JPS6147184A - 体細胞集積浮遊培養法及びそれに使用する培養器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は体細胞集積浮遊培養法及びそれに使用する培養
器に関するもの゛である。

［従来の技術］ 体細胞の大通培養法の原理は、浮遊細胞ではその培養体
積を、付着依存性細胞ではその培養表面積を拡大する事
にある。そして現在までの所、その方法を具体化するも
のとしては浮遊細胞、マイクロキャリヤーに接着させた
付着依存性細胞の低速攪拌培養器がある（例えば、スピ
ンナー培養フラスコ、低速のジャーファーメンタ−等）
。

この低速攪拌培養器は、培養器中の培養液を低速（５〜
３０回／分程度）で攪拌する事により、浮遊細胞及びマ
イクロキャリヤー付着細胞を円滑に懸濁浮遊し、培養体
積を増大させると同時に、培地と細胞との接触数の増大
による培養成分吸収率の向上を計っているものである。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、浮遊細胞（非付着依存性細胞）及び付着
依存性細胞の両者共に、上述の従来培養法における攪拌
操作は、培養液と細胞との間に剪断力を生じさせ、細胞
に対し損傷を与え、その増殖性をある程度抑制させてし
まう。

即ち、非付着依存性細胞の場合には攪拌によって生じる
剪断力により直接的損傷が起こり、付着依存性細胞の場
合には剪断力によりマイクロキャリヤ−１１ＪＩ！複合
体の分離及び付着細胞への直接的損傷が起こるのである
。

［問題点を解決するための手段３ 本発明者は、培養細胞の損傷を軽減出来る浮遊培養法及
びそれに使用する培養器を鋭意研究し、本発明を完成し
た。

即ち、本発明の第１の方法の発明は、多孔性部材で仕切
った培養器の一方の槽に体細胞を集積保持し、他方の槽
の培地を攪拌する事により、前記一方の槽中の集積細胞
を緩慢な浮遊状態として培養する事を特徴とする体細胞
集積浮遊培養法であり、第２の方法の発明は高酸密度培
養を検討した結果のものであり前記第１の、方法の発明
において、培地槽に新鮮培地を供給し一１細胞保持槽に
培地を移行させ、該細胞保持槽から消費され゛た培地を
排出して連続的に培養する。事を特徴とする体細胞集積
浮遊培養法である。第３の方法の発明は、前記第２の方
法の発明において、細胞保持槽から排出した培地の一部
を新鮮培地と共に培地槽に供給して培地を循環させつつ
培養する事を特徴とする体細胞集積浮遊培養法にかかる
ものである。

又、以上の方法の発明を実施するだめの本発明の装置の
発明は、培養器の内部を、培地は通過させるがｍ胞は通
過させない多孔性部材により細胞保持槽と培地槽とに仕
切り、該培地槽内の培地を攪拌可能に構成した事を特徴
とする体細胞集積浮遊培養器にかかるものである。

以上において、培養器を仕切る多孔性部材は、培地は通
過させるが培養細胞は通過させない大ぎさの孔を多数有
するものであればよく、具体的にはナイロンメツシュ等
のメツシュ布が使用できる。

使用する培養器の大きさ、形状は培養の目的、量等に応
じて適宜のものを使用する事が出来、培養器を仕切る方
法は上下、左右或は斜めのいずれでもよいが、上下に仕
切るのが好ましい。

仕切った培養器のいずれの槽を細胞保持槽としても差し
支えないが、上下に仕切った場合には上槽を細胞保持槽
とし下槽を培地槽とするのがよい。

培地槽の培地の攪拌手段は、スピンナー等を利用する事
ができる。

本発明の培養法に適用できる体ＩＩＩ胞としては、非付
着依存性の浮遊ｍ胞及び付着依存性細胞がある。具体的
には、浮遊細胞の例としてプラズマサイトーマ（Ｓ　Ｐ
　２１０　）　、Ｓ　Ｐ　２１０．１１１胞とジステン
パーウィルスで免疫したＢＡＬＤ／Ｃマウスの牌細胞と
細胞融合法によって造成したハイブリドーマ等がある。

付着依存性細胞の例としてはベロ（Ｖｅｒｏ）ｌ胞、ジ
ステンパーウィルス等があり、この場合にはマイクロキ
ャリヤーを接着担体として使用する。

又使用する培地は培養すべき体細胞の種類に応じて適宜
のものを選択して使用し、その他の培養条件（培養温度
等）は通常の一般的条件で行なう。

［作　　　用］ 第１の方法はいわゆるバッチ培養法といわれるもので、
細胞保持槽と培地ｍ＜攪拌ＷＪ）とを多孔性部材からな
るＩＩ飽保持膜により隔離したので、攪拌槽での攪拌力
により培地が強制的に流動され、前記多孔性部材を通っ
て細胞保持槽の浮遊細胞、マイクロキャリヤー・付着依
存性細胞複合体等の集積細胞が緩慢な浮遊状態に浮遊さ
れる。即ち、従来の培養槽の培地全体を攪拌する事を排
したので、この攪拌が細胞へ及ぼす１ｔＡ傷筈の悪影響
を低減する事ができる。

第２の方法は連続ｉ８養法であり、攪拌槽から新鮮培地
を供給し、細胞培養槽へ新鮮培地を通過させ、消費した
培地を細胞保持槽から排出する事により、通常のバッチ
ワイズ（３ａｔｃｈｖｉｓｅ）法に比べ約８〜１０倍の
細胞を得る事ができる。

第３の方法は、連続培養法における培地の流通を連続と
した循環式連続培養法であり、ウィルスの培養を飛躍的
に向上する事ができる。

更に本発明の培養器によれば、上記の各培養方法をきわ
めて容易に実施する事を可能とするものである。

［実　施　例］ 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。

実施例１ 第１図は本発明の培養器の一実施例であり、円筒状の培
地槽１の上方に円筒状の細胞保持槽２を位置させ、両槽
１，２間にデフロン製の目皿３で両側から挟持したフィ
ルター４を介在させ、オーリングパイトン５及びオーリ
ング６を介して両槽１，２を水密となる様固定用リング
７により固定しである。８は培地槽１の側部に設けた培
地入口、９は細胞保持層２の上部側面に設けた培地出口
、１０はキャップ、１１はパツキン、１２は培地槽１の
底部においてマグネチツクスターラ−１３により外部か
ら回転されるスクリュー型マグネットを示ず。

非付着依存性細胞例えばプラズマサイトーマ（ＳＰ２１
０）の培養を行なう場合には、６０〜９０賜のフィルタ
ー１４を装置し、培地ＷＪ１での攪拌速度を３５〜５０
０回／分とする事で、フィルター４上の細胞を緩慢な浮
遊状態に置く事が出来る。Ｍ１図に示した規模（全高３
５０ｍｍ　、直径１１０ｍｍ　）の本発明の培養器によ
れば、細胞の接ｐｉ　ｆｆｊｌ　ヲ１０”５佃ｐ　、／
　１１ｅ　Ｘ　１（１１１トＬ　ｊＣ’１合、１０日間
培養で１ｏ　６−３細胞／１！となり、従来のスピンナ
ー培養の１０５．５細胞／１１に比して約１０倍の増殖
性を得る事が出来る。

実施例２ 更に効果的なのは、体細胞の生産物を得る場合である。

例えば、５Ｐ２１０１胞とジステンパーウィルスで免疫
したＢＡＬ８／ｃマウスの牌細胞と細胞融合法によって
造成したバイブリド、−マの培養を前記第１図に示した
本発明の培養器で行なう事によって、従来のスピンナー
フラスコの同容量培地を用いるよりも、モノクローナル
抗体の生産性を向上する事が出来る。

即ち、１！のスピンナーフラスコ（３ｏｒｐｍの回転数
、培地としてＤ−ＭＥＭ、牛胎児血清１，０％）の培養
７日間では、抗ジステンパーモノクローナル抗体が５０
０単位／ν１　（Ｓ／Ｎ価）しか生産されないのに対し
、本発明の培養法では５２００単位／Ｗ　（Ｓ／Ｎ価）
を１ｑる事が出来、本発明が従来のスピンナー培養に比
べ、その細胞の生理状態を向上させている事を示してい
る。

実施例３ 第２図は本発明の培養器の他の実施例であり、前記実施
例と略同様の構成において、培地人口８に新鮮培地容器
１５からの管１６を接続し、菌フィルター１７を通して
圧力ガスを該新鮮培地容器１５に送入し、新鮮培地を培
地槽１に供給する様にしである。

重環１１器により、効率の良い培養を行なうには、第２
図の様に培地槽１より新鮮培地を注入し、細胞を培養し
ている細胞保持槽２より排出する事により連続培養法を
取る事が出来る。連続培養法はバッチ法（回分法）に比
し、ＩＩＩＶＩ＆増殖阻害物質の希釈と共に新鮮な栄養
分の供給が出来るので、例えば３．５！の連続培養を行
なう事によって、ハイブリドーマ細胞の培養で総計７日
間で３６４８０単位＃　（Ｓ／Ｎ価）を得る事が出来る
。

実施例４ 担体に接着させた付着依存性１細胞を培養する場合にも
、本発明の培養器は以下のように効果を示す。第１図の
培養器でサイトデツクス（ＣＶｔ０ｄｅＸ）　２１．：
付着したへａ　（Ｖｅｒｏ　）　ｍ胞（Ｉｌｌ胞・担体
複合体）の培養を行なった場合、マイクロキャリヤー上
のベロ細胞の増殖細胞は、通常のスピンナーフラスコ（
１））では５［胞／担体であるのに比べ、本発明の培ｉ
法では８１ＩＩＩｌｉ！／担体に向上させる事が出来る
。

実施例５ 実施例４と同様の培養系にてジステンパーウィルスを培
養した場合、スピンナー培養では１０７／ｙｆであるが
、本発明の培養法では１ｏ９１０ｙ−を得る事が出来る
。

実施例６ 第３図は本発明の培養器の更に他の実施例であり、前記
他の実施例と略同様の構成において細胞保持槽２の培地
出口９に管路１８を接続し、咳管路１８の先端部を分岐
せしめ一方の分岐管１９を排出用とし、他方の分岐管２
０を循環用とし、循環用ポンプ２１により新鮮培地と共
に培地槽１に循環供給するようにしである。

この培養器により循環式連続培養法が行なえ、ジステン
パーウィルスを高生産する事が出来る。

例えばサイトデックス２を２５ｍａ／ｙｆの濃度でベロ
細胞を増殖させ、３．５！の循環式連続培養を行なう事
により総計１ｔ３”ｘ　３．ｓ！のウィルス量を得る事
が出来る。

［発明の効果コ 以上述べたように本発明の体細胞集積浮遊培養法及びそ
れに使用する培養器によれば、培養器内を多孔性部材で
仕切り、一方の槽を１ｏＩｌｌ保持槽とし他方の槽を培
地槽として、培地槽を攪拌させる事により細胞保持槽に
ゆるやかな攪拌効果を波及させて培養するようにしたの
で、培！Ｉｌｌ胞の損傷を著しく軽減する事が出来、効
率のよい培養を行なえる。又、新鮮培地を補給しながら
ａ続的に培養する事により、高密度の細胞培養を行なう
事が出来、更に培地の一部を循環させつつ培養する事に
より、培養液中の細胞生産物の濃度を著しく高める事が
出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の培養器の一実施例の部分切断説明図、
第２図は本発明の培養器の他の実施例の説明図、第３図
は本発明の培ＩＩｌの更に他の実施例の説明図である。 １は培地槽、２はｍ胞保持槽、４はフィルター、８は培
地入口、９は培地出口、１２はスクリュー型マグネット
、１５°は新鮮培地容器を示す。 特　　許　　出　　願　　人 日本全薬工業株式会社 第１図 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）多孔性部材で仕切つた培養器の一方の槽に体細胞を
   集積保持し、他方の槽の培地を攪拌する事により、前記
   一方の槽中の集積細胞を緩慢な浮遊状態として培養する
   事を特徴とする体細胞集積浮遊培養法。 ２）一方の槽に集積保持された細胞が、浮遊細胞である
   特許請求の範囲第１）項記載の体細胞集積浮遊培養法。 ３）一方の槽に集積保持された細胞が、キャリヤーに接
   着させた付着依存性細胞である特許請求の範囲第１）項
   記載の体細胞集積浮遊培養法。 ４）多孔性部材で仕切つた培養器の一方の槽に体細胞を
   集積保持し、他方の槽の培地を攪拌する事により、前記
   一方の槽中の集積細胞を緩慢な浮遊状態とし、該他方の
   槽に新鮮培地を供給し、前記一方の槽に新鮮培地を移行
   させ、該一方の槽から消費された培地を排出して連続的
   に培養する事を特徴とする体細胞集積浮遊培養法。 ５）多孔性部材で仕切つた培養器の一方の槽に体細胞を
   集積保持し、他方の槽の培地を攪拌する事により、前記
   一方の槽中の集積細胞を緩慢な浮遊状態とし、該他方の
   槽に新鮮培地を供給し、前記一方の槽に新鮮培地を移行
   させ、該一方の槽から消費された培地を排出し、該排出
   した培地の一部を新鮮培地と共に前記他方の槽に供給し
   て培地を循環させつつ培養する事を特徴とする体細胞集
   積浮遊培養法。 ６）培養器の内部を、培地は通過させるが細胞は通過さ
   せない多孔性部材により細胞保持槽と培地槽とに仕切り
   、該培地槽内の培地を攪拌可能に構成した事を特徴とす
   る体細胞集積浮遊培養器。 ７）細胞保持槽が培地出口を備えた細胞保持槽であり、
   培地槽が培地入口を備えた培地槽である特許請求の範囲
   第６）項記載の体細胞集積浮遊培養器。