JP2022104553A - ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット、およびその製造方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キットの提供。【解決手段】本検査用キットは、捕捉試薬と検出用緩衝液と試験紙とを備え、前記捕捉試薬は、ビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰであり、前記検出用緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０及び７．５％のＢＳＡを含んでなり、前記試験紙は底板を有し、底板上には左から右の順で試料投入パッド、蛍光微小球結合釈放パッド、ニトロセルロース膜及び吸水パッドを段階状に順次固定され、前記蛍光微小球結合釈放パッドはユーロピウム蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの結合液をポリエステル繊維に吹き付けることにより調製され、ニトロセルロース膜には左から右の順でＵＭＯＤモノクローナル抗体から構成された検出バンドとヤギ抗ウサギＩｇＧから構成された参照バンドが順次設けられる。【選択図】図１

Description

本発明は、生物医学的検出の技術分野に属し、特に、ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キットに関する。
尿路上皮癌は、人間の生命と健康を厳しく脅かす重大な疾患の１つである。「早期発見、早期診断、早期治療」は、尿路上皮癌の診断及び治療のための目下重要な発展方向及び最も効果的な方法となり、患者の生存率を大幅に向上させることができる。尿路上皮癌は、腎盂癌や膀胱癌や尿管癌などを含む。臨床的に一般的に用いられている既存の検査方法には尿剥離細胞診や画像検査等がある。尿剥離細胞診の主なマーカーはＮｅｕ５Ｇｃ（Ｎ－グリコリルノイラミン酸）であり、検出原理は糖鎖抗体間の特異性反応に基づいて検出を行うが、Ｎｅｕ５Ｇｃはヒトとニワトリを除くすべての哺乳動物の体内に存在するためマウスに強い免疫応答を引き起こすことができなく、モノクローナル抗体の調製がより難しい。Ｎｅｕ５ＧｃはニワトリがＩｇＹ抗体を生ずるように誘導することができるが、誘導された抗体がポリクローナル抗体であるため、Ｎｅｕ５Ｇｃの癌マーカーとして特異性が低くなる。
関連研究により、シアル酸が細胞膜糖タンパク質の修飾のための重要な構成部分であることが表明されており、既に「ウロモジュリンの構造解析及びヒト***症におけるその機能研究」などのようにシアル酸によって修飾されたＵＭＯＤ（ウロモジュリン）についての関連報告（Ｗｅｉｓｓ Ｇｒｅｇｏｒ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０２０，３６９：１００５－１０１０）もあり、その補足資料の実験方法において、ヒト尿中のシアル酸修飾ＵＭＯＤの調製方法が開示され、すなわち、膀胱癌患者の尿を珪藻土で純化してＮｅｕ５Ｇｃによって修飾されたＵＭＯＤ糖タンパク質を調製する方法が開示されている。また、シアル酸修飾ＵＭＯＤが大腸菌の凝集を促進し、尿路の細菌感染を阻害する機能を有することも開示されている。
中国特許文献（中国特許出願第２０１３１０５０１３６６．２号、発明名称が「ヤツメウナギリ氏タンパク質、その調製方法及び腫瘍性疾患の予防及び治療用薬物の調製ための使用」）は、ヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰの調製方法を開示している。
ＬＩＰの腫瘍細胞に対しての特異的識別及び選択的殺傷機能は既に証明されている（Ｐａｎｇ Ｙｕｅ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｌａｍｐｒｅｙ ｓｕｐｒａｎｅｕｒａｌ ｂｏｄｙ ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｙｔｏｃｉｄａｌ ａｃｔｉｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ，２０１７，１５：４２）。また、ＬＩＰが腫瘍細胞膜表面の脂質ラフト構造においてＮｅｕ５Ｇｃ末端によって修飾された糖型構造を特異的に認識できることについても報告されている（Ｐａｎｇ Ｙｕｅ， Ｇｏｕ Ｍｅｎｇ， Ｙａｎｇ Ｋａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｃｉｄａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｌａｍｐｒｅｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ，２０１９，１７：５４．）。
しかし、シアル酸修飾ＵＭＯＤをマーカーとした、ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査に関する発明についてはまだ報告されていない。
本発明は、先行技術における上記の技術的問題を解決するために、ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キットを提供することを目的とする。
本発明の目的を実現するための技術的手段は以下のとおりである。
本発明のＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キットは、捕捉試薬と検出用緩衝液と試験紙とを備え、前記捕捉試薬は、ビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰであり、前記検出用緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０及び７．５％のＢＳＡを含んでなり、前記試験紙は、底板を有し、底板上には左から右の順で試料投入パッド、蛍光微小球結合釈放パッド、ニトロセルロース膜及び吸水パッドが段階状になるように順次固定され、前記蛍光微小球結合釈放パッドは、ユーロピウム蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの結合液をポリエステル繊維上に吹き付けることにより調製され、前記ニトロセルロース膜には左から右の順でＵＭＯＤモノクローナル抗体から構成された検出バンドとヤギ抗ウサギＩｇＧから構成された参照バンドが順次設けられる。
前記ビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰは、試験管に濃度が０．５ｍｇ／ｍＬであるヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰの水溶液を加えた後、ビオチンを加えて、室温で十分に混合して混合液を得、混合液を脱塩カラムで純化することにより調製され、前記ヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰの水溶液とビオチンとの投与量の比率は１ｍＬ：２ｍｇである。
前記ユーロピウム蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの結合液の調製方法は、
活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を調製するステップと、
活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球と濃度が１．４１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンＳＡと濃度が５ｍｇ／ｍＬのウサギＩｇＧとを２：３：０．５の体積比で混合した後、結合緩衝液を加えて活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、３７℃で２時間反応させるステップと、
反応液を４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ａを取るステップと、
沈殿物Ａに洗浄液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ｂを取るステップと、
沈殿物Ｂにブロッキング液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、微小球懸濁液を得るステップと、
４℃、１５０００×ｇの条件下で微小球懸濁液を１５分間遠心分離して沈殿物Ｃを取るステップと、
沈殿物Ｃに保存液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ｄを取るステップと、
沈殿物Ｄを保存液で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈するステップであって、前記保存液は、ｐＨが７．８であり、再蒸留水を溶媒とし、２５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ ｂａｓｅと、０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムと、１ｗｔ％のウシ胎児アルブミンと、０．０５ｗｔ％のＴｗｅｅｎ－２０と、５ｗｔ％のトレハロースとを含むステップと、を含む。
本発明において、ウサギＩｇＧの代わりに、マウスＩｇＧを用いてもよく、マウスＩｇＧを用いる場合、それに応じてヤギ抗マウスＩｇＧを用いて参照バンドを構成する。
本発明は、シアル酸修飾ＵＭＯＤをマーカーとして、ＬＩＰに基づいて尿中のＵＭＯＤを修飾したＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キットを提供し、即ち、ＬＩＰとＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを結合させ、結合物中のＮｅｕ５Ｇｃ修飾ＵＭＯＤと検出バンドに事前にコーテイングされているＵＭＯＤモノクローナル抗体を結合させることで、ＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃの含有量を正確に検出し、さらに正常なヒトと良性疾患（炎症や嚢胞等の良性腫瘍）と尿路上皮癌とを区別することができる。本発明によって提供された検査用キットは、簡単な操作や高感度や特異性という利点を有し、大量の試料に対して迅速にスクリーニングを行うことが可能であり、優れた臨床検体検出機能を有する。
本発明の実施形態に係る異なる人群別の尿検出結果を示す概略図である。 本発明の実施形態に係る膀胱癌患者の各病期段階での尿検出結果を示す概略図である。
本発明の、ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キットは、捕捉試薬と検出用緩衝液と試験紙とを備える。前記捕捉試薬は、ビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰであり、前記検出用緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０及び７．５％ＢＳＡを含んでなり、前記試験紙は、底板を有し、底板上には左から右の順で試料投入パッド、蛍光微小球結合釈放パッド、ニトロセルロース膜及び吸水パッドが段階状になるように順次固定されており、前記蛍光微小球結合釈放パッドは、ユーロピウム蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの結合液をポリエステル繊維に吹き付けることにより調製され、ニトロセルロース膜には、左から右の順でＵＭＯＤモノクローナル抗体から構成された検出バンドとヤギ抗ウサギＩｇＧから構成された参照バンドが順次設けられる。ＵＭＯＤモノクローナル抗体はＡＢｃｌｏｎａｌ会社から購入し、ヤギ抗ウサギＩｇＧは上海生物生工株式会社から購入した。
ビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰは、次の方法に従って調製する。
試験管に質量濃度が０．５ｍｇ／ｍＬであるヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰの水溶液１ｍＬを加えた後、２ｍｇのビオチンを加え、室温でボルテックスミキサーで２時間十分に混合して混合液を得る。混合液を脱塩カラムで純化し、４℃、５０００×ｇの条件下で５分間遠心分離し、流出液をマイクロピペットで注意深く吸い取ってビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰを得る。ヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰとビオチンの供給源は次のとおりである。ヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰは、中国特許文献（出願番号が２０１３１０５０１３６６．２、発明名称が「ヤツメウナギリ氏タンパク質、その調製方法及び腫瘍性疾患の予防及び治療用薬物の調製のための使用」）に開示された調製方法に従って調製し、ビオチンはＴｈｅｒｍｏ生物会社から購入した。
ストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧがコーテイングされた蛍光微小球結合液は、次の方法に従って調製する。
ａ．従来技術の方法に従って、活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を調製する：
１ｍＬのカルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球の活性化緩衝液を試験管に加え、ボルテックスミキサーで十分に混合してカルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を懸濁し、４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して上清液をマイクロピペットで吸い取り、このステップをもう１回繰り返す。カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球はＴｈｅｒｍｏ生物会社から購入した。
１４μＬのカルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球の活性化試剤ＥＤＣ及び１３０μＬの試剤ＮＨＳを加え、ボルテックスミキサーで十分に混合してカルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を懸濁し、混合液を２ｍＬの遠心分離管に移し、８５４μＬの活性化緩衝液を加えて、室温下で微小球ミキサーで３０分間旋回してから４℃、１５０００×ｇの条件下で３０分間遠心分離し、上清液をマイクロピペットで吸い取る。
１ｍＬの結合緩衝液を加えて、カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を再懸濁し、超音波処理を行って微小球が均一に分散するように再懸濁した。超音波処理は、５０Ｗで１秒間作動、１秒間停止、３分間持続作動を繰り返すように操作した。後述の超音波処理の条件も同様である。次いで、４℃、１５０００×ｇの条件下で３０分間遠心分離して上清液をマイクロピペットで吸い取り、このステップをもう１回繰り返し、活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を得る。
ｂ．活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球、ストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧを取って混合した後、結合緩衝液を加えて活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、３７℃の条件下において、ボルテックスミキサーで十分に混合し、２時間結合反応させる。前記活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球、ストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの投与の体積はそれぞれ２００ｍＬ、３００ｍＬ及び５０ｍＬであり、ストレプトアビジンＳＡの濃度は１．４１ｍｇ／ｍＬであり、ウサギＩｇＧの濃度は５ｍｇ／ｍＬである。ストレプトアビジンＳＡはｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ウサギＩｇＧは上海生物生工株式会社から購入した。
ｃ．４℃、１５０００×ｇの条件下で結合反応液を１５分間遠心分離して沈殿物Ａを取る。
ｄ．沈殿物Ａに洗浄液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ｂを取り、このステップをもう１回繰り返す。
ｅ．沈殿物Ｂにブロッキング液を加えて超音波処理を行って再懸濁した後、別の遠心分離管に移し、ボルテックスミキサーで十分に混合してカルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を懸濁させ、１時間回転して標識を行い、微小球懸濁液を得る。
ｆ．４℃、１５０００×ｇの条件下で微小球懸濁液を１５分間遠心分離して沈殿物Ｃを取る。
ｇ．沈殿物Ｃに保存液を加え、超音波処理によりカルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を再懸濁し、４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ｄを取り、このステップをもう１回繰り返す。
ｈ．沈殿物Ｄを保存液で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈する。保存液は、２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ、０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、１ｗｔ％のウシ胎児アルブミン、０．０５ｗｔ％のＴｗｅｅｎ－２０、及び５ｗｔ％のトレハロースを含み、保存液の溶媒は再蒸留水であり、保存液のｐＨは７．８である。
本発明の、ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キットは、以下のステップに従って使用する。
Ｃ１．検体の準備：患者の尿１ｍＬを採集して、３０００×ｇの条件下で３０分間遠心分離して、尿の残留物を取り除き、上清液を検体として採取する。
Ｃ２．１００μＬのステップＣ１の検体と１００μＬの希釈した捕捉試薬（ビオチン化されたＬＩＰタンパク質）とを混合して混合液を得る。希釈した捕捉試薬は、ビオチン化されたＬＩＰタンパク質と検出用緩衝液を１：５０の体積比で希釈することにより得られる。
Ｃ３．１００μＬのステップＣ２で得られた混合液を試料投入パッドに滴下して２分間静置してから、試験紙を乾式蛍光免疫測定装置ＡＦＳ１０００に入れて検出を行い、検出バンドと参照バンドの蛍光を観察して記録し、すなわち、ＨＴとＨＣ及びその比率Ｒ（ＨＴ／ＨＣ）を検出する。検出バンドの蛍光強度が参照バンドの蛍光強度に比べて差（区別）がない場合、尿検体にＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃがないことを示し、検出バンドの蛍光強度が参照バンドの蛍光強度に比べて差がある場合、尿検体にＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃがあることを示す。標準曲線と比較して解析することで、検体におけるＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃの含有量を算出することができる。参照バンドに蛍光強度がない場合、結果は無効である。
本発明により提供する尿路上皮癌の検査用キットは、４℃、３ヶ月以内の条件下で性能が安定し、検出指標に偏差が発生しない。
標準曲線は、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ：０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）を用いて、濃度がそれぞれ０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬであるＮｅｕ５Ｇｃ修飾ＵＭＯＤの標準品溶液を調製し、検体の代わりにそれぞれの標準品溶液を用いて、上記の検出方法に従って検出を行い、２分後に検出された蛍光を観察するとのことにより得る。なお、並行実験を１０回繰り返す。本発明において、Ｎｅｕ５Ｇｃ修飾ＵＭＯＤの検出に用いた標準品の最低濃度は３０ｎｇ／ｍＬである。Ｎｅｕ５Ｇｃ修飾ＵＭＯＤ標準品は、従来技術に報告された方法により調製する。具体的に、膀胱癌患者の尿を珪藻土で純化することによりＮｅｕ５Ｇｃによって修飾されたＵＭＯＤ糖タンパク質（Ｎｅｕ５Ｇｃ修飾ＵＭＯＤ）を調製する。
本発明の検出原理は次のとおりである。被検者の尿タンパク質をＬＩＰ-ビオチン化溶液と混合した後、尿検体にＮｅｕ５Ｇｃによって修飾されたＵＭＯＤ糖タンパク質がある場合、ＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５ＧｃがＬＩＰ-ビオチンと結合して複合体を形成することができる。複合体中のＬＩＰ-ビオチンは、蛍光微小球結合釈放パッド内のストレプトアビジンＳＡ免疫蛍光微小球と結合することができ、検出バンドまでクロマトグラフィーされる時、複合体中のＮｅｕ５Ｇｃ修飾ＵＭＯＤは、検出バンドに事前にコーテイングされていたＵＭＯＤモノクローナル抗体と結合する。検出バンドの蛍光強度は、尿検体中のＮｅｕ５Ｇｃ修飾ＵＭＯＤ糖タンパク質の濃度に正比例し、検体の検出結果を測定器で読み取って定量的に解析する。参照バンドまでクロマトグラフィーされる時、ウサギＩｇＧ結合蛍光微小球が参照バンドに事先にコーテイングされていたヤギ抗ウサギＩｇＧと結合する。参照バンドに蛍光信号があるかどうかに基づいて、検体の投入及びクロマトグラフィー操作過程に問題があるかどうかを判断する。
（実施例１）
本発明により提供する尿路上皮癌の検査用キットを用いて、正常なヒト６３９例、良性疾患２５例（膀胱炎症８例、膀胱嚢胞７例、膀胱ポリープ６例、腎炎４例）、尿路上皮癌患者９９例（膀胱癌５２例、腎臓癌２０例、前立腺癌２７例）の尿検体を検査測定した。結果を図１に示す。図１に示すように、正常なヒトの尿検体においてＬＩＰ特異的に識別される、ＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃの含有量は６７．６３±９．３１ｎｇ／ｍｇであり、良性疾患２５例の尿検体においてＬＩＰ特異的に識別される、ＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃの含有量は７０．７１±８．２０ｎｇ／ｍｇであって、正常な人に比べて有意差はない。この結果は、泌尿器系癌のスクリーニングにおいて、尿路の炎症などの良性の問題がある場合、ＬＩＰ特異的に識別される、ＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃの含有量が正常な人に比べて差はなく、偽陽性の結果が発生しないことを示す。膀胱癌患者５２例の尿検体においてＬＩＰ特異的に識別される、ＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃの含有量が２６０．２５±２９．３８ｎｇ／ｍｇであり、腎癌患者２０例の含有量は２８０．５４±１１．８１ｎｇ／ｍｇ、前立腺癌患者２７例の含有量は２６４．３４±３０．６３ｎｇ／ｍｇである。従って、本発明の検査キットは、尿路上皮癌の診断に優れた特異性を備える。
多数の検体を有する膀胱癌患者５２例をさらに分析して結果を図２に示す。
図２に示すように、異なる病期段階の膀胱癌患者の尿においてＬＩＰ特異的に識別される、ＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃの含有量に差があり、膀胱癌の病期段階が初期段階Ｔａである場合、尿においてＬＩＰ特異的に識別される、ＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃの含有量が大幅に増加している。検体においてＬＩＰ特異的に識別される、ＵＭＯＤ糖タンパク質を修飾したＮｅｕ５Ｇｃの含有量と比べることにより、検体が尿路上皮癌であるかどうかを検出することが可能であり、その正解率は８０％以上に達する。
（付記）
（付記１）
捕捉試薬と検出用緩衝液と試験紙とを備え、前記捕捉試薬は、ビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰであり、前記検出用緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０及び７．５％のＢＳＡを含んでなり、前記試験紙は、底板を有し、前記底板上には左から右の順で試料投入パッド、蛍光微小球結合釈放パッド、ニトロセルロース膜及び吸水パッドを段階状に順次固定され、前記蛍光微小球結合釈放パッドは、ユーロピウム蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの結合液をポリエステル繊維上に吹き付けることにより調製され、前記ニトロセルロース膜には左から右の順でＵＭＯＤモノクローナル抗体から構成された検出バンドとヤギ抗ウサギＩｇＧから構成された参照バンドが順次設けられる、ことを特徴とするＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット。
（付記２）
濃度が０．５ｍｇ／ｍＬであるヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰの水溶液とビオチンを１ｍＬ：２ｍｇの投与量の比率で室温で十分に混合して混合液を得、混合液を脱塩カラムで純化してビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰを得る、ことを特徴とする付記１記載のＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット。
（付記３）
ユーロピウム蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの結合液は以下の調製方法に従って調製され、前記調製方法は、
活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を調製するステップと、
前記活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球と濃度が１．４１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンＳＡと濃度が５ｍｇ／ｍＬのウサギＩｇＧとを２：３：０．５の体積比で混合した後、結合緩衝液を加えて前記活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、３７℃で２時間反応させるステップと、
反応液を４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ａを取るステップと、
前記沈殿物Ａに洗浄液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ｂを取るステップと、
前記沈殿物Ｂにブロッキング液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、微小球懸濁液を得るステップと、
４℃、１５０００×ｇの条件下で前記微小球懸濁液を１５分間遠心分離して沈殿物Ｃを取るステップと、
前記沈殿物Ｃに保存液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ｄを取るステップと、
前記沈殿物Ｄを保存液で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈するステップであって、前記保存液は、ｐＨが７．８であり、再蒸留水を溶媒とし、２５ｍｍｏｌ／Ｌの Ｔｒｉｓ ｂａｓｅと、０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムと、１ｗｔ％のウシ胎児アルブミンと、０．０５ｗｔ％のＴｗｅｅｎ－２０と、５ｗｔ％のトレハロースとを含むステップと、を含む、ことを特徴とする付記１又は付記２記載のＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット。
ユーロピウム蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの結合液、即ちストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧがコーテイングされたユーロピウム蛍光微小球を含む結合液は、次の方法に従って調製する。
Ｃ２．１００μＬのステップＣ１の検体と１００μＬの希釈した捕捉試薬（ビオチン化されたＬＩＰタンパク質）とを混合して混合液を得る。希釈した捕捉試薬は、ビオチン化されたＬＩＰタンパク質と検出用緩衝液を１：５０の体積比で希釈することにより得られる。検出用緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０及び７．５％のＢＳＡを含む水溶液である。

Claims (3)

  1. 捕捉試薬と検出用緩衝液と試験紙とを備え、前記捕捉試薬は、ビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰであり、前記検出用緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０及び７．５％のＢＳＡを含んでなり、前記試験紙は、底板を有し、前記底板上には左から右の順で試料投入パッド、蛍光微小球結合釈放パッド、ニトロセルロース膜及び吸水パッドを段階状に順次固定され、前記蛍光微小球結合釈放パッドは、ユーロピウム蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの結合液をポリエステル繊維上に吹き付けることにより調製され、前記ニトロセルロース膜には左から右の順でＵＭＯＤモノクローナル抗体から構成された検出バンドとヤギ抗ウサギＩｇＧから構成された参照バンドが順次設けられる、ことを特徴とするＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット。
  2. 濃度が０．５ｍｇ／ｍＬであるヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰの水溶液とビオチンを１ｍＬ：２ｍｇの投与量の比率で室温で十分に混合して混合液を得、混合液を脱塩カラムで純化してビオチン化結合のヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰを得る、ことを特徴とする請求項１記載のＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット。
  3. ユーロピウム蛍光ナノ粒子とストレプトアビジンＳＡ及びウサギＩｇＧの結合液は以下の調製方法に従って調製され、前記調製方法は、
    活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を調製するステップと、
    前記活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球と濃度が１．４１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンＳＡと濃度が５ｍｇ／ｍＬのウサギＩｇＧとを２：３：０．５の体積比で混合した後、結合緩衝液を加えて前記活性化カルボキシル化ユーロピウム蛍光ナノ微小球を２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、３７℃で２時間反応させるステップと、
    反応液を４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ａを取るステップと、
    前記沈殿物Ａに洗浄液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ｂを取るステップと、
    前記沈殿物Ｂにブロッキング液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、微小球懸濁液を得るステップと、
    ４℃、１５０００×ｇの条件下で前記微小球懸濁液を１５分間遠心分離して沈殿物Ｃを取るステップと、
    前記沈殿物Ｃに保存液を加えて超音波処理を行って再懸濁し、４℃、１５０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離して沈殿物Ｄを取るステップと、
    前記沈殿物Ｄを保存液で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈するステップであって、前記保存液は、ｐＨが７．８であり、再蒸留水を溶媒とし、２５ｍｍｏｌ／Ｌの Ｔｒｉｓ ｂａｓｅと、０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムと、１ｗｔ％のウシ胎児アルブミンと、０．０５ｗｔ％のＴｗｅｅｎ－２０と、５ｗｔ％のトレハロースとを含むステップと、を含む、ことを特徴とする請求項１又は請求項２記載のＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット。
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