клетки и ДГФР+СНО К1 (АТСС CCL 61) клетки. Отбирают трансформированные dhfr клетки путем выращивани  на среде, лишенной глицина, гипоксантина и ти

0

0

5 ,.

5

0

5

0

5

мидина. Отбирают трансформированные ДГФР клетки выращиванием в 100 мМ МТТ. Колонии, которые возникают на соответствующей селекционной среде, выдел ют,, использу  клонирующие циклы , и размножают на той же среде до нескольких генераций.

Дл  амплификации клетки колоний

г

выращивают в среде, содержащей 5 10 10Г, 2,5 10s , 5-Ю5 и 106 нМ МТТ.

ДНК амплифицированных колоний выдел ют следующим образом. Промывают монослои в 150 мм пластинах 50 мл стерильного pBS и лизируют добавлением 5 мл 0,1%-ного SDS, 0,4 М СаС1А, 0,1 М ЭДТА (рН 8), через 5-10 мин экстрагируют фенолом, затем хлорофор-1 мом и осаждают этанолом. Осадок ДНК суспендируют в 1 мл (на 150 мм пластине ) 10 мМ трис/HCl, рК 8,1 мМ ЭДТА (ТЕ), добавл ют ГНК-азу до 0,1 мг/мл и инкубируют 30 мин при 37°С.

Затем прибавл ют SDS до О,1%s про- назу до 0,5 мг/мл, инкубируют 3-16 ч при 37°С, экстрагируют фенолом, хлороформом и осаждают этанолом. Осадок ДНК суспендируют в 0,5 мл воды, гидролиз уют рестрикционными ферментами и подвергают электрофорезу в 1%-ном агарозном геле, затем гель извлекают и окрашивают. После визуализации в ультрафиолетовом свете ДНК перенос т на нитроцеллюлозные фильтры, фильтры гибридизуют меченым SacII фрагментом ДНК размером 1700 п.о. плазмиды pEHER или Bglll фрагментом ДНК размером 1970 п.о, плазмиды PETPER.

Дл  трансфекции лишенных ДГФР клеток используют плазмиду pETPFR. Испытывают 21 колонию, которые выращивают на селективной среде (-ГТТ), детекцией на образование плазмина. Обнаруживают четыре клона, имеющих одинаковую или сравнимую т-АП секрецию.

Указанные субклоны в количестве 2-10 клеток помещают на пластины 100 мм в 50 нМ МТТ, еще раз селекционируют , отбирают два клона дл  дальнейшего исследовани  и называют их

1-15 и 18В-9.

Субклоны 1-15 и 18В-9 после выдерживани  примерно в течение 1-2 мес. испытывают,Дл  этого серийно разбавл ют очищенный т-АП и очищенный меченый йодом т-АП, происход щие из клеток меланомы, до концентрации от 12,5 до 400 мг/мл в буфере, содержатем забуферированный фосфатом солевой раствор (рН 7,3), 0,5% сыворотки бычьего альбумина, 0,01% Твина-80 и 0,02% NaNq. Образцы с соответствующими разбавлени ми среды прибавл ют к радиоактивно меченым белкам, инку« бируют в течение ночи при комнатной температуре в присутствии IgG фракции анти-т-АП антисыворотки кролика. Осаждают комплекс антиген - антитело путем абсорбции кеа-анти-кролик IgG иммунобусинок (Вио Рад) в течение 2 ч при комнатной температуре. Шарики отмывают и измер ют радиоактивность , осадков. Определ ют концентра ции путем сравнени  с внутренним стандартомо

Claims (1)

1. Амплифицированна  культура продуцирует до 50 пг на клетку в 1 день, т-АП. Формула изобретени 

   Штамм бактерий Escherichia coli АТСС 31446 (pt-pA)trp12 - продуцент активатора плазминогена тканевого типа.

   Таблица 1

   Активаци  плазминогена экстрактам из E.coli культур, содержащих P&RIPA

   Продолжение табл.1

   Процент активности вычислен вычитанием холостого опыта (0,043) из полученных величин и делением на полученную величину экстракта.

   Таблица2

   Плазминогенна  активаци  экстрактов EoColi культур pt-PAtrp12

   30

   Экстракт

   0,657

   (100)

   Экстракт (без плазминогена )

   0,043 (0)

   Экстракт плюс пред- иммунна  сыворотка

   Экстракт плюс анти- т-АП антитела

   0,665

   0,059

   101