JP3244701B2 - バイオマス粒子の生育方法および装置 - Google Patents
バイオマス粒子の生育方法および装置Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
- C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
- C12M33/22—Settling tanks; Sedimentation by gravity
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 この発明は、バイオマス粒子、特に微小担体結合細胞
を生育させる方法および装置に関する。更に詳しくは、
この発明は、灌流培養バイオリアクタとして知られてい
る攪拌懸濁培養容器と組合せて使用される改良型粒子沈
降隔室に関するものである。
を生育させる方法および装置に関する。更に詳しくは、
この発明は、灌流培養バイオリアクタとして知られてい
る攪拌懸濁培養容器と組合せて使用される改良型粒子沈
降隔室に関するものである。
近年、高い細胞密度の達成を目指して、懸濁状態で細
胞を培養する種々の方法が急速に開発されている。固定
量の栄養培地を利用するバッチ培養システムは、例えば
米国特許第4,166,768号に記載されているような連続ま
たは半連続ベースのシステムに代替されつつある。この
種の連続システムでは、使用済の培養培地は、攪拌培養
培地に浸漬させたフィルタを介して取り除かれることに
なるが、前記フィルタは目詰りするから、連続システム
の操業時間に制限が加わることになる。
胞を培養する種々の方法が急速に開発されている。固定
量の栄養培地を利用するバッチ培養システムは、例えば
米国特許第4,166,768号に記載されているような連続ま
たは半連続ベースのシステムに代替されつつある。この
種の連続システムでは、使用済の培養培地は、攪拌培養
培地に浸漬させたフィルタを介して取り除かれることに
なるが、前記フィルタは目詰りするから、連続システム
の操業時間に制限が加わることになる。
米国特許第4,335,215号には微小担体結合細胞の生育
を改良すると言われている改変された連続培養システム
が開示されている。この改変されたシステムでは、従来
システムにおける浸漬フィルタの代わりに、主培養容器
の外部に置かれる沈降隔室が用いられている。操業中、
培養培地は、主攪拌培養容器から狭いチューブを介して
沈降隔室の底部へ導かれ、その後、使用済み培養培地と
して隔室の頂部を介して外へと抜取られる。前記沈降隔
室内では攪拌は行われず、このため、培養培地と共にチ
ューブを介して沈降隔室に導かれた微小担体ビーズは重
力によって沈降隔室の底部へとゆっくり沈降し、狭いチ
ューブを介して主攪拌培養容器へと戻される。なお、微
小担体ビーズが、沈降隔室の傾斜表面沿いにおいて、ま
た狭いチューブ内において、互いに接触すると、ビーズ
の凝集およびビーズ対ビーズ細胞生育が促進されると言
われている。
を改良すると言われている改変された連続培養システム
が開示されている。この改変されたシステムでは、従来
システムにおける浸漬フィルタの代わりに、主培養容器
の外部に置かれる沈降隔室が用いられている。操業中、
培養培地は、主攪拌培養容器から狭いチューブを介して
沈降隔室の底部へ導かれ、その後、使用済み培養培地と
して隔室の頂部を介して外へと抜取られる。前記沈降隔
室内では攪拌は行われず、このため、培養培地と共にチ
ューブを介して沈降隔室に導かれた微小担体ビーズは重
力によって沈降隔室の底部へとゆっくり沈降し、狭いチ
ューブを介して主攪拌培養容器へと戻される。なお、微
小担体ビーズが、沈降隔室の傾斜表面沿いにおいて、ま
た狭いチューブ内において、互いに接触すると、ビーズ
の凝集およびビーズ対ビーズ細胞生育が促進されると言
われている。
前記したシステムには付随する幾つかの問題がある。
１つは、沈降隔室の底部開口の直径、および沈降隔室と
主容器とを連結する狭いチューブの直径が、比較的小さ
いということである。これらの連結チューブの直径は、
一般に主容器において利用可能な管口の大きさとなる
が、このような狭い領域では、培地の上昇流体速度がビ
ーズの沈降速度より有意に高くなって沈降隔室内のビー
ズが使用済み培養培地と共に排出されてしまうことがあ
り、また、ビーズの凝集を起こさせる。実際、この問題
は米国特許第4,335,215号の特許権者によって予想され
ており、ポンプを逆転させて比較的狭い部分におけるビ
ーズの自由移動を確保することが示唆されている。
１つは、沈降隔室の底部開口の直径、および沈降隔室と
主容器とを連結する狭いチューブの直径が、比較的小さ
いということである。これらの連結チューブの直径は、
一般に主容器において利用可能な管口の大きさとなる
が、このような狭い領域では、培地の上昇流体速度がビ
ーズの沈降速度より有意に高くなって沈降隔室内のビー
ズが使用済み培養培地と共に排出されてしまうことがあ
り、また、ビーズの凝集を起こさせる。実際、この問題
は米国特許第4,335,215号の特許権者によって予想され
ており、ポンプを逆転させて比較的狭い部分におけるビ
ーズの自由移動を確保することが示唆されている。
この設計に付随する他の問題は、システムの殺菌に関
するものである。沈降隔室は主リアクタに対して外部で
あるため、隔室および全ての連結部を殺菌し、また操業
中における殺菌性を維持するのは困難となる。
するものである。沈降隔室は主リアクタに対して外部で
あるため、隔室および全ての連結部を殺菌し、また操業
中における殺菌性を維持するのは困難となる。
発明の要旨 本発明は、連続的または半連続的に新鮮な培養培地を
添加して使用済の培養培地を抜取る攪拌懸濁培養装置に
おいて、バイオマス粒子、特に微小担体結合細胞を生育
させる改良した方法および装置を提供するものである。
その改良点は使用済の培養培地を抜取ることを含み、連
続的または半連続的に抜取るものとする。他の改良点
は、攪拌培養培地に少なくとも部分的に浸漬するように
攪拌懸濁培養容器内に配置した粒子沈降隔室を介して使
用済の培養培地を抜取ることを含む。粒子沈降隔室は中
空の容器で、重力によって沈降する微小担体結合細胞の
ようなバイオマス粒子を攪拌培養培地中に戻す底部開口
と、粒子を含まない使用済培養培地を容器から抜取る頂
部開口とを備えている。沈降隔室は、底部開口を介して
沈降隔室に入る培養培地の流体速度がバイオマス粒子の
沈降速度より有意に小さくなるように構成する。すなわ
ち、沈降隔室の下部内における培養培地の上昇速度は、
下方向へのバイオマス粒子の沈降速度より小さくなけれ
ばならない。
添加して使用済の培養培地を抜取る攪拌懸濁培養装置に
おいて、バイオマス粒子、特に微小担体結合細胞を生育
させる改良した方法および装置を提供するものである。
その改良点は使用済の培養培地を抜取ることを含み、連
続的または半連続的に抜取るものとする。他の改良点
は、攪拌培養培地に少なくとも部分的に浸漬するように
攪拌懸濁培養容器内に配置した粒子沈降隔室を介して使
用済の培養培地を抜取ることを含む。粒子沈降隔室は中
空の容器で、重力によって沈降する微小担体結合細胞の
ようなバイオマス粒子を攪拌培養培地中に戻す底部開口
と、粒子を含まない使用済培養培地を容器から抜取る頂
部開口とを備えている。沈降隔室は、底部開口を介して
沈降隔室に入る培養培地の流体速度がバイオマス粒子の
沈降速度より有意に小さくなるように構成する。すなわ
ち、沈降隔室の下部内における培養培地の上昇速度は、
下方向へのバイオマス粒子の沈降速度より小さくなけれ
ばならない。
図面の説明 図１は、本発明の改良した粒子沈降隔室を備えた攪拌
懸濁培養装置の断面図を示す。
懸濁培養装置の断面図を示す。
図2aは、図１に示した粒子沈降隔室の拡大断面図を示
す。
す。
図2bは、必要に応じて装着する攪拌低減用の格子を備
えた図2aの粒子沈降隔室の底面図を示す。
えた図2aの粒子沈降隔室の底面図を示す。
図3aは、本発明の範囲内の第２の実施例の粒子沈降隔
室を示す。
室を示す。
図3bは、本発明の範囲内の第３の実施例の粒子沈降隔
室を示す。
室を示す。
図4aは、本発明の改良した第４の実施例の粒子沈降隔
室を備えた攪拌懸濁培養装置の断面図を示す。
室を備えた攪拌懸濁培養装置の断面図を示す。
図4bは、図4aに示した培養容器の4b−4b線による頂部
断面図である。
断面図である。
図５、図5a、図5bおよび図5cは、比較試験で試用した
バイオリアクタを示す。
バイオリアクタを示す。
図６は、比較試験で得られた培養時間、灌流速度、バ
イオリアクタ中および回収物中での細胞濃度並びに保持
率をまとめた表図である。
イオリアクタ中および回収物中での細胞濃度並びに保持
率をまとめた表図である。
発明の詳細な説明 本発明の改良した方法および装置は、全ゆる灌流バイ
オリアクタまたは連続細胞培養システムに組合せて利用
することができる。この種のシステムは、全工程に渡っ
て最適な生育条件を維持することにより効率的な細胞の
生育を達成できるように設計されている。このようなシ
ステムは、バイオマス粒子、特に微小担体組合細胞の攪
拌懸濁物として細胞を培養するのに特に適合する。
オリアクタまたは連続細胞培養システムに組合せて利用
することができる。この種のシステムは、全工程に渡っ
て最適な生育条件を維持することにより効率的な細胞の
生育を達成できるように設計されている。このようなシ
ステムは、バイオマス粒子、特に微小担体組合細胞の攪
拌懸濁物として細胞を培養するのに特に適合する。
「バイオマス粒子」という用語は、植物、動物、細
菌、昆虫、カビ、酵母またはハイブリドーマ細胞を含
み、攪拌懸濁培養培地中で生育させることができ、攪拌
しない培地中においては重力により妥当な沈降速度で沈
降するのに十分な質量を有する全ゆる細胞を包含するこ
とを意図し、特に、バイオマス粒子は微小担体結合細胞
を包むものである。「微小担体結合細胞」という用語
は、典型的にはガラス、ポリスチレン、ゼラチン、アガ
ロースまたはセルロースビーズのような微小担体粒子に
結合したC127、COSまたはCHO細胞のような哺乳動物細胞
である足場依存性細胞、および、例えばコラーゲンまた
はゼラチンスポンジマトリックスからなる粒子のような
多孔質微小担体粒子のマトリックス内に結合したハイブ
リドーマ細胞のような足場非依存性細胞を包含すること
を意図する。また「バイオマス粒子」という用語は、微
小担体系に類似して挙動する他の全ての細胞系を包含す
ることも意図し、例えばビーズ中にカプセル封入された
細胞、および微小担体系に類似して重力によって沈降し
得るのに十分な質量の粒子として補集される細胞を含
む。
菌、昆虫、カビ、酵母またはハイブリドーマ細胞を含
み、攪拌懸濁培養培地中で生育させることができ、攪拌
しない培地中においては重力により妥当な沈降速度で沈
降するのに十分な質量を有する全ゆる細胞を包含するこ
とを意図し、特に、バイオマス粒子は微小担体結合細胞
を包むものである。「微小担体結合細胞」という用語
は、典型的にはガラス、ポリスチレン、ゼラチン、アガ
ロースまたはセルロースビーズのような微小担体粒子に
結合したC127、COSまたはCHO細胞のような哺乳動物細胞
である足場依存性細胞、および、例えばコラーゲンまた
はゼラチンスポンジマトリックスからなる粒子のような
多孔質微小担体粒子のマトリックス内に結合したハイブ
リドーマ細胞のような足場非依存性細胞を包含すること
を意図する。また「バイオマス粒子」という用語は、微
小担体系に類似して挙動する他の全ての細胞系を包含す
ることも意図し、例えばビーズ中にカプセル封入された
細胞、および微小担体系に類似して重力によって沈降し
得るのに十分な質量の粒子として補集される細胞を含
む。
典型的な細胞培養灌流システム（攪拌懸濁培養装置）
は図１を参照して説明することができる。この種のシス
テムでは、典型的には微小担体結合細胞であるバイオマ
ス粒子15（説明の目的のために拡大してある）を、バイ
オリアクタすなわち培養容器10内の培養室30に満たした
培養培地16中に懸濁させ、培養室30内の培養培地16は攪
拌機17によって穏やかに振盪させ、培養培地16は培養容
器10内で固定水位に維持する。細胞生育工程を通じて、
必要に応じて酸素、二酸化炭素、pH調節物質等を供給す
ることにより最適な生育条件を維持する。更に、入口ラ
イン11を介して新鮮な培養培地を連続的または半連続的
に培養容器10内に添加しつつ、同時に等量の使用済培養
培地を出口ライン12を介して容器10から抜取る。所要に
応じて、使用済の培養培地の幾分かを容器10に戻してリ
サイクルすることもできる。ライン11および12を介する
培養培地の添加および抜取りは、一般にペリスタポンプ
によって調節するが、圧力差、流速または液体水位を制
御する全ゆる手段を用いることができる。
は図１を参照して説明することができる。この種のシス
テムでは、典型的には微小担体結合細胞であるバイオマ
ス粒子15（説明の目的のために拡大してある）を、バイ
オリアクタすなわち培養容器10内の培養室30に満たした
培養培地16中に懸濁させ、培養室30内の培養培地16は攪
拌機17によって穏やかに振盪させ、培養培地16は培養容
器10内で固定水位に維持する。細胞生育工程を通じて、
必要に応じて酸素、二酸化炭素、pH調節物質等を供給す
ることにより最適な生育条件を維持する。更に、入口ラ
イン11を介して新鮮な培養培地を連続的または半連続的
に培養容器10内に添加しつつ、同時に等量の使用済培養
培地を出口ライン12を介して容器10から抜取る。所要に
応じて、使用済の培養培地の幾分かを容器10に戻してリ
サイクルすることもできる。ライン11および12を介する
培養培地の添加および抜取りは、一般にペリスタポンプ
によって調節するが、圧力差、流速または液体水位を制
御する全ゆる手段を用いることができる。
本発明の改良点は粒子沈降隔室13を使用することにあ
り、第１実施例の粒子沈降隔室13は培養培地16に部分的
に浸漬するように培養容器10内に配置される。この沈降
隔室13をより明瞭に図2b示すが、粒子沈降隔室13は、一
般に好ましくは円筒形状の中空容器14と、重力によって
中空容器14内を沈降するバイオマス粒子15を攪拌培養培
地16へと戻す底部開口18と、使用済の培養培地21を中空
容器14から出口ライン12を介して抜取る頂部開口19とを
備えている。
り、第１実施例の粒子沈降隔室13は培養培地16に部分的
に浸漬するように培養容器10内に配置される。この沈降
隔室13をより明瞭に図2b示すが、粒子沈降隔室13は、一
般に好ましくは円筒形状の中空容器14と、重力によって
中空容器14内を沈降するバイオマス粒子15を攪拌培養培
地16へと戻す底部開口18と、使用済の培養培地21を中空
容器14から出口ライン12を介して抜取る頂部開口19とを
備えている。
前記沈降隔室13は、培養室30から底部開口18を介して
沈降隔室13内に上方向に進入する培養培地16の流体速度
が、沈降隔室13内におけるバイオマス粒子15の沈降速度
より小さく、好ましくは有意に小さくなるように構成す
る。図１および図2aに示す第１実施例では、沈降隔室13
の最上部20は円錐または倒立漏斗形を呈し、この場合、
円錐または倒立漏斗の狭小部分22が頂部開口19を形成す
る。この実施例では、沈降隔室13は培養容器10内の雰囲
気に対して閉止され、頂部開口19は出口ライン12を介し
て培養容器の外部地点と専ら連通する。沈降隔室13の底
部開口18には図2bに示した格子26を嵌合させ、培養室30
内で攪拌されている培養培地16によって引起こされ得る
沈降隔室13内での攪拌の低減または防止を図っている。
沈降隔室13内に上方向に進入する培養培地16の流体速度
が、沈降隔室13内におけるバイオマス粒子15の沈降速度
より小さく、好ましくは有意に小さくなるように構成す
る。図１および図2aに示す第１実施例では、沈降隔室13
の最上部20は円錐または倒立漏斗形を呈し、この場合、
円錐または倒立漏斗の狭小部分22が頂部開口19を形成す
る。この実施例では、沈降隔室13は培養容器10内の雰囲
気に対して閉止され、頂部開口19は出口ライン12を介し
て培養容器の外部地点と専ら連通する。沈降隔室13の底
部開口18には図2bに示した格子26を嵌合させ、培養室30
内で攪拌されている培養培地16によって引起こされ得る
沈降隔室13内での攪拌の低減または防止を図っている。
前記沈降隔室13が種々の他の均等な適切な構成をとり
得ることは容易に明らかであり、よって本発明は前記し
た特定の実施例に限定されるものではない。例えば、図
3aには第２実施例を、図3bには第３実施例をそれぞれ示
す。図3aに示す沈降隔室24は、実質的に円筒形の形状を
有し、培養容器10内の雰囲気に対して開放されていない
点で先に記載したものに類似する。しかしながら、この
実施例では沈降隔室24にその側面に沿って複数の孔23を
配設してあり、これらの孔23は使用に際しては培養室30
の攪拌培養培地16の上面より下側に位置する。これらの
孔23は、培養培地16およびバイオマス粒子15が培養室30
から沈降隔室24に入るような寸法および配置とするが、
その際、攪拌培養培地16の攪拌力による沈降隔室24の中
での攪拌を回避すると共に出口ライン12へのバイオマス
粒子の進入を最小のものとする。
得ることは容易に明らかであり、よって本発明は前記し
た特定の実施例に限定されるものではない。例えば、図
3aには第２実施例を、図3bには第３実施例をそれぞれ示
す。図3aに示す沈降隔室24は、実質的に円筒形の形状を
有し、培養容器10内の雰囲気に対して開放されていない
点で先に記載したものに類似する。しかしながら、この
実施例では沈降隔室24にその側面に沿って複数の孔23を
配設してあり、これらの孔23は使用に際しては培養室30
の攪拌培養培地16の上面より下側に位置する。これらの
孔23は、培養培地16およびバイオマス粒子15が培養室30
から沈降隔室24に入るような寸法および配置とするが、
その際、攪拌培養培地16の攪拌力による沈降隔室24の中
での攪拌を回避すると共に出口ライン12へのバイオマス
粒子の進入を最小のものとする。
図3bに示す他の沈降隔室25は寧ろ異なる構成を有す
る。この実施例は、培養容器10内の雰囲気に対して開放
された比較的広い頂部開口19を備える漏斗形状である。
培養培地16の上面より下方の沈降隔室25の側面には複数
の孔23を配置して、培養室30から培養培地16およびバイ
オマス粒子15の隔室25への進入を図るが、沈降隔室25の
中での攪拌を最小にするような寸法とする。
る。この実施例は、培養容器10内の雰囲気に対して開放
された比較的広い頂部開口19を備える漏斗形状である。
培養培地16の上面より下方の沈降隔室25の側面には複数
の孔23を配置して、培養室30から培養培地16およびバイ
オマス粒子15の隔室25への進入を図るが、沈降隔室25の
中での攪拌を最小にするような寸法とする。
この実施例の出口ライン12は、沈降隔室25の頂部開口
19を介して沈降隔室25の中の培養培地へと延在する浸漬
チューブとなる。
19を介して沈降隔室25の中の培養培地へと延在する浸漬
チューブとなる。
本発明の第４の実施例を図4aおよび図4bに示す。図4a
に示すように、培養容器10、入口ライン11、出口ライン
12、バイオマス粒子15、攪拌培養培地16および攪拌機17
は図１に示す対応する要素と同様である。この実施例の
沈降隔室29は中空容器からなり、隔室中空容器は、培養
容器10の壁により形成される容器壁27と、培養容器の壁
に対して２つの別々の垂直線に沿って接合し接合部分か
ら内方に伸びた壁部分28とから形成される。図4aに示す
ように、壁部分28は培養培地16の水位より上方に延在
し、沈降隔室29の頂部開口19は培養容器10内の雰囲気に
対して開放している。使用済培養培地21は、頂部開口19
を介して沈降隔室29内の培養培地へと通る浸漬チューブ
である出口ライン12を介して抜取られる。沈降隔室29内
に入った全ゆるバイオマス粒子15は、重力により底部開
口18を介して沈降し培養室30の攪拌培養培地16に戻され
る。
に示すように、培養容器10、入口ライン11、出口ライン
12、バイオマス粒子15、攪拌培養培地16および攪拌機17
は図１に示す対応する要素と同様である。この実施例の
沈降隔室29は中空容器からなり、隔室中空容器は、培養
容器10の壁により形成される容器壁27と、培養容器の壁
に対して２つの別々の垂直線に沿って接合し接合部分か
ら内方に伸びた壁部分28とから形成される。図4aに示す
ように、壁部分28は培養培地16の水位より上方に延在
し、沈降隔室29の頂部開口19は培養容器10内の雰囲気に
対して開放している。使用済培養培地21は、頂部開口19
を介して沈降隔室29内の培養培地へと通る浸漬チューブ
である出口ライン12を介して抜取られる。沈降隔室29内
に入った全ゆるバイオマス粒子15は、重力により底部開
口18を介して沈降し培養室30の攪拌培養培地16に戻され
る。
明らかたるように、沈降隔室29にも、図3a、図3bに示
した実施例と同様に、必要に応じて壁部分28に沿って複
数の孔（図示せず）を配置することができ、培養室30か
ら培養培地16およびバイオマス粒子15の沈降隔室29内へ
の進入を図ることができる。勿論、当然のことながら、
全ゆるこの種の孔は出口ライン12から十分に離して配置
すべきであり、培養容器10からのバイオマス粒子15の抜
取りを回避し、また沈降隔室29内での攪拌を最小にする
ような寸法とすべきである。また、沈降隔室29は、その
上にキャップ（図示なし）を載置することにより、必要
に応じて培養容器10内の雰囲気に対して閉止することが
できることも明らかであろう。更なる選択として、壁部
分28は培養容器10の壁と同心の連続環状壁（図示なし）
とすることができ、これにより培養容器の壁と環状壁と
の間の空間が沈降隔室として働く一方、環状壁の内側の
空間が攪拌培養培地を含む培養室となる。
した実施例と同様に、必要に応じて壁部分28に沿って複
数の孔（図示せず）を配置することができ、培養室30か
ら培養培地16およびバイオマス粒子15の沈降隔室29内へ
の進入を図ることができる。勿論、当然のことながら、
全ゆるこの種の孔は出口ライン12から十分に離して配置
すべきであり、培養容器10からのバイオマス粒子15の抜
取りを回避し、また沈降隔室29内での攪拌を最小にする
ような寸法とすべきである。また、沈降隔室29は、その
上にキャップ（図示なし）を載置することにより、必要
に応じて培養容器10内の雰囲気に対して閉止することが
できることも明らかであろう。更なる選択として、壁部
分28は培養容器10の壁と同心の連続環状壁（図示なし）
とすることができ、これにより培養容器の壁と環状壁と
の間の空間が沈降隔室として働く一方、環状壁の内側の
空間が攪拌培養培地を含む培養室となる。
本発明の装置は、ステンレススチール、ガラス、セラ
ミック、高分子等を含むバイオリアクタに適切な全ゆる
殺菌し得る材料により構成することができる。沈降隔室
は培養容器内の全ゆる適切な場所に配置することができ
るため、これは培養容器と同時に殺菌することができ
る。本発明による沈降隔室の使用により、バイオマス粒
子細胞が使用済の培養培地と共に抜取られるのを防止す
るフィルタを用いる必要性が回避され、よってフィルタ
目詰りにより必然的に起こる操業プロセスの時期尚早の
シャットダウンを回避できる。
ミック、高分子等を含むバイオリアクタに適切な全ゆる
殺菌し得る材料により構成することができる。沈降隔室
は培養容器内の全ゆる適切な場所に配置することができ
るため、これは培養容器と同時に殺菌することができ
る。本発明による沈降隔室の使用により、バイオマス粒
子細胞が使用済の培養培地と共に抜取られるのを防止す
るフィルタを用いる必要性が回避され、よってフィルタ
目詰りにより必然的に起こる操業プロセスの時期尚早の
シャットダウンを回避できる。
比較実験 （灌流モードで微小担体付着細胞を生育させる方法およ
び装置並びに従来型のスピンフィルタ装置および方法と
の比較） 本発明の装置および方法を試験し、既存の従来型のス
ピンフィルタと対比した。
び装置並びに従来型のスピンフィルタ装置および方法と
の比較） 本発明の装置および方法を試験し、既存の従来型のス
ピンフィルタと対比した。
比較試験結果を要約すると、本発明によるバイオリア
クタは、微小担体について実質的に100％の細胞保持お
よび95％の全体の細胞保持率を達成した。この新しい装
置では、スピンフィルタ型のバイオリアクタにおいてし
ばしば発生する長期操作の際の目詰りの問題が生じな
い。これが起こると、スピンフィルタの全体の保持率は
50％未満に落ちることとなる。バイオリアクタの有効運
転容積（培養室）は、本発明の装置を使用する場合に更
に高くなる。保持率が高い程細胞の濃度および数が高く
なり、これによりバイオリアクタからの結果生成物が、
従来のバイオリアクタの比較してより大きい収率および
純度でより効率的に提供される。
クタは、微小担体について実質的に100％の細胞保持お
よび95％の全体の細胞保持率を達成した。この新しい装
置では、スピンフィルタ型のバイオリアクタにおいてし
ばしば発生する長期操作の際の目詰りの問題が生じな
い。これが起こると、スピンフィルタの全体の保持率は
50％未満に落ちることとなる。バイオリアクタの有効運
転容積（培養室）は、本発明の装置を使用する場合に更
に高くなる。保持率が高い程細胞の濃度および数が高く
なり、これによりバイオリアクタからの結果生成物が、
従来のバイオリアクタの比較してより大きい収率および
純度でより効率的に提供される。
（材料および方法） チャイニーズハムスターの卵巣（CHO）の細胞系統を
使用して、バイオリアクタ中で生育させた。バイアル内
のCHO細胞を解凍し、その後、250mlのスピンフラスコ、
３リットルのスピンフラスコ、および15リットルのスピ
ンフラスコにより懸濁状態で継代培養した。培地は、イ
スコブス改変ドルベコス培地（Iscove's Modified Dulb
ecco's medium＝IMDM）およびハムスF12改変培地（Ham'
s F12 Modified medium）の１対１の混合物とした。生
育培地に対して３％のウシ胎児血清（FBS）を添加した
が、製造培地は１％のFBSを含むものとした。
使用して、バイオリアクタ中で生育させた。バイアル内
のCHO細胞を解凍し、その後、250mlのスピンフラスコ、
３リットルのスピンフラスコ、および15リットルのスピ
ンフラスコにより懸濁状態で継代培養した。培地は、イ
スコブス改変ドルベコス培地（Iscove's Modified Dulb
ecco's medium＝IMDM）およびハムスF12改変培地（Ham'
s F12 Modified medium）の１対１の混合物とした。生
育培地に対して３％のウシ胎児血清（FBS）を添加した
が、製造培地は１％のFBSを含むものとした。
（従来型のスピンフィルタバイオリアクタの編成） 細胞密度が106/mlに達した後、図５に示した80リット
ルの攪拌バイオリアクタ（オランダ アプリコン製）
に、15リットルのスピンフラスコからの細胞懸濁物を接
種した。図５のバイオリアクタは、従来型のスピンフィ
ルタ（孔径:75ミクロン）と、水中翼インペラと、焼結
スチールスパージャ（孔径:15ミクロン）とを備えてい
る。スピンフィルタおよび水中翼インペラは、頂部駆動
攪拌シャフトに取付けられている。灌流操作のため、新
鮮な培地をバイオリアクタに供給し、50リットルの運転
容積の水位で終端する回収チューブを介して、スピンフ
ィルタの内側から使用済培地を除去した。回収ラインで
は高いポンプ速度を使用して、水位が50リットルを越え
ないよう確保した。その後、培地供給速度によって灌流
を調節した。穿孔したステンレススチールシート（スト
ーク ベコ イントル製、タイプ100B、孔径:150ミクロ
ン）をスピンフィルタの頂部に巻き、フィルタが目詰り
し培地がフィルタの縁をオーバーフローした場合に、微
小担体がスピンフィルタに入るのを排除するようにし
た。
ルの攪拌バイオリアクタ（オランダ アプリコン製）
に、15リットルのスピンフラスコからの細胞懸濁物を接
種した。図５のバイオリアクタは、従来型のスピンフィ
ルタ（孔径:75ミクロン）と、水中翼インペラと、焼結
スチールスパージャ（孔径:15ミクロン）とを備えてい
る。スピンフィルタおよび水中翼インペラは、頂部駆動
攪拌シャフトに取付けられている。灌流操作のため、新
鮮な培地をバイオリアクタに供給し、50リットルの運転
容積の水位で終端する回収チューブを介して、スピンフ
ィルタの内側から使用済培地を除去した。回収ラインで
は高いポンプ速度を使用して、水位が50リットルを越え
ないよう確保した。その後、培地供給速度によって灌流
を調節した。穿孔したステンレススチールシート（スト
ーク ベコ イントル製、タイプ100B、孔径:150ミクロ
ン）をスピンフィルタの頂部に巻き、フィルタが目詰り
し培地がフィルタの縁をオーバーフローした場合に、微
小担体がスピンフィルタに入るのを排除するようにし
た。
（本発明によるバイオリアクタの編成） 従来型のスピンフィルタと本発明によるバイオリアク
タ内の粒子沈降隔室とを比較するため、本発明のバイオ
リアクタを同様に組立てた。図１に示すように、粒子沈
降隔室は、ステンレススチールシリンダ（内径:1cm）
と、多数の孔（孔径:0.5mm）を備えたプラスチック底部
板と、液体の乱流を最小にするようにシリンダの内側に
配した４つのプラスチックシートとから構成してある。
この仕様の装置のため、フィルタハウジング（パウル
製、P/N:VSGTL1G723L）をシリンダとして使用した。こ
れをバイオリアクタの頂部板上で第２回収チューブに対
して３点で締めつけた。底部板の孔により、培地のシリ
ンダへの進入と、微小担体のバイオリアクタ内の培地へ
の沈降とが可能となった。回収の流速は、培地供給の流
速と同一に設定した。供給および回収ポンプは750リッ
トル／日に設定したが、１分サイクルで小さいパーセン
トの時間の間だけ制御装置によって稼働するものとし
た。（50リットルの灌流速度の場合、ポンプ稼働パーセ
ントは50÷750＝6.7％、すなわち分当たり約４秒とな
る。） 80リットル（合計容積）のバイオリアクタにおける50
リットルの運転容積の培地のために、合計250gのサイト
デックス−３（Cytodex−３）を使用して5g/リットルの
最終微小担体濃度を達成した。接種の後、バイオリアク
タの攪拌を10rpmで10分間行い、その後20分間は停止し
て微小担体に対する細胞の付着を促進させた。攪拌を25
rpmで維持する前に、この攪拌パターンを数回繰返し
た。５日目に、バイオリアクタを１日当たり0.5運転容
積、すなわち１日当たり25リットル前後の培地で生育培
地を灌流させた。回収はスピンフィルタにより行った。
タ内の粒子沈降隔室とを比較するため、本発明のバイオ
リアクタを同様に組立てた。図１に示すように、粒子沈
降隔室は、ステンレススチールシリンダ（内径:1cm）
と、多数の孔（孔径:0.5mm）を備えたプラスチック底部
板と、液体の乱流を最小にするようにシリンダの内側に
配した４つのプラスチックシートとから構成してある。
この仕様の装置のため、フィルタハウジング（パウル
製、P/N:VSGTL1G723L）をシリンダとして使用した。こ
れをバイオリアクタの頂部板上で第２回収チューブに対
して３点で締めつけた。底部板の孔により、培地のシリ
ンダへの進入と、微小担体のバイオリアクタ内の培地へ
の沈降とが可能となった。回収の流速は、培地供給の流
速と同一に設定した。供給および回収ポンプは750リッ
トル／日に設定したが、１分サイクルで小さいパーセン
トの時間の間だけ制御装置によって稼働するものとし
た。（50リットルの灌流速度の場合、ポンプ稼働パーセ
ントは50÷750＝6.7％、すなわち分当たり約４秒とな
る。） 80リットル（合計容積）のバイオリアクタにおける50
リットルの運転容積の培地のために、合計250gのサイト
デックス−３（Cytodex−３）を使用して5g/リットルの
最終微小担体濃度を達成した。接種の後、バイオリアク
タの攪拌を10rpmで10分間行い、その後20分間は停止し
て微小担体に対する細胞の付着を促進させた。攪拌を25
rpmで維持する前に、この攪拌パターンを数回繰返し
た。５日目に、バイオリアクタを１日当たり0.5運転容
積、すなわち１日当たり25リットル前後の培地で生育培
地を灌流させた。回収はスピンフィルタにより行った。
灌流速度および攪拌は運転中に数回調整し、製造、保
持率等に対する効果を検討した。９日目に灌流速度を0.
75容積／日に増加させた。10日目に攪拌速度を50rpmに
増加させた。11日目に灌流速度を１日当たり１運転容積
に増加させた。12日目に、25リットル／日の生育培地
（３％のFBS）および50リットル／日の製造培地（１％
のFBS）を用いて、灌流を１日当たり1.5運転容積に増加
させた。また、12日目に１日当たり1.5容積の製造培地
を用いて灌流を行った。17日目に攪拌速度を50rpmから7
5rpmに増加させ、酸素移送能力を向上させ、発泡を減少
させた。19日目に灌流操作の回収をスピンフィルタから
本装置による内部沈降チューブに切換え、保持率を比較
した。28日目に灌流速度を１日当たり２運転容積に増加
させ、灌流を切換えてスピンフィルタに戻した。30日目
に運転を終了した。
持率等に対する効果を検討した。９日目に灌流速度を0.
75容積／日に増加させた。10日目に攪拌速度を50rpmに
増加させた。11日目に灌流速度を１日当たり１運転容積
に増加させた。12日目に、25リットル／日の生育培地
（３％のFBS）および50リットル／日の製造培地（１％
のFBS）を用いて、灌流を１日当たり1.5運転容積に増加
させた。また、12日目に１日当たり1.5容積の製造培地
を用いて灌流を行った。17日目に攪拌速度を50rpmから7
5rpmに増加させ、酸素移送能力を向上させ、発泡を減少
させた。19日目に灌流操作の回収をスピンフィルタから
本装置による内部沈降チューブに切換え、保持率を比較
した。28日目に灌流速度を１日当たり２運転容積に増加
させ、灌流を切換えてスピンフィルタに戻した。30日目
に運転を終了した。
（結果および考察） 微小担体および付着細胞の保持率は、30日の運転を通
じて100％の一定値のままだった。図６に、培養時間、
灌流速度、バイオリアクタ中および回収物中での細胞濃
度並びに保持率をまとめて表示した。全体の保持率は、
バイオリアクタ中の付着および非付着細胞濃度の和で回
収物中の細胞濃度を割ることによって計算した。23日目
の最悪の場合を例として使用すると、その日における沈
降チューブの全体の保持率は、本発明の灌流について6.
3×105÷（9.8×105＋1.27×107）＝95.4％であった。
じて100％の一定値のままだった。図６に、培養時間、
灌流速度、バイオリアクタ中および回収物中での細胞濃
度並びに保持率をまとめて表示した。全体の保持率は、
バイオリアクタ中の付着および非付着細胞濃度の和で回
収物中の細胞濃度を割ることによって計算した。23日目
の最悪の場合を例として使用すると、その日における沈
降チューブの全体の保持率は、本発明の灌流について6.
3×105÷（9.8×105＋1.27×107）＝95.4％であった。
19日目にスピンフィルタから沈降チューブに灌流を切
換える前に、バイオリアクタの運転容積は10％高く増加
していたが、これはスピンフィルタの目詰りが既に起こ
ったことを示すものであった。バイオリアクタ中の培地
水位はスピンフィルタの縁より高いため、培地はフィル
タをオーバーフローした。スピンフィルタの頂部の穿孔
遮蔽体は、微小担体の回収帯域への進入を防止し得る
が、懸濁細胞についてはできない。本発明の沈降チュー
ブバイオリアクタの使用へと19日目に回収モードに対し
て切換えを行わなかったならば、目詰りは更に悪くな
り、懸濁細胞の保持率は更に減少していたであろう。
換える前に、バイオリアクタの運転容積は10％高く増加
していたが、これはスピンフィルタの目詰りが既に起こ
ったことを示すものであった。バイオリアクタ中の培地
水位はスピンフィルタの縁より高いため、培地はフィル
タをオーバーフローした。スピンフィルタの頂部の穿孔
遮蔽体は、微小担体の回収帯域への進入を防止し得る
が、懸濁細胞についてはできない。本発明の沈降チュー
ブバイオリアクタの使用へと19日目に回収モードに対し
て切換えを行わなかったならば、目詰りは更に悪くな
り、懸濁細胞の保持率は更に減少していたであろう。
沈降チューブを使用した後は、微小担体および付着細
胞の保持率は100％のままだった。本発明の沈降チュー
ブバイオリアクタを使用することにより、合計の保持率
は95％を越えた優れたものとなった。
胞の保持率は100％のままだった。本発明の沈降チュー
ブバイオリアクタを使用することにより、合計の保持率
は95％を越えた優れたものとなった。
沈降チューブ装置はスピンフィルタと対比し得る保持
率を有したが、後者は長期の運転に際してフィルタ目詰
りを起こしがちであることを銘記すべきである。本発明
の他の利益は、沈降チューブはスピンフィルタより遥か
に小さい容積を占めるという点である。この結果、沈降
チューブを使用すると、バイオリアクタの実際の運転容
積が大きくなる。また最近の研究によれば、スピンフィ
ルタを介する酸素および栄養物の拡散は非常に遅く、こ
れによりスピンフィルタ内部で著量の細胞が死亡に至る
ことも示されている。これに対して、本発明の沈降チュ
ーブバイオリアクタはこの種の問題を被らず、十分な酸
素および栄養の供給を含むものである。スピンフィルタ
の設計より遥かに大きな板に対する孔を備える沈降チュ
ーブの設計は、この点で明らかに利点を有する。
率を有したが、後者は長期の運転に際してフィルタ目詰
りを起こしがちであることを銘記すべきである。本発明
の他の利益は、沈降チューブはスピンフィルタより遥か
に小さい容積を占めるという点である。この結果、沈降
チューブを使用すると、バイオリアクタの実際の運転容
積が大きくなる。また最近の研究によれば、スピンフィ
ルタを介する酸素および栄養物の拡散は非常に遅く、こ
れによりスピンフィルタ内部で著量の細胞が死亡に至る
ことも示されている。これに対して、本発明の沈降チュ
ーブバイオリアクタはこの種の問題を被らず、十分な酸
素および栄養の供給を含むものである。スピンフィルタ
の設計より遥かに大きな板に対する孔を備える沈降チュ
ーブの設計は、この点で明らかに利点を有する。
ポンプ速度は、沈降チューブのより高い合計保持率を
減少させることができることを銘記すべきである。例え
ば、ポンプ流速は150リットル／日に設定することがで
きる。50リットル／日の灌流は、１分サイクルでポンプ
の33％稼働により達成することができる。ポンプ速度を
低くすると、より高い保持率に至ることとなる。更なる
分割体を沈降チューブに挿入すると、液体乱流を更に最
小化し、懸濁細胞の保持率を最大化することができる。
減少させることができることを銘記すべきである。例え
ば、ポンプ流速は150リットル／日に設定することがで
きる。50リットル／日の灌流は、１分サイクルでポンプ
の33％稼働により達成することができる。ポンプ速度を
低くすると、より高い保持率に至ることとなる。更なる
分割体を沈降チューブに挿入すると、液体乱流を更に最
小化し、懸濁細胞の保持率を最大化することができる。
以上のように、本発明による装置および方法は、細胞
保持率において対比し得るか更に優れた結果を有するこ
とが示され、また遥かに優れたバイオリアクタ運転容積
および長期操作の際の実質的にゼロの目詰りおよび更に
高い灌流速度を有するものである。
保持率において対比し得るか更に優れた結果を有するこ
とが示され、また遥かに優れたバイオリアクタ運転容積
および長期操作の際の実質的にゼロの目詰りおよび更に
高い灌流速度を有するものである。
本発明のバイオリアクタは、例えば10、20、30、40、
50、60、70、80、90または100日を越える、または１、
２、３、４、５、６、７、８、９、10、11または12か月
を越える長期間の生育の間、従来のバイオリアクタを越
えて優れた細胞保持率並びに生育および製造速度を有す
ることが期待される。
50、60、70、80、90または100日を越える、または１、
２、３、４、５、６、７、８、９、10、11または12か月
を越える長期間の生育の間、従来のバイオリアクタを越
えて優れた細胞保持率並びに生育および製造速度を有す
ることが期待される。
フロントページの続き (72)発明者 セベイ，ピエール−フランコイス スイス連邦共和国，クリッサー，シーエ イチ−1023，ケミン デ ラ クレセン チネ 27 (56)参考文献 特開 昭62−265（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−95769（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/02 C12M 3/02
Claims (6)
- 【請求項１】攪拌懸濁培養容器内でバイオマス粒子を生
育させる方法であって、（Ａ）前記バイオマス粒子を培
養する前記培養容器内の培養室に新鮮な培養培地を添加
すると共に、（Ｂ）前記培養室の攪拌培養培地に少なく
とも部分的に浸漬させられて粒子沈降隔室を区画する中
空容器を介して、前記培養室から使用済み培養培地を抜
き取ることからなり、 （Ｉ）前記粒子沈降隔室内の前記バイオマス粒子は、重
力により沈降させることで前記中空容器の底部開口を介
して前記培養室の前記攪拌培養培地に戻し、前記使用済
み培養培地は前記中空容器の頂部開口を介して前記粒子
沈降隔室から抜き取り、 （II）前記底部開口を介して前記培養室から前記粒子沈
降隔室に進入する前記培養培地の流体速度は、前記粒子
沈降隔室内における前記バイオマス粒子の沈降速度より
有意に小さくし、 （III）前記中空容器の側面には、前記培養室の前記攪
拌培養培地の上面より下側に位置して前記培養室と前記
粒子沈降隔室とを水平方向において連通させる複数の孔
を設けて、前記培養室から前記粒子沈降隔室に、前記培
養培地及び前記バイオマス粒子を流入させるが、前記培
養室内の前記培養培地の攪拌力は前記孔を介して前記粒
子沈降隔室内に伝達させないバイオマス粒子の生育方
法。 - 【請求項２】内部にバイオマス粒子の培養室を備えた攪
拌懸濁培養容器と、該培養容器内に設けられ前記培養室
内の攪拌培養培地に少なくとも部分的に浸漬させられて
粒子沈降隔室を区画する中空容器とを備え、 （Ｉ）前記中空容器には底部開口と頂部開口とを設け
て、前記底部開口を介して前記粒子沈降隔室内を重力に
より沈降する前記バイオマス粒子を前記培養室の前記攪
拌培養培地に戻し前記頂部開口を介して使用済み培養培
地を前記粒子沈降隔室から抜き取る構成とし、 （II）前記中空容器は、前記底部開口を介して前記培養
室から前記粒子沈降隔室に進入する前記培養培地の流体
速度が、前記粒子沈降隔室内における前記バイオマス粒
子の沈降速度より有意に小さくなる形状とし、 （III）前記中空容器の側面には、前記培養室の前記攪
拌培養培地の上面より下側に位置して前記培養室と前記
粒子沈降隔室とを水平方向において連通させる複数の孔
を設け、前記孔は、前記培養室から前記粒子沈降隔室
に、前記培養培地及び前記バイオマス粒子を流入させる
が、前記培養室内の前記培養培地の攪拌力は前記粒子沈
降隔室内に伝達させない大きさとしたバイオマス粒子の
生育装置。 - 【請求項３】請求項２に記載の装置において、前記頂部
開口は前記培養容器の外部のみに連通させて操業時にお
いては前記粒子沈降隔室が前記培養容器内の雰囲気に対
して閉止されるようにし、前記底部開口は前記頂部開口
より有意に大きく形成し、前記中空容器または前記中空
容器の上側部分は円錐または倒立漏斗形状に形成し、前
記円錐または倒立漏斗の狭小部分により前記頂部開口を
構成したバイオマス粒子の生育装置。 - 【請求項４】請求項２に記載の装置において、前記装置
は、前記培養容器の外部地点から前記頂部開口を介して
前記中空容器内に延在する浸漬チューブを備え、使用に
際しては前記浸漬チューブは前記中空容器内の培養培地
と接触するようにし、前記頂部開口の断面積は前記浸漬
チューブの断面積より大きくしたバイオマス粒子の生育
装置。 - 【請求項５】請求項２〜請求項４のいずれか１項に記載
の装置において、前記中空容器は、前記培養容器の壁の
一部により形成した一方の共通壁と、前記共通壁の両側
に接合し前記培養容器の内方に向かって膨らむ壁とを有
するバイオマス粒子の生育装置。 - 【請求項６】請求項２〜請求項５のいずれか１項に記載
の装置において、前記中空容器のの前記底部開口には、
前記バイオマス粒子の通過は許容するが、前記粒子沈降
隔室内の前記培養培地の攪拌を低減させる格子を設けた
バイオマス粒子の生育装置。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US82230192A | 1992-01-17 | 1992-01-17 | |
| US822,301 | 1992-01-17 | ||
| PCT/US1993/000272 WO1993014192A1 (en) | 1992-01-17 | 1993-01-15 | Method and apparatus for growing biomass particles |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06510205A JPH06510205A (ja) | 1994-11-17 |
| JP3244701B2 true JP3244701B2 (ja) | 2002-01-07 |
Family
ID=25235685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51262993A Expired - Fee Related JP3244701B2 (ja) | 1992-01-17 | 1993-01-15 | バイオマス粒子の生育方法および装置 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5654197A (ja) |
| EP (1) | EP0585419B1 (ja) |
| JP (1) | JP3244701B2 (ja) |
| AT (1) | ATE197813T1 (ja) |
| AU (1) | AU664596B2 (ja) |
| CA (1) | CA2106064C (ja) |
| DE (1) | DE69329706T2 (ja) |
| DK (1) | DK0585419T3 (ja) |
| ES (1) | ES2151901T3 (ja) |
| GR (1) | GR3035408T3 (ja) |
| HK (1) | HK1012674A1 (ja) |
| IL (1) | IL104385A (ja) |
| PT (1) | PT585419E (ja) |
| WO (1) | WO1993014192A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA93310B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US6335191B1 (en) | 1998-02-27 | 2002-01-01 | Nch Corporation | Automated system and method for growing bacteria |
| DE19918409A1 (de) * | 1999-04-22 | 2000-10-26 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Bioreaktor umfassend einen Medienablauf und einen Rührer sowie Rührer und Medienablauf |
| US20040185535A1 (en) * | 2003-03-21 | 2004-09-23 | Giles Wilson | Industrial-scale serum-free production of recombinant FVII in mammalian cells |
| WO2002029045A2 (en) * | 2000-10-02 | 2002-04-11 | Novo Nordisk A/S | Method for the production of vitamin k-dependent proteins |
| US20040185534A1 (en) * | 2000-10-02 | 2004-09-23 | Knudsen Ida Molgaard | Industrial-scale serum-free production of recombinant proteins in mammalian cells |
| US20020179544A1 (en) * | 2001-04-27 | 2002-12-05 | Nexell Therapeutics, Inc. | Cell processing and fluid transfer apparatus and method of use |
| DE60221553T2 (de) * | 2001-10-02 | 2008-04-10 | Novo Nordisk Health Care Ag | Verfahren zur herstelllung rekombinanter proteine in eukaryontischen zellen |
| US7160719B2 (en) | 2002-06-07 | 2007-01-09 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Bioartificial liver system |
| CN1300297C (zh) * | 2002-09-20 | 2007-02-14 | 华东理工大学 | 一种用于动物细胞扩大接种的消化反应器 |
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| US20080020049A1 (en) * | 2005-02-25 | 2008-01-24 | Andrew Darling | Super-sparger microcarrier beads and precision extrusion deposited poly-epsilon-caprolactone structures for biological applications |
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