JPS60127462A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は同相法による酵素免疫測定法に関する。

従来技術 ペプチドホルモンなどのアミノ酸関連物質蓚炭水化物お
よびその代謝物質；脂質；ヌクレオチドなどの生体関連
物質の検出・同定・定量には１例えば、抗原抗体反応を
用いた固相法による酵素免疫測定法が用いられる。この
同相法により被測定物質を定量する方法のひとつにサン
ドイツチ法が知られている。このサンドインチ法を用い
て９例えばインシュリンを定量する場合には、まず、担
体となるＡＢＳやポリスチレンなどでなるビーズを準備
しこの表面にインシュリンの抗体となる免疫グロブリン
Ｇ（ＩｇＧ）を担持させて同相化抗体が調製される。こ
の同相化抗体を、濃度既知のインシュリン溶液に加えイ
ンシュリンを抗原として担体上に固定し、第−固相糸が
調製される。他方。

あらかじめＨＲＰ（ベルオキシターゼ）などの酵素で標
識したインシュリンの抗体となるＩｇＧを標識抗体とし
て一１′、１ルリしておく。これを前記第一固相系に加
えるとこの標識抗体はインシュリンに結合し、第二回（
目早が１し成される。被測定物質であるインシュリンは
抗体であるＩｇＧにサンドイッチ状にはさ寸れた形１歩
となる。ζこへＡＢＴＳ（２・２′−アジノルビス−（
３−エチルベンゾチアゾリン−６−ス〜フオン酸）〕な
どの酵素八へαを加えると基質が酵素反応をうける。得
られる反応生成物は反応液のｏＤ値を測定することによ
り、あらかじめＯＤ値とインシュリン濃度との関係を示
す検量線から被測定物質中のインシュリン濃度を知るこ
とができる。このようにして未知試料中に含まれる特定
物質を定量することができる。ｏＤ値の測定には、酵素
反応終了液の一部をキュベツト（セ／Ｌ／）に移すこと
が必要である。とのとき担体がキュベツトに入りやすい
。この混入担体が光路をさえぎシ、測定誤差や測定不能
の原因となっている。混入担体をキュベツトから取り除
くには手間がかかる。そのために、酵素標識抗体の旦を
一定にしておき、担体に結合しなかった酵素の量を測定
することも考えられるが、余分な手間がかかり能率が悪
い。サンドイツチ法以外に競合反応法も用いられる。こ
の場合も上記と同様に測定時の固相による光路の妨害が
問題となる。固相法を実施するにあたり１反応時間を短
縮しかつ簡便にするだめに担体の直径を小さくし反応液
との接触面積を大きくして反応速度を増大できれば便利
である。

しかし１粒子径の小さい担体は通常の大きさの担体よシ
もさらにキュベツト内に入シやすくなる。

このため微小な粒子は遠心分離機にかけて除去しなけれ
ばならず、不便である。光路の妨害を極小にするべく、
担体として透明性に優れたアクリルアミドゲＭを用いる
ことも考えられうる。しかし。

抗原あるいは抗体の固４″ｌｌ化に化学的な結合方法を
用いねばならないために、操作が著しく不便である。さ
らに透明性という観点のみからアクリルアミドを素材と
して用いているため、担体の素材としては必ずしも適切
でない。

発明の目的 本発明の目的は、試料の分光学的測定にさいし担体がキ
ュベツトに入り込んで光路をさえぎり測定値を狂わせる
ということのない固相法による酵素免疫測定法を提供す
ることにある。本発明の池の目的は、Ｉａ小粒子を担体
として用いて反応効率を高め、同相系の影響を受けるこ
となく分光学的手法により被測定物質の定量を可能にす
る酵素免疫測定法を提供することにちる。

発明の要旨 本発明の同相法による酵素免疫測定法は酵素反応溶液の
比重が担体を含む同相系の比重よりも小さく、かつ酵素
反応停止後の溶液の比重が同相系の比重よシも大きくな
るよう設定され、そのことにより上記目的が達成される
。

本発明方法はサンドインチ法、競合反応法などの固相法
による酵素免疫測定法に適用しうる。サンドイツチ法は
　、抗体もしくは抗原を担体に担持させ、該抗体もしく
は抗原に特異的に反応する抗原もしくは抗体である被測
定物質を検出、同定。

もしくは定量する同相法であって、（１）該被測定物質
を前記担体に担持された抗体もしくは抗原に結合させ第
一固相系を形成する工程、（２）該被測定物質と特異的
に反応する酵素で標識された抗体もしくは抗原を第−固
相糸の被測定物質に結合させ第二固相系を形成する工程
、（３）該酵素により酵素反応をうける基質を第二固相
系と反応させる工程。

および（４）酵素反応生成物を介して該被測定物質を分
光学的に検出、同定もしくは定量する工程が包含される
。

以下にサンドイツチ法の場合を例にあげ１本発明につい
て説明する、。

本発明に用いられる相体は、任意の形状例えばビーズ状
に成形され得、かつ抗原または抗体を物理的吸着などに
より担持しうる材質であればよく。

特に限定されない。その−例を挙げれば、ＡＢＳ。

ホリスチレンなどの熱可塑性樹脂がある。この担体は１
通常、直径６ＭＮＦｌｉ度のビーズ状に成形して用いら
れる。担体の直径はさらに小さくてもよく。

それには例えば、スチレンを乳濁重合させて得たラテッ
クスや懸副重合させて得られるゲルがある。

とのような倣細粒子を用いると反応時の反応形）叫が液
相一液相反応に近くなり、そのために反応速度が増大す
る。その結果１反応時間が短縮されうる。これら担体け
その反応に適切な比重を有しておればそのまま反応系に
供することができるが硫酸バリウム、炭酸カルシウムな
どの無機塩類を充邸、剤として加えてその比重を大きく
することが可能である。ラテックスやゲルの場合もモノ
マーに充填剤を添加して重合させれば充填剤を含有する
担体となる。さらに重合方法にょっ−Ｃも比重を変化さ
せることができる。

このような担体に、被測定物質に対する抗体もしくは抗
原となる物質を例えば物理的吸着により担持させる。例
えば、インシュリンを被測定物質とする場合には、Ｊｋ
ｌｌｌ−上にインシュリンの抗体としてＩｇＧを担持さ
せる。これにインシュリンを結合させ、第−同相系を形
成させる。次いで、酵素で標識した。被測定物質に特異
的に反応する抗体もしくは抗原を結合させて第二固相系
を形成させる。担体をＡ、被測定物質をＢ、被測定物質
の抗体もしくは抗原をＣ１，酵素標識した抗体もしくは
抗原をＣ３とすれば第−固相糸はＡ−Ｃ，Ｂ。

第二固相系はＡ−Ｃ１−Ｂ−Ｃ，で表わされる。ｃｌと
Ｃ９は同一の物質であってもよい。ｃ、ｌとしては。

例えば、ＨＲＰ（ペルオキシダーゼ）を椋識醇素として
結合させたＩｇＱが用いられる。なお、標識抗体もしく
は抗原は例えばＪ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　、Ｃｙｔｏｃ
ｈｅｍ。

２２．１０８４（１９７４）に記載のＮａｋａｎｅらの
方法により容易に調製されうる。

次いで、第二固相系に酵素基質溶液を加えて酵素反応を
行なわせる。このとき、第二固相系は反応液に完全に浸
／１　していることが必要である。しだがって、第二同
相系の比重は反応溶液の比重よりも大きいことが望まし
い。反応溶液には必要に応じて比重調整物質が添加逼れ
る。比重調整物質には塩化ナトリウム、塩化マグネシウ
ムなどの無（洩１盆６１；グリセロールなどの多１曲ア
ルコール；グルコーヌなどの糖頑；尿緊；酸；塩基など
がある。

これら比【Ｒ調整物色↓酵素反応を妨害しない範囲で適
宜、添加される。比重調整物質をりらかじめ基質溶ｉ夜
に加えておｒｔ）ば操ｆＰがＩ＋ｉ’ｉ　ｒｌｉである
。

酵素反応終了後１反応面には反応生成物、酵素。

固相糸が含有される。Ｃれに反応１？止液＝　／Ｊ１１
えて反応を完全に停止さぜる。反応停止６ｆには１反応
液と混合し９る。ａ１２隻ｆｆｆ剤や酸、アルカリが利
用されうる。反応１’；ｒ　Ｌ故は、上記反応溶液に使
用されるのと同様の比重調整物質を用い′Ｃあらかじめ
比重調整がなされており、こノし足Ｊｉ応ン俟に加える
ことにより１反応液に存在する固相糸がｌ讐倭液上に浮
上する。比重調整された反応停止液は酵素反応を停止さ
せることが可能でかつ分光学的測定を妨害しないことが
重要である。

反応停止後、酵素反応液を分光学的手法により例えば０
０測定をイイなう。このＯＤ測定値から。

あらかじめ作成した検量線を用いてインシュリン址をめ
ることができる。反応停止後の反応液は比重調整がなさ
れているため、その一部をそのままキュベツトに移した
とき、たとえ固イ゛日系がキュベツト内に移行しても底
に沈まない。それゆえ。

光路勿妨害することがない。

競合反応法により測定を行なう場合にも本発明方法を適
用すれば、担体、酵素反応時の溶液、および反応停止剤
が比重調整されているため、測定時に固Ａ′１４系によ
る妨害がなく、旧確な測定ができる。

実施例 以下に本発明を実施例について説明う゛る。

実施例１ （Ａ）　固相化抗体の調製：担体としてボリヌチレンを
素材とする直径６．８５１１ＪＲのｋｌｚ形ビーズを形
成した。このビーズを５％の５ｃａｔ　２Ｑ　Ｘ−Ｎ　
（半回化学社製）を用いて洗節し９次いで、水洗し、風
乾した。比１１ｄ１．０５であった。別に１モルモット
に精製ブタインシュリン（ノホ社製のアクトラピッドＭ
Ｃ）を免疫して抗インシュリン血清を産生させた。この
血清をｆ）　Ｉｉ　Ａ　Ｅ−セルロースによるイオン交
１めクロマトグラフィーにかけ、ＩｇＧ　分画を得た。

これを１０　ｌｚｇ　／ｗｔとなるように０．１Ｍ　ｐ
Ｈ７，０のリン酸緩瞬蔽に溶解させた。上記ビーズ１０
０個をビーカーにとり、これに上記ＩｇＧのリン酸緩（
９７ａ２５ｒｒｌを加え、３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。これをジらに４　”Ｃで１６時間放置した。

生成した固４［１化抗体を沖取し、上記リンｆＩ２緩衝
液で充分洗浄した。＜１．）られた固相化抗体にウシ血
清アルブミンの０．１％リン酸緩衝液（Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｆ
Ｈ（ｆｆ、　）２５ｗｉを加えて４°Ｃで１６時間放置
した。

（Ｂ）　酵素標識抗体の、＊ＩＸ４　ｆｆ＋！！　四項
で得だＩｇＧ分画をＪ、ｌｌｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙ
ｔｏｃｈｅｍ、　ｐ、２　、１０８４（１９７４）に記
載のＮａｋａｎｅらの方法によりペルオキシダーゼ（Ｈ
ｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａＳｅ　）　
で標識した。得ら赴た酵素標識抗体はＢＳＡ溶液により
　１２００　倍に希釈した。

Ｃ）第−固相系の調製：塩化すｌ−１ＪウムＯ，１Ｍ。

塩化マグネシウム’０．０１　Ｍ　、　ＢＳＡ　ｍ１４
１０．１％およびアジ化ナトリウム０．１％を含むｐＨ
７０，０２Ｍのリン酸緩衝液（以下０．０２Ｍ！Ｊン酸
緩衝液）を調製した。精製フ゛クインシュリン（ノボｉ
土製、アクトラビッド　ＭＣ）を上記の０．０２Ｍ！Ｊ
ン酸緩衝液で希釈し、濃度ｏ、ｌｏ、２ｏ、４ｏ、ｇｏ
、ｘｅｏ、ａ２ｏ　ｐ　ｕｎｉｔ／　＠Ｉ！の希釈列を
調製した。試験管に各濃度のインシュリン溶液を１００
μｌずつ分注し、各々０．５　ｍｌの０．０２Ｍ’Ｊン
酸緩衝液を加えた。これに（Ａ）項で調製した同相化抗
体を１個ずつ加え、３７°Ｃて１時間インキュベートし
た。インキュベート段、吸引ρ取し１２ｄの０．０２Ｍ
！Ｊン酸緩衝液で１回洗浄して第−固相系を得た。

（ロ）　第二固相系の調製：０項で得られた第−固相糸
に串）項で得られた酵素標識抗体溶液３００１１Ｊを加
え３７°Ｃで２時間インキュベートした。反応１１￥を
吸収δ−ｉ過し、　０．０２Ｍリン酸緩衝液２　ｔｕｔ
で２回吸引洗浄して第二１ｉｉｌ相糸を得た。

（Ｅ）　酵素反応：月頃で得た第二固相系に基質として
Ｏ−ニトロフエニｌレ−β−り一カーラクトピラノシド
の０．１％リン酸緩衝溶液を０．５　ｍｌを加え。

３７℃で１時間インキュベートしだ。次いで、２０％の
グリセロールを含む０．１　ｒｖｘ炭酸ナトリウム溶′
ｆｉｌ　２　ｗｌを加え酵素反応を停止さ亡た。

（Ｆ′）分光学的測定：（Ｅ）項の反応停止後の溶液を
キュベツトにあけ、その４２０　ｎｍにおける（月）値
を測′定した。このとき測定溶液中に存在ず／：Ｊ固Ａ
’Ｌｌ示は液上層部に浮」ニするだめ測定時の光路を妨
害しない。インシュリン１見度に対）、１Ｓする０Ｄ値
をプロットし９図に示うイリ＞　ｌｌ線を作成した。こ
れを用いて未知検体に含有されるインシュリン量が定量
されうる。

実施例２ （〜　固相化抗体の調製：担体の索利としてＡＢＳを用
いたこと以外は実施例１と同様である。なお。

担体となる球形ビーズの比重は１．０２であった。

（１１）　ｔｒ￥素標識抗体の調製：（Ａ）項で得たＩ
ｇＧ分画にＮ−（ｍ−マレイミドベンシイμオキシ）−
サクシイミドヲ作用場せ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（
以下β−Ｇａｌ）で標識した。得られた標識色票を０．
０２Ｍ！Ｊン酸緩衝液で５００倍に希釈した。

０　第−固相糸の調製：実施例１と同様である。

ｐ）　第二固相系の調製：実施例１と同様である。

（Ｅ）　酵素反応：酵素基質溶液として、２・２′−ア
ジノービス−（３−エチＩレベンゾチアゾリンー６−ス
〜フォン酸）２．５ｍＭと過酸化水素５　ｍ　Ｈとを含
むｐＨ７の０．１　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液を調製した。

σ〕）項で得た第二固相糸に上記基質溶液を加え３７°
Ｃで１時間インキュベートした。次いで、０．５Ｍ硫酸
を２１加えて酵素反応を停止させた。

（杓　分光学的測定：　４０５　ｎｍ　における０１）
値を測定したこと以外は実施例１と同様である。

発明の効果 本発明方法によれば、このように、同相法による酵素免
疫測定法において酵素反応系を構成する反応液１反応停
止液および担体が各々比重調整されているだめ９分光学
的手法によるｊｌｌｌ定時のキュベツト内の固イ■系は
すべて液」一層Ｅ’ｄＩ　Ｋ浮上する。

そのため、同相糸による光路の妨？１５がなく、正（俺
なｔ１１１定ができる。さらに、担体はその粒径に関係
なく反応液に層ｊ＜１１に浮上するため９反応系に最屑
な素材の微小粒子を担体として用いることができる。し
たがって７反応法度が増大し、　Ｍｌｉｌ定範囲も拡大
されうる。

４、　図面のｆｆｉ’ｉ　ｎ’な説明 図は本発明方法におけるインシュリンノｊｌ！１度とＯ
Ｄ値との関係の一例を示すグラブである。

ＩＪ　Ｊ、：。

出４人　債水化学工業株式会社 特開昭ＧＯ−１２７４６２（６） 手続補正書印発） １．事°件の表示 昭和５８年特許願第２３５６１３号 ２、発　明　の　名　称 酵素免疫測定法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５３０ 住　所　大阪市北区西天満二丁目４番４号５補正の内容 ＋１１明細書第１１頁下から第５行に ［の０１％」とあるのを 「を０１％含む」と訂正する。

（２）第１１頁下から第３行ないし第１２頁第３行に ［（Ｂ）酵素標識抗体の調製：・・・・・・・・・・・
・（中略）・・・・希釈した。」とあるのを ［（Ｂ）酵素標識抗体の調製：（Ａ）項で得たＩｇＧ分
画にＮ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−ザクジ
イミドを作用させ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（以下β
−Ｇａｌ）で標識した。得られた標識酵素を１ｆｉＭの
塩化マグネシウムを加えた０、　０２　Ｍ　リン酸緩衝
液で５００倍釦希釈した。ｊ と訂正する。

（３）第１２頁第５ないし６行に 「塩化マグネシウムＯ，０１Ｍ、ＢＳＡ溶液０１％およ
びアジ化ナトリウムｏ、　ｉ％を含む」とあるのを （−ｓ　Ｓ　Ａ　０．１％を含むＪ と訂正する。

（４）第１３頁第１行に 「濾過」とあるのを ［除去Ｊと訂正する。

（５）第１３頁Ｍ５行に ［−の０．１％リン酸緩衝溶液」とあるのを［を０１％
含む１ｍＭの塩化マグネシウムを加え九〇、　０２　Ｍ
リン酸緩衝溶液］ と訂正する。

（６）第１４頁第１ないし５行に 「（Ｂ）酵素標識抗体の調製：・・・・・・・・（中略
）・・・・・に希釈した。」とあるのを 「（Ｂ）酵素標識抗体のＩｇ製：（Ｎ項で得たＩｇＧ分
画をＪ、　ｆ（ｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ
、　２２　、１０８４（１９７４）に記載のＮａｋａｎ
ｅらの方法によりペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅ　ｒａ
ｄｉｓｈ　ｐｅ−ｒｏｘｉｄａｓｅ　）で標識した。得
られた酵素標識抗体はＢＳＡ溶液によ１１１１２００倍
に希釈した。」 と訂正する。

（７）第１４頁第８行に 「２０２′−」　とあるのを 「２．ｚ’−Ｊ　と訂正する。

（８）第１４頁第１０行に ［５痛Ｈ］とあるのを 「５ｍＭ」と訂正する。

以　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　酵素反応時の溶液の比重が担体を含む面相糸の比
   重よりも小さく、かつ酵素反応停止後の溶液の比重が同
   相系の比重よシも大きくなるよう設定することを包含す
   る９分光学的測定法を用いた同相法による酵素免疫測定
   法。 ２、　前記酵素反応の開始時に反応系が比重調整物質を
   含む特許請求の範囲第１項に記載の測定法。 ３、前記酵素反応を停止させる反応停止剤は比重調整物
   質を含む特許請求の範囲第１項に記載の測定法。 ４、前記担体は高分子化合物を特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の測定法。 ５、　前記担体はガラスもしくけアルミナである特許請
   求の範囲第１項に記載の測定法。 ６、　前記担体は充坤剤を含む特許請求の範囲第１項に
   記載の測定法。 ７、　前記担体は重合可能なモノマーを乳化重合させて
   なるラテックスである特許請求の範囲第１項に記載の測
   定法。 ８、　前記担体は重合可能なモノマーを懸濁重合させて
   なるゲルである特許請求の範囲第１項に記載の測定法。 ９、前記比重調整物質は無機塩類、酸、塩基。 多価アルコールおよび糖類でなる群から選択される少な
   くとも一種である特許請求の範囲第２項もしくは第３項
   に記載の測定法。 １０、前記充ｉｐ剤は無機塩類である特許請求の範囲第
   ６項に記載の測定法。