JPS6146784B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素免疫法による抗原もしくは抗体の
新規な測定方法に関するものである。

測定しようとする物質、即ち低分子および高分
子の抗原活性物質（ハプテンとなりうる物質を含
む）を用いて、それに対応して結合する抗体を実
験動物例えば家兎に作らせ、抗原活性物質と抗体
との間の特異反応を用いて抗原もしくは抗体を測
定する方法は、免疫学的測定法として知られてい
る。

ここで測定しうる物質としては、各種ポリペプ
チド系ホルモン、ステロイド系ホルモン、ビタミ
ンB₁₂、葉酸、サイロキシン、トリヨードサイロ
ニン、補体、α−フエトプロテイン、カルシノエ
ンプリオニツクアンチゲン、臓器および血中の各
種の酵素および蛋白質、HBs抗原などの各種微生
物抗原、植物ホルモン、抗生物質等であり、特に
重要な測定対象は下垂体ホルモン、HBs抗原、イ
ンシユリン、免疫グロブリンおよび肝酵素であ
る。

従来これらの微量物質の測定方法として用いら
れている免疫学的測定法としては、沈降反応、凝
集反応、補体結合反応などがあり実用化されてい
る。しかしこれらの方法は反応の終了を視覚的に
とらえるものであり、一般的には感度が低いかあ
るいは半定量的であつた。これらの微量にしか存
在しないホルモンや各種生物活性物質の測定に
は、高感度かつ定量的な方法の確立が望まれ、そ
の一方法として放射性同位元素を用いるラジオイ
ムノアツセイ法（以下RIA法という）が開発され
利用されてきた。

しかしながらこのRIA法は放射性同位元素の使
用に起因する種々の大きな欠点、例えば放射線に
よる人体障害の危険性、放射線の拡散防止のため
の特殊な施設を要すること、操作が複雑でかつ測
定に長時間を要すること、半減期の短かい同位元
素の場合は標識抗原を長時間保存できないこと等
の欠点を有し、臨床検査への導入も通常の臨床検
査室では検査が行なえないことが大きなネツクに
なつている。このため臨床検査法としてより普通
的な方法、環境汚染につながらない方法が求めら
れていた。

これらのRIA法のもつ欠点を解決するため、酵
素免疫検査法（以下EIA法という）が開発され、
その特徴、反応機構、応用例についてはすでに発
表されている。（“酵素免疫測定法”、石川栄治ほ
か編、医学書院、1978以下文献(1)という）この
EIA法は、RIA法が放射線同位元素で標識されて
いるのに対し酵素で標識されるものであり、RIA
法の有する欠点は見当らない。

しかしながら従来EIA法に用いられる固相とし
ての担体はセルロース、セフアローズ等の多糖
類、ガラス、シリコーンゴム等の無機物が知ら
れ、これらの担体に結合剤を介して抗体を化学結
合させて、または吸着させて使用する場合が多
い。

これらの場合に、遊離の抗原、抗体、酵素−抗
体結合物等の除去が困難であつたり、担体の材質
的な欠点によつて抗体が十分付着または反応しな
かつたり、逆に検体となるべき血清や尿中の各種
成分が非特異的に吸着して、抗原−抗体反応を妨
害したり、酵素−抗体結合物が担体そのものへ非
特異的に付着したりする等種々の問題点があり、
これらに起因してブランク値が異常に高くなつた
り、測定可能領域がきわめて狭められたりし、特
に低濃度領域における対象物の定量性に劣つてい
る。その為、ガラスをアミノアルキルシリル化し
たもの以外は実用に供されていない。

そこで最近、各種合成高分子より成る樹脂成形
品が固相用担体として用いられ始めたが、一般的
にこれらの合成高分子より成る樹脂担体は表面に
活性な反応基を持たないため、抗体もしくは抗原
を固相化するに際し、物理的吸着によつている。
したがつて測定プロセス中の洗滌のさいに固相化
した抗体もしくは抗原が遊離してしまい、正確な
測定が不可能になつたり、固相化された抗体の抗
原結合部（Fabの可変域）が立体的に障害を受け
ることになつたりする。

発明者らは、これらのEIA法固相用担体の持つ
欠点を改善し、RIA法と同等以上の感度を持つ有
用なEIA法検査試薬等を開発する目的で、蛋白質
特に抗原、抗体との反応及び吸着の機構を研究し
実験を繰り返した結果、担体表面を特定の試薬を
用いてアミノ化したものに抗体もしくは抗原を化
学的に結合させて固相化したものを用いる方法が
従来見い出されている方法に比し、飛躍的にすぐ
れていることを見い出し、本発明を完成させるに
至つた。

すなわち本発明の要旨は、酵素免疫法による抗
原もしくは抗体の測定方法において、測定対象の
抗原もしくは抗体に対応した抗体もしくは抗原
を、エチレンイミンを用いて反応させることによ
り、活性アミノ基を導入した樹脂表面を有する担
体上に化学結合により結合させて固相化すること
を特徴とする抗原もしくは抗体の測定方法に存す
る。

本発明においては樹脂表面を有する担体が用い
られるが、該担体としてはメチルアクリレート、
メチルメタクリレート、アクリル酸、メタクリル
酸、アクリロニトリル、無水マレイン酸などの単
量体の単独重合体やこれらの単量体を含む共重合
体より形成された担体を用いることが出来、例え
ばポリメチルメタクリレート、アクリロニトリル
−ブタジエン−スチレン共重合樹脂、スチレン−
無水マレイン酸共重合体などを射出成形法などの
成形法により球形、円柱状、等の適宜な形状に成
形したものが好適に使用出来る。又、上記担体に
は活性アミノ基が導入されるのであるが、アミノ
基を導入するには、担体を塩酸または苛性ソーダ
を含む水溶液中に浸漬し、40〜80℃で数時間放置
して担体表面を加水分解させ、次に数％のアセト
ンを含む水中に担体を移し、エチレンイミンを滴
下し反応させることにより行うことが出来る。

なおEIA用担体としては、担体１ケ当り導入す
る官能基量が10⁴〜10⁶ケ位あるのが好ましい。

かくして活性アミノ基を導入した樹脂表面を有
する担体を用意することが出来る。

次に本発明においては、測定対象の抗原もしく
は抗体に対応した抗体もしくは抗原を、上記で用
意した活性アミノ基が導入された担体上に化学結
合により結合させて固相化するのである。固相化
用の抗体としてはKohler，Milsteinにより導入さ
れた方法により、抗体産生細胞とマウスミエロー
マ細胞との融合によるモノクローナル抗体分泌ハ
イブリドーマ（hybridoma）を作製し、このハイ
ブリドーマの分泌する抗体を用いるのがよい。な
おマウスミエローマの細胞株名としてはP₃／
NS1／１−Ag4−１（NS−１と略す）、SP2／０
−Ag14（SP−２と略す）があり、又、抗体産生
細胞としてはフロイント完全アジユバントで免疫
したBALB／Ｃマウスの脾細胞を用いることが出
来る。又、細胞融合法としては、免疫実験操作法
、2221（′78）（渡辺武他、日本免疫学会編）に
示される方法を採用することが出来る。さらに固
相化用抗体としてはハイブリドーマが産生する抗
体そのもの以外にも、抗体をペプシンにより分解
処理して得られたＦ（ab′）₂フラグメント、更に
Ｆ（ab′）₂を２−メルカプトエタノール等の還元
剤で処理して得たFab′フラグメント等のいずれ
をも用いることができる。

又、前記活性アミノ基が導入された担体上に、
上記固相化用抗体ないしは抗原を化学結合により
固相化するには、常用結合剤が用いられ、該結合
剤としては免疫組織化学で常用されているグルタ
ールアルデヒドを用いるのがよく、２段階反応で
担体と抗体のIgG分子を架橋させることが出来
る。

又、抗体にチオール基が導入される場合は、結
合剤としてマレイミドを用いてチオール基とアミ
ノ基との架橋による結合を行うことも可能であ
り、特に抗体がFab′である場合は有効である。
そしてマレイミドとしては４−（マレイミドメチ
ル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸のＮ−ハ
イドロオキシサクシニイシドエステルやメタマレ
イミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロオキシ−サクシ
ニイシドエステルが好適である。このようにして
得られた固相化抗体は、文献(1)に記されている競
争的結合法またはサンドイツチ法のいずれのEIA
法にも応用できる。また逆に抗原を固相化する場
合も、ハイブリドーマ産生抗体をSepharose413
等のゲルに固定したアフイニテイークロマトグラ
フイーにより精製した抗原を上記と同様にして担
体上に固相化していることが出来る。

本発明においては上記の如く活性アミノ基を導
入した樹脂表面を有する担体上に、抗体もしくは
抗原を化学結合により結合させ固相化させた担体
を酵素免疫法による測定に使用するので、測定対
象の抗原もしくは抗体と反応させた後や、さらに
酵素標識抗体と反応させた後の担体を洗浄する
際、洗浄力の強い界面活性剤等を用いることが可
能であり、したがつて検体の血清あるいは尿中の
各種成分による干渉を防ぐことができる。その結
果としてより低濃度領域の測定が可能となるので
ある。

又、EIA法による抗原もしくは抗体の測定を行
う際には標識用酵素が使用されるが、本発明にお
いては該酵素としてアルカリフオスフアターゼ、
カタラーゼ、パーオキシダーゼ、β−グルクロニ
ダーゼ、β−Ｄ−ダルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダ
ーゼおよびガラクトースオキシダーゼを用いるの
が好ましく、酵素自身の安定性等の面から特にβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いるのが好ましい。

本発明の測定方法は上述の通りの方法であり、
化学結合により、測定対象の抗原もしくは抗体に
対応した抗体もしくは抗原を担体上に固相化し、
この状態の担体を用いてEIA法による測定を行う
ので、RIA法の如き放射性同位元素の使用に起因
する欠点を有しないのは無論のこと、従来のEIA
法における欠点、即ち遊離の抗原、抗体、酵素−
抗体結合物等の除去が困難であつたり、担体の材
質的な欠点によつて抗体が十分付着または反応せ
ず、そのため固相化抗体（担体）の表面に抗原が
非特異的に結合したり、酵素と標識抗体との非特
異的吸着が見い出され、これらに起因してブラン
ク値が異常に高くなり特に低濃度域における対象
物の定量性に劣る点が改善され、従つて一般的な
病院検査室および検査センター等で従来とほゞ同
等の測定器具および装置を用いて簡単かつ精度良
く検査を行うことができるのである。

以下本発明を実施例にもとずいて説明する。

実施例 サンドイツチ法によるＢ型肝炎ウイルス表面抗
原（HBs Ag）の測定 (A) 担体の製造 射出成形により、球形（Ｄ＝６mm）に成形さ
れたポリメチルメタクリレートを1N−Nacl中
に漬浸し、60℃で５時間加水分解反応させた。
次いでアセトン５％を含む水中へ移しエチレン
イミンを滴下した。このようにしてポリメチル
メタクリレート球状物の表面にアミノ基を導入
した。

(B) 抗原と抗体 HBs抗原（HBs Ag）は、株式会社目黒研究
所（大阪府池田市）より分与されたサブタイプ
adrの精製抗原を用いた。本抗原を用いて通常
の方法によりFreundの完全アジユバンド
（Difco Lad.デトロイト、US）で乳化し、
BALB／Ｃマウスに一匹あたりHBsAg10μｇを
皮下に１次感作した。１ケ月後HBs抗原50μｇ
を静脈内に２次感作し、その３日後の脾細胞を
抗体産生細胞としてミエローマNS−１との融
合に用いた。HAT培地を用いてhybridomaを
育成し、培養上清中の抗体活性を検察し、活性
の認められたものを抗HBs抗体（モノクロ−ナ
ル抗体）として用いた。

(C) 担体上への抗体の結合 (A)で用意した担体をPH5.0の炭酸バツフアー
中に漬浸し５％グルタールアルデヒド液を1/10
量添加し４℃、16時間反応させ0.03Mリン酸バ
ツフアー（PH7.4）であらう。0.1Mリン酸バツ
フアー中で抗体を１μｇ／c.c.濃度に調節し担体
がちようど浸る程度加える。35℃２時間反応さ
せ４℃で16時間おく。その後Ａ緩衝液（0.1％
牛血清アルブミン、0.01％NaN₃、1.0mN
MgCl₂、0.1M NaCl含有 0.01M Na−リン酸
緩衝液）中へ浸漬しておく。

(D) 酵素標識抗体の調整 抗体は(B)で用意されたモノクロ−ナル抗体を
ペプシン消化し、さらに２−メルカプトエタノ
ールで還元したFab′を用いた。

酵素として大腸菌由来のβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ（β−Gal）を選びベーリンガー社（マ
ンハイム）の市販品を用いた。β−Galと
Fab′の結合は、過剰のＮ，N′−オルトフエニ
レンジマレイミドを用いてFab′のSH基とβ−
GalのSH基を架橋する方法を採用した。Fab′は
抗原結合部位から遠い位置にSH基を持ち、ま
たβ−Galも活性に影響せずかつ反応性が高い
SH基が存在するためジマレイミドによるSH基
の架橋が適しているのである。

(E) 酵素活性の測定 標識に用いた酵素β−Galの活性は、４−メ
チルウンペリフエリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（4MUG）を基質として、遊離した４−メチル
ウンペリフエロン（4MU）を蛍光光度計を用
いて励起波長360nm、蛍光波長450nmの条件下
で定量することにより測定した。30℃１分間に
１μモルの4MUGが4MUに分解する酵素活性を
１単位とした。

(F) 定量曲線の作成 Ａ緩衝液200μ中に各種濃度に希釈した
HBsAg含有液200μを加えたものに(C)で用意
した１個のモノクローナル抗体結合担体を入
れ、37℃で６時間振盪後４℃で16時間放置し
た。

次いで担体を取り出して0.01M、Na−リン酸
緩衝液（PH7.0）で洗浄後、30℃、20分間の反
応で100μ単位の活性を示すβ−Gal−Fab′と
共に37℃で４時間振盪しながら反応させた後、
Ａ緩衝液で洗浄し、固相の担体球を別の試験管
に移した。

この担体球について0.1mMの4MUGを30℃20
分間反応させ、反応停止剤（0.1Mグリシン−
HCl緩衝液）を加え、次に遊離している4MUを
蛍光光度計で測定した。かくして得られたEIA
定量曲線を第１図に示した。

次に、正常人の血清200μを加えたものに
対し１個の抗体結合担体を入れ、以下Ａ緩衝液
を用いて行なつたのと同じ方法により4MUを
測定し得られた定量曲線も第１図にあわせ示し
た。

(G) 結果 第１図に示す如く、抗体を化学結合させた樹
脂担体を用いるEIA法に於ては従来の測定限界
0.5ng／c.c.〜1ng／c.c.を大きく下まわることが
明らかである。

ブランク値の2.1倍までを陰性とすると、測
定限界は約0.01ng／c.c.となる。

比較例 ポリスチレン担体を用いて、モノクローナル抗
体を物理吸着させた以外は上記実施例のＡ緩衝液
を用いた場合と同様な条件下でHBsAgの定量曲
線を求め第１図に合わせ示した。

この場合の測定下限は数ng／c.c.（望ましくは
5ng／c.c.）となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明実施例及び比較例で得られた定
量曲線を示すグラフである。 １……Ａ緩衝液を用いて行つた本実施例による
定量曲線、２……人血清を用いて行つた本実施例
による定量曲線、３……比較例による定量曲線。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酸素免疫法による抗原もしくは抗体の測定方
   法において、測定対象の抗原もしくは抗体に対応
   した抗体もしくは抗原を、エチレンイミンを用い
   て反応させることにより活性アミノ基を導入した
   樹脂表面を有する担体上に化学結合により結合さ
   せて固相化することを特徴とする抗原もしくは抗
   体の測定方法。 ２ 樹脂がポリメチルメタクリレートである第１
   項記載の測定方法。 ３ 樹脂がアクリロニトリル−ブダジエン−スチ
   レン共重合樹脂（ABS）である第１項記載の測
   定方法。 ４ 樹脂がスチレン−無水マレイン酸共重合体で
   ある第１項記載の測定方法。