JPS59210365A - 均一系免疫試験法ならびにそれに用いるための試薬系、試験キツトおよび試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特異的結合試験法の発展は、液体媒体中に極めて低濃度
で現われる診断上、医学上、環境上および工業上重要な
種々の有機物質を測定するだめの極めて有用な分析法を
もたらした。特異的結合試験は、分析対象物と呼ばれる
こともある測定下の物質と、その結合相手の間の相互反
応に基づく。

分析対象物がノ・ブテンまたは抗原であり、その結合相
手が抗体でちる場合、この試験は免疫試験として知うれ
ている。ホルモン類、ビタミン類、代謝産物類および薬
理学的物質と、それらの各々の受容体および結合性物質
との間の結合相互反応をはじめとする、分析対象物と結
合相手との間の他の結合相互反応が結合試験の基礎とし
て役立つ。

分析対象物が結合性物質、例えば、ヨードチロエン結合
性蛋白質（チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合
プレアルブミン等）のような結合性蛋白質もしくは受容
体、または抗原に対して特異的な抗体である場合には、
このような結合性物質と結合する標識化された物質を使
用する結合試験手法が用いられるのが普通である。結合
性物質と結合するようになる標識（結合種）の量または
標識化試薬のうち遊離種として残存する量を測定するこ
とによシ、標識化試薬の取込み量を測定する。結合種状
態の標識化試薬を、遊離種状態の標識化試薬の存在の下
で、標識を監視するために用いられる方法によシ、実質
的に識別できない場合には、結合種および遊離種は、こ
の試験を完遂するために物理的に分離されねばならない
。このタイプの試験を従来”不均一系″　と呼ぶ。標識
化複合体の結合種型および遊離種型が互いの存在下で識
別用能である場合には、　“均一法を行うことができ、
分離工程を省略できる。

結合性物質を測定するためのこのタイプの試験において
は、種々の標識が用いられている。第一番目に用いられ
た標識は放射性同位元素であったが、放射活性物質の取
扱いの不便さおよび困難さの故に、酵素補助因子（ｏｏ
ｆａｃｔｅｒ　）類、酵素基質類、酵素活性調節基類、
例えば活性剤および阻害剤、環化反応剤類、スピンラジ
カル類、酵素類、バクテリオファージ類、金属類および
有機金属錯体類、有機および無機触媒類、酵素補欠分子
族類、化学ルミネセンス反応剤類、ならびに螢光性分子
類をはじめとする、放射性同位元素以外の物質を、標識
成分として、用いる試験系が考案されている。

標識化試薬の取込み量に基づく、結合性物質を測定する
だめの従来の結合試験の代表的なものは次のようである
。

Ａ、結合性物質の結合目標物である物質の放射性標識化
型を用い、明白な分離工程を必要とする放射性試験（米
国特許第３，３７６．１１４号；第３゜４５１　、７７
７号；第３，６１５，２２２号；第３，７１０，１１７
号；第３，７１１，２４７号；第３，８２３，００１号
；第４．２１１，７６３号；第４，２３８，４７１号：
および第４．２５２，７８２号参照）。これらの放射性
試験の主な欠点は、保存寿命が短いこと、取扱いが危険
であること、および放射性同位元素標識の使用に関連し
て計器具を要することである。

Ｂ、酵素基質類、酵素補欠分子族類、酵紫阻害剤類およ
び酵素類のような種々の非放射活性標識を用いる非放射
性同位元素均一系試験（米国特許第４，１３４，７９２
号；第４．１．９０，４９６号：第４，２３８．５６５
号；第４，２７９，９９２号；および第４，３４１゜８
６５号参照）。

（ａ）測定下の結合性物質と、（ｂ）このような結合性
物質と結合する低分子量の物質に対する抗体間で、標識
化されたこのような低分子量物質との結合に関する競争
を設定することにより、結合性物質についての試験を遂
行することもまた知られている。

米国特許第４，１６８，２０７号は、試料をトリョード
チロニン（Ｔ−３）に対する抗体並びに標識化Ｔ−３お
よび非標識化Ｔ−３と混合する、ＴＢＧ　　についての
試験に関する。用いられる標識は酵素であり、酵素標識
化Ｔ−３が抗体に結合すると、酵素活性に対して測定可
能な妨害をもたらす結果となるので、この試験は均−系
である。

標識化抗体を用いる特に独特なしかも有利な均一系結合
試験は、１９８２年３月１８日に出願され本願の蒙り受
は人に譲渡された米国特許出願第３５９．６１０号に記
載されている。一実施態様において、この試験系は単一
の標識化モノクローン性抗体試薬を用いる。重要な分析
対象物を含有すると思われる試験試料を標識化モノクロ
ーン性抗体調製物と合わせるが、該調製物中においては
、分析対象物に対する抗体は実質的に唯一の標識化成分
である。該標識化抗体が分析対象物と結合するように、
用いられる標識を選択する。従って、得られる検出可能
な応答は、試験試料中の分析対象物の関数である。分析
対象物濃度が増加するにつれ、標識化抗体の結合が増加
し、従って標識の検出可能な応答の変調も増加する。一
実施例においては、分析対象物が標識化抗体と結合する
際の、検出可能な応答における測定可能碌変化は、試薬
検出系の構成員の接近の立体障害による。

臨床免疫学における、モノクローン性抗体の応用につい
ての総説は　ＣＩ　ｉｎ、　ＣｈｅＬｏ、２７巻：１７
９７頁（１９８１年）にある。この概説は、免疫試験に
標識化抗体を用いるいくつかの利点を列誉し、標識化抗
体対の近接結合に基づく試験系へ標識化モノクローン性
抗体を応用するという今後おこりそうな応用について二
、三予測している。この示唆によれば二つの異なる標識
化抗体を用いるこれら公知の試験系に、従来のポリクロ
ーン性抗体調製物の代）に標識化モノクローン性抗体を
代替させることである。

本発明は、試験試料中の結合性物質のような分析対象物
を測定するだめの、標識化抗体、または抗体フラグメン
トを特徴とする特な一連の試薬を包含する均一系免疫試
験を提供する。このよう力試系は、（１）分析対象物と
結合可能な高分子試薬、および（１１）分析対象物とこ
のような高分子試薬との結合に対して競争しうるような
方法で、高分子試薬に結合できる標識化抗試薬物質、例
えば、抗体よシなる。標識化抗試薬物質中に含まれる標
識は、標識化試薬物質が高分子試薬と結合すると、その
ように結合していガい場合と比較して、測定可能に異々
る検出可能な応答を提供する。好ましい実施態様におい
ては、試薬系はまた標識を検出するための化学的検出系
を含有する。どのような実施態様においては、標識およ
び検出系は、標識と検出系の構成員が相互反応すると、
検出系の構成員の標識への接近の立体障害のために、標
識化抗試薬物質が結合した際、結合しなかった場合と比
較して異なる検出可能な応答をなすように選択される。

次いで、検出可能な応答が、試料中の分析対象物の関数
として測定される。分析対象物が高分子試薬とよシ多く
結合すれば、標識化抗試薬物質はこのような試薬とよシ
少くしか結合することができず、非結合標識北枕試薬物
質の量に応じた応答が発生する結果となる。通常の場合
と同様、標識化抗試薬物質が高分子試薬と結合すると応
答の発生量が減少する結果となる場合は、より多くの分
析対象物が高分子試薬と結合すれば、応答はよシ多く発
生する。

好ましい実施例においては、分析対象物は、例えば、チ
ロキシン（Ｔ−４ンおよびトリヨード°チロキシン（Ｔ
−ａ）のようなヨードチロニンホルモンに対する、一群
の血清結合体、主に　ＴＢＧ　である。従って、生物学
的試料のヨードチロニン取込み量の測定のためには、高
分子試薬はヨードチロニンの高分子担体物質との複合体
よシなシ、標識化抗試薬物質は標識化抗ヨードチロニン
よりなる。

本発明方法は、他のホルモン結合性蛋白質類、組織ホル
モン受容体類、および特異的免疫グロブリン類をはじめ
とする種々の他の結合性物質の測定にもまた応用できる
。

標識化抗試薬物質は、最も好ましくは標識化モノクロー
ン性抗体またはそのフラグメント、すなわち、実質上、
化学的に純粋な免疫グロブリン調製物を産生ずる体細胞
融合手法により得られる標識化抗体またはその７ラグメ
ントである。標識用のモノクローン性抗体調製物の調製
においては、非特異的蛋白質は、免疫グロブリン類に対
して選択的な分離手法にモノクローン性調製物を付する
ことによシ、容易にしかも効率的に除去される。

調製物中の実質的にすべての免疫グロブリン類はモノク
ローン性、すなわち、化学的に同一となるであろうから
、分離された免疫グロブリン画分は非特異的成分を実質
的に含まないであろう。従って、得られた標識化モノク
ローン性抗試薬物質は、実質的に、高分子試薬と結合し
た場合にのみ、検出可能な応答の変化を示すであろう。

この方法で標識化モノクローン性抗体を用いると、標識
化ポリクローン性抗体、すなわち、種々の構造および由
来の抗体が混合した、従来の抗血清手法により得られる
抗体を使用する別の場合には発生するであろうバックグ
ランド応答を有為に減少する。

分析対象物 本発明は、その最も広い意味では、もし第二物質に対す
る抗体を産生ずることができ、この抗体がこのよう外第
二物質への結合に関して分析対象物と競争できるならば
、該第二物質に対する特異的結合親和力を有するいずれ
の物質の測定にも適用できる。分析対象物は、例えば、
ペプチド、蛋白質、炭水化物、糖蛋白質、ステロイド等
の適切な有機性分子であってよく、および機能的意味で
は、通常、抗原、ハブテン、抗体、ホルモン、ビタミン
、代謝産物もしくは薬剤、またはそれらに対する結合相
手もしくは受容体であるだろう。本発明法は、チロキシ
ン結合性グロブリン（Ｔ　Ｂ　Ｇ）、チロキシン結合性
プレアルブミン、コルチン層結合性グロブリン、エスト
ロゲン受容体類、ＡＣＴＨ受容体類、アビジン、ジアノ
コバラミン類、酵素類、インシュリン受容体類、エンド
ルフィン受容体類、ノルエピネフィリン受容体類、セロ
トニン受容体類、プロスタグランジン受容体類、レクチ
ン類、ならびに、例えば、ビールス類（肝炎ビールス、
ＣＭ■、ルベラ）、アレルケ：ｙ類、Ｒｈ　因子類およ
び薬剤類（ペニシリン等）のような特定の抗原類または
ノ・ブテン類に対して特異的な抗体類、および自己免疫
性抗体類のような抗体をはじめとする結合性蛋白質類お
よび受容体類のよう力結合性物質の測定に特に適用可能
である。

原理的には、分析対象物は特定の分子量範囲に制限され
るものではないが、しかしながら、実用上の事柄として
、結合性蛋白質および受容体の測定に適用される際には
、分析対象物の分子量範囲は約１０，０００ないし１０
，０００，０００ドルトン、更に普通には、２５，００
０ないし２５０　、０００ドルトンであろう。同様に、
分析対象物と特異的に結合する結合相手は、その分子量
に関して制限されない。

一実施態様においては、本発明の試験法の目標物である
分析対象物は特定物質もしくは分子に対して特異的結合
親和力を有する一群の関連物質または一群の関連物質も
しくは分子（リガンド）よりなる。従って、本質的に、
試験試料中の、このようなりガントとの結合能もしくは
取込み能の測定に本発明方法を適用できる。別の言い方
をすれば、試験試料成分上のりガント−結合部位の不飽
和度を測定することができる。例えば、リガンドがヨー
ドチロニン（Ｔ−３またはＴ−４）のようなホルモンで
ある場合、血清廿たはプラズマのような、生物学的試験
試料中のホルモン結合性蛋白質の不飽和度を測定するこ
とができる。このような試験における測定値は、例えば
、Ｔ−３取込み指数またはＴ−４取込み指数のような取
込み指数として、しばしば表わされる。

本発明の試薬系成分は、分析対象物および抗試薬物質と
のその結合能により特徴づけられる。高分子試薬は、該
分析対象物または抗試薬物質のいずれかとの結合に適応
するが、同時に双方との結合には適応しない１捷たけそ
れ以上の部位を有するであろう。このようにして、高分
子試薬上のこのような結合部位への結合に関して、分析
対象物と標識化抗試薬物質の間の競争を設定することが
でき、高分子試薬への標識化抗試薬物質の結合により影
響されるように彦る標識量が、存在する競争分析対象物
の量の関数である。

この高分子試薬は、標識化抗試薬物質と結合すると標識
化抗試薬物質中の標識により発生する検出可能な応答に
変調を引起すことができるその能力により特徴づけられ
る。後に、よυ十分に述べるように、このような変調は
、試薬の大きさおよび／ま／こは試薬上の標識−変調要
素の存在により普通、引起されるであろう。上記パラメ
ータ内で、高分子試薬は広汎な形態をとることができる
。この試薬は、標識化抗試薬物質と結合した際、標識に
立体障害を引き起こすことができ、および／または標識
−変調要素を担持することができるようにするために、
最低約ｓ、ｏｏｏドルトンのサイズを有するであろう。

通常、高分子試薬は約１０，０００ドルトンより大きい
分子量、好ましくは５０，０００ドルトンより大きい分
子量を有するであろう。任意の試薬系において有用な、
試薬の最低サイズは、選択された標識化抗試薬物質その
ものの性質および例えば感度のような試験の所望の性能
特性によ如左右されるであろう。高分子試薬の最大サイ
ズは本質的には制限されず、厳密には試薬系の設計者の
好みにもとづいて選択されるであろう。

分析対象物と結合する物質が天然に存在し、その物質に
対して抗試薬物質を産生ずることができ、しかもその物
質が十分に巨大な分子（５，０００ドルトンより大）で
ある場合には、このような物質それ自身が高分子試薬と
して役立つことができる。

生物学的系においては、このような状況にしばしば遭遇
し、この生物学的系においては、分析対象物は、結合性
蛋白質重たはある蛋白質ホルモン類、たとえば絨毛膜性
腺刺激ホルモン、インシュリン、成長ホルモン、卵胞刺
激ホルモン（ＦＳＨ）　、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、およびプロラクチンの
ような比較的大きな分子に対する受容体である。同様に
、分析対象物が抗体である場合、例えば、あるビールス
類、アレルゲン類、Ｈｈ因子等に対して特異的な抗体を
測定する場合には、抗原を高分子試薬として使用するこ
とができる。更に、高分子試薬は抗体またはそのフラグ
メントであってもよく、この抗体またはフラグメントは
分析対象物と結合し、この分析対象物は、このような場
合、比較的低分子量のハブテン（例えば、１００〜１５
００ドルトン）または抗原（例えば、１００　Ｆ１〜１
０，０００，０００　　ドルトン）であろう。このよう
な状況においては、抗試薬物ａは、抗分析対象物抗体ま
たはそのフラグメントに対して産生された抗体よシ選択
され、分析対象物および抗分析対象物高分子試薬に対す
る抗試薬物質の両者が同時に結合することを著しく妨害
するように、抗分析対象物の結合部位に、または十分に
近接位に結合するであろう。抗試薬物質は抗イデイオタ
イプの抗体（ａｎｔｉｉｄｉｏｔｉｐｉｃ　ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ）等であってよく、モノクローン手法によシ便宜
に産生ずることができる。

代りに、または分析対象物が、例えば、約２０００ドル
トンよシ小さい比較的小分子に対して特異的結合親和力
を有する場合には、このようなリガンドのポリマーもし
くは会合体、またはこのようなリガンドと高分子担体と
の複合体を形成することによシ、適切な高分子試薬を製
造することができる。このような複合体は、少くとも５
，０００　　ドルトンより大きい、通常、ｉｏ、ｏｏｏ
ドルトンより犬きい、好捷しくは５０，０００ドルトン
より大きい分子量の担体分子に結合した１またはそれ以
上のりガントよシなるであろう。リガンドは、複合体が
試験の条件下で実質的に安定であるような方式で担体に
結合するであろう。普通の場合、リガンドは担体分子に
共有結合で化学的に連結するであろう。担体物質として
役立つことができる広範な種々の物質および適切なリガ
ンドを担体物質に結合させるための広範な稙々の方法は
、十分に、この分野の普通の当業者の手腕内の事柄であ
る。反応混合物中に均一に分散することができる溶解性
の、通常は水溶性の担体物質を用いることが一般に好捷
しいが、担体物質は試験試料および反応混合物に溶解性
のものであっても不溶性のものであってもよい。しかし
ながら、樹脂、ゲル、プラスチック片、吸水性パッドの
形態の不溶性の、多孔性もしくは非多孔性物質さえも、
また反応容器それ自身の表面さえも、高分子試薬用の担
体として役立つ。担体物質の形状は制限されず、主に、
試薬系の設計者の選択に任される事柄である。

明らかに、高分子担体の原理上の目的は、単に、結合物
質分析対象物と抗試薬物質間の競争結合の目標物である
分子に最低サイズを付与するに過ぎないのであるから、
極めて広範囲の種々の物質が高分子担体として役立つこ
とができる。担体物質として用いることができる物質の
、確かに言いつくしてはいないが簡潔なリストとしては
、蛋白質類（例えば、アルブミン類およびグロブリン類
）；ポリペプチド類：多糖類；カルボキシメチルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびＤＥＡＥ−
セルロースのような変性セルロース類をはじめとするセ
ルロース類のような合成および天然に産出する有機性ポ
リマー類；デンプン類；寒天；アガロース；デキストラ
ン：ゼラチン；ポリビニルアルコール類；ポリエチレン
イミン；ポリリジン、ポリグルタミン酸のような合成ポ
リ　（アミノ酸類）等が挙げられる。少くとも１個の、
および普通には若干数のリガンドが担体物質に結合する
。％定の担体物質に結合するりガントの数は、包含され
る試験の必要性次第で、１から相体上の利用しうる連結
部位の数寸で変動するであろう。

標識北枕試薬物質 標識北枕試薬物質に高分子試薬が結合すると、結果とし
て、標識により発生する検出可能な応答が減少または増
加して測定可能な変化をもたらすことになる。例えば、
標識と相互反応して測定信号を発生する１まだはそれ以
上の物質よりなる化学的検出系の構成員との化学反応の
ような相互反応に基づく、立体的障害を感知する検出可
能な試験応答を提供するように、標識を選択することが
好ましい。このような試験系においては、標識北枕試薬
物質および高分子試薬の大きさは、その高分子試薬と結
合すると標識北枕試薬物質の大きさが有為に増加するよ
うに選択されるであろう。高分子試薬の相対的大きさが
より大きくなるので、標識の周囲における立体的効果が
よシ増幅され、従って、よシ容易に検出されうるように
なる。

通常の場合、標識それ自身は、例えば、ｓｏ、ｏｏ。

より小さい、一般には、１０　、０００より小さい、更
に普通には４，０００より小さい、好ましくは２，００
０より小さい分子量の、小さいものであることが好まし
く、この標識が相互反応する検出系構成員は、有為に大
きいことが好丑しく、例えば、標識の３倍、更に通常に
は１０倍、好ましくは２０ないし１００倍以上であろう
。従って、分子量が、１００ないＬ２０００ドルトンの
オーダーの大きさを有する標識を含む最も好ましい系に
おいては、標識が相互反応して検出可能な信号を発生す
る検出系の少くとも一構成員は、分子量が１０．０００
　　ないし２００　、０００　ドルトン以上のオーダー
のものであろう。標識と検出系構成員の大きさに関する
このような関係は、高分子試薬が標識北枕試薬物質と結
合する際の、有為の立体効果の可能性を増大させる。従
って、好ましい標識は、酵素基質類、補酵素類、酵素補
欠分子族類および酵素阻害剤類のような、酵素触媒反応
における関与物であり、何故なら、試験成分を選択する
ために、広範囲の種々の酵素反応が前記のものから利用
可能であるためである。多くの小さい、基質類、補酵素
類、および阻害剤類が、標識およびそれらと相互反応を
行う検出系構成員との間の好ましい大きさに関する関係
を有するだめの十分に大きな分子量の酵素頻用として知
られている。これらは同様に補欠分子族類およびそれら
に対応・するアポ酵素頻用に応用される。同様に、有為
に大きい基質を有する多くの酵素類、またはそのために
、小さい基質類、補酵素類、および阻害剤類を、水溶性
ポリマーのような高分子量骨格物質に結合させることに
より、人工的に大きい基質類、補酵素類、または阻害剤
類を製造することができる多くの酵素類が知られている
。

標識への立体効果の代替法として、または標識への立体
効果との組合せとして、標識北枕試薬物質が結合して、
標識−変調化要素、すなわち、接近した際、標識と相互
反応して、検出可能な応答を変調させる化学基または成
分を構成するような高分子試薬を立案することもできる
。このような接近効果は、均一系結合試験の従来技術に
おいて周知である（例えば、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２
７巻：１７９７〜１８０６頁（１９８１年）参照）。例
えば、抗試薬物質および高分子試薬の一方は発光要素、
例えば、螢光性基、化学ルミネセンス基、またはリン光
性基を構成してもよく、他方は、明白な特徴を有する光
を消滅させるかおよび／または再発光させる適切な光吸
収要素を構成してもよい。通常、このような系は、螢光
もしくは化学ルミネセンスの減光（米国特許第４，１６
０，０１６号およびＪ、Ｃｉｉへｐａｔｈ、　３０巻：
５２６頁（１９７７年）参照）、またはエネルギー移動
Ｃ米国特許第３，９９６，３４５号参照）を包含するで
あろう。抗試薬物質および高分子試薬の一方が螢光体を
構成し、他方が、２個の試験成分が結合すると螢光分極
の差異が検出用能となるように十分大きなサイズのもの
である場合には、螢光分極もまた坏Ｕ用することができ
る（Ｊ。

ＥＸｐ、　Ｍａｄ、　１２２巻：１２０９頁（１，９７
５年）およびｉｍｍｕｎｏｃｈｓｍ、　７巻ニア９９頁
（１９７０年）参照）。

他の接近効果を用いるアプローチとしては、抗試薬物質
および高分子試薬の一方が酵素系の一成分を構成し、他
方がこのような酵素系の第二成分を構成し、その酵素系
においては、２個の酵素系標識の接近関係により左右さ
れる速度で、ある酵素反応生成物が生成されるような酵
素チャネリング（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ　）を挙げるこ
とができる。このような酵素系標識対としては、例えば
、一方により触媒される反応の生成物が他方にとっては
基質である２個の異なる酵素、酵素とその基質壕だは補
助因子もしくは阻害物、またはアポ酵素とその補欠分子
族を挙げることができる（米国特許第４゜２３３．４０
２号参照）。

変調効果が立体障害に依る場合には、抗試薬物質中に含
まれる標識は、他の分子（化学的検出系の構成員）と相
互反応して、検出可能な応答を与えるいかなる物質であ
ってもよく、このような相互反応は立体的状況に感度を
有するので、標識化抗試薬物質への高分子試薬の結合が
応答生成相互反応を立体的に妨害する。特に好ましい標
識は前記米国特許出願第３５９，６１０号に詳述されて
いるものであシ、簡潔には、酵素基質および補酵素標識
（米国特許第４，２７９，９９２号および英国特許明細
書第１，５５２，６０７号）；酵素補欠分子族標識（米
国特許第４，２３８，５６５号；酵累活性調船物（例え
ば、阻害物）標識（米国特許第４　、１３４　、７９２
号および４，２７３，８６６号）：酵素標識（米国特許
第３．８１７，８３７号および４，０４３，８７２号）
；化学的励起螢光性標識（米国特許第４．２３８，１９
５号）−並びにエピトープ標識（米国特許第３，９３５
，０７４号および３，９９８，９４３号）を誉げること
ができる。

高分子試薬および標識化抗試薬物質の結合により惹起さ
れる立体効果は、高分子試薬との複合体生成により有意
に増大される大きさく嵩）を有する抗試薬物質を選択す
ることにより強められる。

一般に、抗試薬物質は試薬の嵩の１０倍以上とはならな
いことが打型しく、よシ一般的には、試薬の絶対的な大
きさより、より小さく、更に試薬の嵩の０．２５倍よシ
小さいことが好ましい。比較的低分子量の免疫グロブリ
ンクラス（群）の抗体を選択することによシ、抗試薬物
質の嵩を減少させることができ、例えば、ＩＢＭクラス
の抗体が約９００．０００の分子量を有するのに対し、
　ＩｐＧ抗体は約１５０，０００の分子量を有する。ま
た、選択的に抗体を開裂して、特異的結合親和力を保持
している低分子量のフラグメントを生成することができ
、例えば、Ｆａｂ　　（５０，０００ドルトｙ）　、Ｆ
　（ａｂ’）（５３，０００ドルトン）およびＦ　　（
ａｂ’）２　Ｃ１０６，０００ドルトン）のようなＩ、
ｉＧ抗体の腫々のフラグメントを製造することができる
。

すべての実施態様において、標識化された抗試薬物質は
、分析対象物と競争して高分子試薬と結合することがで
きる免疫学的に惹起された結合性物質である。抗試薬物
質は、普通、分析対象物も捷た結合する高分子試薬上の
結合部位（エピトープ）に対して産生される完全抗体、
または適切なフラグメントもしくはそれらの会合体より
なる。

かくして、高分子試薬が、分析対象物が結合する抗ｉｔ
たは他の自然に産出する高分子リガンドの場合には、抗
試薬物質はこのようなりガントに対して産生される。得
られる抗体は、このようなりガントへの結合に関して分
析対象物と競争させるためにスクリーンにかけられる。

高分子試薬が、前述したような高分子担体とリガンドの
複合体よシなる場合には、抗試薬物質はこのリガンドに
対して産生され、また、もしノ・ブテン性ならば、従来
公知のりガント−免疫原性担体複合体に対して産生され
る。

完全抗体の形態の場合には、抗試薬物質は公知の免疫グ
ロブリン、例えば、ＩｆＧ　、　ＩｐＭ　、　ＩｆＥ等
のクラスおよびサブクラスのいずれかに所属することが
できる。高分子試薬に対する特異的結合親和力を保持し
ているこのような抗体のフラグメントのいずれも、例え
ば、Ｆａｂ　ＸＦ　（ａｂ’）、およびＦ（ａｂ’）２
　として従来公知のＩｐＧのフラグメントもまた用いる
ことができる。更に、免疫グロブリンの会合体、ポリマ
ー、および複合体も適切な場合には使用することができ
る。このようなポリ　（抗試薬物質）を、試薬に対する
結合親和力を維持するような、利用可能な方法のいずれ
によっても産生ずることができる。選択された物質が、
当該試薬に対する特異的結合親和力を有する限りにおい
て、他の形態の抗体を用いることができる。

抗試薬物質用の免疫グロブリン資源は、第１用可能ない
かなる方法でも爪間できる。通常、抗試薬物質免疫グロ
ブリンは、従来の抗血清手法訃たはモノクローン手法に
より得られる。抗試薬物質を含有する抗血清は、適切な
免疫原を用いての、ラビット、モルモット、またはヤギ
のような動物の免役化を含む、十分に確立された手法に
より得られる。技術水準に関する概説は、バーカー（Ｐ
ａｒｋｏｒ　）、Ｒａ旧ｏｉｍｍｕｎｏａｓｇｎｙ　ｏ
ｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＡｏｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐ
ｏｕｎ＋１ｓ　、プレンティス−ホール（イン−グルウ
ッド・クリフス、ニューシャーシー、アメリカ合衆国、
１９７６年）　　（ＰｒａｎＬｉｃｅ−１（ａｌｌ（Ｅ
ｎｇｌｅｗｏｏｄ　Ｃ１１ｆｆｓ、　Ｎｅｗ　ＪＣｒｓ
ｅｙ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

１９７６））：　　バラトラ−（１３１１ｊ　ｌｅｒ　
）、Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　。

Ｍｅｔｌｘ、　７巻：］−２２４頁１９７５年）；　ワ
インリブおよびシ：ｚ　ロア　（Ｗｅｉｎｒｙｂ　ａｎ
ｄ　５ｈｒｏｆｆ　）、］）ｒｕｇＭ６もａｂ、　Ｒｅ
ｖ、　１０巻：２７１−２８３頁（１，９７，５年）；
ブロートンおよびストロング、Ｃｉｎ、　（：ｈｅｍ、
　２２巻ニア２６−７３２頁（１９７６年）−々らびに
プレイフェア（ｐｌａｙ４ａｉｒ　）等、Ｂｒ、　Ｍａ
ｄ、１３ｕ１１．３０巻：２４−３１頁（１９７４年）
によシ提供される。

使用することが好ましい。モノクローン性抗体は化学的
に均一であり、体細胞融合（ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　）手法により得られる：
　Ｌｙｍｐｂｏｏｙｔ。

Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、メルチャース等編、スフリンケ
ルーフエルラーク（ｅｄ、　Ｍｅｌｃｈｅｒｓ　ａｔ　
ａｌ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒ　ｌａｇ　）　（
＝　：ｘ−−ヨーク、１９７８年）およびＭｅｔｈｏｄ
ｓ　　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　７　３　　
（パー　ト　Ｂ　）　　＝　３　巻４６頁（１９８１年
）を参照されたい。一般に、モノクローン性抗試薬物質
免疫グロブリンは、このような抗体を産生するリンパ球
細胞を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ（融合細
胞、　　ｈｙｂｒｉ−ｄｏｍａｓ）を形成し、所望の抗
体を分泌するノ・イブリド−マクローンを単離し、かつ
分泌されたモノクローン性抗体を収穫することによシ産
生する。

細胞融合に包含されるリンパ球細胞は、通常、高分子試
薬上の関与エピトープに対して従来法で免役化されてい
るマウス又はラットのような動物から取り出された膵臓
細胞である。

選択された標識は、従来法で抗試薬物質に連結されて、
本発明の標識化成分を生成する。２要素を連結するだめ
の広範囲の積々の方法が利用可能であり、かつ、従来公
知である。連結は共有結合でもよく、−重化学結合また
は、水素を除く、主に、炭素ならびに窒業、酵素、燐、
および硫黄から選択されたへテロ原子からなる１〜５０
個の原子、更に通常には、１〜３０個の原子、普通には
１〜２０個の原子からなる連鎖を包含してもよい。従来
の連結基は文献に詳細に記載されている。例えば、米国
特許第４，２３０，７９７号；第４，２７９，９９２号
；第３，８１７．８３７号；第３，９３５，０７４号及
び第３．９９６，３４５号を参照されたい。抗試薬物質
への結合用の標識および／または標識もしくは標識誘導
体を抗試薬物質へ連結するのに用いた二官能性結合試薬
の残基に空間を与えおよび／または機能性を与える目的
のために、連結基は、標識上に載置される側腕基からな
ることもできる。

本発明においては、標識は抗試薬物質と結合しているの
で、標識化条件に付される抗試薬物質調製物については
、比較的高純度を達成することが必要であり、さもない
と、有為の非特異的標識が生じることがあシ、バックグ
ランド標識応答が発生する結果となる。アフイニテイ手
法により精製された従来の抗血清を用いてもよいが、モ
ノクローン性抗体調製物が特に好ましい。

一旦、モノクローン性抗試薬物質調製物（腹水液又は組
織培養液）が得られると、実質的に免疫グロブリンのみ
を含有する両分を、存在するかもしれない他の蛋白質か
ら分離する。このような分離は、オＵ用されうるいかな
る方法によって達成されてよい。好ましくは、アフィニ
ティークロマトグラフィー手法がこの作業に適用される
。クローントゲラフイーのカラム上の親和結合相手とし
て、通常、所望の抗試薬物質が所属する免疫グロブリン
クラスに対する抗体、例えば、抗ＩｐＧｔたはそのフラ
グメントである抗−（抗試薬物質）を用いることができ
る。好ましい方法ではガいが、親和結合相手として試薬
それ自身またはリガンドを用いることもできる。好まし
いアフィニティークロマトグラフィーの手法は、蛋白質
入と通常呼ばれる物質、■２Ｇ免疫グロブリン顛と特異
的に結合する特有の性質を有する黄色ブドウ球菌（３ｔ
ａｐｈ、ｙ−１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａＬｌｒ［ｌｕ８　）
より得られる蛋白質を用いる［：　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、　９７％：　８２２頁（１９６６年）およびＩｍｍ
ｕｎｏｌ　、　］、　０３巻：８２８頁（１９６９年）
〕。蛋白質Ａは、アフィニティークロマトグラフィーの
カラムマトリックスとして用いるのに適切な、単離され
た近日質またはゲル粒子に付着した蛋白質として市販さ
れている〔蛋白質Ａ−セファロース、ファルマシア・フ
ァイン・ケミカルズ、ピスヵクウエイ、ニューシャーシ
ー、アメリカ合衆国（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　−ｓｅｐｈ
ａｒｏｇｏ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ
ｍｉ　−ａａｌｓ、　Ｐｉｇｃａｔａｗａｙ、　Ｎ（Ｉ
Ｗ　Ｊｅｒ８ｅｙ、　ＵＳＡ）　］。モノクローン調製
物から抗試薬物質を分離するために、蛋白質Ａを用いる
ことは、特に有利である。モノクローン調製物中に存在
する唯一の免疫グロブリンは、抗試薬物質なので、免疫
グロブリン類を分離する手法を適用しさえすればよく、
がっ抗試薬物質のみが分離されるであろうことが保証さ
れる。

精製された抗試薬物質調製物は、次に、所望の特定の検
出系に従って標識°される。上述のように、標識は、利
用されうるいかなる方法によっても、抗試薬物質に結合
される。Ｍ製杭試薬物質調製物中に実質的に存在する唯
一の蛋白質は抗試薬物質であるので、標識物質と一般の
蛋白質問に共有結合を形成する条件下の反応により、標
識物質は効率よくかつ特異的にその中の抗試薬物質に付
着させることができる。蛋白質類を非％！’ｉ−的に標
識する懸念なしに、抗試薬物質を標識するために標準蛋
白質修飾反応を使用できることが、特に、有利である。

１またはそれ以上の標識を、個々の抗試薬物質分子に付
着することができるし、標識の性質が許すならば、逆も
また同じである。普通、抗試薬物質は、抗試薬物質１分
子当υ１ないし３０ｔの、、更に通常には工ないし２０
の標識を有する。感度を高めるために、抗試薬物質当り
複数個の標識を有することが望ましいが、標識濃度が高
すぎると、抗試薬物質の試薬への効果的な結合能力に影
響を与えることがある。標識が、酵累のように比較的大
きくかつ多価官能性である場合は、複数個の抗試薬物質
が単一の標識に付着してもよい。単−標識北枕試薬物質
複合体が、複数個の試薬分子と結合し、その各々が順に
標識北枕試薬物質と結合することができる故に、試薬の
結合は格子形成を導くことになり、標識で、またけその
近傍で、立体障害を増す結果となる。

反応混合液及び条件 試験されるべき試験試料は、分析対象物を含有すると思
われる、自然に存在する液体または人工的に生成された
液体でもよく、かつ、通常は、生物学的液体またはその
希釈液である。試験可能な生物学的液体としては、血清
、プラズマ、尿、唾液、乳汁、ならびに羊膜液および脳
を髄液を挙げることができる。

試験反応は、はとんどすべての場合、穏やかな条件下で
進行させる。試料および試薬の不存在下で、完全な検出
系および標識が有為の応答を発生することがないという
条件では、高分子試薬および標識北枕試薬物質、ならび
に、用いられる場合には検出系の所要量のオーダーは制
限されない。

反応混合液は、一般に、少量存在する所望の有機性共存
溶媒を含む水性媒質であろう。反応温度は、装置期間お
よび測定段階を通して、正常環境中で一定値を保持する
であろう。温度は、通常１５　ｉイＬ　５０℃であり、
更に普通には、２ｏないし４０℃であろう。好ましくは
、反応は室温で進行する。反応混合液の−は、　　５　
と　１０の間で変動し、更に普通には、　６　と　９の
間である。

種々の試薬の濃度は、試験媒質中の予想される分析対象
物濃度によって左右され、このような濃度は、通常、１
０−３ないし１０−”Ｍである。先に述べた反応パラメ
ーターの場合のように、選択は主に、経験的に引き出さ
れた、好適例に対してバランスのとれた最適条件、およ
び日常的な基本に基づいて試験を最終的に行う技能者の
要求に基づいて行われる。従って、パラメーターのいず
れも、本発明に対し決定的な性質ではなく、むしろそれ
らはすべて従来の普通の技法内のものである。

試薬系 本発明の試薬系、すなわち、試薬配合は、本発明により
包含される所望の試験方法を行うのに必要とされるすべ
ての必須の化学的な要素から々る。

試薬系は、箱詰め状の市販品の形で、試薬間での両立が
できる範囲で組成物もしくは混合物として；試験具の形
で；または、試験キット、すなわち、必要な試薬を保管
する１個またはそれ以上の容器の箱詰め組合わせとして
提供される。試薬系には、高分子試薬および標識北枕試
薬物質、カらびに、適切な場合には、標識の検出系が含
まれる。このような結合反応試薬は、更に、包含される
特異的試験法を遂行するための他のいかなる任意の試薬
を含有してもよい。勿論、この試薬系は、当業者に公知
の、かつ、緩衝液、希釈剤、標準液等のような商業上お
よびユーザーの立場から望ましい他の試薬を含有しても
よい。試薬系及びそれらを包含せしめた固体状の担体物
質からなる試験共もまた好ましい。このような試験具の
種々の形態は、１９８０年１０月３０日出願の米国特許
出願第２０２．３７８号に記載されており、かつ、ヨー
ロッパ特許出願束５１．　、２１３号として公開されて
いる。

ここで、本発明を次の実施例によシ説明するが、本発明
はこれによって制限されるものではない。

実施例 Ａ、ゲンタマイシンに対す否モノクローン性抗体の精製 ゲンタマイシンに対するモノクローン性抗体を含有する
マウス腹水（スクリップスーマイルス、インコーホレー
テッド、ラジョラ、カリフォルニア、アメリカ合衆国（
５ｃｒｉｐｐＢ−Ｍｉｌｅａ、　Ｉｎｃ、。

ＬａＪｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ）
　）　　を、次のように、蛋白質Ａ−セファロースを用
いたアフィニティークロマトグラフィによシ精製した。

使用に先立って、−２０℃で貯蔵した腹水液〔１ミリリ
ツトル（艷）〕を室温で０．０４％アジ化ナトリウムを
含有する、ｐＨ８，２の２０ｍＭ　ノ（イシン（Ｎ、Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〕を用いて平
衡化した４　ｍｌ　（１ｔｙｎ　Ｘ　５　ｃｒｎ）の蛋
白質Ａ−セファロース−４Ｂ（ファルマシアーファイン
ーケミカルズ、ビスカタウエー、ニュージャージ、アメ
リカ合衆国（ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｓ　Ｃｈｅｍ
ｉｃ−ａｌｓ、　ＰｉｇｃａＬａｗａｙ、　Ｎｏｗ　Ｊ
ｅｒｓｅｙ、　ＵＳＡ）　）　　カラムに施した。カラ
ムを、このバイシン緩衝液１５ｍ１で洗浄し、続いて、
０１モル濃度（Ｍ）塩化ナトリウム（Ｎａ（：ｔ）を含
有する同一のバイシン緩衝液１５−で、次いでＮａＣＡ
を含有しないバイシン緩衝液１５ｍ１で洗浄した。０．
　］、　］Ｍグリシンー塩酸ＨＣｔ）緩衝液（ｐ１４３
．０）を用いて、カラムを洗浄するととにより抗体を溶
出した。この酸溶出液を受容した試験管に、１Ｍバイシ
ン（ｐｌ（８，５）　　１００マイクロリツトル（μｔ
）を加えて、直ぢに−を高めた。カラムを最終的にバイ
シン緩衝液１５７で洗浄して、再びｐＨ８，２とした。

１００滴ずつの両分の２８０ナノメートルにおける吸光
度（Ａ２ｓｏ）を監視し、抗体を含有する両分をプール
し、ミリボアＣＸ−１０浸漬型超ろ過装置（Ｍｉ　ｌ　
Ｉｉｐｏｒｅｉｍｍｅｒｓｉｂｌｅ　ｕｌｔｒａｆｉｌ
ｔｒａｔｉｏｎ　ｄｅｖｉｃｅ　）を用いて約１　ｍｌ
捷で濃縮した。

濃縮された抗体溶液を、セファデックス（Ｓｅｐｂａｄ
ｓｘ　）　Ｇ　２５　（微細）（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒ−ｍａｃｉａ））を用いてクロマトグラフにかけて、
グリシンを除去した。この抗体溶液（約ｘｍｌ）を、室
温でｏ、０４％アジ化ナトリウムを含有する、−８２０
２０ｍＭバイシンで平衡化したＢｏｒｎ！（１，５ｃｍ
　Ｘ　４５　ｃｍ）セファデックスＧ−２５（微細）カ
ラムに施した。１００滴ずつの両分のＡ２．。を監視し
、抗体を含有する両分をプールし、前述のように２−ま
で濃縮した。

Ｂ、精製モノクローン性抗体の標識化 Ｎ−６−（６−アミンヘキシル）−７−β−ガラクトシ
ルクマリン−３−カルボキサミド（ＡＨ−ＧＵ）（米国
特許第４，２５９，２３３号）（５■、１０μＭｏ１）
を水２００μｔに溶解した。ジメチルアジピミデート　
（５■、２０μＭｏ１）　　を、１Ｍトリエチルアンモ
ニウム炭酸水素塩（ＴＥＡＢ）（ｐｌ＋９．６）４００
μｔおよびＡＨ−ＧＵ溶液１００μｔに室温で約５分間
溶解した。次に、抗体溶液［２ｍｌ。

ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、　１９３巻：２６５頁（１９５１年））による測定
値として２．４キ蛋白質］を添加し、次いで反応混合物
を室温で約１時間買置した。この時点で、１Ｍグリシン
−水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（ｒＪ（９，６）１０
０μｔを添加して反応を終了させた。黄色溶液を蚕白質
Ａ−セファロース・カラムに施し、ＧＵで標識化された
ゲンタマイシンに対する抗体を前述のようにして単離し
た。４４４を測定して、存在するＧＵ置換基濃度を定量
しくＳ、、３−２１）；β−ガラクトシダーゼを用いて
加水分解を行ってＡ、ｏｏを測定し、ＧＵ置換基のどれ
だけが加水分解できたかを定量しく８．。。＝３５）：
　　螢光を測定して、加水分解されたＧＵ置換基のどれ
だけが減光したかを定量した。

Ｃ，ゲンタマイシン−高分子試薬の調製仔ウシの血清ア
ルブミン（ＢＳＡ、ａｏｏｑ）を水１５ゴに溶解した。

一定量（１，０ｄ）を、必要に応じて２Ｎ塩酸（ＨＣり
または２Ｎ水酸化ナトリウム（Ｎａ０Ｈ）の添加により
、約４．５に調整された−を有するゲンタマイシン硫酸
塩（シエーリンクーコーポレーション、ブルームフィー
ルド、ニュージャージ、アメリカ合衆国（Ｓｃｈｅｒｉ
ｎｇ　Ｃｏｒｐ、。

Ｂ１ｏｏｍｆｉｅ１４．　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、　Ｕ
ＳＡ）　）の水溶液２．０−に添加した。混合液のｐ＋
（を同様に４．５に調整した。水を添加して、最終容量
を約８　ｍｌとし、−を再び４．５に調整した。水浴中
で１５分間冷却後、１−エチル−３−（ａ−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ピアス−ケミカ
ル・カンパニー、ロックフォード、イリノイ、アメリカ
合衆国（　ｐｉｒｏｅ　（：ｈａｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、
　　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，　Ｉｌｌｉ−ｎｏｉａ，ＵＳＡ
））　　６００９をこの溶液に添加し、水浴中で２時間
混合した。４℃で一晩買置後、溶液を室温になるまで放
置し、次いで、５０ｍＭノくイラン−０１％アジド（Ｓ
８．５）で平衡化したＧ−２５（微細）セファデックス
（ファルマシア）のカラムに施した。７ミリリツトルの
両分を収集し、ニンヒドリン反応に対する正応答および
２　８　０　ｎｍにおける吸光度により、ＢＳＡ−ゲン
タマイシン試薬の存在について試験した。ＢＳＡ−ゲン
タマイシンを含有する両分をプールした。

Ｄ．試験方法−ヤギ抗ゲンタマイシンの測定ＢＳＡＳグ
ータマイシン高分子試薬（前出）　２００マイクログラ
ム（μｍ）を含有する、２０ｍＭノ（イシン、０．９１
％アジ化ナトリウム、１２ｍＭ塩化マグネシウムおよび
４多ポリエチレングリコール（６０００エムダブリユー
シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ミズ
ｉす、アメリカ合衆国（　６０００　ＭＷ−　Ｓｉｇｍ
ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、　Ｓｔ．Ｌｏｕｉ８。

ＭＯ，　ＵＳＡ）　）　（ｐ１４　８．　２）　　１．
　３　５　ｒｎ！．に、ヤギのゲンタマイシン（分析苅
象吻）に対する抗血清を徐々に量を増加させながら（０
−４０μｔ）添加した。室温で１５分間温買置後標識化
モノクローン性抗ゲンタマイシン１００μｔ　（　０．
　０　１　Ａ３４３単位）を添加し、混合し、更に１５
分間温装置た。最後に、０、５単位／ゴのβ−ガラクト
シダーゼ１０μｔを添加して螢光発生を開始させた。３
０分後、螢光を読取った。

Ｅ．結果 標識化モノクローン性抗体調製物は、抗体１分子当り０
．　７　２のＡＨ−ＧＵ置換基を有することが判明した
。標識を過剰のβ−ガラクトシダーゼと買置すると、抗
体−１分子当り　０．　１　８のＡＨ−ＧＵ置換基（２
　５　％）が加水分解され、抗体１分子当り０、００３
の置換基（２５％）（加水分解された基の２％）が螢光
により検出された。ヤギのゲンタマイシンに対する抗血
清による、ＧＵ−抗ゲンタマイシンの加水分解に対する
阻害の緩和について、次表に示す。

０　　　　　１８、８　　　１６．３　　　　２．５５
　　　　２６、０　　　２２．θ　　　４．０１０　　
　　３４、０　　　２８．４　　　　５．６２０　　　
　４０、１　　　３２．２　　　　７．９３０　　　　
４５、７　　　３５．５　　　１０．２４０　　　　４
８、０　　　３８．２　　　　９．８データは、結合性
物質抗ゲンタマイシンの演１１定試験が本発明法により
遂行できることを示している。ゲンタマイシン−ＢＳＡ
　高分子試薬の存在下で、標識化モノクローン性抗ゲン
タマイシンにより発生する信号は、ヤギの抗ゲンクマイ
シンが試薬に結合すると増加する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　試験試料中の分析対象物を測定するだめの均一系免
   疫試験法であって、該試験試料を、（ａ）　（１）該分
   析対象物と結合しうる高分子試薬、および（１１）該高
   分子試薬との結合に関して、該分析対象物と競争するこ
   とが可能な標識化抗試薬物質、 但し、該標識化抗試薬物質は、該標識化抗試薬物質が該
   高分子試薬と結合すると、そのように結合しない場合と
   比較して、測定可能な程異なる検出可能な応答を万す標
   識よりなる、 と合わせる工程、および Φ）該試料中の該分析対象物の関数として、該検出可能
   な応答を測定する工程 からなることを特徴とする試験法。 ２　該高分子試薬が少くとも約５　、０００　　ドルト
   ンの分子量を有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３　該分析対象物が約２，０００　　ドルトン未満の分
   子量を有する分子と結合する結合性物質であυ、該高分
   子試薬が約２　、０００　　ドルトン未満の分子量を有
   する該分子と高分子植体との複合体よりなる特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ４　該総合性物質が結合性蛋白質寸たは受容体である特
   許請求の範囲第３項記載の方法。 ５　該分子がホルモンである特許請求の範囲第４項記載
   の方法。 ６　該分析対象物が約１０　、０００ドルトンより大き
   い分子量を有する分子と結合する結合性物質であり、該
   高分子試薬が約１０　、０００ドルトンより大きい分子
   量を有する該分子より々る特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ７、　該結合性物質が特定の抗原に対する抗体である特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 ８　該標識化抗試薬物質が標識化されたモノクローン性
   抗体寸たはそのフラグメントである特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ９　該試験試料が、また該標識化抗試薬物質中に含１れ
   る標識のだめの化学的検出系とも合わされており、該標
   識化抗試薬が該高分子試薬と結合すると、該検出系の構
   成員の該標識への接近の立体障害のために、そのように
   結合しない場合と比較して、該標識が該化学的検出系の
   構成員と相互反応して、測定可能な程に異った検出可能
   な応答をなすものである特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 １０、　　該標識が該検出系に含まれる＃累触媒反応に
   おける関与物である特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１　　該標識が酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
   酵素阻害物、または酵素である特許請求の範囲第１０項
   記載の方法。 １２　　生物学的液体試験試料中へのヨードチロニンの
   取込みを測定するための均一系免疫試験法であって、 ＜−）　　該試験試料を、（１）ヨード千ロニンと高分
   子用体との複合体、（）１）標識化抗ヨードチロニン、
   および（１１Ｄ該標識化抗ヨードチロニン中に含まれる
   標識の化学的検出系 但し、該標識化抗ヨードチロニンが該篩分子ヨード千ロ
   ニン複合体に結合すると、該検出系の構成員の該標識へ
   の接近の立体障害のために、そのように結合しない場合
   と比較して、該標識は、該検出系の構成員と相互反応し
   て、゛測定可能な程に異った検出可能な応答をなすもの
   、 と合わせる工程、および （ｂ）　　該試料中へのヨードチロニン取込みの関数と
   して、該検出可能な応答を測定する工程からなることを
   特徴とする試験法。 １３、　　該高分子担体が少くとも約５，０００　　ド
   ルトンの分子量を有する特許請求の範囲第１２項記載の
   方法。 １４、　　該ヨードチロニンがトリョートチロニンまた
   はチロキシンである特許請求の範囲第１２項記載の方法
   。 １５、　　該標識化抗ヨードチロニンが標識化された一
   Ｅ−７クロ一ン性抗体寸たはぞのフラグメントである特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 １６、該標識が該検出系に含まれる酵素触媒反応におけ
   る関与物である特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １７、該標識が酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、酵
   素阻害物、または酵素である特許請求の範囲第１６項記
   載の方法。 １８、　　試験試料中の分析対象物の測定用均一免疫試
   験法を実施するための試薬系であって、（１）分析対象
   物と結合しうる高分子試薬、および （２）該高分子試薬との結合に関して、該分析対象物と
   競争することが可能な標識化抗試薬物質、 但し、該標識化抗試薬物質は、該標識化抗試薬物質が該
   高分子試薬と結合すると、そのように結合しない場合と
   比較して、測定可能な程に異った検出可能な応答をなす
   標識よりなる、 からなることを特徴とする試薬系。 １９　　該高分子試薬が少くとも約５，０００ドルトン
   の分子量を有する特許請求の範囲第１８項記載の試薬系
   。 ２０　　該分析対象物が約２，０００ドルトン未満の分
   子量を有する分子と結合する結合性物質であり、該高分
   子試薬が約３，０００ドルトン未満の分子量を有する該
   分子と高分子担体との複合体よりなる特許請求の範囲第
   １８項記載の試薬系。 ２１　　該結合性物質が結合性蛋白質まだは受容体であ
   る特許請求の範囲第２０項記載の試薬系。 ２２、　　該分子がホルモンである特許請求の範囲第２
   １項記載の試薬系。 ２３　　該ホルモンがトリョードチロニンまたはチロキ
   シンである特許請求の範囲第２２項記載の試薬系。 ２４　　該分析対象物が約ｉｏ　、　ｏｏｏドルトンよ
   り大きい分子量を有する分子と結合する結合性物質であ
   り、該高分子試薬が約１０，０００ドルトンより犬きい
   分子量を有する該分子よりなる特許請求の範囲第１８項
   記載の試薬系。 ２５　　該結合性物質が特定の抗原に対する抗体である
   特許請求の範囲第２４項記載の試薬系。 ２６、　該標識化洗試薬物質が標識化モノクロ−４抗体
   またはそのフ　ラ　グメ・ン　トである特許１ｔＦｔ求
   の範囲第１８項記載の試薬系。 ２７　　該試験試料が、また該標識化洗試薬物質中に含
   まれる標識のだめの化学的検出系とも合わされており、
   該標識化洗試薬が該高・分子試薬と結合すると、該検出
   系の構成員の該標識への接近の立体障害のために、その
   ように結合しない場合と比較して、該標識は、該化学的
   検出系の構成員と相互反応して、？１１１１定可能な程
   に異った検出可能な応答をなすものである特許請求の範
   囲第１８項記載の試薬系。 ２Ｂ。　　該標識が該検出系に含まれる酵素触媒反応に
   おける関与物である特許請求の範囲第２５項記載の試薬
   系。 ２９、該標識が酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、酵
   素附害剤才たは酵素でおる特許請求の範囲第２８項記載
   の試薬系。 ３０、生物学的液体試験試料中へのヨードチロニンの取
   込みの測定用均一系免疫試験を実施するだめの試験キッ
   トであって、 （１）　　ヨードチロニンと高分子担体との複合体、（
   ２）標識化抗ヨードチロニン、および（３）該標識化抗
   ヨードチロニン中に含まれる標識の化学的検出系、 但し、該標識化抗ヨード千ロニンが該高分子ヨードチロ
   ニン複合体に結合すると、該検出系の構成員の該標識へ
   の接近の立体障害のために、そのように結合しない場合
   と比較して、該標識は、該検出系の構成員と相互反応し
   て、測定可能な程に異った検出可能な応答をなす、 からなることを特徴とする試験キット。 ３１、該高分子試薬が少くとも約５，０００ドルトンの
   分子量を有する特許請求の範囲第３０項記載の試験キッ
   ト。 ３２・　該ヨード千ロニンがトリョードチロニンまたは
   チロキシンである特許請求の範囲第３０項記載の試験キ
   ット。 ３３、　　該標識化抗ヨードチロニンが標識化モノクロ
   ーン性抗体またはそのフラグメント　である特許請求の
   範囲第３０項記載の試験キット・３３４、該標識が該検
   出系に含まれる酵素触媒反応における関与物である特許
   請求の範囲ＩＥ３ｏ項記載の試験キット。 ３５　　該標識が酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
   酵素阻害物、または酵素である特許請求の範囲第３４項
   記載の試験キット。 ３６　　試験試料中の分析対象物の均一系結合試験測定
   用試験具であって、 （１）分析対象物と結合しうる高分子試薬、および （２）該高分子試薬との結合に関して、該分析対象物と
   競争することが可能な標識化洗試薬物質、 世し、該標＆ｅ化抗試薬物質は、該標識化洗試薬物質が
   該高分子試薬と結合すると、そのように結合しない場合
   と比較して、測定可能な程に異った検出可能な応答をな
   す標識よシなる、 よりなる、試験試料中の分析対象物の測定用均一系免疫
   試験法を実施するだめの試薬系およびそれを包含せしめ
   た固体相体部材からなることを特徴とする試験具。