JPS61272661A - イムノアツセイ法 - Google Patents
イムノアツセイ法Info
- Publication number
- JPS61272661A JPS61272661A JP60114084A JP11408485A JPS61272661A JP S61272661 A JPS61272661 A JP S61272661A JP 60114084 A JP60114084 A JP 60114084A JP 11408485 A JP11408485 A JP 11408485A JP S61272661 A JPS61272661 A JP S61272661A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrolyte
- electrophoresis
- antigen
- phosphor
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
- G01N33/561—Immunoelectrophoresis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
〔発明の背景〕
ラジオアイソトープで標識した特定の抗体を用いて、微
量のインシュリンを測定する方法が報告されてから、ラ
ジオイムノアッセイと呼ばれるこの測定法は、種々の生
体物質及び薬物の定板に利用されるようになった。しか
し、ラジオアイソトープを用いるが故に取扱い一1ユ格
別の注意を要するという問題点がある。そこで酵素、酵
素基質、蛍光物質、化学発光物質等の非放射性の標識物
を利用する各種のイムノアッセイ法が検討され、これら
のなかで酵素あるいは蛍光物質を標識物とする方法が実
用化の域に達している。なかでも蛍光体標識物を用いた
蛍光計測法は、短時間に測定が可能であることから自動
化装置に適している。しかし、この方法も全体のプロセ
スに手間と時間を要するためにこれを自動化することが
困難である。
量のインシュリンを測定する方法が報告されてから、ラ
ジオイムノアッセイと呼ばれるこの測定法は、種々の生
体物質及び薬物の定板に利用されるようになった。しか
し、ラジオアイソトープを用いるが故に取扱い一1ユ格
別の注意を要するという問題点がある。そこで酵素、酵
素基質、蛍光物質、化学発光物質等の非放射性の標識物
を利用する各種のイムノアッセイ法が検討され、これら
のなかで酵素あるいは蛍光物質を標識物とする方法が実
用化の域に達している。なかでも蛍光体標識物を用いた
蛍光計測法は、短時間に測定が可能であることから自動
化装置に適している。しかし、この方法も全体のプロセ
スに手間と時間を要するためにこれを自動化することが
困難である。
この全体のプロセスの簡略化のため、膜状の担体に抗体
を固定化し、この膜の面に垂直に電位勾配をかけること
により、この方向に被測定試料中の抗原を電気泳動によ
って移動せしめ、上記固定化された抗体と抗原抗体反応
を起こさせて固定させ、さらに、上記過程で固定化させ
て抗原に標識された抗体を電気泳動によって移動せしめ
て反応させるか、又は膜状の担体に固定化された抗体の
未反応部に標識された抗原を電気泳動によって移動せ1
7めて反応させるかのいずれかの反応により膜状の担体
に標識物を固定化し、この標識物の濃度を測定すること
番Jより、試料中の抗原の濃度を測定するli法が提案
されている(特開昭60−57257 )。
を固定化し、この膜の面に垂直に電位勾配をかけること
により、この方向に被測定試料中の抗原を電気泳動によ
って移動せしめ、上記固定化された抗体と抗原抗体反応
を起こさせて固定させ、さらに、上記過程で固定化させ
て抗原に標識された抗体を電気泳動によって移動せしめ
て反応させるか、又は膜状の担体に固定化された抗体の
未反応部に標識された抗原を電気泳動によって移動せ1
7めて反応させるかのいずれかの反応により膜状の担体
に標識物を固定化し、この標識物の濃度を測定すること
番Jより、試料中の抗原の濃度を測定するli法が提案
されている(特開昭60−57257 )。
この方法によれば、電気泳動用の担体は実質的に全ての
部分に抗体あるいは抗原が固定化された反応部分であり
、この部分は直接一方で陰極側の電解液と、他方で陽極
側の電解液と接触するため、従来のイムノアッセイ法で
1回の抗原抗体反応で□ 必要とする3〜4時間ないし
1(1という反応時間を1時間以内に短縮できる。さら
に従来のイムノアッセイで必要とされるプロセスを簡略
化できる。
部分に抗体あるいは抗原が固定化された反応部分であり
、この部分は直接一方で陰極側の電解液と、他方で陽極
側の電解液と接触するため、従来のイムノアッセイ法で
1回の抗原抗体反応で□ 必要とする3〜4時間ないし
1(1という反応時間を1時間以内に短縮できる。さら
に従来のイムノアッセイで必要とされるプロセスを簡略
化できる。
つまり、非反応物および過剰の標識抗体は反応膜を透過
して下部電解液中に移動してしまうので、従来の固相反
応に基づくイムノアッセイで必要とされる水洗という操
作が不要となる。
して下部電解液中に移動してしまうので、従来の固相反
応に基づくイムノアッセイで必要とされる水洗という操
作が不要となる。
しかし、上記電気泳動を用いたイムノアッセイ法は、全
体のプロセスの簡略化が図れて装置の自動化に適してい
るが、蛍光体m識した抗体あるいは抗原を用いて、蛍光
計測により試料中の抗原濃度を測定する場合に、散乱光
および妨害蛍光の大きな膜状の電気泳動用担体からの標
識物による蛍光を計測しなければならないという問題点
がある。
体のプロセスの簡略化が図れて装置の自動化に適してい
るが、蛍光体m識した抗体あるいは抗原を用いて、蛍光
計測により試料中の抗原濃度を測定する場合に、散乱光
および妨害蛍光の大きな膜状の電気泳動用担体からの標
識物による蛍光を計測しなければならないという問題点
がある。
本発明の目的は、抗体を固定化した膜状の担体!1il
ll1手段を提供することにある。
ll1手段を提供することにある。
一般に膜中では、膜からの散乱光あるいは膜の成分物質
からの背景蛍光が大きいため、感度良く蛍光体からの蛍
光fn k if1′M+11するのは困難である。
からの背景蛍光が大きいため、感度良く蛍光体からの蛍
光fn k if1′M+11するのは困難である。
これに対して水溶液中では」二記の妨害発光が弱いため
、高感度な蛍光計測が実現できる。
、高感度な蛍光計測が実現できる。
そこで本発明では、標識蛍光体の緻を膜中で直接蛍光体
計測するかわりに、基質を蛍光体化する酵素を標識物と
し、抗原抗体反応により電気泳動担体の膜に固定化され
た−に記酵索と電気泳動によって−I−記膜中に移動せ
しめた基質とを反応させ、基質を蛍光体化し、この蛍光
物質をさらに電気泳動により電解液中に移動せしめ、電
解液中で蛍光体の蛍光にをfil測する。上記理由によ
り、電解液中の蛍光体の蛍光址は高感度に計11111
できる。さらに本発明によれば、基質分子を多にに膜中
を透過させることにより、標識酵素1分子あたり、複数
の基質分子を蛍光体化できるため、膜中に固定化された
標識抗体分子あるいは標識抗原分子より多くの蛍光分子
を得ることができる。この点からも蛍光計411の高感
度化が実現できる。
計測するかわりに、基質を蛍光体化する酵素を標識物と
し、抗原抗体反応により電気泳動担体の膜に固定化され
た−に記酵索と電気泳動によって−I−記膜中に移動せ
しめた基質とを反応させ、基質を蛍光体化し、この蛍光
物質をさらに電気泳動により電解液中に移動せしめ、電
解液中で蛍光体の蛍光にをfil測する。上記理由によ
り、電解液中の蛍光体の蛍光址は高感度に計11111
できる。さらに本発明によれば、基質分子を多にに膜中
を透過させることにより、標識酵素1分子あたり、複数
の基質分子を蛍光体化できるため、膜中に固定化された
標識抗体分子あるいは標識抗原分子より多くの蛍光分子
を得ることができる。この点からも蛍光計411の高感
度化が実現できる。
ところで、−1−、記過程で電解液中に移動してくる蛍
光体の濃度を高めるためには電解液槽中の電解液社は少
ない方がよい。一方、電解液の址が少ないと電気泳動中
に電解液の成分が変化してしまい、適正な電気泳動が行
なわれなくなる1r能性がある。
光体の濃度を高めるためには電解液槽中の電解液社は少
ない方がよい。一方、電解液の址が少ないと電気泳動中
に電解液の成分が変化してしまい、適正な電気泳動が行
なわれなくなる1r能性がある。
このため、本発明では蛍光体の流出してくる側の電解液
槽を電解液中の電解質は透過させるが、蛍光体は透過さ
せない腸で部分することにより、電解液中の電解質の組
成を変化させずに、蛍光体を小さな容積の部分に濃縮す
ることを可能にLまた。
槽を電解液中の電解質は透過させるが、蛍光体は透過さ
せない腸で部分することにより、電解液中の電解質の組
成を変化させずに、蛍光体を小さな容積の部分に濃縮す
ることを可能にLまた。
以下、本発明の一実施例を第1図により説明する。電気
泳動用担体である反応膜1は、J’%さ約300μmの
ポリアクリルアミドゲル膜で、これに抗ヒトアルブミン
抗体(ウサギ)を固定化した。
泳動用担体である反応膜1は、J’%さ約300μmの
ポリアクリルアミドゲル膜で、これに抗ヒトアルブミン
抗体(ウサギ)を固定化した。
反応膜1の製法は以下の通りである。まず、抗ヒI、ア
ルブミン抗血清のIgGフラクション(有効抗体成分を
2.4mg/m(l含む) 0.5 m Qに2.5%
アクロレイン水溶液を25μQ加えて水冷下で330分
間放置したあと、P BSでよく透析してから、これに
0.32 g / m Qのアクリルアミド溶液1.5
m Q 、 O,[116g / rn QのN、N
’−メチレンビスアクリルアミド溶液を1.5mQ、4
.6 μQ/mQのN、N、N’ 、N’ −テトラメ
チルエチレンジアミン水溶液を1.25mQ、および1
.2mg/mQの過硫酸アンモニウム溶液5.75m
Qを加えて、製膜を行なった。この膜から直径9mmの
円形膜を切り出して、これをアクリル製の膜保持器2で
保持した。ただし、抗体固定化したポリアクリルアミド
ゲル勲の脆弱性を考慮して、反応膜の周囲の厚さ200
μmのポリエステル製のスペーサーリング3を挿入した
。
ルブミン抗血清のIgGフラクション(有効抗体成分を
2.4mg/m(l含む) 0.5 m Qに2.5%
アクロレイン水溶液を25μQ加えて水冷下で330分
間放置したあと、P BSでよく透析してから、これに
0.32 g / m Qのアクリルアミド溶液1.5
m Q 、 O,[116g / rn QのN、N
’−メチレンビスアクリルアミド溶液を1.5mQ、4
.6 μQ/mQのN、N、N’ 、N’ −テトラメ
チルエチレンジアミン水溶液を1.25mQ、および1
.2mg/mQの過硫酸アンモニウム溶液5.75m
Qを加えて、製膜を行なった。この膜から直径9mmの
円形膜を切り出して、これをアクリル製の膜保持器2で
保持した。ただし、抗体固定化したポリアクリルアミド
ゲル勲の脆弱性を考慮して、反応膜の周囲の厚さ200
μmのポリエステル製のスペーサーリング3を挿入した
。
ヒトアルブミン標準試料のしよ活況合液をに部電解液槽
4中の電解液5に注入してから、−1一部電解液中の白
金電極8と下部電解液槽6中の白金電極8′の間に直流
電源9で250vの電圧を印加して30分間電気泳動を
行なった。
4中の電解液5に注入してから、−1一部電解液中の白
金電極8と下部電解液槽6中の白金電極8′の間に直流
電源9で250vの電圧を印加して30分間電気泳動を
行なった。
さらに、エステラーゼを標識した抗ヒトアルブミン抗血
清(ウサギ)を同様に、L部電解液槽4中の電解液5中
に注入してから、同様に印加電圧250■で20分間電
気泳動を行なった。
清(ウサギ)を同様に、L部電解液槽4中の電解液5中
に注入してから、同様に印加電圧250■で20分間電
気泳動を行なった。
次に標識酵素エステラーゼの基質であるFDA(フロオ
レセインジアセテート)を同様に」一部電解液槽4中の
電解液5中に注入してから、印加電圧250■で30分
間電気泳動を行なった。
レセインジアセテート)を同様に」一部電解液槽4中の
電解液5中に注入してから、印加電圧250■で30分
間電気泳動を行なった。
上記過程により下部電解液槽6中の電解液7に流出して
きた蛍光体フルオレセインの蛍光強度の計測をXsラン
プ10を励起/光源として行なった。干渉フィルター1
1により490nmの波長の光を選択し、レンズ12.
13により光学窓21を通して下部電解液7中の蛍光体
を励起した。
きた蛍光体フルオレセインの蛍光強度の計測をXsラン
プ10を励起/光源として行なった。干渉フィルター1
1により490nmの波長の光を選択し、レンズ12.
13により光学窓21を通して下部電解液7中の蛍光体
を励起した。
蛍光は励起光に対して90°方向から、光学窓22、レ
ンズ1.6.17、干渉フィルター15、カットオフフ
ィルター16を通して、510nm近傍の波長の光を選
択的にフォトマル18で検出した。下部電解液7中を透
過した励起光は光学窓23を通して外部に導いた。上記
光学系で散乱光の影響の少ない蛍光計測ができた。フォ
トマル18の出力は、増幅器19を通した後で、レコー
ダ20で記録した。第1図に示した構成の装置で定量性
良く高感度に、ヒ]・アルブミン標準試料の測定が実現
できた。
ンズ1.6.17、干渉フィルター15、カットオフフ
ィルター16を通して、510nm近傍の波長の光を選
択的にフォトマル18で検出した。下部電解液7中を透
過した励起光は光学窓23を通して外部に導いた。上記
光学系で散乱光の影響の少ない蛍光計測ができた。フォ
トマル18の出力は、増幅器19を通した後で、レコー
ダ20で記録した。第1図に示した構成の装置で定量性
良く高感度に、ヒ]・アルブミン標準試料の測定が実現
できた。
本発明の他の実施例と第2図により説明する。
反応膜24の製法、電気泳動槽の構成および、電気泳動
による抗原抗体反応、酵素反応は第1図で示した実施例
の場合と同様である。本実施例では、反応膜24と下部
電解液25の間にアクリル製の膜保持具26に取付けた
ポーラスガラス膜27を配置することにより小容積の電
解液槽28を構成した。1−記ボーラスガラスは、ゾル
ゲル法でテ1〜ラメ1〜キシシランをメタノールと水溶
媒中で反応させたもので、電解液中の電解質は透過させ
るが、蛍光体は透過させないという性質をもつ石英ガラ
スである。したがって反応膜24中に固定化された酵素
によって蛍光体化された基質は、小容積の電解液槽28
中に濃縮される。本実施例では、上記過程によって濃縮
された蛍光体を含む電解質溶液をガイド穴29を通して
ピペット30を用いて、蛍光セル31に導いた。ピペッ
ト30は回転上下機構32に保持した。蛍光セル31中
の蛍光体は、第1図で説明したのと同様な光学系で蛍光
計測した。本実施例により、さらに高感度な試料中の抗
原濃度の測定が実現できた。
による抗原抗体反応、酵素反応は第1図で示した実施例
の場合と同様である。本実施例では、反応膜24と下部
電解液25の間にアクリル製の膜保持具26に取付けた
ポーラスガラス膜27を配置することにより小容積の電
解液槽28を構成した。1−記ボーラスガラスは、ゾル
ゲル法でテ1〜ラメ1〜キシシランをメタノールと水溶
媒中で反応させたもので、電解液中の電解質は透過させ
るが、蛍光体は透過させないという性質をもつ石英ガラ
スである。したがって反応膜24中に固定化された酵素
によって蛍光体化された基質は、小容積の電解液槽28
中に濃縮される。本実施例では、上記過程によって濃縮
された蛍光体を含む電解質溶液をガイド穴29を通して
ピペット30を用いて、蛍光セル31に導いた。ピペッ
ト30は回転上下機構32に保持した。蛍光セル31中
の蛍光体は、第1図で説明したのと同様な光学系で蛍光
計測した。本実施例により、さらに高感度な試料中の抗
原濃度の測定が実現できた。
本発明によれば、電気泳動担体である膜中で抗原抗体反
応を行なわせることによって試料中の抗度に比例する標
識酵素により多量の基質分子を蛍光体化し、水溶液中で
の蛍光計測を可能とできること、さらに小容積の中に蛍
光体詮濃縮する手段を提供できるため、高感度な抗原濃
度の測定が可能となる。
応を行なわせることによって試料中の抗度に比例する標
識酵素により多量の基質分子を蛍光体化し、水溶液中で
の蛍光計測を可能とできること、さらに小容積の中に蛍
光体詮濃縮する手段を提供できるため、高感度な抗原濃
度の測定が可能となる。
第1図は本発明の一実施例を示す構成図、第2図は本発
明の一実施例に示す部分構成図である。 1・・・反応槽、2・・・膜保持器、3・・スペーサー
リング、4・・・」二部電解液槽、5・・・電解液、6
・・・下部電解液槽、′7・・電解液、8.8’・・・
白金電極、9・・・直流電源、10・・・Xsランプ、
11.15・・・干渉フィルター、14・・・カットオ
ツフィルター、12゜1、3. l E;、 l
’7・・・レンズ、18・・・フォトマル、19・・・
増幅器、20・・・レコーダ・−12]、22゜23・
・・光学窓、24・・・反応膜、25・・・下部電解液
、26・・・膜保持器、27・・ポーラスガラス瞼、2
8・・・小容積の電解液槽、29・・ガーrド穴、30
・・・ピペツ1−1a +・・・蛍光セル、32・・・
回転1−下機構、:33・・・1−都電解除。
明の一実施例に示す部分構成図である。 1・・・反応槽、2・・・膜保持器、3・・スペーサー
リング、4・・・」二部電解液槽、5・・・電解液、6
・・・下部電解液槽、′7・・電解液、8.8’・・・
白金電極、9・・・直流電源、10・・・Xsランプ、
11.15・・・干渉フィルター、14・・・カットオ
ツフィルター、12゜1、3. l E;、 l
’7・・・レンズ、18・・・フォトマル、19・・・
増幅器、20・・・レコーダ・−12]、22゜23・
・・光学窓、24・・・反応膜、25・・・下部電解液
、26・・・膜保持器、27・・ポーラスガラス瞼、2
8・・・小容積の電解液槽、29・・ガーrド穴、30
・・・ピペツ1−1a +・・・蛍光セル、32・・・
回転1−下機構、:33・・・1−都電解除。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、電気泳動用担体の実質的に全域に抗体を固定し、被
測定試料の抗原を電気泳動によつて移動せしめる過程で
、上記固定化された抗体と抗原抗体反応を起こさせて固
定させ、上記固定化させた抗原に、標識抗体を電気泳動
によつて移動せしめて反応させるか、又は上記固定化さ
せた抗体の未反応部に標識された抗原を電気泳動によつ
て移動せしめて反応させるかのいずれかの反応を行なわ
せて、上記抗原の濃度を測定するイムノアツセイ法にお
いて、標識物が基質を蛍光体化する酵素であり、該酵素
に蛍光体化される基質を電気泳動によつて移動せしめて
標識酵素と反応させて蛍光体化し、さらに該蛍光体を電
気泳動によつて電気泳動用担体から電解液中に移動せし
めてから、蛍光体濃度を測定することにより、試料中の
抗原の濃度を測定することを特徴とするイムノアツセイ
法。 2、特許請求の範囲第1項記載のイムノアツセイ法にお
いて、蛍光体が移動してくる側の電解液槽が、電解質を
透過するが蛍光体は透過しない膜により二分されている
ことを特徴とするイムノアツセイ法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60114084A JPS61272661A (ja) | 1985-05-29 | 1985-05-29 | イムノアツセイ法 |
DE19863617946 DE3617946A1 (de) | 1985-05-29 | 1986-05-28 | Immunassay-verfahren |
US06/867,554 US4824778A (en) | 1985-05-29 | 1986-05-28 | Immunoassay for measuring the concentration of antigen in a sample |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60114084A JPS61272661A (ja) | 1985-05-29 | 1985-05-29 | イムノアツセイ法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61272661A true JPS61272661A (ja) | 1986-12-02 |
Family
ID=14628671
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60114084A Pending JPS61272661A (ja) | 1985-05-29 | 1985-05-29 | イムノアツセイ法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4824778A (ja) |
JP (1) | JPS61272661A (ja) |
DE (1) | DE3617946A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4868103A (en) * | 1986-02-19 | 1989-09-19 | Enzo Biochem, Inc. | Analyte detection by means of energy transfer |
AU8654891A (en) * | 1990-08-10 | 1992-03-02 | Purdue Research Foundation | Matrix sequential addition immunoassay |
JP2912957B2 (ja) * | 1991-06-18 | 1999-06-28 | 東ソー株式会社 | 酵素活性測定方法及び装置 |
US5958202A (en) | 1992-09-14 | 1999-09-28 | Perseptive Biosystems, Inc. | Capillary electrophoresis enzyme immunoassay |
US5516465A (en) * | 1993-08-04 | 1996-05-14 | Koch Engineering Company, Inc. | Method and apparatus for vapor distribution in mass transfer and heat exchange columns |
US5986076A (en) * | 1994-05-11 | 1999-11-16 | Trustees Of Boston University | Photocleavable agents and conjugates for the detection and isolation of biomolecules |
US5643722A (en) | 1994-05-11 | 1997-07-01 | Trustees Of Boston University | Methods for the detection and isolation of proteins |
US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
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