JPS62240864A - エネルギ−伝達による分析物検出 - Google Patents

エネルギ−伝達による分析物検出

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JPS62240864A JP62034696A JP3469687A JPS62240864A JP S62240864 A JPS62240864 A JP S62240864A JP 62034696 A JP62034696 A JP 62034696A JP 3469687 A JP3469687 A JP 3469687A JP S62240864 A JPS62240864 A JP S62240864A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の要約） 分析物の存在を検出する方法が開示される。
この方法は分析物と結合構成要素からなる複合体の形成
を含む。結合構成要素はエネルギー伝達システムの第一
パートナからなる。複合体は報告構成要素と接触してユ
ニットを形成する。
報告構成要素はエネルギー伝達ソステムの第二パートナ
からなる。第一パートナと第二パートナは形成されたユ
ニット中に相互にフルスター半径内にある。ユニットは
前記パートナの一つ、即ち、エネルギー供与体によって
のみ吸収され得るエネルギーで照射され、次いで蛍光エ
ネルギーを放射する。このエネルギーの幾らかは前記パ
ートナの一方、即ち、エネルギー受容体により吸収され
、これも又蛍光エネルギーを放射する。しかし、エネル
ギー受容体の蛍光エネルギーはエネルギー供与体の蛍光
エネルギーよりもより長い波長を有し、かつ更に実質的
により大きな持続時間を打する。より長い波長における
又は与えられた時間間隔の後の蛍光の検出は分析物の存
在を立証する。
（産業上の利用分野） 本発明は、深色及び／又は遅発性蛍光放射の発生の際に
生成するエネルギー伝達により分析物の存在を決定する
方法に関する。第一エネルギーエミッタ（Ｅｌ）から発
する蛍光放射エネルギーは第二エネルギーエミッタ（Ｅ
、）によって吸収される。この第二エネルギー供与体タ
は第一エネルギーエミッタよりも長波長の蛍光放射エネ
ルギーを発生する。第二エネルギーエミッタは更に第一
エネルギーエミッタよりも実質的に長期間（遅発性的に
）蛍光を発生する。深色蛍光又は背景源からの蛍光放射
が減゛衰した期間の後の蛍光のどちらかの蛍光の検出は
分析物の存在を立証する。
（従来の技術） 分析物の生体外での検出方法は公知技術である。この方
法は抗体／抗原複合体の形成（免疫検出）、及び核酸複
合体の形成（ポリヌクレオチドハイブリッド形成）を包
含する。分析物は健全細胞又は細胞成分であることが出
来る。分析物の例は細菌、ウィルス、抗原、抗体、及び
ポリヌクレオチドである。
抗原（又は抗体）分析物の免疫検定法は充分に確立され
た技術である。この検定は抗原／抗体複合体の形成を包
含する。放射性免疫検定法（ＲＩ　Ａ）において、放射
活性同位元素を使用して分析物の存在を報告する。酵素
免疫検定法において、色原体又は酵素によって生成する
蛍光を使用して分析物の存在を報告する。幾つかの酵素
免疫検定法が最近使用されている。これらは酵素複合免
疫検定技術（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）と酵素結合免疫吸着検定
法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）を包含する。ＥＬ　ｒ　ＳＡ法は
抗原のサンドウィッチ法、抗体検定法、及び抗原の競合
検定法からなる。
サンドウィッチ技術を使用する代表的ＥＬＩＳＡ検定法
は支持体の表面に抗原を吸着することにより実施される
。試験検体を支持体に添加し、次いで抗原を抗体と複合
させる。未結合抗原は洗い流す。酵素結合抗体を添加し
、次いて支持体吸収抗体により遮断されない結合抗原の
異種決定基と反応させる。反応後、過剰の未結合酵素結
合抗体を洗い流し、次いで酵素の基質を支持体に添加す
る。着色物の生成は試験検体中に抗原の存在を示す。ラ
ボラトリ　マネージメント１９８０年８月第２１頁のＳ
、ベーカマンによる酵素免疫検定法を参照。
（発明が解決しようとする問題点） これら方法の欠点は一工程で実施する、即ち、抗体を抗
原に添加するか、又は抗原を抗体に添加することによる
検出を達成出来ない。一つ又はそれ以上の洗浄工程が抗
原に未結合の抗体を除去（又はこの反対）することを必
要とする。
更に、これらの方法の幾つかは、ある場合にはっきりし
ない結果を与えることがある競合キネティクスを含む。
　　標的ポリヌクレオチド分析物の存在を立証するため
ポリヌクレオチドプローブを使用するポリヌクレオチド
ハイブリッド形成検定法は公知方法である。ハイブリッ
ド形成は相補塩基結合に基づいている。単一鎖ポリヌク
レオチドプローブが単一鎖標的ポリヌクレオチドと溶液
培養される時に、これは支持体上で相補的塩基配列対合
の運動抑制して二重鎖ハイブリッド分子を形成する。こ
の二重鎖ハイブリッド分子は運動抑制されて支持体上に
留どまる間に未結合ポリヌクレオチドプローブ分子は洗
い流される。Ｍ、グルンシュタインとＪ、ウォーリス、
酵素学における方法、第６８巻、Ｒ，Ｗ。
Ｕ、　（＆ｉ）、１９７９年、第３７９〜４６９頁Ａ、
ｎ、デュンとＪ、サムプルツク、酵素学における方法、
第６５巻、第１部、１９８０年、第４６８〜４７８頁；
Ｄ、Ｃ，ウアードとＡ。
Ａ、ウアルドロップとＰ、Ｒ，ランゲル、欧州特許公報
第０．０６３，８７９号、１９８２年、１１月３日公告
、［改良ヌクレオチド及びこりを調製しかつ使用する方
法Ｊ　：Ａ、Ｊ、ベリイとＪ。
Ｂ、ベータ、診断薬、１９８４年、第１〜８頁、［伝染
性疾病のＤＮＡプローブ」；ウィーーシング　リーとジ
ェームス　し、ペニングトン、ラボラトリ　マネージメ
ント、１９８５年、４月、第２１〜２６頁、［組換型Ｄ
ＮＡテクノロジー：臨床微生物における幾つかの応用」
を参照。
ポリヌクレオチドプローブは一般にポリヌクレオチドセ
グメントとポリヌクレオチドに結合するシグナルセグメ
ントとからなる。プローブのポリヌクレオチドセグメン
トは塩基対合への能力、即ち、重要な配列、即ち、分析
物又は標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成能力
を有する。プローブのシグナルセグメントは分析物部分
の存在を立証可能とする手段を有しがつ生成する。この
手段は、例えば、蛍光、放射活性、色素、又は電子密度
であってよい。
標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法は、一般に
幾つかの工程を含み、その一つはハイブリッド形成ポリ
ヌクレオチドプローブの非ハイブリッド形成プローブか
ら分離することである。こり分離は、プローブ又は標的
のいずれかが固体支持体への運動抑制されることに上り
助長することが出来る。代表的には、二重鎖ポリヌクレ
オチドが標的ポリヌクレオチドを含むと思われる試料か
ら単離される。二重鎖ポリヌクレオチドは限定エンドヌ
クレアーゼ酵素消化によって小セグメント？こ切断され
、このセグメントはゲル電気泳動により分離され、次い
でこのセグメントはゲルから支持体、例えば、ニトロセ
ルローズ紙に移される。別法として、二重鎖ポリヌクレ
オチドは予めの酵素消化なしに支持体に直接固定される
。固定ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドプローブを
含む溶液と接触され、次いで支持体は約８０〜９０℃に
加熱されてポリヌクレオチド二重鎖を変性する。（二重
鎖は別法として、アルカリによって変性出来る。）かく
してシステムは変性標的ポリヌクレオチドとポリヌクレ
オチドプローブとを含有し、適切な温度に冷却されてバ
イブリド形成が生成される。バイブリド形成が完成する
のに充分な時間、それは１０分から数時間であることが
あり、この時間経過した後、固定標的ポリヌクレオチド
は洗浄されて総ての未結合ポリヌクレオチドプローブを
除去する。かくいてポリヌクレオチドプローブのシグナ
ル化部分が、直接に、例えば、放射活性又は蛍光により
、又は間接に、例えば、酵素反応により形成された色素
によるいずれかによって検出される。
この方法の欠点は、標的ポリヌクレオチドの存在が立証
される前に数工程を必要とすることである。即ち、標的
ポリヌクレオチドを支持体に固定し、標的ポリヌクレオ
チドをポリヌクレオチドプローブと接触し、更に総ての
未ハイブリッド形成ポリヌクレオチドプローブを支持体
から除去する必要がある。更に時間がかかり、この方法
は自動化になじみ難く、かつ再現可能な結果を得る為に
専門的技術を必要とする。更に、ハイブリッド形成と一
相システム中での標的ポリヌクレオチドの検出は不可能
である。
均質（一工程又は一相）核酸ハイブリッド形成検定を使
用して標的ポリヌクレオチドの存在を検出することによ
り１１り記欠点を克服することを求める一つの方法が報
告されている。この方法は第一と第二の単一鎖ポリヌク
レオチドをハイブリッド形成することからなり、この両
方は試料からの相補単−鎖ポリヌクレオチド標的と共に
光感性ラベルを包含し、その為に第一と第二ポリヌクレ
オチドの光感性ラベル間に非放射エネルギー伝達を引き
起こさない。少なくとも一つの光感性ラベルが吸収体／
発光体型のものであるため１、このラベルによって吸収
され、他の光感性ラベルの放射からのエネルギーは、異
なる波長で再放射される。これら第二放射は、第一と第
二単一鎖ポリヌクレオチドの両方のハイブリッド形成が
標的ポリヌクレオチドに対して起こる場合にのみ発生出
来る。試料中の標的ポリヌクレオチドの量は第二放射光
の量に関係する。ミカエル　ジェームス　ヘラ−１欧州
特許公報第０．０７０，６８５号、１９８３年、１月２
６日、を参照。
この方法の欠点は、標的ポリヌクレオチドの存在を検出
するために二つの分離ポリヌクレオチド鎖を必要とする
ことである。更に、この方法は化学発光触媒、吸収体／
発光体部分、及び化学発光触媒の存在において光放射生
成に効果的な化学発光試薬を必要とする。更に、光感性
う、ベルが末端ヌクレオシドの糖部分に結合するため、
ただ一つのラベルのみポリヌクレオチドプローブ当たり
に結合出来るのみである。更に、嵩高なラベルはラベル
に隣接する塩基のハイブリッド形成を妨害する。
均質検定によって標的ポリヌクレオチドの存在を検出す
るもう一つの方法が最近報告されている。この方法は標
的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドプローブとの間
にハイブリッドを形成することを含み、その際ハイブリ
ッドは２つの特定試薬に対し結合部位を有し、その１つ
は第一ラベルからなり、他は第ニラベルからなる。第一
と第ニラベルの相互反応は、この２つのラベル試薬が同
じハイブリッドに結合する時に、これらがこのように結
合しない時に比べて、測定可能な相異がある検出可能な
応答を付与する。ハイブリッド検定物の形成はこの２つ
のラベルを相互の反応距離内にもたらし、例えば、配列
触媒（酵素）の相互反応およびエネルギー伝達の場合の
ようにである。ラベルがハイブリッド形成プローブと結
合する時に区別可能な応答を付与するので、分離工程は
不要である。Ｊ。
Ｐ、アルバレラ等、欧州特許出願第０．１４４，９１４
号、１９８４年Ｉ■月２９日、を参照。
この方法は２つの主実施態様を有する。第一実施態様は
引き続き色を生成する成分の発生を含む。この実施態様
は２つの明確な化学反応の使用を必要とし、即ち、拡散
可能な媒介物を生成する第一ラベルの反応と、検出可能
な物を生成する媒介物と第ニラベルとの反応である。更
に、検出は溶液中の他の場所に比べて第一ラベル付近に
おいて、媒介物のより高い局部的濃度の形成と保持に依
存する。更に、両応性はポリヌクレオチドプローブに結
合する嵩高酵素分子の使用を必要とする。これら嵩高分
子は立体的に相互の「衝突」を引き起こすであろう。
第二実施態様はエネルギー伝達の実施態様を含み、即ち
第一ラベルから光量子の放射、例えば、蛍光であって、
これは第ニラベルによる光量子の吸収によって発生し、
放射を消すか第二放射を付与する。この方法は、挿入体
が第一ラベルである場合に、共有結合的にポリヌクレオ
チドプローブに結合するという欠点を有する。
更に、この方法は２つの複合体、即ちポリヌクレオチド
／ポリヌクレオチド複合体の形成、及び抗原／抗体複合
体の形成を必要とする。更に、放射光ｍ子の消失のため
、プローブの標的に対するハイブリッド形成は普通数％
以下にすぎず、かかる歩出の消光はあいまいな結果を６
たらすであろう。
蛍光検出はハイブリッド形成検定に広く使用される。蛍
光分光学において、液体又は固体相で存在する物質の測
定は既知スペクトル分布の放射線、例えば制限波長帯幅
の光を照射される。
その際発生する蛍光放射線は励起放射線よりも長い波長
を有し、かっこの放射線は測定される物質に特定のもの
である。蛍光放射線の強度の測定は測定される物質の定
ｍ化を構成する。ポリヌクレオチドプローブに結合する
蛍光部分は、高い強度、比較的長い波長（５００ｎｍ以
上）、高いストークシフト、及びハイブリッド形成能力
に反対に作用することの無くポリヌクレオチドプローブ
に共有結合的に結合される可能性を有する場合に最も効
果的である。芳香族剤を生物学的システムに使用すると
、より強い蛍光を付与しかつ比較的に安定であり、例え
ば、フルオレッセンイソチオサイアネイト（ＦＩＴＣ）
、ローダミン類（ＲＢＩＴＣ，ＴＩ？ＩＴＣ，ＲＢ−２
００−ＳＣ）、塩化デンンル（ＤＮＳ−ＣＩ）、及びフ
ルオレッスカミン（ＰＬ）である。
蛍光は一般に分光蛍光計により測定される。
分光蛍光計によるシグナル部分の検出用の電流方法の不
便は、その検出感度が、背景を増大する励起しかつ検出
するシステムにおける妨害蛍光又はノイズのために制限
されることである。
妨害蛍光は基質分子、非特定結合化合物の試料支持体、
空気粒子、及び生物学的システムの固有蛍光のような物
から発生する。背景もまた強い散乱によって影響され、
この散乱は、特に小さいストークシフト（５０ｎｍ未ｆ
４）の芳香族剤を使用する場合に妨害を発生する。
蛍光検出に関する背景問題の克服を試みる幾つかの研究
方法が記載されている。米国特許第４．０５８，７３２
号に記載される一つの研究方法は、ノイズ源の蛍光の期
間をかなり越える期間を有する蛍光発生の物質からなる
シグナル部分を使用して連発性蛍光を測定するものであ
る。レーザパルスが試料を励起するのに使用され、シグ
ナル部分からの蛍光の検出は、ノイズ源からの蛍光が減
衰した充分長い時間の後にのみなされる。この方法は商
業的使用にすぐに適用出来ず、かつ均質検定になじみに
くい欠点がある。
第二の研究方法は、Ｅ、ソイニと■、ヘミリア、米国特
許第４，３７４，１２０号に記載される乙のて、第一配
位子を抗体に結合し、ランタニド金属を第一配位子に複
合させ、かつ第二配位子をランタニド金属に複合させる
ことにより、抗原の存在を測定する方法を開示している
。抗原含有試料を支持体に固定し、次いで抗体を試料と
結合させ、未結合抗体を洗い流す。短時間の放射線パル
スが使用されて第二配位子を励起する。
エネルギーはこの配位子の３重状態からキレート金属へ
伝達され、このキレート金属はノイズ源よりも長い波長
と長い期間の放射線を放射する。この遅発性蛍光の検出
は抗原の存在を立証する。この方法は一工程で実施出来
ない欠点を存しており、総ての未結合抗体は支持体から
洗い流さねばならない。
（発明の目的） 本発明の目的は、エネルギー伝達システムの第一パート
ナからなる結合構成要素に分析物を複合させることによ
り、分析物を検出する方法を提供することにあり、その
際、複合体の形成は、第一パートナに近接距離内にある
エネルギー伝達ソステムの第二パートナからなる報告構
成要素の局部化を誘導し又は許すことにより、一方のパ
ートナにより発生するエネルギー、エネルギー供与体Ｅ
、が他方のパートナ、エネルギー受容体Ｅ、により吸収
可能とされ、かつその際、第二パートナにより発生する
蛍光エネルギーは、第一パートナにより発生する蛍光エ
ネルギーよりも長波長であり、更に第一パートナ又は背
景蛍光よりも実質的に大きな持続を存する蛍光を有する
。
本発明のもう一つの目的は、分析物を第一エネルギー放
射体（Ｅｌ）からなる結合構成要素に複合させて分析物
を検出する方法を提供することにあり、その際、複合体
の形成は、Ｅｌの近接距離内にある第二エネルギー放射
体（Ｅ、）からなる報告構成要素の局部化を誘導し又は
許すことにより、Ｅ、により発生するエネルギーが、Ｅ
、により吸収可能とされ、かつその際、Ｅ、により発生
する蛍光エネルギーは、Ｅｌにより発生する蛍光エネル
ギーよりも長波長であり、更にＥｌ又は背景蛍光よりも
実質的に大きな持続を有する蛍光を有する。
本発明の別の目的は、分析物を第二エネルギー放射体（
Ｅ、）からなる結合構成要素に複合させて分析物を検出
する方法を提供することにあり、その際、複合体の形成
は、Ｅ、の近接距離内にある第一エネルギー放射体（Ｅ
、）からなる報告構成要素の局部化を誘導し又は許すこ
とにより％　　Ｅｌにより発生するエネルギーが、Ｅ、
により吸収可能とされ、かつその際、Ｅ、により発生す
る蛍光エネルギーは、Ｅｌにより発生する蛍光エネルギ
ーよりも長波長であり、更にＥ、又は背景蛍光よりも実
質的に大きな持続を有する蛍光を有する。
本発明のもう一つ別の目的は、抗原をＥｔ（又はＥ、）
からなる特定抗体に複合させ、形成複合体をＥ、（又は
Ｅｔ）からなるＣｌｑ　（補体の）又はＥｌ（又はＥ、
）からなる第二抗体に接触させてユニットを形成し、Ｅ
、を適切なエネルギーで放射し、次いで発生蛍光を測定
することにより溶液中の抗原の存在を検出する方法を提
供するにある。
本発明の更に別の目的は、抗原を支持体に固定し、抗原
をＥｚ（又はＥ、）からなる特定抗体を含をする溶液と
接触して抗原／抗体複合体を形成し、前記複合体をＥ、
（又はＥ、）からなるＣｌｑと又はＥ、（又はＥｔ）か
らなる第二抗体と接触して構成要素を形成し、Ｅｌを適
切なエネルギーで放射し、次いで発生蛍光を測定するこ
とにより抗原の存在を検出する方法を提供することにあ
る。
本発明の別の目的は、Ｅ　ｔ　（又はＥｌ）からなる特
定抗体を支持体に固定し、この抗体を抗原を含有する溶
液と接触して抗原／抗体複合体を形成し、前記複合体を
Ｅ、（又はＥｔ）からなるＣｌｑ又はＥｌ（又はＥ、）
からなる第二抗体と接触して構成要素を形成し、次いで
発生蛍光を測定することにより抗原の存在を検出する方
法を提供することにある。
本発明の目的はまた、抗原をＥ、（又はＥ、）を結合し
た支持体に固定し、この支持体をＥ。
（又はＥ、）からなる抗体を含む溶液と接触し、抗体を
抗原と複合させ、Ｅｌに適切なエネルギーを放射し、次
いで蛍光発生を測定することにより抗原の存在を検出す
る方法を提供することである。
本発明の目的は更に、標的ポリヌクレオチドをＥ、から
なるポリヌクレオチドプローブにハイブリッド形成し、
Ｅ、を形成したハイブリッド中に挿入させ、Ｅ、を適切
なエネルギーで放射し、次いで蛍光発生を測定すること
により溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する
方法を提供することである。
本発明の目的はまた、標的ポリヌクレオチドを支持体に
固定し、この標的ポリヌクレオチドをＥ、からなるポリ
ヌクレオチドプローブを含有する溶液と接触してハイブ
リッドを形成し、Ｅｌを形成ハイブリッド中に挿入し、
Ｅｌを適切なエネルギーで放射し、次いで蛍光発生を測
定することにより標的ポリヌクレオチドの存在を検出す
る方法を提供することである。
本発明のもう一つ別の目的は、Ｅｔからなるポリヌクレ
オチドプローブを支持体に固定し、ポリヌクレオチドプ
ローブを標的ポリヌクレオチドを含む溶液と接触してハ
イブリッドを形成し、Ｅ、を形成ハイブリッド中に挿入
させ、Ｅｌを適切なエネルギーで放射し、次いで蛍光発
生を測定することにより標的ポリヌクレオチドの存在を
検出する方法を提供することである。
本発明の更にもう一つの目的は、標的ポリヌクレオチド
をＥ、（又はＥ、）を結合した支持体に固定し、支持体
をＥ、（又はＥ、）からなるポリヌクレオチドプローブ
を含有する溶液と接触し、標的ポリヌクレオチドをポリ
ヌクレオチドプローブにハイブリッド形成さけ、Ｅ、を
適切なエネルギーで放射し、次いで蛍光発生を測定する
ことにより標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法
を提供することである。
本発明の更に別の目的は、標的ポリヌクレオチドをハブ
テンからなるポリヌクレオチドプローブにハイブリッド
形成し、ハブテンに対し、又はＥｌ（又はＥｔ）からな
る特定の二重鎖ポリヌクレオチドに対して特定の抗体を
前記ハイブリッドに結合して複合体を形成し、前記複合
体をＥ、（又はＥ、）からなるＣｌｑと接触して構成要
素を形成し％ＢＩを適切なエネルギーで放射し、次いで
蛍光発生を測定することにより溶液中の標的ポリヌクレ
オチドの存在を検出する方法を提供することである。
（問題点を解決するための手段） 本明細書中には、均質又は一工程検定において分析物の
存在を検出する方法が開示される。
この検定は一相（液体）又は二相（液体と固体）のいず
れかで実施出来る。この方法はまず分析物を結合構成要
素と複合することからなる。結合構成要素と分析物を液
体相に溶解してよく、又はこれらの一つを固体支持体に
固定してよい。
液体相に溶解した又は固体支持体からなる報告構成要素
を次いで複合体と接触させてユニットを形成する。
分析物は抗原、抗体、又はポリヌクレオチドからなる。
結合構成要素は認識セグメントとシグナルセグメントと
からなる。認識セグメントは抗体、抗原、又はポリヌク
レオチドからなる。
シグナルセグメントはＥ、（エネルギー供与体）又はＥ
ｌ（エネルギー受容体）のいずれかからなる。報告構成
要素は、シグナル構成要素がなにからなるかによってＥ
ｌ又はＥ、からなる。結合構成要素と報告構成要素との
真の組成は、分析物の組成と検出を実施するために使用
した実施態様とによる。
ＥＩとＥ、はエネルギー伝達システムにおける２つのパ
ートナを構成する。Ｅ、とＥ、は蛍光芳香族剤又はラン
タニド金属のいずれかであることが出来る。Ｅｌが蛍光
芳香族剤である場合、Ｅ、は蛍光芳香族又はランタニド
金属であることが出来る。Ｅ、がランタニド金属である
場合、Ｅ、は蛍光芳香族剤であらねばならない。
ＩＥ　Ｉは常に最初のエネルギーを吸収し、次いでこの
エネルギーの幾らかをＣ２によって吸収された波長のエ
ネルギーで放射する。Ｅ、は次いでこのエネルギーの幾
らかをＥ、よりも長波長の蛍光として放射し、更にＥ、
及び背景蛍光の持続時間よりも比較的に長い持続時間の
蛍光を放射する。この深色及び／又は遅発性蛍光放射の
存在は分析物の存在を示す。
本発明は、分析物の存在を測定するための均質検定法を
開示する。均質検定法は、一工程検定法としても知られ
ており、分析物を検定媒体中の結合構成要素と報告構成
要素（及び他の成分）と接触することにより分析物の検
出を可能とする。未結合の結合構成要素を検定媒体から
検出の＋ＦＪに除去する必要なしに立つ達成出来る。
この方法は、第一エネルギー放射体、Ｅ、（エネルギー
供与体）、及び第二エネルギー放射体、Ｅ、（エネルギ
ー受容体）からなる。Ｅ、は、Ｅｌによって放射される
エネルギーの幾らかを吸収できる。結合構成要素の分析
物への複合体は、この形成複合体に報告構成要素を接触
させテユニットを形成する。このユニットのＦｆ３　ｒ
＆　ハ、ＥｌをＥ、の充分に近傍に置くため、Ｅ、にょ
って放射されるエネルギーはＥ、にょって吸収され得る
。Ｅ、はその吸収エネルギーをＥ、の蛍光よりも長波長
（深色）の蛍光として放射し、更に、Ｅ、（又は他の背
景蛍光）よりも実質的に大きな持続時間（遅発性）の蛍
光を放射する。
この深色及び／又は遅発性蛍光の存在は分析物の存在を
示す。
この方法は、例えば、抗原ハブテン、抗体、ホルモン、
酵素、又はポリヌクレオチドを含む分析物の検出に摘要
され、かっ一相システム、即ち、溶液において、又は二
相システム、即ち、固体支持体上の溶液において実施出
来る。検出は分析物と結合構成要素との間に複合体を形
成することにより実施される。
結合構成要素は認識セグメントとシグナルセグメントを
含存する。認識セグメントは分析物の一部に複合する結
合構成要素の部分である。
シグナルセグメントは、エネルギー伝達ンステムを形成
して結合構成要素によって分析物の認識を示すシグナル
を生成する際包含される部分である。分析物が抗原であ
る場合、結合構成要素は抗体膜なる。分析物が品体であ
る場合、結合構成要素は抗原からなる。分析物が標的ポ
リヌクレオチドである場合、結合構成要素は相補ポリヌ
クレオチドからなる。シグナルセグメントはＥ、又はＥ
、のいずれかからなる。Ｅｌは蛍光芳香族剤であること
が出来、Ｅ、は蛍光芳香族剤又はランタニド金属である
ことが出来る。
報告構成要素はＥｌ又はＥ、のいずれかからなる。シグ
ナルセグメントがＥ、からなる場合、報告構成要素はＥ
、からなる。シグナルセグメントがＥｘからなる場合、
報告構成要素はＥ、からなる。
検定の幾つかの実施態様において、総ての成分は溶液（
液体相）に溶解される。他の実施態様において、成分の
一つ又はそれ以上は固体支持体に固定され、一方残りの
成分は溶液に溶解される。多くの各種の実施態様を以下
に記載する。これらの実施態様は限定することを意味す
るしのでない。
１、分析物は抗体であり、結合構成要素は抗原とＥ、と
からなる。Ｅ、はＣｌｑ　（補体の）又は抗体に結合さ
れる。すべての成分は液体相に溶解される。
２、分析物は抗体であり、結合構成要素は抗原とＥ、と
からなる。ＥＩはＣｌｑ又は抗体に結合される。総ての
成分は液体相に溶解される。
３、分析物は抗原であり、結合構成要素は抗体とＥｌと
からなる。Ｅ、はＣｌｑ又は抗体に結合される。総ての
成分は液体相゛に溶解される。
４、分析物は抗原であり、結合構成要素は抗体とＥ、と
からなる。ＥｌはＣｌｑ又は抗体に結合される。総ての
成分は液体相に溶解される。
５、分析物は抗体であり、かつ固体支持体に固定される
。結合構成要素は抗原とＥｌとからなる。Ｅ、はＣｌｑ
又は抗体に結合される。
結合構成要素とＣｌｑ又は抗体との両方は液体相に溶解
される。
６　結合構成要素は抗原からなり、がっＥ、は固体支持
体に固定される。Ｅ、はＣＩｑＪこ結合される。分析物
とＣｌｑ又は抗体との両方は液体相に溶解される。
７、分析物は抗体でありかつ固体支持体に固定される。
結合構成要素は抗原とＥ、とからなる。Ｅ、はＣｌｑ又
は抗体に結合される。結合構成要素とＣｌｑの両方は液
体相に溶解される。
８、結合構成要素は抗原がらなりがっＥ、は固体支持体
に固定される。Ｅ、はＣｌｑ又は抗体に結合される。分
析物とＣｌｑ又は抗体との両方は液体相に溶解される。
９、分析物は抗原でありかつ固体支持体に固定される。
結合構成要素は抗体とＥｌからなる。Ｅ、はＣｌｑ又は
抗体に結合される。結合構成要素とｃ＋ｑ又は抗体との
両方は液体相に溶解される。
ＩＯ結合構成要素は抗体からなりかつＥ　ｌは固体支持
体に固定される。分析物は抗原である。Ｅ２はＣｌｑ又
は抗体に結合される。分析物とＣＩ（＋又は抗体との両
方は液体相に溶解される。
＋１．分析物は抗原でありかつ固体支持体に固定される
。結合構成要素は抗体とＥ、とからなる。結合構成要素
とＣｌｑ又は抗体との両方は液体相に溶解される。
＋２．結合構成要素は抗体からなりかつＥ、は固体支持
体に固定される。分析物は抗原である。ＥｌはＣｌｑ又
は抗体に結合される。分析物とＣｌｑ又は抗体との両方
は液体相に溶解される。
１３、分析物は抗体でありかつ固体支持体に固定される
。結合構成要素は抗原とＥ、とからなる。Ｅ、は固体支
持体に固定される。
結合構成要素は液体相に溶解される。
！４１分析物は抗体でありかつ固体支持体に固定される
。結合構成要素は抗原とＥ、とからなる。Ｅ、は固体支
持体に固定される。
結合構成要素は液体相に溶解される。
＋５．分析物は抗原でありかつ固体支持体に固定される
。結合構成要素は抗体とＥ、とからなる。Ｅ、は固体支
持体に固定される。
結合構成要素は液体相に溶解される。
１６、分析物は抗原でありかつ固体支持体に固定される
。結合構成要素は抗体とＥ、とからなる。Ｅｌは固体支
持体に固定される。
結合構成要素は液体相に溶解される。
１７、分析物は標的ポリヌクレオチドでありかつ結合構
成要素は相補ポリヌクレオチドとＥ、とからなる。Ｅ、
は挿入剤であるか挿入剤に結合されるかのいずれかであ
る。総ての成分は液体相に溶解される。
］８０分野物は標的ポリヌクレオチドでありかつ結合構
成要素は相補ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドに結
合するハプテン、及びハプテンに結合する抗体に結合す
るＥ。
とからなる。Ｅ、は挿入剤であり又は挿入剤に結合する
。総ての成分は液体相に溶解される。
′１９１分析物は標的ポリヌクレオチドでありかつ固体
支持体に固定される。結合構成要素は相補ポリヌクレオ
チドとＥ、とからなる。
Ｅｌは挿入剤であるか又は挿入剤に結合される。結合構
成要素とＥ２との両方は液体相に溶解される。
２０、結合構成要素は相補ポリヌクレオチドからなりか
っＥ、は固体支持体に固定される。
分析物は標的ポリヌクレオチドである。
Ｅｌは挿入剤であり又は挿入剤に結合される。分析物と
Ｅｌの両方は液体相に溶解される。
２１、分析物は標的ポリヌクレオチドでありかつ固体支
持体に固定される。結合構成要素は相補ポリヌクレオチ
ド、ポリヌクレオチドに結合するハプテン、及びハプテ
ンに結合する抗体に結合されるＥ、とからなる。
Ｅ、は挿入剤であらか又は挿入剤に結合される。結合構
成要素、抗体及びＥ、は液体相に溶解される。
２２、結合構成要素はポリヌクレオチド、ポリヌクレオ
チドに結合するノ１ブテンからなり、ハブテンに結合す
る抗体に結合されるＥ、は固体支持体に固定される。分
析物は標的ポリヌクレオチドである。Ｅ、は挿入剤であ
るか又は挿入剤に結合される。分析物、抗体、及びＥｌ
は液体相に溶解される。
２３、分析物は標的ポリヌクレオチドでありかつ固体支
持体に固定される。結合構成要素は相補ポリヌクレオチ
ドとＥ、とからなる。
Ｅ、は固体支持体に固定される。結合構成要素は液体相
に溶解される。
２４、分析物は標的ポリヌクレオチドでありかつ固体支
持体に固定される。結合構成要素はポリヌクレオチドと
Ｅ、とからなる。Ｅ。
は固体支持体に固定される。結合構成要素は液体相に溶
解される。
７′ ／′ 検定の方法は、螢光放射剤（Ｅｌ）、一般に芳香族剤を
照射し、その電子の幾つかを励起状態に飛び上がらせる
ことを含む。この剤はその電子が基底状態に戻った時に
螢光エネルギーを放射する。このエネルギーの幾らかは
、近傍のランタニド金属又は他の螢光芳香族剤（Ｅ、）
により吸収され得、次いでこのエネルギーの幾らかをま
た螢光エネルギーとして放射する。しかし、Ｅ２の螢光
エネルギーはＥ、の螢光より長波長（深色）において放
射され、更にＥ２の螢光エネルギーはＥ、の螢光よりも
より長く続き、又はＥ、の螢光に比較して「遅発性」で
ある。かくして、深色及び／又は遅発性螢光の検出は分
析物の存在を示す。
重要な限定はＥ、を励起するため使用される放射エネル
ギーはＥ、によってのみ吸収されねばならずＥ、によっ
て吸収されてはならず、かつＥｌは、結合構成要素が分
析物に複合された場合のみＥ２の所定近距離内にもたら
さ２する。
従って、Ｅ、とＥ２の濃度は、分析物が結合構成要素に
初めて複合されない場合でも相互の所定距離内に置かれ
る値であるべきでない。Ｅ。
とＥ２間の所定距離はフルスター半径位より大きくない
、好適には約３０Ａ以下であるべきである。
説明として、分析物が抗原である一つの相検定の例は、
認識セグメントとしての抗体及びシグナルセグメントと
してのキレート−ランタニド金属、並びにＣｌｑと螢光
芳香族剤（Ｅ、）とからなる報告構成要素を試料抗原か
らなる溶液に添加することである。Ｅ、とＥ２の濃度は
Ｅ２の任意拡散が、Ｅ２がＥ、によって放射されたエネ
ルギーを吸収出来るＥ、に充分に近距離に置かれないよ
うにすることである。抗体の抗原への複合体は、しかし
、Ｃｌｑを形成複合体に結合させる。このことは、Ｅ、
（Ｃｌｑに結合している）をＥ２の距離内にもたらし、
かくしてＥ、により放射されるエネルギーはＥ２により
吸収される。Ｅ、を適切な波長のエネルギーで照射する
ことは、Ｅ、が螢光エネルギーを放射するようにさせる
。このエネルギーの幾らかは、Ｅ２によって吸収され、
これは次いでこのエネルギーの幾らかをＥ、によって放
射される螢光エネルギーの波長に比較して長い波長の螢
光エネルギーとして放射され、かつまたある場合連発性
螢光エネルギーとしても放射される。次いでこの放射螢
光は測定可能である。若し試験抗原が試料中に存在しな
かった場合は、抗原と抗体からなり、これにＣｌｑが結
合可能であった複合体は形成されないであろう。かくし
て、ＥｌはＥ２に近接して位置されることもなく、Ｅ、
からＥ２に伝達されるエネルギーもなく、従って、螢光
エネルギー転位又は連発性螢光も観察されないであろう
。
分析物が抗原である２相検定の例は、Ｅ２からなる結合
構成要素を含む溶液を抗原が固定された固体支持体に添
加することである。Ｅ、は２つの方法の１つで付与され
る。第一の方法は、ＣｌｑとＥ、とからなる報告構成要
素の溶液に添加することである。報告構成要素は複合体
に結合してユニットを形成する。第二の方法は、連鎖ア
ームによって固体支持体にＥ、を結合することである。
抗原／抗体複合体を支持体上に形成してユニットを形成
するに際し、連鎖アームはＥ、がエネルギー伝達が起り
得るに充分に近距離にＥ２に対して位置させる。若し抗
原が試料中に存在しなかった場合、複合体は形成されず
、従って支持体に結合したＥ、は、エネルギー伝達がＥ
、からＥ２へ起り得たであろうのに充分近距離にＥ２に
対して位置しないだろう。
分析物が標的ポリヌクレオチドである１相検定の例は、
認識セグメントとしてポリヌクレオチドからなる結合構
成要素（ポリヌクレオチドのための結合構成要素は一般
にポリヌクレオチドプローブとして知られている）とシ
グナルセグメントとしてのキレート−ランタニド金属複
合体（Ｅ２　）　、並びに螢光芳香族挿入剤（Ｅ、）を
試験標的ポリヌクレオチドからなる溶液へ添加すること
である。ＥｌとＥ２との濃度は、Ｅ２の任意拡散がＥ、
によって放射されたエネルギーをＥ２が吸収出来るほど
充分にＥ、に近くに位置しないようにする程度である。
ポリヌクレオチドプローブを標的ポリヌクレオチドヘハ
イブリッド形成して標的ポリヌクレオチド／ポリヌクレ
オチドプローブハイブリッドを生成し、しかし、Ｅｌが
このハイブリッド中に挿入することは可能である。この
挿入はＥ、をＥ２の距離内にもたらすので、Ｅ、によっ
て放射されるエネルギーがＥ２によって吸収される。Ｅ
、を適切な波長のエネルギーで照射することにより、Ｅ
、は螢光エネルギーを放射するようになる。
このエネルギーの幾らかはＥ２によって吸収され、次い
でこのエネルギーの幾らかをより長波長の螢光エネルギ
ーとして、かつある場合には遅発性螢光エネルギーとし
て放射する。若し標的ポリヌクレオチドが試料中に存在
しなかった場合、Ｅ、が挿入できるべき標的ポリヌクレ
オチド及びポリヌクレオチドプローブからなるハイブリ
ッドは形成されないだろう。かくしてＥ。
に近接して位置するＥ、はなく、Ｅ、からＥ。
へ伝達されるエネルギーはなく、従って、螢光エネルギ
ー転位又は遅発性螢光は観察されないだろう。
分析物が標的ポリヌクレオチドである２相検定の例は、
Ｅ２からなるポリヌクレオチドプローブを含有する溶液
を標的ポリヌクレオチドが固定された固体支持体に添加
することである。
Ｅｌは２つの方法の１つにおいて付与される。
第一の方法は、螢光芳香族挿入剤からなる報告構成要素
の溶液に添加することである。第二の方法は、螢光芳香
族剤を連鎖アームによって固体支持体に結合することで
ある。この剤は挿入剤である必要はない。支持体上に標
的ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチドプローブハイブ
リッドの形成に際し、連鎖アームはＥ、を充分にＥ２に
近接して位置されるので、エネルギー伝達が起り得る。
もし標的ポリヌクレオチドが試料中に存在しなかった場
合、ハイブリッドは形成されないであろうし、従って、
支持体に結合されたＥ、ばＥ、に充分に近接して位置さ
れないので、Ｅ、からＣ２へのエネルギー伝達は起るこ
とばできないだろう。
第１ａ図は抗体とＣ２とからなる結合構成要素と、Ｃｌ
ｑとＥ、とからなる報告構成要素との溶液中の分析物の
検出を示す説明図、第１ｂ図は抗原とＥ、とからなる結
合構成要素と、ＣｌｑとＣ２とからなる報告構成要素と
を有する固体支持体に固定された分析物抗原の検出を示
す説明図、第１ｃ図は抗体とＣ２とからなる結合構成要
素と、固体支持体とＥ、とからなる報告構成要素とを有
する固体支持体に固定された分析物抗原の検出を示す説
明図、第１ｄ図は相補ポリヌクレオチドとＣ２とからな
る結合構成要素と、Ｅ、としての挿入剤からなる報告構
成Ｖ素との？′ｇ液中の分析物標的ポリヌクレオチドの
検出を示す説明図、第１ｅ図は相補ポリヌクレオチドと
Ｃ２とからなる結合構成要素と、固体支持体とＥｌとか
らなる報告構成要素とを１′１゛する固体支持体に固定
された分析物標的ポリヌクレオチドの検出を示す説明図
、第１ｒ図は相補ポリヌクレオチドとＣ２とからなる結
合構成要素と、固体支持体とＥ、とからなる報告構成要
素とを有する固体支持体に固定された分析物標的ポリヌ
クレオチドの検出を示す説明図、第２図はランタニド金
属からなるプローブを有する分析物の検出を実施するた
めに使用できる螢光針の回路略図である。
２、結合性実体の説明 Ａ、結合性実体は抗原または抗体からなっている １、　認識セグメント これは分析物（ａｎａｌｙｔｅ　）のセグメントの構造
もしくは形状を認識する結合性実体の部分であり、した
がってこの結合性実体によりアナライトとの錯体を形成
させることができる。分析物が抗原である場合、認識セ
グメントは抗体からなっている。分析物が抗体である場
合、認識セグメントは抗原からなっている。
抗体（Ａｂ）と抗原（Ａｇ）との反応は、免疫学の分野
で周知されかつ記載された反応である。抗原は２つの性
質、すなわち（ａ）免疫性（すなわち対応する抗体の形
成を刺戟する能力）および（ｂ）これら抗体に対し特異
的に反応する能力を有する。ハプテンは免疫性でない物
質であるが、これらは適当な特異性を有する抗体と選択
的に反応する。これらは抗原決定子を抗原分子に付与す
る。抗体は抗原に呼応して生成される蛋白質であり、こ
の抗原に対し特異的に反応する。全ての抗体は免疫グロ
ブリンと呼ばれる特殊な血清蛋白質の群に属する。
抗体は、抗原上の少なくとも１個の抗原決定子部位また
はエピトープに対し特異性である。
抗体は、免疫グロブリンを抗原に露出して作成される。
抗体の精製方法は、抗体／リガンド複合体の解離性に基
づいている。少な（とも２つの工程が一般に含まれる：
すなわち（１１抗体を可溶性抗原によって血清から沈澱
させ、或いは不溶性抗原物質によって吸収させる（後者
はしばしば小ハプテン群もしくは可溶性蛋白質をたとえ
ばアガロースのような不溶性マトリックスに結合させて
作成される）、および（２）外来血清を洗浄除去した後
に抗体を特異的もしくは非特異的過程によって不溶性複
合体から溶出させる。
特異的方法によって多数の抗体を精製することができる
。主として安定性が特異性のイオン相互作用に基づく集
合体（たとえば３型および８型の肺炎双球菌多糖類）を
用いれば、強力な塩溶液（たとえば１．８Ｍ　　ＮａＣ
１）は精製抗体を効果的に溶出する。特異的抗原決定子
がたとえば２．４−ジニトロフェノールのような簡単な
ハプテン群である場合、決定子の重要部分（たとえば２
．４−ジニトロフェノール）を含む小さい一価のハプテ
ンは沈澱抗原または吸着剤からの競合的排除に対し有用
であって、可溶性の抗体／ハプテン複合体を生成する。
抗原。
吸着剤およびハプテンの性質に応して、種々の方法を用
いることにより可溶性の抗体−ハプテン複合体を単離し
、かつ最後にハプテンを抗体から分離する（たとえば、
イオン交換樹脂、透析、ゲル濾過）。小さい一価のハプ
テンを抗原の特異的溶出に使用する場合、（１１抗体に
より弱く結合されかつ（２）高度に可溶性であるような
ハプテンを使用することが望ましい。次いで、高度に濃
縮したハプテンの溶液を用いて抗体を高収率で溶出させ
ることができ、かつ弱（結合したハプテンはたとえば透
析またはゲル濾過によって可溶性のハプテン−抗体複合
体から容易に分離される。
蛋白質抗原に対する他の抗体の単離には、非特異的方法
が使用される。一般に、特異性抗原／抗体の集合体を抗
体の可逆的変性を往ぜしめる条件に露出させて、これを
抗原から解離させる必要がある。しばしば、ｐＨ２〜３
の有機酸が有効である。次いで、各種の方法を用いて変
性された抗体および抗原をこれら抗原の性質に応じて分
ｇｌｆする。一般に抗体は生理的条件に復帰させるとそ
の原構造を取り戻すので、抗原を含まない物質の中和に
より一般に永久的変性に基づく過度の損失なしに活性な
抗体がｉｎられる。
抗体は血清から高収率（５０〜９０％）かつ高純度（回
収された抗体の９０％は一般に抗原に対し特異的に反応
する）にて単離しうるが、精製された分子は一般に親和
性並びに他の多くの物理的および化学的性質に関し不均
質となる。
抗原は、一般に蛋白質、多糖類またはポリヌクレオチド
で構成される。抗原を精製するには各種の方法を使用す
ることができる。これらはクロマトグラフィー、電気泳
動、遠心分離および免疫拡散を包含する。これらの方法
は当業者に周知されている。
２、信号化セグメント これは、エネルギ移動によって信号の発生に関与する結
合性実体の部分である。この信号はＥ、に関する深色団
螢光の放出、或いは遅延螢光の放出のいずれかで構成さ
れる。信号の存在は分析物の存在を示す。
信号化セグメントは認識セグメントに結合される。この
結合は、共有もしくは非共有手段によって行ないうる。
さらに、この結合はリンカアームを介して行なうことも
できる。信号化セグメントはＥ、もしくはＥ２のいずれ
かで構成される。Ｅ、は一般に螢光性芳香族試薬であり
、Ｅ２は螢光性芳香族試薬もしくはランタニド金泥のい
ずれかである。認識セグメントに対する信号化セグメン
トの結合の詳細につき、下記に説明する。
Ｂ、結合性実体はポリヌクレオチドからなっている １、　認識セグメント これは標的ポリヌクレオチドの構造を認識する結合性実
体の部分であり、かつポリヌクレオチドからなっている
。この種の結合性実体はポリヌクレオチドプローブとし
て当業界で知られている。標的ポリヌクレオチドは、ポ
リヌクレオチドプローブと複合化して標的ポリヌクレオ
チド／ポリヌクレオチドプローブのハイブリッドを形成
する。
ポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分は、
検出すべき基礎配列（標的ポリヌクレオチド）に対し実
質上相補的である少なくとも１つの一本鎖基礎配列から
なっている。この配列は、プローブに対し特異性を付与
する少なくとも約１２ｒｌＷの塩基で構成される。しか
しながら、この種の基礎配列は単一の連続相補ポリヌク
レオチド配列である必要はなく、非相補的配列により中
断された２個もしくはそれ以上の個々の相補的配列で構
成することもできる。さらに、プローブの相補的領域は
、たとえば繁殖のために同族配列が挿入されているベク
ターのＤＮＡもしくはＲＮＡからなるような非相補的配
列により３′−および５−末端で整列することができる
。いずれの場合にも、分析試薬として提供されるプロー
ブは、問題とする試料の核酸に対し１点もしくはそれ以
上の点にて検出可能なハイブリッド化を示す。
標的ポリヌクレオチドに対し実質上相補的なポリヌクレ
オチドの製造方法は、当業界で周知されておりかつ慣用
である。最も一般的ムこ使用される方法は、組換ＤＮＡ
およびクローン化の技術である。広く使用されている１
種のベクタ−はＭ　１３フアージである。要するに、こ
の方法は（ｌ１Ｍ１３ＲＦ（複製型）ＤＮＡをクローン
化ＶＪ域に独特の認識配列を有するｉｌ、ｌＪ限酵素の
１種で切断し、（２）所望のポリヌクレオチドを切断さ
れた挿入部位へ結合させ、（３）イー・コリ宿主菌体を
形質転換させ、（４）これら宿主菌体を栄養源含有のプ
レートで増殖させかつ無色のプラークを選択し、単一の
プラークからファージを少皿培養で増殖させ、（６）培
養上澄液からファージを収穫しかつフェノールでの処理
により蛋白コートを除去し、かつ（７）　精製されたＤ
ＮＡをエタノールで沈毅させることを含む。より詳細に
ついては、アメルシャム・コーポレーション社により出
版されたＭ１３クローン化および配列決定ハンドブック
（１９８３）、並びにコールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−社により出版されたＴ、マニアチス、Ｅ
、Ｆ、フリッチおよびＪ、サムプルツクによるモレキュ
ラ・クローニング（１９８２）に見ることができる。
さらに、特異性ポリヌクレオチドは、たとえばカリホル
ニア州９４４０４、フォスター・シティ−、リンカン・
センター・ドライブ８５０番地所在のアプライド・バイ
オシステムス社により製造されているようなりＮＡ合成
装置により、適当なヌクレオチド先駆体を用いて製造す
ることもできる。製造業者によれば、極めて特異性の大
きい約１２０〜２００塩基のポリヌクレオチドを製造す
ることができる。合成法は、ホスホルアミダイトを使用
して、所定の塩基を結合させることを含む。ポリヌクレ
オチド合成装置の他の製造業者は、カリホルニア州９４
９０１、サン・ラフアニル、ケルナー・プールバード２
９８０番地所在のバイオサーチ・インコーポレーション
社、およびカリホルニア州９４３０４、パロアルト・ペ
ージ・ミル・ロード１０５　（１地所在のベックマン・
インスッルメンツ社ヲ包含する。
さらにポリヌクレオチドは、二ツク拐１５尺の方法によ
っても製造することができる。この方法は、選択された
塩基を二重鎖ポリヌクレオチドから除去しかつその幾つ
かを他の所定の塩基で置換することを含む。しかしなが
ら、この方法は二重鎖プローブを生成する。本発明は、
下記するように二本の相補的ストランドの一方のみが分
析の際に存在する一本鎖プローブの使用をｄ・要とする
ので、プローブの２本のストランドを互いに分離せねば
ならない。これは、たとえばメチル化アルブミンカラム
を用いてカラムクロマトグラフィーにより達成すること
ができる。
しかしながら、この分離は、異なる比率のＧ−Ｃ／Ａ−
Ｔを有する２本のストランドに依存する。したがって、
プローブのＧ−Ｃ含有量が約５０％である場合、二フク
翻訳を用いてプローブを作成することはできない。
２、信号化セグメント これは、エネルギ移動により信号の発生に関与する結合
性実体の部分である。この信号は深色団および／または
遅延螢光の発生である。信号化セグメントは、結合性実
体の認識セグメントに結合される。信号化セグメントは
、直接にまたはリンカアームを介して認識セグメントに
結合することができる。さらに、信号化セグメントは共
有的または非共有的に認識セグメントに結合することも
できる。共有結合の例は、キレート剤／金属錯体がアリ
ルアミンによって相補的ポリヌクレオチドに結合させる
場合である。
了りルアミンはリンカアームである。非共有結合の例は
、キレート剤／金属錯体が抗体に共有結合される場合で
あり、抗体はハプテンに対し非共有結合され、ハプテン
は相補的ポリヌクレオチドに対し共有結合される。この
場合、ハプテンと抗体とはリンカアームを構成する。
信号化セグメントはＥ、もしくはＥ２である。
Ｅ、は一般に芳香族螢光放出剤である一方、Ｅ２は芳香
族螢光放出剤またはランタニド金属である。認識セグメ
ントに対する信号化セグメントの結合の詳細については
、下記に説明する。
３、　ポリヌクレオチドプローブの形態深色団および／
または遅延螢光放出は、ポリヌクレオチドプローブのポ
リヌクレオチドセグシフトが標的ポリヌクレオチドに対
しハイブリッド化した場合にのみ生ずる。螢光性におけ
るシフトまたは遅延は、ハイブリッドストランドの一方
が標的ポリヌクレオチドのストランドでない場合には、
ハイブリッドの存在下で生じてはならない。ポリヌクレ
オチドプローブのポリヌクレオチド部分がハイブリッド
化する標的ポリヌクレオチドは試料から生ずるものでな
ければならない。すなわち、ポリヌクレオチドプローブ
は一本鎖試料に供給されねばならず、供給された一本鎖
のいずれも互いに相補的であってはならない。ポリヌク
レオチドプローブが二重鎖試料に供給されかつ次いで試
料中で変性されれば、プローブの信号化セグメントは螢
光放出のシフト或いは遅延螢光性の発生を促進し、その
際一方のポリヌクレオチドプローブストランドは初期に
ハイブリッド化された相補的プローブストランドに対し
ハイブリッド化する。これは、間違ったプラスの結果を
もたらす。
ヘアピンループの形成も、報告用実体が挿入剤から構成
されていれば、間違ったプラスの結果をもたらす。これ
は、約３０個の塩基配列より長くないポリヌクレオチド
プローブを用いることにより、或いは分析を高温度にて
または厳格な条件下で行なうことにより最小化すること
ができる。
ポリヌクレオチドプローブは一律的ストランドからなる
ことが好ましい。すなわち、深色団および／または遅延
螢光放出は、２本のみのストランドのハイブリッド化に
際し信号化セグメントの補助によって発生せねばならな
い。これは、１個のみのポリヌクレオチドプローブ分子
を用いて標的ポリヌクレオチドを検出することを可能に
する。しかしながら、ポリヌクレオチドプローブが２種
の異なるポリヌクレオチドストランドからなる場合もあ
る。これは、たとえば各ポリヌクレオチドストランドが
異なる信号化セグメントを含有しかつ２本のポリヌクレ
オチドストランドが隣接する標的ポリヌクレオチド上の
非重複配列に対しハイブリッド化する場合である。各ス
トランド自身の信号化セグメントは、検出可能な深色団
および／または遅延螢光を発生せず、２個の信号化セグ
メントの相互作用が検出可能な深色団および／または遅
延螢光を発生する。このような状況も本発明に包含され
ると考えられる。
３、報告用実体 これは、結合性実体以外の実体であって、エネルギ移動
系の一つの相手を構成する。この相手はＥ、もしくはＥ
２のいずれかとすることができる。報告用実体と結合性
実体とは一緒になって単位を構成する。この単位はエネ
ルギ移動系を発生する手段を含む。何故なら、この単位
の１部分はＥ、からなりかつユニットの他の部分はＥ２
からなるからである。さらに、報告用実体は、分析に応
じてＣｌｑ、抗体、芳香族挿入剤または支持体のいずれ
かとしうる成分で構成される。報告用実体のエネルギ移
動相手は、Ｃｌｑまたは抗体のいずれかとじうろこの成
分に、或いは分析物が溶液である場合には芳香族挿入剤
に対し結合され、また分析物もくしは結合性実体が支持
体に固定される場合には支持体、に結合することもでき
る。Ｅ、は結合性実体が分析物に対し複合化する場合に
のみＥ２の所要の近距離内に運ばれねばならない。すな
わち、Ｅ、とＥ２との濃度は、好ましくはＥ２がＥ。
により放出されたエネルギを吸収しうるような距離内に
これら２種の相当な量をランダム拡散によって持ち込ま
ないようにせねばならない。
この量は、バックグランドを著しく増大させかつ正確な
測定を困難にするならば、重要であると考えられる。
Ｃｌｑは補体蛋白質の１種である。補体（Ｃ）は、現在
、１１種の蛋白で構成されることが知られている。これ
らの蛋白はヒトおよびその他のを推動物の正常な血清に
おけるグロブリンの約ｌθ％を占める。これらの蛋白は
免疫グロブリン（ＩＯＡ）でなく、免疫化によってその
濃度が増大しない。これらは広範な種類の抗体−抗原（
Ａｂ−Ａｇ）複合体と反応し、かつ主としてその作用を
細胞膜に及ぼして成る種の菌体の溶菌を生ぜしめると共
に、他の菌体においては機能的異常を生ぜしめ、たとえ
ばヒスタミンを放出しながら肥満細胞が顆粒崩壊し、細
血管の透過性が増大し、多形核白血球の移動に方向性が
生じ、白血球および大食細胞による食細胞活性が増大し
、さらに溶菌も増大する。補体における１１種の蛋白は
Ｃｌｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓおよびＣ２〜Ｃ９である。Ｃｌ
ｑは複合体の認識単位である。これは５種のサブ単位で
構成され、そのそれぞれは全Ｃ配列を誘発させうるよう
な１ｇ種類（たとえば、ＩｇＧ−１，ＩｇＧ−２，Ｔｇ
Ｇ−３，ＩｇＭ）の重鎮に対する１つの結合部位を有す
る。他のＣ蛋白と異なり、Ｃｌｑは安定な結合部位であ
って活性化を必要としない。このＣｌｑはコラーゲンに
対し極めて化学的に類似しており、すなわち高含有量の
グリシンとヒドロキシプロリンとヒドロキシリジンとを
有し、ガラクトースーグルコースニ糖類がヒドロキシリ
ジンのヒドロキシルに結合され、コラゲナーゼによって
失活させることができる。
ＥｌもしくはＥ２は、分析物が抗原もしくは抗体である
場合、Ｃｌｑに結合することができる。このＣｌｑは、
個々には抗原にも抗体にも結合しない。抗体に対する抗
原の複合化の後にのみ、Ｃｌｑは形成複合体に結合する
。したがって、たとえば分析を溶液中で行なう場合、Ｃ
ｌｑはＥ、はたはＥ２）を抗原分析物がＥ。
はたはＥｌ）からなる抗体結合性実体に対し結合される
場合にのみ、Ｅ２　　はたはＥｌ）の所要の距離内に移
動させる０分析物と結合性実体とＣｌｑとが存在すれば
、Ｅ、に対する適当なエネルギの照射はＥ、からＥ２へ
のエネルギの移動を生せしめる。ＥｌもしくはＥ２をＣ
ｌｑに結合させる方法は、下記するようなリンカアーム
を結合させるのに用いる方法と同様である。
Ｅ、もしくはＥ２は、分析物が抗原、抗体もしくはポリ
ヌクレオチドである場合、抗体に結合することができる
。分析物ポリヌクレオチドはＲＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／
ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを包含する。
抗体は、分析物または結合性実体のいずれにも個々には
結合しないものである。抗体は、分析物と結合性実体と
からなる複合体にのみ結合する。報告用実体は、したが
ってこの複合体に対する抗体とＥ、もしくはＥ２とで構
成される。
複合体にのみ特異性である抗体の分離は、当業者によっ
て容易に達成される。これは、同系交配種の動物から抗
体を単離しかつ特定抗原に対する耐性をこれら動物の一
方に生せしめることを含む。分析物／結合性実体の複合
体に対してのみ特異性であるような抗体を分離すること
ができる。Ｅ、もしくはＥ２は、下記する方法によって
特定抗体に結合させることができる。
Ｅ、もしくはＥ２は、分析物が抗原、抗体もしくはポリ
ヌクレオチドである場合、支持体に結合させることがで
きる。支持体はガラス、プラスチック、セルロースまた
はゲルマトリックス（たとえばセファロース）とするこ
とができる。Ｅ、もしくはＥ２は、リンカアームによっ
て支持体に結合させることができる。成る種の支持体は
、リンカアームの結合前にシリコン処理する必要がある
。
Ｅｌは螢光性芳香族挿入剤とすることができ、これは分
析物が標的ポリヌクレオチドである場合任意のその他の
成分には結合しない、これは、挿入剤がＥ２により吸収
されうる波長にて螢光を放出する場合である。Ｅ２が吸
収する波長にて挿入剤が放出しなければ、Ｅ、を芳香族
挿入剤に結合させることができる。Ｅｌは、リンカアー
ムによって挿入剤に結合させることができる。挿入剤は
、標的ポリヌクレオチド（分析物）とポリヌクレオチド
プローブ（結合性実体）とから形成されたハイブリッド
に挿入される。これは、Ｅ、をポリヌクレオチドプロー
ブの１部であるＥ２に隣接した二重Ｉｌ！＆ｌ旋の周辺
部に位置せしめることができる。Ｅ、からＥ２へのエネ
ルギ移動がかくして生ずる。事前のハイブリッド化なし
には、エネルギ移動が生じない。
４、　リンカアームの説明 Ａ、一般的説明 信号化セグメントは一般にリンカアームによって結合性
実体の認識セグメントに結合され、結合性実体の信号化
セグメントと認識セグメントとの間には最小限の立体干
渉が生じ、かつ信号化セグメントはＥ、をＥ２の所要間
隔内に位置せしめる。リンカアームは、信号化セグメン
トを認識セグメントに結合させる結合性実体における断
片を意味する。
Ｂ、認識セグメントが抗体もしくは抗原からなる場合の
リンカアーム この具体例において、リンカアームは螢光性芳香族試薬
またはキレート剤−金属錯体を抗体または抗原のいずれ
かに結合させる。しかしながら、リンカアームは、抗原
／抗体複合体の形成を阻害するものであってはならない
。
抗体および／または抗原は多数の第一および第ニアミノ
およびヒドロキシ官能基を含む。さらに、成る種の抗原
は１個もしくはそれ以゛上のスルフヒドリル基をも含む
。これら殆んどの官能基に対する電気親和性付加による
リンカアームの共有結合は、抗体／抗原複合体の形成を
著しく阻害しないであろう。何故なら、抗体の活性部位
は相対的に言って極く僅かのこれら原子を含むからであ
る。リンカアームが抗体もしくは抗原に結合しうる官能
基、およびその他のリンカアームの特徴については後記
Ｃに記載する。
Ｃ０認識セグメントがポリヌクレオチドからなる場合の
リンカアーム この具体例において、リンカアームは螢光性芳香族試薬
またはキレート剤−金属複合体をポリヌクレオチドに結
合させる。リンカアームは、標的ポリヌクレオチドに対
するポリヌクレオチドプローブのハイブリッド化を実質
的に阻害しないものとすべきである。したがって、リン
カアームおよび／またはキレート剤は、ｆａ）これが結
合する塩基がその相補的塩基と対を形成するのを妨げて
はならず、　（ｂｌ相補的塩基の複合化を妨げて標的ポ
リヌクレオチドに対するポリヌクレオチドプローブのハ
イブリッド化を妨げてはならず；（Ｃ）リンカアームが
ポリメラーゼ酵素により結合されるヌクレオチドの組込
みを妨げてはならず（これはポリヌクレオチド配列の末
端位置にある場合を除り）；かつ（ｄ）好ましくはポリ
ヌクレオチドにおける糖成分の構成を変化させてはなら
ない。
リンカアームは一般にポリヌクレオチドに対し共有結合
されるが、非共有結合成分で構成することもできる。こ
の結合は好ましくは塩基成分に対して行なわれるが、糖
成分または燐酸成分に対することもできる。塩基成分は
プリンであってもピリミジンであってもよい。上記した
ように、塩基成分に対するリンカアームの結合は、好ま
しくはリンカアームが塩基のワトソンークリック対を阻
害しないような位置とすべきである。たとえば、適する
位置はウラシルの位置５および６、シトシンの環外４−
アミノの位ＷＬ５および６、デアザプリンの位置７およ
び８、グアニンの位置８、並びにアデニンの環外６−ア
ミノの位置８である。塩基成分に結合するための好適リ
ンカアームはアリルアミンである〔ダビット・ワード等
による１９８２年１１月３日公開のヨーロッパ特許公報
筒０．０６３．８７９号参照。これをここに参考のため
引用する〕。
塩基上の好適位置はピリミジンの位置５および６、並び
にデアザプリンの位置７である。何故なら、８−プリン
ヌクレ吃チドはポリメラーゼ酵素に対し貧弱な基質であ
りかつアデニンもしくはシトシンの環外アミノ基はチミ
ンおよびウラシルに対する或いはグアニンに対する塩基
対に対しそれぞれ関与するからである。塩基の環外アミ
ノ基における置換基は、この塩基が成る場合にその相補
的塩基に対状となるのを妨げるが、この置換基は２つの
塩°基間の最適方向性を変化させる。好適ピリミジンは
ウラシルおよびシトシンであり、位置５が好適である。
好適プリンはデアザアデニンおよびデアザグアニンであ
る。
Ｄ、リンカアームの結合方法 認識セグメントが抗原である場合、所要のエピトープの
改変もしくは封鎖を生ぜしめない任意の条件で充分であ
る。認識セグメントが抗体である場合、抗体を変性させ
ずまたは活性部位の改変をもたらさない任意の条件で充
分である。
認識セグメントがポリヌクレオチドである場合、ハイブ
リッド化に必要とされる塩基における官能基の改変もし
くは封鎖或いは糖からの塩基の切断を生ぜしめない任意
の条件で充分である。
ｐＨ１温度、溶剤または反応時間を含む最適条件は、当
業者によって容易に決定することができる。
リンカアームは認識セグメントをキレート剤−金属錯体
へ或いは螢光性芳香族試薬へ結合する原子群で構成され
る。このリンカアームは、多くの方法によって認識セグ
メントへ結合させることができる。リンカアームは、認
識セグメントへ結合させうる第一官能基とキレート剤−
金属錯体または螢光性芳香族試薬へ結合させうる第二官
能基を持たねばならない。リンカアームは炭素−炭素単
一結合、炭素−炭素二重結合。
炭素−窒素単一結合、炭素−窒素二重結合、炭素−酸素
単−結合、炭素−硫黄単一結合または炭素−珪素単一結
合によって結合させることができる。適する官能基は、
限定はしないがアミノ基、チオ基、アルキルサルフェー
トおよびハライドを包含する。
リンカアームを１断片として認識セグメントに結合させ
る必要はない。リンカアームは、第１断片を認識セグメ
ントへ結合させ、次いで第２断片を第１断片へ結合させ
て゛作成することができる。適する第１断片の例は次の
通りであるニーＣＨ−ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ−； −−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２ＣＨ２−５Ｈｉおよび −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−０−ＣＨ，−ＣＨ，−ＮＨ適す
る第２断片の例は次の通りである：Ｎ−０−Ｃ−Ｒ；　
　　Ｒ−Ｃ−○Ｒ；Ｎ−ヒドロキシスフ　　　イミデー
ト シンイミドエステル Ｒ−Ｃ−０−Ｃ−Ｒ；　　Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ。
無水物　　　　イソチオシアネート および　　　　　Ｓ −Ｃ−３Ｒ チオエステル リンカアームをポリヌクレオチドの塩基に結合させる一
般的方法は、Ｊ、Ｌ、ルスおよびＤＥ、ベルゲストロー
ム、ジャーナル・オーガニック・ケミストリー、第４３
巻、第２８７０頁（１９７８）；Ｄ、Ｅ、ベルゲストロ
ームおよびＭ、　Ｋ、オガワ、ジャーナル・アメリカン
・ケミカル・ソサエティ、第１００巻、第８１０頁（１
９７８）：およびＣ，Ｆ、ビゲ、Ｐ、カラリチス、Ｊ、
Ｒ，デックおよびＭ、Ｐ、メルテス、ジャーナル・アメ
リカン・ケミカル・ソサエティ、第１０２巻、第２０３
３頁（１９８０）に検討されている。１つの好適方法は
、１９８２年１１月３日付けで公開されたダビフ）、Ｃ
。
ワード等によるヨーロッパ特許出願筒０．０６３．８７
９号に詳細に開示されたものであり、これを参考のため
ここに引用する。この方法は、リンカアームまたはαビ
ニル基を有するリンカアーム断片をに２ＰｄＣ１，の存
在下に水銀化された塩基と反応させることからなり、こ
こで水銀はＨｇ＋とじて、リンカアームと反応しうる塩
基の位置に結合する。これは次式によって示され、　る
： 〇− リンカアームについては、特定の寸法もしくは含有量の
限界は存在しない。リンカアームは約２個の炭素原子乃
至任意の個数の炭素原子を含むことができ、ただしキレ
ート剤は認識セグメントから所要の距離にあるものとす
る。リンカアームは異原子および不飽和を含むことがで
きる。このリンカアームは脂肪族、脂環式もしくは芳香
族成分からなることができる。リンカアームの実際の寸
法もしくは含有量は、これが結合する認識セグメントお
よび選択したキレート剤−金属錯体もしくは螢光性芳香
族試薬に依存する。
ポリヌクレオチドの糖成分に対するリンカアームの結合
は、所定塩基の説プリン化もしくは脱ピリミジン化の後
に１′アルデヒドに対するシッフ塩基によることができ
、或いは糖がトボースの場合には２′ヒドロキシとする
こともできる。１′アルデヒドに結合する場合、リンカ
アームはたとえばアミン５　ヒドラジンもしくはヒドラ
ジド官能化を含むことができる。この種の方法は１９８
５年８月１３日付けで出願されかつ同一出願人に譲渡さ
れたジャニス・スタブリアノプルスによる米国特許出願
第０６／　７６５．２８８号明細書に開示されており、
これを参考のためここに引用する。燐酸部分に対するリ
ンカアームの結合は、燐酸部分のアルキル化によって行
なうことができる（Ｐ、Ｏ，Ｐ、ツオおよびＰ。
Ｓ、ミラーによる米国特許第４．４６９，８６３号公報
参照。これを参考のためここに引用する〕。
リンカアームが塩基成分に結合される場合、これはヌク
レオシドもしくはヌクレオチドレベルにて塩基に結合す
るのが好適である。何故なら、リンカアームを塩基へ結
合させるのに必要とされる反応条件は、ポリヌクレオチ
ドに対し望ましくない副反応を生じうるからである。さ
らに、ポリヌクレオチドレベルにおける結合は一様でな
く、かつ再現性のない収率をもたらしうる。ヌクレオシ
ドもしくはヌクレオチドレベルにおける結合は、改変ヌ
クレオシドもしくはヌクレオチドを最初に精製し、次い
でポリヌクレオチド中へ組込むことを可能にする。この
組込みは、たとえばＭ１３ベクターにおけるクローン化
により、或いは上記のポリヌクレオチド合成装置での合
成によって行なうことができる。
Ｍ１３ベクターによる組込みには、改変ヌクレオチドは
一般に検討されている核酸ポリメラーゼに対し比較的効
果的な基質でなければならない。たとえば、リンカアー
ムは酵素における活性部位を立体阻害したり、或いは改
変ヌクレオチドの相補的塩基対を立体阻害してはならな
い。通常の「反」ヌクレオシド構成を変化させる位置で
の置換も避けねばならない。何故なら、この種の構成変
化は一般に改変ヌクレオチドをポリメラーゼ酵素に対し
貧弱な基質にするからである。
リンカアームを糖の１′アルデヒドに結合させる場合、
リンカアームはポリヌクレオチドプローブのポリヌクレ
オチド部分が形成した後に結合させねばならない。何故
なら、糖の結合はこの糖の１−位置に遊離アルデヒドを
必要とするからである。遊離アルデヒドは、脱プリン化
または脱ピリミジン化によって形成される。塩基なしに
糖と燐酸とからなる成分は、ポリメラーゼ酵素に対する
基質とならない。すなわち、リンカアームは、先ず最初
に所望のポリヌクレオチド配列を選択的に脱プリン化も
しくは脱ピリミジン化し、次いでこのリンカアームをア
ルデヒドによって糖へ結合させることにより結合させね
ばならない。リンカアームをリボース糖の２−ヒドロキ
シに結合させる場合、リンカアームはヌクレオシド、ヌ
クレオチドもしくはポリヌクレオチドレベルで結合させ
ることができる。何故なら、リンカアームにより改変さ
れたヌクレオチドは、遺伝子合成装置によってポリヌク
レオチド中へ組込みうるからである。リンカアームを燐
酸に結合させる場合、リンカアームは結合が燐酸以外の
位置で生じないようにヌクレオシドもしくはヌクレオチ
ドレベルで結合させねばならない。
５、　キレート剤の結合 キレート剤は、金属陽イオンを封鎖しかつ結合しうる成
分である。キレ−１・剤は、全屈に対し非共有的に作用
する２個もしくはそれ以上の官能基を有する。このキレ
ート剤は抗原、抗体。
ポリヌクレオチドもしくは支持体に結合することができ
る。抗体に対するキレート剤−金泥基の結合は当業界で
公知である（Ｅ、ソイニおよび■６ヘミリアによる米国
特許第４，３７４，１２０号。
これを参考のためここに引用する〕。ポリヌクレオチド
に対する金属−キレート化基の結合も当業界で知られて
いるＣＤ、エンゲルハルト等により１９８４年１月４日
付けで公開されたヨーロッパ特許公開第９７．３７３号
、１９８５年８月７日付けで公開されたＪ、スタブリア
ノプルスによるヨーロッパ特許公開第１５０，８４４号
、並びに１９８５年９月１８日付けで公開されたＪ。
スタブリアノブルスによるヨーロッパ特許公開第１５７
，７８８号参照。これらは本出願と同一の出願人に譲渡
され、ここに参考のため引用する〕。
限定を惹味するものでないが、キレ−）′ｆＦＪＪＯ例
はｔ−（ｐ−ヘンゼンジアゾニウム）ＥＤＴＡ（Ｉ）： から誘導しうるエチレンジアミンテトラ酢酸（Ｄ　Ｔ　
Ｐ　Ａ）、 ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ、）■　： および トランス−ジアミノシクロヘキサンテトラ酢酸（ＤＣＴ
Ａ　ン　　（ＩＩＩ）　　： である。
その他のキレート剤は、Ｌ、ストライヤー、Ｄ、Ｄ、）
−マスおよびＣ，Ｆ、メアレスによる「拡散促進される
螢光エネルギＪ　　（Ａｎｎ、Ｒｅｒ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇ　（１９８２）　、第１
１巻、第２０３７３２頁）に挙げられており、これを参
考のためここに引用する。
キレート剤は多数の基によってリンカアームに結合する
ことができる。これらの基の例は、限定を意図としない
が、次の通りであるニーＯ−，−ＮＨ−Ｃｏ、−Ｎｌ−
Ｔ−ＣＮＨ−。
−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎｌ（−Ｓｏ２＋、−５−。
−０−ＰＯ２−０−、−０３Ｏ，＋、−ＮＨ−Ｎ”Ｎ−
、−ＮＨＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ−。
−Ｎ−、−〇−ＣＨ２−、０−Ｃｏ−、−Ｎｔ（−Ｃｏ
−ＣＨ２−３−、−ＮＨ−Ｃｏ−ＣＨ２−ＮＨ−、−０
−ＣＨ２−ＣＨ２−０−、−０−ＣＯＣＨ２−、−３−
ＣＨ２−および−０−Ｃｏ−ＮＨ キレート剤をリンカアームに結合させるには種々の条件
を用いることができる。一般に、約４〜約１０、好まし
くは約５〜約８の任意のｐＨ範囲、約り０℃〜約１００
℃、好ましくは約り０℃〜約６５℃の任意の温度、任意
の溶剤および任意の緩衝剤もしくは触媒を用いることが
でき、ただしｐＨ，温度、溶剤もしくは緩衝剤は抗原。
抗体もしくはポリヌクレオチドの任意の基もしくは成分
を改変させないものとする。たとえば、ポリヌクレオチ
ドを脱プリン化しもしくは脱アミノ化しうるような試薬
もしくは条件は回避すべきである。さらに、反応時間に
ついても比較的制限が少ない。リンカアームに対しキレ
ート剤を結合させるための最適ｐＨ，温度、溶剤もしく
は反応時間は、反応させるべきリンカアーム。
キレート剤および官能性に依存する。これらの条件は、
当業者により容易に決定することができる。
これらの反応に必要とされる反応体の理論量は広範囲で
変化することができる。一般に、より容易に作成される
成分を過剰に用いて、キレート剤を抗原、抗体もしくは
ポリヌクレオチドに結合させる。実用上、この量は所要
の反応条件、キレート剤、リンカアームおよびその反応
性官能基に応じて変化する。
キレート剤は、リンカアーム含有のヌクレオチドがポリ
ヌクレオチド中・＼組込まれた後、或いはリンカアーム
含有のヌクレオチドがポリヌクレオチド中へ組込まれる
前に、リンカアームに結合することができる。唯一の制
限は、キレート剤がポリヌクレオチド合成を阻害しない
ならば組込み前に結合しえないことである。
結合性実体は、１個のキレート剤或いは１（ＩＮより多
いキレート剤で構成することができる。
認識セグメントがポリヌクレオチドである場合、キレー
ト剤はポリヌクレオチドプローブの末端位置または非末
端位置のいずれかに結合することができる。キレート剤
の個数が多い程、結合性実体の感度は大となる。しかし
ながら、キレート剤は、結合性実体に対する分析物の効
果的複合化が実質的に妨げられないような個数で存在し
てはならない。結合させうるキレート剤の個数は、認識
セグメントの組成２寸法および長さに依存する。
６、　ランタニド金属の説明 成る種のランタニド金属キレート化物は、芳香族化合物
よりも相当長時間にわたって螢光を発する。２種のこの
種のキレート化物は、約数ミリ秒にわたって螢光を発す
るヨーロピウムおよびテルビウムである。テルビウム（
Ｔ　ｂ　＋　３　）は４８０〜６３０ｎｍの範囲で螢光
を発し、かつヨーロピウム（Ｅｕ”　”　）は５８０〜
７００ｎｍの範囲で螢光を発する。両者は、そのアース
状態と最低の励起状態との間に禁止された移行特性を有
するので、長い励起状態の寿命を有する。これらランタ
ニドの吸光係数は、殆んどの螢光性有機発色団に対する
１０３〜１０５Ｍ−１ｃｍ−’　と比較して、０．１　
Ｍ　−１ｃｍ−’の程度である。この長い螢光性は、芳
香族化合物によるバンクグランドの螢光性が減衰した後
に、これら金属の検出を可能にする。これらの金運キレ
ート化物は、さらにその吸光性が極めて強力（約１０４
）であり、その最大励起が短いｕｖ範囲内にあり（テル
ビウムキレート化物は２７０〜３２０および約４８８ｎ
ｍにて励起する一方、ヨーロピウムキレート化物は３２
０〜３６０および約５８０ｎｍにて励起する）、その最
大励起は複合化リガンドとは無関係であると言う利点を
有し、このことは市販のランプもしくはレーザーによっ
て励起させることを可能にし、さらにその放出は狭いバ
ンド幅で監視することを可能にし、さらに種々異なる溶
液および異なる温度にてレーザーする能力を有する。
ランタニド金属キレート化物の螢光放出は、照射線励起
の近位リガンドもしくは芳香族化合物としうるエネルギ
吸収性物質によるエネルギの吸収、シングレット状態か
らトリプレット状態へのこのエネルギの変換、並びにエ
ネルギ吸収性物質から金属へのこのエネルギの移動から
生じうる。次いで、このエネルギは比較的長い間隔で、
金運に特徴的な狭いハンド幅および長い波長にて金属螢
光として放出される。テルビウムの螢光は緑色であるの
に対し、ヨーロビウムの螢光は紫色である。
７、螢光性芳香族試薬の説明 螢光性芳香族試薬はＥ、もしくはＥ２のいずれかとする
ことができる。Ｅ、である場合、これはＥ２によって吸
収されうる波長の螢光を放出せねばならない。Ｅ２であ
る場合、これはＥ。
によって放出されるよりも長い波長で螢光を放出せねば
ならない。Ｅ２の検出は、Ｅｌの全螢光放出を遮断する
が、より長い波長のＥ２の螢光を通過させうるようなフ
ィルタを用いて螢光を測定することにより行なうことが
できる。
Ｅ、とＥ２との両者が螢光性芳香族試薬である場合、上
記に示した基準を満たす試″′Ａセの任意の組合せで充
分である。Ｅ、が螢光性芳香族試薬でありかつＥ２がラ
ンタニド金属である場合、分析物が標的ポリヌクレオチ
１ごであれば、結合性実体はたとえばトリプトファンを
Ｅｌとして構成することができる。１−リプトファンは
エネルギをＥ２へ効果的に移動させうろことが示されて
いる。ポリヌクレオチドに結合された単一のトリプトフ
ァン残基でさえ優秀なＥ、である。
何故なら、約３３０　ｎｍに集中するその螢光放出は、
ランタニド金属を包含する多くの有力なエネルギ受容体
の吸収に重なるからである（Ｗ。
Ｄ、ホルロック、ジュニア、Ｂ、ホルムキストおよびＢ
、Ｌ、バレーによるプロシーディング・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス、ＵＳＡ（１９７５）、第７２巻
、第４７６３−６８頁に記載された論文参照。これをこ
こに参考のため引用する］。分析物が抗原もしくは抗体
でげ）る場合、螢光性芳香族試薬は、たとえばルミクロ
ーム、９−アミノアクリジンおよびオーロミンー０とす
ることができる。
螢光性芳香族試薬は、適当な官能基によってリンカアー
ムに結合される。この種の方法は上記した通りである。
８、挿入剤の説明 多数の螢光性芳香族試薬または染料は、二重鎖ポリヌク
レオチド螺旋中に挿入することができる。二重鎖ポリヌ
クレオチドはＤＮＡ／ＤＮＡ。
ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡとすることができ
る。これらの試薬は、二重鎖螺旋中に挿入された後、螢
光放出のシフトを示す。このシフトは、これら試薬の疎
水性環境における変化によって引き起こされる。
一般に、挿入剤は芳香族染料である。これらの挿入用芳
香族染料は平面リング構造を有し、かつ明確な螢光放出
スペクトルを有する。螢光は挿入剤の電子非局在化を示
し、かつ染料に結合された置換基の誘発作用および急冷
剤によって影習を受ける。
挿入の結果、隣接する塩基対がその正常な分離距離の約
２“倍まで広げられて、二＠鎖分子の分子長を増大させ
る。さらに、約１２〜３６゜の二重螺旋を巻き戻して、
挿入剤を収容せねばならない。その一般的検討およびそ
の他の情報についてＪ、レルマン、ジャーナル・モレキ
ュラ・バイオロジー、第３巻、第１８頁（１９６１）　
　；ブルームフィールド等、「核酸の物理化学」、第７
童、第４２９〜４７６頁、ハーバ−・アンド・ローウニ
、ニューヨーク（１９７４）；ワーリング、ネイチャー
、第２１９巻、第１３２０頁＜１９６ｓ＞；ハルトマン
等、アンゲバンテ・ヘミ−１英語版、第７巻、第６９３
頁（１９６８）、リバード、Ａｃｃｔｓ、　Ｃｈｅｍ、
　Ｒｅｓ、、第１１巻、第２１１頁（１９７８）、ウィ
ルソン、挿入化学（１９８２）、第４４５頁−並びにベ
ルマン等、アニュアル・レビュー・ハイオフィジンクス
・バイオエンジニアリング、第１０巻、第８７頁（１９
８１）から、さらに上記米国特許出願第５６０．４２９
号から得ることができる。
挿入剤の例はアクリジン染料、たとえばアクリジン・オ
レンジ、フェナンスリジン、たとえばエチジウム、アン
トラサイクリン、たとえばアドリアマイシン３フエナジ
ン、フロクマリン。
フェノチアジンおよびキノリンである。
９、分析物 Ａ、抗原および抗体 この方法は大抵の抗体および抗原を検出するために使用
することができる。抗体はモノクローナルもしくはポリ
クローナルのいずれとすることもできる。抗原のエピト
ープは蛋白、炭水化物またはその両者で構成することが
できる。
抗原は、１単位ま゛たは多数のサブ単位で構成すること
ができる。抗原は微生物、植物細胞または哺乳動物細胞
からのものとすることができる。
微生物は細菌、真菌類、ウィルスまたは酵母とすること
ができる。抗原は微生物もしくは細胞のエピトープとす
ることができ、或いは微生物もしくは細胞により分泌さ
れた生成物であってもよい。抗原はたとえば膜リセプタ
５血球または筋肉蛋白とすることができる。
Ｂ、標的ポリヌクレオチド この方法は、たとえば微生物、植物細胞または哺乳動物
細胞からの標的ポリヌクレオチドを検出するために使用
することができる。この微生物は細菌、真菌類、ウィル
スまたは酵母とすることができる。標的ポリヌクレオチ
ドは特定の病原性ウィルスに対し独特なもの、非官能性
蛋白の産生をもたらす突然変異哺乳動物遺伝子に存在す
るもの、或いは抗生物質耐性を細菌に付与するものとす
ることができる。たとえば、これはペニシリン耐性をス
トレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはナイセリア・メニン
ギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉ　ｔｉ
ｄｉｓ）に付与するもの；テトラサイクリン耐性をスフ
フィロコツカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）　、キャンシダゝアルビカン
ス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）　、シュウト
モナス６エアルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ
ｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレブトコ・ンカス・ピオゲ
ネス（Ｓｔｒｅρｔｏｃｏｃｃｕｓρｙｏｇｅｎｅｓ）
またはナイセリア・ゴルア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏ
ｎｏｒｒｈｏｅａｅ　）に付与するもの；並びにアミノ
グリコシド耐性をミコバクテリウム、ツバキュロシス（
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
）に付与するものとすることができる。
Ｃ０分析物原料 分析すべき試験試料は興味ある任意の媒体とすることが
でき、一般に医学、獣医学、環境。
栄養もしくは工業上の意義を有する液体試料である。ヒ
トおよび動物の試料並びに体液を本発明の方法によって
特に分析することができ、それらには尿、血液（血清も
しくは血漿）、羊膜液、ミルク、髄液、唾液、糞、肺吸
引物、咽腔綿棒試料、生殖器綿棒試料および滲出液、　
ＨＴｉｋ内綿棒試料およびＩｈ咽膣腔吸引物包含する。
患者またはその他の試験すべき原料から得られた試験試
料が主として細胞内に含をされるような二重鎖核酸であ
る場合は、この試料を処理して核酸を変性させ、かつ必
要に応じ最初に核酸を細胞から放出させる。核酸の変性
は好ましくは沸とう水中での加熱或いはアルカリ処理（
たとえば０．ＩＮ水酸化ナトリウム）で行なわれ、これ
を必要に応じ同時に細胞を熔解させるために使用するこ
とができる。さらに、核酸の放出は、たとえば機械的破
壊（凍結／解凍、磨砕、音波処理）、物理／化学的破壊
（たとえば、トリトン、ツイーン、ドデシル硫酸ナトリ
ウムのような洗剤、アルカリ処理、浸透圧ショックまた
は加熱）、或いは酵素的熔解（リゾチーム、プロテナー
ゼに、ペプシン）で行なうことができる。
得られる試験媒体は一本鎖型で核酸を含有し、これを次
いで本発明のハイブリッド化法によって分析することが
できる。
この方法は、たとえば海洋性貧血症および鎌状血球貧血
症のような遺伝子障害の診断にも拡大することができる
。その存在および不存在（海洋性貧血症の場合）が障害
に関連するポリヌクレオチド遺伝子を本発明によるポリ
ヌクレオチドプローブとのハイブリッド化の後に検出す
ることができる。
染色体上の特定位置に対する遺伝子またはその転写物の
地図化は面倒でありかつ時間の要する作業であって、主
として細胞融合および体細胞遺伝学の技術を含む。たと
えばショウジヨウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｔｌａ）のよう
な染色体ボリテニ化を受ける動物種類にて単一コピーの
遺伝子配列を地図化するにはその場でのハイブリッド化
が好適に使用されているが、殆んどの高級真核染色体に
おける独特な配列遺伝子の検出は、標準ハイブリッド化
法を用いては不可能でないにしても極めて困難である。
ハイブリッド化部位の放射能写真による位置決定を容易
化させるには極めて高特異性の放射能を有するポリヌク
レオチドプローブを必要とする結果、ポリヌクレオチド
プローブの急速な放射能分解をもたらすと共に、銀粒子
付着によるバックグランドノイズを増大させる。低〜中
庸の特異性放射能を有するハイブリッド化プローブの使
用は、たとえばリポソームＲＮＡ遺伝子またはサテライ
トＤＮＡのような多コピー配列を検出する場合にも多く
の日数の露出時間を必要とする。組換ＤＮＡ技術が真核
細胞に見られるほぼ全ての単一コピー配列の分子クロー
ン化を可能にしているので、この種のクローン化ゲノム
断片の染色体源を地図化するための迅速かつ鋭敏な方法
を有することが極めて有利である。
最後に、ＩＩ！ｌ’！細胞は本発明によるポリヌクレオ
チドプローブを作成して診断することができ、このポリ
ヌクレオチド試料は、たとえば胎児蛋白抗原もしくは胎
生期癌抗原のようなポリペプチドの産生に関連するデオ
キシリボ核酸遺伝子配列から転写されたメソセンジャー
リボ核酸に対し相補的であり、その存在は特異的腫瘍細
胞の診断となる。プローブ／標的ポリヌクレオチドハイ
ブリッドのハイブリッド化および検出は、腫瘍細胞の検
出方法を提供する。
１０、遅延螢光の検出 遅延螢光の検出は第２図に示した装置によって測定する
ことができる。この装置はエルツキ・ソイニおよびハン
ヌ・コヨラによって開発されたものである〔クリニカル
・ケミストリー、第２９／１巻、第６５−６８頁（１９
８３））。
試料の分室を遮光型で覆い、かつ試料を手で交換する。
これら試料をポリスチレン製の小型使い捨てチューブも
しくはキュベツトに入れ、これら容器は合理的には長期
Ｉｌ衰の低バツクグランド螢光を有するものである。キ
セノンフランシュチューブからの単一フラッシュの強さ
は大して再現性がないので、励起装置の安定化を確保せ
ねばならなかった。半導体光ダイオードの積分器（ＰＩ
）はフラッシュランプの安定器として作用する。このフ
ラッシュランプを１ｋＨｚの周波数にて約１０”倍に活
性化させる。フラッシュの正確な数（Ｎ）は、光子放出
の積算強度が固定されるように積分器Ｐ１によって制御
する。安定化検出器としては光ダイオード〔モデルＵＶ
−２１５Ｂ型、ＥＣ・アンド・Ｇインコーポレーション
社、エレクトローオブテソクス部門、マサチューセソッ
州０１９７０．ザレム、コンクレソス・ストリート３５
番地〕を使用し、これを光起電方式で操作しかつ光フア
イバーガイドによって光学系に接続する。積分器は、フ
ラッシュチューブ回路に制御信号を供給する操作増＠器
で作成される。フラッシュチューブからの積算光子放出
はこの方法によって安定化され、単一フラッシュの強さ
変動が±５０％以下であると仮定すれば精度は±（１／
Ｎ）×１００％である。
この安定化法は多くの利点を有する。先ず第１に、この
装置はＷ１単であり、フラッシュチューブとその電力供
給を安定化回路の必要なしに行なうことができ、さらに
安定性の低い安価なフラッシュチューブを使用すること
ができる。
この装置の温度依存性は、単一の補償部材によって最小
化することができる。フラッシュチューブは測定の際に
のみ操作され、したがって長い使用寿命を確保する。フ
ラッシュチューブの最終的疲労は、積分器によって自動
補償される。
この螢光測定装置に使用するパルス光源は、１．５盲腸
アークキャップを備えるＦＸ−１９８バルブ型のキセノ
ンフラッシュチューブとした（ＥＣ・アンド・Ｇインコ
ーポレーション社）。
ＥＣ・アンド・Ｇライト−バック・トリガー・モジュー
ルは、フラッシュチューブを作動させるのに要する高電
圧のトリガーパルスを発生した。このフランシュチュー
ブ装置を＋６００Ｖで操作し、フラッシュ時間を０．５
　ｕ　ｓとした。
最適な励起および放出バンドを与えるため、芦易にかつ
迅速に交換するための試料分室内に装着した緩衝バンド
−通過フィルタを用いた〔フェロパームＡＳ社、コペン
ハーゲン、デンマーク国〕。
検出器は側部窓の光電子増倍管〔モデルＲ９２８；浜松
ＴＶ株式会社、日本国、浜松イチョノ町１１２６番地在
〕とし、これを負バイヤス電圧で操作して陽極とアース
との間に直接的アナログ信号を得た。これは、螢光の全
量を監視しかつカウンタ飽和の指示を得るのに実用的な
装置であることが判明した。
単一光子方式で操作する光電子増倍管を迅速プレアンブ
リファイヤおよび弁別器に接続し、さらに７桁のデジタ
ル表示を有する迅速目盛に接続した。ランダム事象の計
数速度は、プレアンブリファイヤおよび単一光子弁別器
によって４０ＭＨｚに制限される。
Ｊｌ、分析物の検出方法 Ａ９分析物が抗体もしくは抗原である場合抗原または抗
体は、一般に循環する体液から精製される。さらに、抗
原の検出は細胞の溶解を含む。一般に、抗原および抗体
は、たとえば親和性カラム、硫酸アンモニウム分別、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および免疫
拡散を用いて精製される。この＄ｉ製された抗原もしく
は抗体分析物を、結合性実体と報告用実体とからなる溶
液に添加する。或いは、分析物または結合性実体のいず
れかを支持体に固定化し、かつ他の成分を溶液中に熔解
させる。
さらに、報告用実体も支持体を含むことができる。Ｅ、
を照射した後の深色口および／または遅延螢光の出現は
分析物の存在を示す。
Ｂ０分析物がポリヌクレオチドである場合一般に、標的
ポリヌクレオチドは微生物または細胞から分離される。
ランタニド金属が信号化セグメントである場合、ポリス
クレオチドプローブを用いる１つの方法は、たとえは標
的ポリヌクレオチドを含む試料における細胞を溶液中で
溶解させて、標的ポリヌクレオチドを包囲膜から放出さ
せる。溶解は、たとえば試料を音波または洗剤に露出し
て行なうことができる。
ポリヌクレオチドは、遠心分離によって細胞残骸から分
離しかつさらにアルコール沈澱によりまたは透析により
精製することができる。次いで、ポリヌクレオチドプロ
ーブを、標的ポリヌクレオチドを含有する溶液へ添加す
る。遅延螢光の出現は、試料中の標的ポリヌクレオチド
の存在を示す。
標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプローブの
ポリヌクレオチド成分部分とハイブリッド化させる前に
ハイブリッド化工程で一本鎖型にせねばならない。これ
は熱により或いはアルカリによって達成することができ
る。典型的にはハイブリッド化は、僅かに高めた温度（
たとえは約３５〜７５℃、一般に約６５℃）にて、ｐＨ
約６〜８の緩衝液を含みかつ適当なイオン強度（たとえ
ば５ＸＳＳＣ，ここで１×Ｓ　Ｓ　Ｃ＝　０．１５Ｍ塩
化ナトリウムおよび０．０１５　Ｍクエン酸ナトリウム
、ｐＨ７，０である）を有する溶液中で進行する。より
低いハイプリント化温度が望ましい場合は、たとえばジ
メチルスルホキシドおよびホルムアミドのような水素結
合試薬を含ませることができる。ハイブリッド化を生せ
しめるのに要する試料とプローブストランドとの間の相
補程度は、条件の厳格度に依存する。厳格度を決定する
因子は当業界で知られている。
ハイブリッド化の後、溶液を装置内に入れ、ここで芳香
族試薬を適切な波長の光子で励起させる。次いで、螢光
放出を４〜６ミリ秒の間で変化しうる所定の時間間隔の
後に測定する。
ポリヌクレオチドプローブには少なくとも１個のキレー
ト剤が結合されている。たとえばランタニド金属、テル
ビウムはキレート剤に錯体化する。この金属は選択的な
螢光性芳香族試薬により特定波長で放出されたエネルギ
を吸収する能力を有し、さらに芳香族試薬自身よりも相
当長い時間にわたり螢光を放出する能力ををする。かく
して、標的ポリヌクレオチドの存在は、標的ポリヌクレ
オチドを含有すると予想される試料を（１）キレート剤
が共有結合されておりかつキレート剤に錯体化されたテ
ルビウムをも含むポリヌクレオチドプローブ、および（
２）テルビウムにより吸収されうる螢光エネルギを放出
する螢光性芳香族挿入剤と接触させることにより決定さ
れる。挿入剤により放出されるよりも長波長の螢光、或
いは挿入剤の螢光が減衰している間の所定期間後の螢光
の放出は標的ポリヌクレオチドの存在を示す。
この分析は、標的ポリヌクレオチドを１工程で検出する
ことにより、他の検出分析の多くの制限を排除する。た
とえば、未結合のプローブ分子を除去する。ｉｌ−要が
ないため、ハイブリッド化がたとえば高温度、フェノー
ルおよび有機熔剤の抽出、電気泳動、カラムクロマトグ
ラフィー或いは低もしくは高ｐ＋＋などの各種の条件ま
たは操作に耐える必要がなくなる。
１２、試薬キット さらに本発明は、所望の分析法を行なうのに必要とされ
る必須部材の全てを含む試薬キット、すなわち試薬組合
せもしくは手段をも提供する。
この試薬系は市販の包装形態として、組成物として、或
いは試薬の相客性が可能な場合には混合物として、試験
キットとして、すなわち１個もしくはそれ以上の容器、
装置など必要な試薬を保持しかつ一般に分析の実施に対
する指導書を含む包装組合せ物として提供される。本発
明の試薬系は、上記した各種の複合化もしくはハイブリ
ッド化構成を行なうための全ゆる成分を含む。
この試薬系は一般に（１１結合性実体と、（２）報告用
実体とを備える。たとえば標的ポリヌクレオチドに対す
るこの装置の試薬キント形態は、さらにたとえばハイブ
リッド化溶液の成分および試験試料における二重鎖核酸
を一本鎖型に変換させうる変性剤などの補助薬品をも含
むことができる。好ましくは、化学的溶解および変性剤
（たとえばアルカリ）を含んで試料から一本鎖核酸を放
出させるようこの試料を処理する。
以上、幾つかの分析物を検出する分析につき説明したが
、これらの分析は適当な結合性実体を用いて他の分析物
を検出するにも使用することができる。各種の分析物／
結合性実体組合せ物の例は、限定はしないがレクチン／
糖；糖／レクチン；ホルモン／リセプタ；リセプタ／ホ
ルモン；阻止剤／酵素；酵素／阻止剤；補因子／酵素；
酵素／補因子；リガンド／基質および基質／リガンドを
包含する。これらの組合せ物も本発明の範囲内に包含す
ることを意図する。
【図面の簡単な説明】
第１ａ図は抗体とＥ２とからなる結合構成要素と、Ｃｌ
ｑとＥｌとからなる報告構成要素との溶液中の分析物の
検出を示す説明図、第１ｂ図は抗原とＥ、とからなる結
合構成要素と、ＣｌｑとＥ、とからなる報告構成要素と
を有する固体支持体に固定された分析物抗原の検出を示
す説明図、第１　ｃ、図は抗体とＥ２とからなる結合構
成要素と、固体支持体、とＥ、とからなる報告構成要素
とを有する固体支持体に固定された分析物抗原の検出を
示す説明図、第１ｄ図は相補ポリヌクレオチドとＥ２と
からなる結合構成要素と、Ｅ、としての挿入剤からなる
報告構成要素との溶液中の分析物標的ポリヌクレオチド
の検出を示す説明図、第１ｅ図は相補ポリヌクレオチド
とＥ２とからなる結合構成要素と、固体支持体とＥｌと
からなる報告構成要素とを有する固体支持体に固定され
た分析物標的ポリヌクレオチドの検出を示す説明図、第
１ｆ図は相補ポリヌクレオチドとＥ２とからなる結合構
成要素と、固体支持体とＥ、とからなる報告構成要素と
を有する固体支持体に固定された分析物標的ポリヌクレ
オチドの検出を示す説明図、第２図はランタニド余圧か
らなるプローブを有する分析物の検出を実施するために
使用できる螢光計の回路略図である。 特許出願人　エンヅー　バイオヶム ＦＩＧ、ｌａ　　　　図面の１７’Ｗ（内ｂｉ：　空Ｅ
なＬ−）ＦＩＧ、ＩｂＦＩＧ、ｌｅ　　　　　　　　　
　　　ＦＩＧ、ｌｆＥり ＦＩＧ、２

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）分析物の存在を検出するための均質検定法におい
    て、 ａ、前記分析物と結合構成要素とからなる複合体を形成
    し、前記結合構成要素は認識 セグメントと蛍光エネルギー伝達システ ムの第一パートナとからなり、前記第一 パートナはエネルギー供与体とエネルギ ー受容体とからなる群から選択され； ｂ、前記複合体を成分と前記蛍光エネルギー伝達システ
    ムの第二パートナとからなる 報告構成要素とに接触してユニットを形 成し、（ｉ）、前記第二パートナはエネル ギー供与体とエネルギー受容体とからな る群から選択され、その際、前記第一パ ートナがエネルギー供与体である時は前 記第二パートナはエネルギー受容体であ りかつ前記第一パートナがエネルギー受 容体である時は前記第二パートナはエネ ルギー供与体であることを条件とし、か つ（ｉｉ）、前記第一パートナと第二パートナの間の距
    離はフルスター半径位い以下 であり； ｃ、前記エネルギー供与体によって吸収され得かつ前記
    エネルギー受容体によって吸 収され得ないエネルギーによって前記ユ ニットを放射し、その際前記エネルギー 供与体は前記エネルギー受容体を励起出 来る蛍光エネルギーを放射することを条 件とし；次いで ｄ、前記エネルギー受容体によって放射される蛍光を検
    出する 諸工程からなる分析物の存在を検出するための均質検定
    法。
  2. （２）前記第一パートナは連鎖アームによって前記結合
    構成要素の前記認識セグメントに共有結合的に結合され
    る特許請求の範囲第１項記載の分析物の存在を検出する
    ための均質検定法。
  3. （３）前記検定法は液体からなる一相と固体支持体と液
    体とからなる二相からなる群から選択されるシステム中
    で実施される特許請求の範囲第１項記載の分析物の存在
    を検出するための均質検定法。
  4. （４）前記検定法は前記一相システム中で実施される特
    許請求の範囲第３項記載の分析物の存在を検出するため
    の均質検定法。
  5. （５）前記分析物は抗原であり、その際前記結合構成要
    素は特定抗原からなる特許請求の範囲第４項記載の分析
    物の存在を検出するための均質検定法。
  6. （６）前記分析物は抗原、ハプテン、抗体及び標的ポリ
    ヌクレオチドからなる群から選択される特許請求の範囲
    第１項記載の分析物の存在を検出するための均質検定法
    。
  7. （７）前記分析物は抗原である特許請求の範囲第６項記
    載の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  8. （８）前記抗原は蛋白質、多糖類、微生物、ウィルス、
    ファージ、細菌、及びアレルギンからなる群から選択さ
    れる特許請求の範囲第７項記載の分析物の存在を検出す
    るための均質検定法。
  9. （９）前記第一パートナはエネルギー受容体であり、前
    記第二パートナはエネルギー供与体である特許請求の範
    囲第１項記載の分析物の存在を検出するための均質検定
    法。
  10. （１０）前記エネルギー供与体は蛍光性芳香族剤であり
    、前記エネルギー受容体は蛍光性芳香族剤とランタニド
    金属からなる群から選択される特許請求の範囲第１項記
    載の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  11. （１１）前記エネルギー供与体は蛍光性芳香族剤であり
    、前記エネルギー受容体はランタニド金属である特許請
    求の範囲第１０項記載の分析物の存在を検出するための
    均質検定法。
  12. （１２）前記芳香族はオウロミンＯ、ルミクローム、及
    び９−アミノアクリジンからなる群から選択される特許
    請求の範囲第１０項記載の分析物の存在を検出するため
    の均質検定法。
  13. （１３）前記金属はユウロピウムとテルビウムからなる
    群から選択される特許請求の範囲第 １０項記載の分析物の存在を検出するための均質検定法
    。
  14. （１４）前記第二パートナは連鎖アームによって前記報
    告構成要素の成分に共有結合的又は非共有結合的に結合
    する特許請求の範囲第１項記載の分析物の存在を検出す
    るための均質検定法。
  15. （１５）前記分析物は抗原と抗体からなる群から選択さ
    れ、その際前記報告構成要素はＣｌｑ、抗体、及び固体
    支持体からなる群から選択される成分からなる特許請求
    の範囲第１項記載の分析物の存在を検出するための均質
    検定法。
  16. （１６）前記分析物は抗原と抗体からなる群から選択さ
    れ、その際前記報告構成要素はＣｌｑと固体支持体から
    なる群から選択される成分からなる特許請求の範囲第１
    ５項記載の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  17. （１７）前記分析物は標的ポリヌクレオチドであり、そ
    の際前記報告構成要素は挿入剤と固体支持体からなる群
    から選択される成分からなる特許請求の範囲第６項記載
    の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  18. （１８）前記固体支持体は硝子、プラスチック、セルロ
    ース、及びゲル　ポリマーからなる群から選択される特
    許請求の範囲第３項記載の分析物の存在を検出するため
    の均質検定法。
  19. （１９）前記エネルギー供与体と前記エネルギー受容体
    との間の距離は約３０Å以下である特許請求の範囲第１
    項記載の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  20. （２０）前記分析物は抗原であり、前記第一パートナは
    エネルギー受容体であり、前記第二パートナはエネルギ
    ー供与体であり、前記報告構成要素はＣｌｑと固体支持
    体から選択される成分からなる特許請求の範囲第１項記
    載の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  21. （２１）前記エネルギー受容体はランタニド金属である
    特許請求の範囲第２０項記載の分析物の存在を検出する
    ための均質検定法。
  22. （２２）前記分析物は抗原であり、前記結合構成要素は
    抗体であり、前記第一パートナはエネルギー受容体であ
    り、前記第二パートナはエネルギー供与体であり、かつ
    前記報告構成要素はＣｌｑからなる特許請求の範囲第４
    項記載の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  23. （２３）前記エネルギー受容体はランタニド金属である
    特許請求の範囲第２２項記載の分析物の存在を検出する
    ための均質検定法。
  24. （２４）前記分析物は標的ポリヌクレオチドであり、前
    記認識セグメントは相補ポリヌクレオチドであり、前記
    第一パートナはランタニド金属であり、かつ前記第二パ
    ートナは蛍光芳香族挿入剤である特許請求の範囲第１項
    記載の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  25. （２５）前記分析物は標的ポリヌクレオチドであり、前
    記結合構成要素は相補ポリヌクレオチドからなり、前記
    第一パートナはランタニド金属であり、前記第二パート
    ナは蛍光芳香族挿入剤である特許請求の範囲第３項記載
    の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  26. （２６）前記分析物は標的ポリヌクレオチドであり、前
    記結合構成要素は相補ポリヌクレオチドからなり、前記
    第一パートナはランタニド金属であり、前記第二パート
    ナは蛍光芳香族挿入剤である特許請求の範囲第４項記載
    の分析物の存在を検出するための均質検定法。
  27. （２７）前記分析物及び前記結合構成要素は抗原／抗体
    、レクチン／糖、ホルモン／受容体、阻止因子／酵素、
    補助因子／酵素、及び配位子からなる群から選択される
    複合体を形成する特許請求の範囲第１項記載の分析物の
    存在を検出するための均質検定法。
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