JPS62182662A - ウイルス抗体検出用試薬 - Google Patents
ウイルス抗体検出用試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
Ｃ産業上の利用分野〕
後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｌｒｅｄ Ｉｍｍｕｎ
ｏｄｅｆｌ−山ｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍ＠、以下ｒ Ａ
ＩＤＳ Ｊ と呼ぶ。）は、１９８１年に初めて認め
られた新しい病気である（ Ｍ、 Ｓ、 Ｇｏｔｔｌｌ
ｂ ｅｔ ａｌ、、 Ｎ、 Ｅｎｇ、 Ｊ、 Ｍａｄ、
、 ３０５゜１４２５（１９８１）］。その後、フラン
スでリンツク節疾患症候＃ （Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐ
ａｔｈｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ）患者がらＬＡＹとなす
けられたレトロウィルスが（Ｆ、Ｂａｒｒｓ〜５ｉｎｏ
ｕａｓｉ ｅｔ ａｌ、、 ５ｅｌｅｎｃｏ、 ２２０
＋ ８６８（１９８３））、そして、アメリカでＡＩ
ＤＳ患者やｐｒｅ−ＡＩＤＳ患者からＩ（ＴＬＶ−ｄｉ
［Ｍ、 Ｐｏｐｏｖｉｃ ａｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅ
ｎｃｅ、 ２２４゜４９７（１９８４）］及びＡＲＭ
［Ｊ、Ａ、 Ｌｅｖｙ ａｔ ｍｌ、。
ｏｄｅｆｌ−山ｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍ＠、以下ｒ Ａ
ＩＤＳ Ｊ と呼ぶ。）は、１９８１年に初めて認め
られた新しい病気である（ Ｍ、 Ｓ、 Ｇｏｔｔｌｌ
ｂ ｅｔ ａｌ、、 Ｎ、 Ｅｎｇ、 Ｊ、 Ｍａｄ、
、 ３０５゜１４２５（１９８１）］。その後、フラン
スでリンツク節疾患症候＃ （Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐ
ａｔｈｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ）患者がらＬＡＹとなす
けられたレトロウィルスが（Ｆ、Ｂａｒｒｓ〜５ｉｎｏ
ｕａｓｉ ｅｔ ａｌ、、 ５ｅｌｅｎｃｏ、 ２２０
＋ ８６８（１９８３））、そして、アメリカでＡＩ
ＤＳ患者やｐｒｅ−ＡＩＤＳ患者からＩ（ＴＬＶ−ｄｉ
［Ｍ、 Ｐｏｐｏｖｉｃ ａｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅ
ｎｃｅ、 ２２４゜４９７（１９８４）］及びＡＲＭ
［Ｊ、Ａ、 Ｌｅｖｙ ａｔ ｍｌ、。
５ｃｉｅｎｃｅ、２２５，８４０（１９８４）］となす
けられたレトロウィルスが相次いで発見された。最近、
これらのＬＡＹ％ＨＴＬＶ−１［及びＡＲＶはその遺伝
子の核酸配列が完全に解析され、これらのレトロウィル
スは同じウィルスの変異株であることが明らかになった
（ Ｌ、Ｒａｔｎｅｒ ｅｂ ｍｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ
＋ ３１３ 、２７７（１９８５） ＊ Ｒ，５ａｎｃ
ｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｏｏｒ ｅｔ ａｌ、。
けられたレトロウィルスが相次いで発見された。最近、
これらのＬＡＹ％ＨＴＬＶ−１［及びＡＲＶはその遺伝
子の核酸配列が完全に解析され、これらのレトロウィル
スは同じウィルスの変異株であることが明らかになった
（ Ｌ、Ｒａｔｎｅｒ ｅｂ ｍｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ
＋ ３１３ 、２７７（１９８５） ＊ Ｒ，５ａｎｃ
ｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｏｏｒ ｅｔ ａｌ、。
５ｅｔｅｎｅｅ、 ２２７ 、４８４ （１９８５）
、 Ｓ、 Ｗａｉｎ−Ｈｏｂａｏｎｅｔ ａｌ、、 Ｃ
ｅ１１．４０，９（１９８５））。 以下、これらに同
じウィルスであるので酩称し°ｒ ＡＩＤＳ関連つイル
スと呼ぶ。最近、このＡＩＤＳ関連ウィルスにヒトとヒ
トとの接触、輸血等により感染し、発病することが判明
してきた。この際、感染したヒトの血液中にＡＩＤＳ関
連ウィルスと特異的に反応する抗体が生ずることも知ら
れている。逆にこの抗体を検出することによって、ＡＩ
ＤＳ関連ウィルス感染の有無ｆ、調べることによって、
ＡＩＤＳの予防につながるものと考えられている。
、 Ｓ、 Ｗａｉｎ−Ｈｏｂａｏｎｅｔ ａｌ、、 Ｃ
ｅ１１．４０，９（１９８５））。 以下、これらに同
じウィルスであるので酩称し°ｒ ＡＩＤＳ関連つイル
スと呼ぶ。最近、このＡＩＤＳ関連ウィルスにヒトとヒ
トとの接触、輸血等により感染し、発病することが判明
してきた。この際、感染したヒトの血液中にＡＩＤＳ関
連ウィルスと特異的に反応する抗体が生ずることも知ら
れている。逆にこの抗体を検出することによって、ＡＩ
ＤＳ関連ウィルス感染の有無ｆ、調べることによって、
ＡＩＤＳの予防につながるものと考えられている。
本発明はこのＡＩＤＳの起因因子であるＡＩＤＳ関連ウ
ィルスに対する特異抗体を検出するのに用いる試薬に関
するものである。
ィルスに対する特異抗体を検出するのに用いる試薬に関
するものである。
最近、ＡＩＤＳ関連ウィルスに対する特異抗体を検出す
るため、間接螢光抗体法、酵素免疫測定法、放射免疫測
定法、ウェスタンブロッティング法等が開発さ扛てきた
。間接螢光抗体法は、ＡＩＤＳ関連ウィルス産生細胞を
スライドガラスに固定し、これに被検血清をのせて反応
させたのち、未反応の血清成分を除き、さらに反応した
ヒトの血清成分にＷ異的な螢光標識抗体全反応させる。
るため、間接螢光抗体法、酵素免疫測定法、放射免疫測
定法、ウェスタンブロッティング法等が開発さ扛てきた
。間接螢光抗体法は、ＡＩＤＳ関連ウィルス産生細胞を
スライドガラスに固定し、これに被検血清をのせて反応
させたのち、未反応の血清成分を除き、さらに反応した
ヒトの血清成分にＷ異的な螢光標識抗体全反応させる。
反応後、未反応の標識抗体を除き、螢光！Ｉａ鏡にて特
異螢光の有無によって、ＡＩＤＳ関連ウィルスに対する
抗体の有無を検査するものである。
異螢光の有無によって、ＡＩＤＳ関連ウィルスに対する
抗体の有無を検査するものである。
酵素抗体法は、ＡＩＤＳ関連ウィルスの特徴的な蛋白成
分を用い、これを固定化し、以下間接螢光抗体法と同様
に被検血清を反応させ、洗浄後、螢光標識の代りに酵素
を標識し、ヒト血清成分に特異的な抗体を反応させ、未
反応の標識抗体を洗浄して除いたのち、酵素に特異的な
基質を加えてその発色の度合によって、ＡＩＤＳ関連ウ
ィルスに対する抗体の有無を検査するものである。
分を用い、これを固定化し、以下間接螢光抗体法と同様
に被検血清を反応させ、洗浄後、螢光標識の代りに酵素
を標識し、ヒト血清成分に特異的な抗体を反応させ、未
反応の標識抗体を洗浄して除いたのち、酵素に特異的な
基質を加えてその発色の度合によって、ＡＩＤＳ関連ウ
ィルスに対する抗体の有無を検査するものである。
放射免疫測定法は酵素抗体法での抗体標識に放射性同位
元素を用いるほかは、原理は酵素抗体法と同様の方法で
ある＠ ウェスタンプロティング法は、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗
原蛋白を電気泳動しニトロセルロース膜に転写した後、
被検血清と反応させ、ＡＩＤＳ関連ウィルスの特異的な
蛋白と特異抗体の反応を蛋白バンドとして検出する方法
である。
元素を用いるほかは、原理は酵素抗体法と同様の方法で
ある＠ ウェスタンプロティング法は、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗
原蛋白を電気泳動しニトロセルロース膜に転写した後、
被検血清と反応させ、ＡＩＤＳ関連ウィルスの特異的な
蛋白と特異抗体の反応を蛋白バンドとして検出する方法
である。
上述し友様に、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗体検出法はそれ
ぞれに感度、特異性に工夫がこらされているが、尚、実
用上問題が残されている。第一に、操作が二段階、三段
階と繁雑である。第二に、反応測定に特殊な器材を必要
とする。最後に、特に螢光抗体法においては、ＡＩＤＳ
関連ウィルス産生細胞を１吏用するため、安全性の面で
も問題が残っている。以上の問題点は多数の被検血清に
ついて、測定を行う場合、重要な課題である。
ぞれに感度、特異性に工夫がこらされているが、尚、実
用上問題が残されている。第一に、操作が二段階、三段
階と繁雑である。第二に、反応測定に特殊な器材を必要
とする。最後に、特に螢光抗体法においては、ＡＩＤＳ
関連ウィルス産生細胞を１吏用するため、安全性の面で
も問題が残っている。以上の問題点は多数の被検血清に
ついて、測定を行う場合、重要な課題である。
本発明は、上記ＡＩＤＳ関連ウィルス抗体検出方法に見
られる諸問題を解決する新しいＡＩＤＳ関連ウィルス抗
体検出用試薬を提供するものであって、ＡＩＤＳ関連ウ
ィルス抗体検出方法として間接凝集反応を利用したこと
を特徴としている。
られる諸問題を解決する新しいＡＩＤＳ関連ウィルス抗
体検出用試薬を提供するものであって、ＡＩＤＳ関連ウ
ィルス抗体検出方法として間接凝集反応を利用したこと
を特徴としている。
すなわち、本発明は、ＡＩＤＳ関連ウィルスの抗原成分
を感作させた担体粒子を主剤とするＡＩＤＳ関連ウィル
ス抗体検出用間接凝集反応試薬に関するものである。
を感作させた担体粒子を主剤とするＡＩＤＳ関連ウィル
ス抗体検出用間接凝集反応試薬に関するものである。
ＡＩＤＳ関連ウィルスの抗原成分に、次の方法に従って
取得できる。すなわち、ＡＩＤＳ関連ウィルス産生細胞
を培養し、培養上清液からＡＩＤＳ関連ウィルスを分離
した後、ＡＩＤＳ関連ウィルスを界面活性剤で可溶化し
、上清液を分離採取することにより、ＡＩＤＳ関連ウィ
ルスの抗原成分を取得することができる。
取得できる。すなわち、ＡＩＤＳ関連ウィルス産生細胞
を培養し、培養上清液からＡＩＤＳ関連ウィルスを分離
した後、ＡＩＤＳ関連ウィルスを界面活性剤で可溶化し
、上清液を分離採取することにより、ＡＩＤＳ関連ウィ
ルスの抗原成分を取得することができる。
上記ＡＩＤＳ関連ウィルス産生細胞には、ＡＩＤＳ関連
ウィルスを産生ずる細胞株の全てが包含される。
ウィルスを産生ずる細胞株の全てが包含される。
例えば、ＡＩＤＳ関連ウィルスはヒ）Ｔ細胞の表面抗原
であるＴ４抗原を有する細胞に感染することが知られて
いるので［： Ｄ、Ｋｌａｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、
。
であるＴ４抗原を有する細胞に感染することが知られて
いるので［： Ｄ、Ｋｌａｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、
。
５ｃｉｅｎｃｅ、２２５．５９（１９８４）］、この表
面抗原を有する細胞にＡＩＤＳ関連ウィルスを感染させ
ることによ、９ ＡＩＤＳ関連ウィルス産生細胞を得る
ことができる。特に、公知の株化細胞であるＨ９（Ｍ。
面抗原を有する細胞にＡＩＤＳ関連ウィルスを感染させ
ることによ、９ ＡＩＤＳ関連ウィルス産生細胞を得る
ことができる。特に、公知の株化細胞であるＨ９（Ｍ。
Ｐｏｐｏｖｊｅ ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、
２２４，４９７（１９８４）） ＋ＯＥＭ （Ｒ，Ｃｈ
＠ｉｎｇａｏｎｇ−Ｐｏｐｏｖｌｃ ＠ｔ ａｌ、、
Ｌａｎｃｅｔ。
２２４，４９７（１９８４）） ＋ＯＥＭ （Ｒ，Ｃｈ
＠ｉｎｇａｏｎｇ−Ｐｏｐｏｖｌｃ ＠ｔ ａｌ、、
Ｌａｎｃｅｔ。
ｉｌ、４７７（１９８４）］、ＨＵＴ７８ （Ｊ、Ａ、
Ｌｓｖｙ ｅｔｍｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５，８
４０（１９８４））、Ｍｏ１ｔ−４［Ｓ、Ｈａｒａｄａ
ｅｔ ａｌ、、 Ｊｐｎ、Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ａ、、 ７６ 。
Ｌｓｖｙ ｅｔｍｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５，８
４０（１９８４））、Ｍｏ１ｔ−４［Ｓ、Ｈａｒａｄａ
ｅｔ ａｌ、、 Ｊｐｎ、Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ａ、、 ７６ 。
４３２（１９８５）Ｅ等ノ細胞株Ｋ ＡＩＤＳＩＤＳ関
連フィルスさせると、これらのＡＩＤＳ関連ウィルス感
染細胞は永久に継代培養することが可能なＡＩＤＳ関連
ウィルス産生細胞となることが知られており、これらの
細胞株は、本発明に使用することができる。
連フィルスさせると、これらのＡＩＤＳ関連ウィルス感
染細胞は永久に継代培養することが可能なＡＩＤＳ関連
ウィルス産生細胞となることが知られており、これらの
細胞株は、本発明に使用することができる。
上記ＡＩＤｓ関連ウィルス産生細胞の培養は、通常の方
法によシ行なうことができる。培地としては通常の細胞
培養に用いられる各種の栄養培地をいずれも開用できる
。好ましい培地としては、ＲＰＭ１１６４０培地、イー
グル最低必須培地（ＭＥＭ培地）等をウシ胎児血［（Ｆ
ｅ２ ） 、子ウシ血清等の血清補液を用いて改質した
培地等を例示できる。培地条件は通常の細胞培養に利用
される条注と特に異なるものではなく、一般には約３６
〜３８℃の温度及び６．４〜７．６のｐＨを採用できる
。培養は通常３〜５日毎に液交換を行なうことにより実
施され、これにより所望の細胞を良好に増殖させ得る。
法によシ行なうことができる。培地としては通常の細胞
培養に用いられる各種の栄養培地をいずれも開用できる
。好ましい培地としては、ＲＰＭ１１６４０培地、イー
グル最低必須培地（ＭＥＭ培地）等をウシ胎児血［（Ｆ
ｅ２ ） 、子ウシ血清等の血清補液を用いて改質した
培地等を例示できる。培地条件は通常の細胞培養に利用
される条注と特に異なるものではなく、一般には約３６
〜３８℃の温度及び６．４〜７．６のｐＨを採用できる
。培養は通常３〜５日毎に液交換を行なうことにより実
施され、これにより所望の細胞を良好に増殖させ得る。
本発明においてＡＩＤＳ関連ウィルスの抗原成分の原料
として利用されるＡＩＤＳ関連ウィルスとしては、上記
ＡＩＤＳ関連ウィルス産生細胞の培養上清液から常法に
より分離し友ものを使用する。ＡＩＤＳ関連ウィルスの
分離は通常の遠心分離法等によシ行なわれ、特に超遠心
密度勾配法等を用いるとＡＩＤＳ関連ウィルスを高純度
で取得出来るので好都合である。
として利用されるＡＩＤＳ関連ウィルスとしては、上記
ＡＩＤＳ関連ウィルス産生細胞の培養上清液から常法に
より分離し友ものを使用する。ＡＩＤＳ関連ウィルスの
分離は通常の遠心分離法等によシ行なわれ、特に超遠心
密度勾配法等を用いるとＡＩＤＳ関連ウィルスを高純度
で取得出来るので好都合である。
ＡＩＤＳ関連ウィルスの抗原成分は、上記ＡＩＤＳ関連
ウィルスを、常法に従って界面活性剤で可溶化すること
によって取得することができるＯ界面活性剤としてはノ
二デットＰ−４０、トリトンＸ−１００等の非イオン系
のもの、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸の
ような陰イオン系のものなどが使用できる。
ウィルスを、常法に従って界面活性剤で可溶化すること
によって取得することができるＯ界面活性剤としてはノ
二デットＰ−４０、トリトンＸ−１００等の非イオン系
のもの、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸の
ような陰イオン系のものなどが使用できる。
可溶化方法としては、特に制限はないが、より好ましく
は界面活性剤を０．０１〜２．０％含む緩衝液を、上記
ＡＩＤＳ関連ウィルスの沈殿物に加え、約０〜２５℃の
温度下に、３０分〜２４時間攪拌して可溶化する。この
可溶化液を遠心分離して得られる上清液′ｔ−ＡＩＤＳ
関連ウィルスの抗原成分として使用する。
は界面活性剤を０．０１〜２．０％含む緩衝液を、上記
ＡＩＤＳ関連ウィルスの沈殿物に加え、約０〜２５℃の
温度下に、３０分〜２４時間攪拌して可溶化する。この
可溶化液を遠心分離して得られる上清液′ｔ−ＡＩＤＳ
関連ウィルスの抗原成分として使用する。
本発明における担体粒子は間接凝集反応に使用可能なも
のであれば如何なる担体でも良く、ヒト、羊、ニワトリ
等の動物の赤血球、及びゼラチン粒子（％開昭５７−１
５３６５８号明細書参照）等の人工担体を例示すること
が出来る。特にゼラチン粒子は非特異反応が少なく、用
途に応じた性質を付加できる等、ＡＩＤＳ関連ウィルス
抗体検出のための間接凝集反応用担体として優れた長所
を有している。
のであれば如何なる担体でも良く、ヒト、羊、ニワトリ
等の動物の赤血球、及びゼラチン粒子（％開昭５７−１
５３６５８号明細書参照）等の人工担体を例示すること
が出来る。特にゼラチン粒子は非特異反応が少なく、用
途に応じた性質を付加できる等、ＡＩＤＳ関連ウィルス
抗体検出のための間接凝集反応用担体として優れた長所
を有している。
ＡＩＤＳ関連ウィルスの抗原成分を担体粒子に感作する
方法は、一般の抗原を感作する公知の方法によればよい
。例えばタンニン酸、ゲルタールアルデヒド、ビスソア
ゾベンソジン、トリレンジイソシアネート、ジフロロノ
ニトロベンゼン、カルがジイミド類、千ノン類、及び塩
化クロム等のいわゆるカップリング剤を１吏用する方法
あるいは物理吸着させる方法などによって行うことが出
来る。
方法は、一般の抗原を感作する公知の方法によればよい
。例えばタンニン酸、ゲルタールアルデヒド、ビスソア
ゾベンソジン、トリレンジイソシアネート、ジフロロノ
ニトロベンゼン、カルがジイミド類、千ノン類、及び塩
化クロム等のいわゆるカップリング剤を１吏用する方法
あるいは物理吸着させる方法などによって行うことが出
来る。
感作ぼ畝酸性の条注下で行うのがよく、特にＰＩｔ ５
〜７の範囲が好適であり、これより高＜゛〔も低くても
よい結果は１（すられない。
〜７の範囲が好適であり、これより高＜゛〔も低くても
よい結果は１（すられない。
製造例１の（１）で調製したＡＩＤＳ関連ウィルス抗原
を製造例１の（２）の感作粒子の調製方法に従って、各
−０条注下でゼラチン粒子に感作した。得られたＡＩＤ
Ｓ関連ウィルス抗原の感作粒子を常法に従って試験し次
結果を第−表に示す。
を製造例１の（２）の感作粒子の調製方法に従って、各
−０条注下でゼラチン粒子に感作した。得られたＡＩＤ
Ｓ関連ウィルス抗原の感作粒子を常法に従って試験し次
結果を第−表に示す。
第−表
ｐｉ−１４，０−−
ｐｌ−１５，０＋
ＰＨ６，０＋
ＰＩ−１７，０＋
ＰＩ−１８，０＋ 判定不能上記第−表にお
いて、対照試験とｉｄ ＡＩＤＳ関連ウィルス抗原の感
作粒子と血清希釈溶液との反応を示し、力価試験とｉ
ＡＩＤＳ関連ウィルス抗体陽性血清との反応を示す。又
、第−表において、−は凝集反応が生じなかったことを
、＋に凝集反応が生じ友ことを示す・ 第−表よシ、感作時のＰＨはｐｉ４５．０〜ｐＨ７，０
の範囲が好ましいことが判明する。
いて、対照試験とｉｄ ＡＩＤＳ関連ウィルス抗原の感
作粒子と血清希釈溶液との反応を示し、力価試験とｉ
ＡＩＤＳ関連ウィルス抗体陽性血清との反応を示す。又
、第−表において、−は凝集反応が生じなかったことを
、＋に凝集反応が生じ友ことを示す・ 第−表よシ、感作時のＰＨはｐｉ４５．０〜ｐＨ７，０
の範囲が好ましいことが判明する。
こうしＣ得られたＡＩＤＳ関連ウィルス抗原感作粒子は
通常は常法によシ凍結乾燥し、復元後、被験試料（通常
は血清）希釈溶液、標準血清、未感作担体などと組合せ
てＡ■Ｄｓ関連ウィルつ抗体検出用間接凝果反応試薬と
してＡＩＤＳ関連ウィルス抗体の検出・測定に供される
。
通常は常法によシ凍結乾燥し、復元後、被験試料（通常
は血清）希釈溶液、標準血清、未感作担体などと組合せ
てＡ■Ｄｓ関連ウィルつ抗体検出用間接凝果反応試薬と
してＡＩＤＳ関連ウィルス抗体の検出・測定に供される
。
キットの調製は通常の方法に従って行えばよく、例えば
感作粒子、未感作担体、標準面？′Ｆ？（対照用陽性血
清）に、被験血清の稀釈用溶液及び必要に応じて感作粒
子の凍結乾燥品溶解用溶液等を組合せることによりキッ
ト化することができる。
感作粒子、未感作担体、標準面？′Ｆ？（対照用陽性血
清）に、被験血清の稀釈用溶液及び必要に応じて感作粒
子の凍結乾燥品溶解用溶液等を組合せることによりキッ
ト化することができる。
本発明において、感作粒子と組合わせる被験試料の希釈
用溶液のＰＩ（は倣アルカリ性がよく、特にｐ）１７〜
９の軛ｖＭが好適であって、これより高いかあるいは低
いと、ＩＩｉ集の有無の判定が困難になるため不適当で
ある。
用溶液のＰＩ（は倣アルカリ性がよく、特にｐ）１７〜
９の軛ｖＭが好適であって、これより高いかあるいは低
いと、ＩＩｉ集の有無の判定が困難になるため不適当で
ある。
上記第−表のｐ）１６．０の条件で調製され九ＡＩＤＳ
関連ウィルス抗原の感作粒子を、各−の被験試料の希釈
用溶液を用い°Ｃ１常法に従って試験した給米を第二人
に示す。
関連ウィルス抗原の感作粒子を、各−の被験試料の希釈
用溶液を用い°Ｃ１常法に従って試験した給米を第二人
に示す。
第二人
希釈用溶液の−対照試験 力価試験ＰＨ６，０＋
判屋不Ｈヒ ｐＨ７，０＋ ｐ）ｔ ８． Ｏ−１− ｐＨ９，０−１− 上記第二人における、対照試験、力価試験および−、十
に第−表と同一である。
判屋不Ｈヒ ｐＨ７，０＋ ｐ）ｔ ８． Ｏ−１− ｐＨ９，０−１− 上記第二人における、対照試験、力価試験および−、十
に第−表と同一である。
第二人より、被験試料の希釈用溶液のＰＨは−７，０〜
ｐＨ９，０の範囲が好ましいことが判明する。
ｐＨ９，０の範囲が好ましいことが判明する。
本発明の試薬を用いてＡＩＤＳ関連ウィルス抗体を測定
する方法は、閾接縦果反応を利用した測定方法の常法に
よればよく、例えば、マイクロプレートのウェルに被検
血清を入れてその希釈列を作り、各ウェルにＡＩＤＳ関
連ウィルス抗原感作粒子を加えて混合し、通常１〜３時
間程度靜置し、この感作粒子の凝集像を観察して凝集の
有無を判定することによシ行われる。
する方法は、閾接縦果反応を利用した測定方法の常法に
よればよく、例えば、マイクロプレートのウェルに被検
血清を入れてその希釈列を作り、各ウェルにＡＩＤＳ関
連ウィルス抗原感作粒子を加えて混合し、通常１〜３時
間程度靜置し、この感作粒子の凝集像を観察して凝集の
有無を判定することによシ行われる。
ＡＩＤＳ関連ウィルス抗原感作粒子浮遊液をＡＩＤＳ患
者血清の二倍段階希釈液に９６穴マイクログレートのウ
ェルに等量ずつ加え、混合し、室温に静置する。１〜３
時間後、各穴を観察すると、希釈倍数の低い穴にはＡＩ
ＤＳ関連ウィルス抗原感作粒子が底−面に広がって、凝
集像が見られ、希釈倍数の高い所では、ブタン状となり
凝集像が認められない。ＡＩＤＳ関連ウィルス抗原を感
作していない粒子は低希釈から高希釈の血清中いずれに
も凝集像は見られない。また、健康なヒト血清について
同様に検査した場合には、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗原感
作粒子及び未感作粒子にも凝集像は見られない。
者血清の二倍段階希釈液に９６穴マイクログレートのウ
ェルに等量ずつ加え、混合し、室温に静置する。１〜３
時間後、各穴を観察すると、希釈倍数の低い穴にはＡＩ
ＤＳ関連ウィルス抗原感作粒子が底−面に広がって、凝
集像が見られ、希釈倍数の高い所では、ブタン状となり
凝集像が認められない。ＡＩＤＳ関連ウィルス抗原を感
作していない粒子は低希釈から高希釈の血清中いずれに
も凝集像は見られない。また、健康なヒト血清について
同様に検査した場合には、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗原感
作粒子及び未感作粒子にも凝集像は見られない。
このことは、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗原感作粒子上にあ
る抗原と、ＡＩＤＳ恵者血清中に存在するＡＩＤＳ関連
ウィルス抗体が特異的に反応していることを示している
。
る抗原と、ＡＩＤＳ恵者血清中に存在するＡＩＤＳ関連
ウィルス抗体が特異的に反応していることを示している
。
製造例１
（１） ＡＩＤＳＩＤＳ関連フィルス抗原ＡＩＤＳＩ
ＤＳ関連フィルス１ｔ−４細胞に感染させ、ＡＩＤＳ関
連ウィルス産生細胞として株化した細胞を、ワシ胎児血
清を１０％含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に接種し、
５％炭酸ガスを含む空気中で３７℃で４日間培養した。
ＤＳ関連フィルス１ｔ−４細胞に感染させ、ＡＩＤＳ関
連ウィルス産生細胞として株化した細胞を、ワシ胎児血
清を１０％含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に接種し、
５％炭酸ガスを含む空気中で３７℃で４日間培養した。
この培養液２０リツトルを３０００ｒｐｍで１０分間遠
心して細胞を除去して上清を得た。この上清をあらかじ
め連続ゾーナルローター内に作成した０〜５０％のシ璽
糖密度勾配に重層し、循環しなから３００００ ｒｐｍ
で超遠心分離を行ったＯ 得られたウィルス画分を再び遠心用チューブ内に作製し
た２０〜５５チのシマ糖連続密度勾配に重層し、スイン
グローターにょシ２５０００ｒｐｍにて４時間超遠心分
離を行った。得られたウィルス画分を４５００Ｏｒｐｍ
にて６０分間遠心してウィルスを沈澱させて、この沈澱
に０．５％ノニデットｐ−４０含有リン酸緩衝生理食塩
液を加えた。沈澱を浮遊させ、氷水中で３０分間攪拌し
て溶解させ、１３０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し
て得られた上清をＡＩＤＳ関連ウィルス抗原とした。
心して細胞を除去して上清を得た。この上清をあらかじ
め連続ゾーナルローター内に作成した０〜５０％のシ璽
糖密度勾配に重層し、循環しなから３００００ ｒｐｍ
で超遠心分離を行ったＯ 得られたウィルス画分を再び遠心用チューブ内に作製し
た２０〜５５チのシマ糖連続密度勾配に重層し、スイン
グローターにょシ２５０００ｒｐｍにて４時間超遠心分
離を行った。得られたウィルス画分を４５００Ｏｒｐｍ
にて６０分間遠心してウィルスを沈澱させて、この沈澱
に０．５％ノニデットｐ−４０含有リン酸緩衝生理食塩
液を加えた。沈澱を浮遊させ、氷水中で３０分間攪拌し
て溶解させ、１３０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し
て得られた上清をＡＩＤＳ関連ウィルス抗原とした。
（２）感作粒子の調製
特開昭ｓ ｓ −１１３７５４号公報の実施例１に記載
された方法で製造したゼラチン粒子を５ ｐｐｍのタン
ニン酸を含むｐＨ６，０の０．１５ＭＩＪン酸塩緩衝生
理食塩液（以下０．１５ＭＰＢＳ（メｉ６．ｏ）と略す
）０．１５Ｍ ＰＢＳ （ｐ１′＋７．２ ）中に粒子
濃度が２．５％になるように分散させ、３７℃で１０分
間加温した。この粒子を遠心分離して回収し、生理食塩
液で３回遠心分離法で洗浄してから０．１５ Ｍ ＰＢ
Ｓ （ｐＨ６，０）に５チになるように分散させた。
された方法で製造したゼラチン粒子を５ ｐｐｍのタン
ニン酸を含むｐＨ６，０の０．１５ＭＩＪン酸塩緩衝生
理食塩液（以下０．１５ＭＰＢＳ（メｉ６．ｏ）と略す
）０．１５Ｍ ＰＢＳ （ｐ１′＋７．２ ）中に粒子
濃度が２．５％になるように分散させ、３７℃で１０分
間加温した。この粒子を遠心分離して回収し、生理食塩
液で３回遠心分離法で洗浄してから０．１５ Ｍ ＰＢ
Ｓ （ｐＨ６，０）に５チになるように分散させた。
一方、（１）で調製したＡＩＤＳ関連ウィルス抗原を０
．１５Ｍ ＰＢＳ （ＰＩ−１６，０）で５０倍に希釈
し、前記のタンニン酸処理粒子分散液に等容のこの希釈
液を混合して３７℃で４０分間加温し、粒子にＡＩＤＳ
ＩＤＳ関連ワイル全抗原させた。との感作粒子を生理食
塩液で３回遠心洗浄してから浮遊分散液（リン酸水素二
ナトリウム・１２水塩１．９２０．ｌｉ’、リン酸二水
素カリウム０．２９１ｇ、塩化ナトリウム０．４３８
、ｆ、アラビアゴム０．２５ξ、グリシン１．５ ＃
、ちめろさ−る０、０１Ｎ及び正常家兎血清１． Ｏｒ
ｎｌを全量１００Ｍになるように、精製水に溶解した液
）に分散させた。この分散液を凍結乾燥し、ＡＩＤＳ関
連ウィルス抗原感作ゼラチン粒子の凍結乾燥品を得た。
．１５Ｍ ＰＢＳ （ＰＩ−１６，０）で５０倍に希釈
し、前記のタンニン酸処理粒子分散液に等容のこの希釈
液を混合して３７℃で４０分間加温し、粒子にＡＩＤＳ
ＩＤＳ関連ワイル全抗原させた。との感作粒子を生理食
塩液で３回遠心洗浄してから浮遊分散液（リン酸水素二
ナトリウム・１２水塩１．９２０．ｌｉ’、リン酸二水
素カリウム０．２９１ｇ、塩化ナトリウム０．４３８
、ｆ、アラビアゴム０．２５ξ、グリシン１．５ ＃
、ちめろさ−る０、０１Ｎ及び正常家兎血清１． Ｏｒ
ｎｌを全量１００Ｍになるように、精製水に溶解した液
）に分散させた。この分散液を凍結乾燥し、ＡＩＤＳ関
連ウィルス抗原感作ゼラチン粒子の凍結乾燥品を得た。
（３）被験血清希釈用溶液の調製
リン酸水素二ナトリウム・１２水塩１．９２０Ｊｉ’、
リン酸二水素カリウム０．２９１，９、塩化ナトリウム
０．４３１．アラビアゴム０．２５Ｎ、アジ化ナトリウ
ム０．１５Ｆ、を全量１００ｍ１になるように精製水に
溶解して血清希釈溶液とした。
リン酸二水素カリウム０．２９１，９、塩化ナトリウム
０．４３１．アラビアゴム０．２５Ｎ、アジ化ナトリウ
ム０．１５Ｆ、を全量１００ｍ１になるように精製水に
溶解して血清希釈溶液とした。
（４） キットの調製
感作粒子の凍結乾燥品のほかに抗原未感作粒子の凍結乾
燥品及び対照用陽性血清の凍結乾燥品も別途に調製し、
感作粒子溶解用溶液及び被験血清希釈用溶液を組合せて
、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗体検出用試薬キットとした。
燥品及び対照用陽性血清の凍結乾燥品も別途に調製し、
感作粒子溶解用溶液及び被験血清希釈用溶液を組合せて
、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗体検出用試薬キットとした。
製造例２
常法に従ってホルマリンで固定した羊赤血球を５ｖ／ｖ
％になるようＫ Ｏ，１５Ｍ ＰＢＳ （ｐＨ６，０）
に浮遊させた液に等量の０．００１ ｗ／ｖ％タンニン
酸の０、１５ Ｍ ＰＢＳ （ｐｉ−１６，０）溶液を
加え、ときどき攪拌しながら３７℃で１５分間反応させ
た。この血球を生理食塩液で洗浄後、０．１５ Ｍ Ｐ
ＢＳ （ｐｉｉ５．Ｑ ）ｆ５ｖ／ｖ％になるように浮
遊させてタンニン酸処理血球液を得た。
％になるようＫ Ｏ，１５Ｍ ＰＢＳ （ｐＨ６，０）
に浮遊させた液に等量の０．００１ ｗ／ｖ％タンニン
酸の０、１５ Ｍ ＰＢＳ （ｐｉ−１６，０）溶液を
加え、ときどき攪拌しながら３７℃で１５分間反応させ
た。この血球を生理食塩液で洗浄後、０．１５ Ｍ Ｐ
ＢＳ （ｐｉｉ５．Ｑ ）ｆ５ｖ／ｖ％になるように浮
遊させてタンニン酸処理血球液を得た。
製造例１の（１）で調製したＡＩＤＳＩＤＳ関連フィル
ス０．１５ＭＰＢＳ （ｐＨ６，０）を加えて５０倍に
希釈し、前記のタンニン酸処理血球液に等量のこの希釈
液を加えて３７℃で３０分間加温した。血球を遠心分離
して０．１５ Ｍ ＰＢＳ （７，２’）で２回洗浄し
、浮遊分散液に浮遊させて凍結乾燥し、感作血球の凍結
乾燥品を得た。
ス０．１５ＭＰＢＳ （ｐＨ６，０）を加えて５０倍に
希釈し、前記のタンニン酸処理血球液に等量のこの希釈
液を加えて３７℃で３０分間加温した。血球を遠心分離
して０．１５ Ｍ ＰＢＳ （７，２’）で２回洗浄し
、浮遊分散液に浮遊させて凍結乾燥し、感作血球の凍結
乾燥品を得た。
リン酸水素二ナトリクム・１２水塩１．９２（１゜リン
酸二水素カリウム０．２９１Ｆ、塩化ナトリウム０．４
３８．９．アラビアゴム０．２５：！、アジ化ナナトリ
ウム０．１５．９正常家兎血清１． Ｑ ｍｌ、羊赤血
球膜破砕液２． Ｏｍｌ！及び牛赤血球膜破砕液１．
Ｏｍｌを全量１００ｄになるように精製水に溶解して血
清希釈用液とした。
酸二水素カリウム０．２９１Ｆ、塩化ナトリウム０．４
３８．９．アラビアゴム０．２５：！、アジ化ナナトリ
ウム０．１５．９正常家兎血清１． Ｑ ｍｌ、羊赤血
球膜破砕液２． Ｏｍｌ！及び牛赤血球膜破砕液１．
Ｏｍｌを全量１００ｄになるように精製水に溶解して血
清希釈用液とした。
感作血球凍結乾燥品に未感作血球の乾燥品、対照用陽性
血清及び上記血清希釈用液を組み合わせ、ＡＩＤＳＩＤ
Ｓ関連フィルス出用試薬キットとした。
血清及び上記血清希釈用液を組み合わせ、ＡＩＤＳＩＤ
Ｓ関連フィルス出用試薬キットとした。
各製造例で得られた試薬キットを用い、各種被検血清に
ついて間接凝集反応テストを行なった。
ついて間接凝集反応テストを行なった。
得られた結果を第３表に示す。
この結果より、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗体の検出におい
て、間接凝集法は螢光抗体法と全く同等の検出感度及び
特異性を有することが分る。
て、間接凝集法は螢光抗体法と全く同等の検出感度及び
特異性を有することが分る。
本発明の試薬によって、多数の検体を簡便な操作で迅速
に測定出来る。例えば、螢光抗体法あるいは酵素抗体法
の場合、検査開始から結果を書名まで、洗浄も加え数回
の操作を必要とされるが、本発明の試薬を用いた場合、
希釈血清に加えるだけで、結果がでるまで静置しておけ
ばよく、非常に簡便である。また、結果の判定には特殊
な器材を必要とせず肉眼で判定出来る。しかも試薬調製
に用いたＡＩＤＳ関連ウィルス抗原は界面活性剤処理に
よって、感染性をなくしであるため安全性も高い。これ
らの点は、多数の検体の検査に適している。
に測定出来る。例えば、螢光抗体法あるいは酵素抗体法
の場合、検査開始から結果を書名まで、洗浄も加え数回
の操作を必要とされるが、本発明の試薬を用いた場合、
希釈血清に加えるだけで、結果がでるまで静置しておけ
ばよく、非常に簡便である。また、結果の判定には特殊
な器材を必要とせず肉眼で判定出来る。しかも試薬調製
に用いたＡＩＤＳ関連ウィルス抗原は界面活性剤処理に
よって、感染性をなくしであるため安全性も高い。これ
らの点は、多数の検体の検査に適している。
ＡＩＤＳ関連ワイルス抗体が検出された場合、ＡＩＤＳ
関連ワイルスを体内に保有していると考えられるので、
本発明試薬を用い、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗体の有無を
検査することにより、接触及び輸血などによる感染を防
止しうるので臨床上非常に有用である。
関連ワイルスを体内に保有していると考えられるので、
本発明試薬を用い、ＡＩＤＳ関連ウィルス抗体の有無を
検査することにより、接触及び輸血などによる感染を防
止しうるので臨床上非常に有用である。
Claims (3)
- （１）担体粒子に後天性免疫不全症候群関連ウイルスの
抗原成分を感作させた感作粒子を主剤とする後天性免疫
不全症候群関連ウイルス抗体検出用間接凝集反応試薬 - （２）被験試料の希釈用溶液のｐＨが７．０〜９．０の
範囲であることを特徴とする特許請求の範囲第１項の後
天性免疫不全症候群関連ウイルス抗体検出用間接凝集反
応試薬 - （３）担体粒子に後天性免疫不全症候群関連ウイルスの
抗原成分を感作させるときのｐＨが５．０〜７．０の範
囲であることを特徴とする特許請求の範囲第１項の後天
性免疫不全症候群関連ウイルス抗体検出用間接凝集反応
試薬
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61024626A JPS62182662A (ja) | 1986-02-06 | 1986-02-06 | ウイルス抗体検出用試薬 |
| DE8787301017T DE3770651D1 (de) | 1986-02-06 | 1987-02-05 | Reagenz zum nachweis vom antikoerper des virusantigens. |
| EP87301017A EP0233061B1 (en) | 1986-02-06 | 1987-02-05 | Reagent for detecting antibody to viral antigen |
| NO870461A NO870461L (no) | 1986-02-06 | 1987-02-05 | Reagens for paavisning av antistoff mot virusantigener. |
| KR1019870000951A KR960005366B1 (ko) | 1986-02-06 | 1987-02-06 | 후천성 면역결핍 증후군(aids) 관련 바이러스에 대한 항체 검출용 시약 |
| FI870500A FI870500A (fi) | 1986-02-06 | 1987-02-06 | Reagens foer bestaemning av antikropp mot virusantigen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61024626A JPS62182662A (ja) | 1986-02-06 | 1986-02-06 | ウイルス抗体検出用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62182662A true JPS62182662A (ja) | 1987-08-11 |
Family
ID=12143350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61024626A Pending JPS62182662A (ja) | 1986-02-06 | 1986-02-06 | ウイルス抗体検出用試薬 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0233061B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62182662A (ja) |
| KR (1) | KR960005366B1 (ja) |
| DE (1) | DE3770651D1 (ja) |
| FI (1) | FI870500A (ja) |
| NO (1) | NO870461L (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4921787A (en) * | 1987-05-01 | 1990-05-01 | Cambridge Bioscience Corporation | Detection of antibodies to human immunodeficiency virus by agglutination of antigen coated latex |
| CA1308652C (en) * | 1987-09-17 | 1992-10-13 | Carmel J. Hillyard | Agglutination assay |
| US4879211A (en) * | 1987-11-30 | 1989-11-07 | United Biomedical Inc. | Rapid immunoagglutination test for presence of HIV in body fluids |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5951355A (ja) * | 1982-09-17 | 1984-03-24 | Fujirebio Inc | 抗ウイルス抗体検出用試薬 |
| JPS6067859A (ja) * | 1983-09-15 | 1985-04-18 | インスティチュート・パスツール | リンパ節疾患及び後天性免疫不全症候群の診断用抗原組成物、検出方法及び診断キット |
| JPS60111159A (ja) * | 1983-11-21 | 1985-06-17 | Tetsuo Tomiyama | 結核菌リン脂質感作ラテックス及びそれを用いた結核菌リン脂質抗体の検出方法 |
| JPS60209179A (ja) * | 1984-04-02 | 1985-10-21 | Tetsuo Tomiyama | 肺炎マイコプラズマ脂質抗原レシチン複合物感作ラテツクス試薬及びそれを用いた肺炎マイコプラズマ抗体の検出方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS502730B1 (ja) * | 1970-12-26 | 1975-01-29 | ||
| JPS5962527A (ja) * | 1982-09-30 | 1984-04-10 | Eisai Co Ltd | 成人ｔ細胞白血病関連抗原の製造方法 |
| JPS6044870A (ja) * | 1983-08-22 | 1985-03-11 | Fujirebio Inc | 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗体検出用試薬 |
| FR2580177B2 (fr) * | 1985-04-15 | 1989-06-02 | Pasteur Institut | Antigenes apparentes a la glycoproteine d'enveloppe du virus du sida, notamment precurseurs de cette glycoproteine, procedes d'obtention de ces antigenes et moyens mis en oeuvre dans ces procedes, applications de ces antigenes a la preparation de compositions immunogenes ou pour le diagnostic du sida ou des affections qui lui sont apparentees |
-
1986
- 1986-02-06 JP JP61024626A patent/JPS62182662A/ja active Pending
-
1987
- 1987-02-05 EP EP87301017A patent/EP0233061B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-05 NO NO870461A patent/NO870461L/no unknown
- 1987-02-05 DE DE8787301017T patent/DE3770651D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-06 FI FI870500A patent/FI870500A/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-02-06 KR KR1019870000951A patent/KR960005366B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5951355A (ja) * | 1982-09-17 | 1984-03-24 | Fujirebio Inc | 抗ウイルス抗体検出用試薬 |
| JPS6067859A (ja) * | 1983-09-15 | 1985-04-18 | インスティチュート・パスツール | リンパ節疾患及び後天性免疫不全症候群の診断用抗原組成物、検出方法及び診断キット |
| JPS60111159A (ja) * | 1983-11-21 | 1985-06-17 | Tetsuo Tomiyama | 結核菌リン脂質感作ラテックス及びそれを用いた結核菌リン脂質抗体の検出方法 |
| JPS60209179A (ja) * | 1984-04-02 | 1985-10-21 | Tetsuo Tomiyama | 肺炎マイコプラズマ脂質抗原レシチン複合物感作ラテツクス試薬及びそれを用いた肺炎マイコプラズマ抗体の検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI870500A (fi) | 1987-08-07 |
| NO870461L (no) | 1987-08-07 |
| FI870500A0 (fi) | 1987-02-06 |
| KR870007685A (ko) | 1987-09-21 |
| EP0233061B1 (en) | 1991-06-12 |
| EP0233061A3 (en) | 1988-01-07 |
| DE3770651D1 (de) | 1991-07-18 |
| NO870461D0 (no) | 1987-02-05 |
| EP0233061A2 (en) | 1987-08-19 |
| KR960005366B1 (ko) | 1996-04-24 |
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