JP2613109B2 - 抗原に対してクラス特異的抗体の測定法及びこのために好適な試薬 - Google Patents
抗原に対してクラス特異的抗体の測定法及びこのために好適な試薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、体液中の抗原に対してクラス特異的抗体を
免疫検定法の原理により、試料溶液を少くとも２種類の
レセプターのR1及びR2（そのうちR1は固定可能でかつ測
定すべき抗体と結合能を有し、R2は標識されかつ測定す
べき抗体又は測定すべき抗体に特異的な抗原と結合能を
有する）とインキュベートし、固相を液相から分離しか
つ双方の相の一方における標識を測定することによる体
液中の抗原に対してクラス特異性抗体を測定する方法並
びにそのために好適な試薬に関する。
免疫検定法の原理により、試料溶液を少くとも２種類の
レセプターのR1及びR2（そのうちR1は固定可能でかつ測
定すべき抗体と結合能を有し、R2は標識されかつ測定す
べき抗体又は測定すべき抗体に特異的な抗原と結合能を
有する）とインキュベートし、固相を液相から分離しか
つ双方の相の一方における標識を測定することによる体
液中の抗原に対してクラス特異性抗体を測定する方法並
びにそのために好適な試薬に関する。
生体は異物の侵入に対する応答として免疫グロブリン
とも呼ばれる抗体を生産する。この免疫グロブリンは、
これらの構成によつて区別される５種類のクラスに分類
することができる。種々の免疫グロブリンのクラスは、
生体中において種々の役割を有する。そこで一次免疫に
際してはまずＭクラスの免疫グロブリンが生成される
が、その濃度は感染が進行するにつれて急速に再度減少
する。Ｇクラスの免疫グロブリンは、一次免疫に際して
は、まず緩慢に生成されるが同一の抗原との２次反応に
際しては多量に生成する。クラスＡの免疫グロブリンは
生体の粘膜上皮における防禦過程を相当する。クラスＥ
の免疫グロブリンは、主としてアレルギー反応にあづか
る。クラスＤの免疫グロブリンに関しては、今迄の所で
は比較的知られていない。個別の免疫グロブリンクラス
は血液中で非常に異つた濃度で存在する。例えば、正常
人の血清中のIgG含有量は、８〜16mg/lの範囲である。I
gMクラスの抗体は血清中に0.5〜2mg/mlの量で含まれ
る。２番目に多い免疫グロブリンは、IgAであり、これ
は、正常人の血清中に1.4〜4mg/mlの量で含まれてい
る。血清中のIgEの濃度は、最も少く、0.000017〜0.000
45mg/mlの範囲である。血清中のIgDの含有量は０〜0.4m
g/mlの範囲にある。
とも呼ばれる抗体を生産する。この免疫グロブリンは、
これらの構成によつて区別される５種類のクラスに分類
することができる。種々の免疫グロブリンのクラスは、
生体中において種々の役割を有する。そこで一次免疫に
際してはまずＭクラスの免疫グロブリンが生成される
が、その濃度は感染が進行するにつれて急速に再度減少
する。Ｇクラスの免疫グロブリンは、一次免疫に際して
は、まず緩慢に生成されるが同一の抗原との２次反応に
際しては多量に生成する。クラスＡの免疫グロブリンは
生体の粘膜上皮における防禦過程を相当する。クラスＥ
の免疫グロブリンは、主としてアレルギー反応にあづか
る。クラスＤの免疫グロブリンに関しては、今迄の所で
は比較的知られていない。個別の免疫グロブリンクラス
は血液中で非常に異つた濃度で存在する。例えば、正常
人の血清中のIgG含有量は、８〜16mg/lの範囲である。I
gMクラスの抗体は血清中に0.5〜2mg/mlの量で含まれ
る。２番目に多い免疫グロブリンは、IgAであり、これ
は、正常人の血清中に1.4〜4mg/mlの量で含まれてい
る。血清中のIgEの濃度は、最も少く、0.000017〜0.000
45mg/mlの範囲である。血清中のIgDの含有量は０〜0.4m
g/mlの範囲にある。
ところで診断にとつては、特定の抗原に対して特異的
な特定の免疫グロブリンクラスの抗体を検出することが
重要である。それというのもこのようにして、ウイル
ス、細菌、及び寄生虫感染を夫々鑑別診断することが可
能だからである。殊にIgG及びIgM測定は、新しい及び遠
い過去の感染歴の識別並びに感染の経過の検査のために
好適である。特にＢ型肝炎、トキソプラズマ、ルベラ
（Rubella）及びクラミデイア（Chlamydia）感染に際し
てクラス特異的抗体が検出されている。
な特定の免疫グロブリンクラスの抗体を検出することが
重要である。それというのもこのようにして、ウイル
ス、細菌、及び寄生虫感染を夫々鑑別診断することが可
能だからである。殊にIgG及びIgM測定は、新しい及び遠
い過去の感染歴の識別並びに感染の経過の検査のために
好適である。特にＢ型肝炎、トキソプラズマ、ルベラ
（Rubella）及びクラミデイア（Chlamydia）感染に際し
てクラス特異的抗体が検出されている。
クラス特異的抗体の測定法は周知である。そこで、例
えば米国特許（US−PS）第4,020,151号明細書には、血
清中のIgG、IgA、及びIgMの濃度の定量法が記載されて
いるが、この方法においては、まず、固体坦体を試料溶
液と反応させ、（その際IgG、IgA又はIgMは固相に吸着
される）それに続いて夫々のIgクラスに対する標識され
た抗体を加え結合した標識を評価する。他の検出系は、
W.Duermeyer等によりThe Lancet II,684−685に記載さ
れているが、この場合には特異的免疫グロブリンクラス
に対する抗体を固体坦体に結合させている。試料の添加
後、クラス特異的免疫グロブリンは、この壁に結合し、
かつ第二段階で、測定すべき抗体に特異的な抗原を添加
し、この抗原はつづいてこの抗体に結合する。第三段階
でこの抗原に対して標識された抗体を添加し、結合した
標識分をあらためて測定する。
えば米国特許（US−PS）第4,020,151号明細書には、血
清中のIgG、IgA、及びIgMの濃度の定量法が記載されて
いるが、この方法においては、まず、固体坦体を試料溶
液と反応させ、（その際IgG、IgA又はIgMは固相に吸着
される）それに続いて夫々のIgクラスに対する標識され
た抗体を加え結合した標識を評価する。他の検出系は、
W.Duermeyer等によりThe Lancet II,684−685に記載さ
れているが、この場合には特異的免疫グロブリンクラス
に対する抗体を固体坦体に結合させている。試料の添加
後、クラス特異的免疫グロブリンは、この壁に結合し、
かつ第二段階で、測定すべき抗体に特異的な抗原を添加
し、この抗原はつづいてこの抗体に結合する。第三段階
でこの抗原に対して標識された抗体を添加し、結合した
標識分をあらためて測定する。
これらの従来公知のクラス特異的免疫グロブリン測定
の方法は、しかし乍ら満足すべきものではない。固相の
限定された結合能及び試料中の分析体高濃度に基づき、
血清中に含有される免疫グロブリンクラスの僅か一部分
のみが結合できるにすぎない。従つて抗原特異的免疫グ
ロブリンの定量の際に著るしく変動することになる、そ
れというのも血清中の免疫グロブリンの全含有量は著る
しく変動するからである。従つて、これらの既知の方法
を用いると、種々の試料中の免疫グロブリンクラスの抗
原特異的免疫グロブリン含有量の等しい際に測定結果が
異なり極端な場合には実質的にプラスの試料がマイナス
として検出されるようなことになる。
の方法は、しかし乍ら満足すべきものではない。固相の
限定された結合能及び試料中の分析体高濃度に基づき、
血清中に含有される免疫グロブリンクラスの僅か一部分
のみが結合できるにすぎない。従つて抗原特異的免疫グ
ロブリンの定量の際に著るしく変動することになる、そ
れというのも血清中の免疫グロブリンの全含有量は著る
しく変動するからである。従つて、これらの既知の方法
を用いると、種々の試料中の免疫グロブリンクラスの抗
原特異的免疫グロブリン含有量の等しい際に測定結果が
異なり極端な場合には実質的にプラスの試料がマイナス
として検出されるようなことになる。
これらの障害を軽減させるために、例えばJournal of
Clinical Microbiology,1986年８月,288−293頁には、
試料液を稀釈し、続いて測定すべき免疫グロブリンクラ
スの抗体を含有する血清を添加し、その後更に稀釈する
ことが提案されている。この方法では1:2000〜1:20000
の稀釈が必要である。この強度の稀釈によつて、一方で
は得られる結果の再現性が問題となるし、他方では、こ
の方法は自動分析器にかけることはできないということ
にもなる。
Clinical Microbiology,1986年８月,288−293頁には、
試料液を稀釈し、続いて測定すべき免疫グロブリンクラ
スの抗体を含有する血清を添加し、その後更に稀釈する
ことが提案されている。この方法では1:2000〜1:20000
の稀釈が必要である。この強度の稀釈によつて、一方で
は得られる結果の再現性が問題となるし、他方では、こ
の方法は自動分析器にかけることはできないということ
にもなる。
従つて本発明の課題は、煩雑な試料の準備又は試料の
高度の稀釈が不必要で、かつ僅かな段階で実施すること
の可能な、体液中の抗原に対してクラス特異的抗体を定
量的に測定することのできる方法を提供することであつ
た。
高度の稀釈が不必要で、かつ僅かな段階で実施すること
の可能な、体液中の抗原に対してクラス特異的抗体を定
量的に測定することのできる方法を提供することであつ
た。
この課題は、免疫検定法の原理に従つて、試料溶液を
少くとも二種類のレセプターR1及びR2、その内のR1は固
定可能でかつ測定すべき抗体と結合能を有し又R2は標識
されかつ測定すべき抗体又はそれの抗原Ａと結合能を有
するこれらのレセプターとインキュベートし、固相を液
相から分離し、双方の相の一つにおける標識を測定する
ことにより、体液中の抗原Ａに対する特定の免疫グロブ
リンクラスの抗体を測定する方法によつて解決せられ、
これは、免疫反応を均質の相で実施し、試料溶液をレセ
プターR1及び測定すべき抗体と等しい免疫グロブリンク
ラスに所属し抗原Ａとの結合能を有しない過剰の人抗体
又はそれのフラグメントと同時にインキュベートし、そ
れに続いてレセプターR2及び場合によつては更に他のレ
セプターを添加することよりなる。
少くとも二種類のレセプターR1及びR2、その内のR1は固
定可能でかつ測定すべき抗体と結合能を有し又R2は標識
されかつ測定すべき抗体又はそれの抗原Ａと結合能を有
するこれらのレセプターとインキュベートし、固相を液
相から分離し、双方の相の一つにおける標識を測定する
ことにより、体液中の抗原Ａに対する特定の免疫グロブ
リンクラスの抗体を測定する方法によつて解決せられ、
これは、免疫反応を均質の相で実施し、試料溶液をレセ
プターR1及び測定すべき抗体と等しい免疫グロブリンク
ラスに所属し抗原Ａとの結合能を有しない過剰の人抗体
又はそれのフラグメントと同時にインキュベートし、そ
れに続いてレセプターR2及び場合によつては更に他のレ
セプターを添加することよりなる。
驚くべきことに本発明による方法により、試料を予備
処理する必要なく、クラス特異的抗体を再現可能に検出
することに成功している。本発明による方法は簡単かつ
迅速に実施することが可能である。
処理する必要なく、クラス特異的抗体を再現可能に検出
することに成功している。本発明による方法は簡単かつ
迅速に実施することが可能である。
本発明によれば、抗原Ａに対するクラス特異的抗体
を、均質免疫検査法で、即ち免疫反応が均質な相で進行
する方法で測定する。このために、測定すべき抗体と結
合能を有するレセプターR1として、免疫反応の間、均質
な相で存在し、これに続いて固相に固定化される固定化
可能のレセプターを使用する。レセプターR1は、従つて
固相に結合可能にする分及び他方ではクラス特異的な抗
体との結合を可能にする分を含有する。クラス特異的な
抗体との結合のために、抗体の不変部に対する抗体又は
そのフラグメント又はその誘導体を用いるのが有利であ
る。クラスＧの免疫グロブリンを測定すべき場合には、
レセプターR1は、抗IgG抗体又はそのFabフラグメントを
含有する。固定化のために、レセプターR1の不変部と結
合可能なレセプターが固相に固定されていてよい。しか
しながら、レセプターR1としては、クラス特異的抗体と
結合可能な部分及び特異的に結合可能な一対の一方の成
分、有利には、ビオチンからなる複合体を使用するのが
有利である。それから、固相としては特異的に結合する
対の他の成分、殊に有利にストレプトアビジン（Strept
avidin）に結合しているマトリツクスを使用できる。固
定化は従つて両方の成分同志の結合によつて行われる。
この結合は異質同志で行われ、従つてこの免疫反応より
も極めて緩慢に進行するので、これは、均質相における
免疫反応の進行を妨害しない。他の変法においては、特
異的に結合する対の同じ成分、有利にはビオチンが同様
にこの固相に結合することができるが、この際には、固
定化のために、特異的に結合する対の他の成分を加え、
これがこの際固相とレセプターR1との間の結合を媒介す
る。
を、均質免疫検査法で、即ち免疫反応が均質な相で進行
する方法で測定する。このために、測定すべき抗体と結
合能を有するレセプターR1として、免疫反応の間、均質
な相で存在し、これに続いて固相に固定化される固定化
可能のレセプターを使用する。レセプターR1は、従つて
固相に結合可能にする分及び他方ではクラス特異的な抗
体との結合を可能にする分を含有する。クラス特異的な
抗体との結合のために、抗体の不変部に対する抗体又は
そのフラグメント又はその誘導体を用いるのが有利であ
る。クラスＧの免疫グロブリンを測定すべき場合には、
レセプターR1は、抗IgG抗体又はそのFabフラグメントを
含有する。固定化のために、レセプターR1の不変部と結
合可能なレセプターが固相に固定されていてよい。しか
しながら、レセプターR1としては、クラス特異的抗体と
結合可能な部分及び特異的に結合可能な一対の一方の成
分、有利には、ビオチンからなる複合体を使用するのが
有利である。それから、固相としては特異的に結合する
対の他の成分、殊に有利にストレプトアビジン（Strept
avidin）に結合しているマトリツクスを使用できる。固
定化は従つて両方の成分同志の結合によつて行われる。
この結合は異質同志で行われ、従つてこの免疫反応より
も極めて緩慢に進行するので、これは、均質相における
免疫反応の進行を妨害しない。他の変法においては、特
異的に結合する対の同じ成分、有利にはビオチンが同様
にこの固相に結合することができるが、この際には、固
定化のために、特異的に結合する対の他の成分を加え、
これがこの際固相とレセプターR1との間の結合を媒介す
る。
該方法の実施のために、まず、レセプターR1及び試料
溶液に、抗原Ａと結合能を有さない測定すべき免疫グロ
ブリンクラスの過剰の人クラス特異的抗体又はそのフラ
グメントを添加する。フラグメントとしては、この際、
測定すべき免疫グロブリンクラスのFcフラグメント又は
Ｈ鎖抗原決定基を使用することができる。かくしてIgM
の検出のためにはμ鎖を、IgGの検出のためにはγ−鎖
等を使用することができる。
溶液に、抗原Ａと結合能を有さない測定すべき免疫グロ
ブリンクラスの過剰の人クラス特異的抗体又はそのフラ
グメントを添加する。フラグメントとしては、この際、
測定すべき免疫グロブリンクラスのFcフラグメント又は
Ｈ鎖抗原決定基を使用することができる。かくしてIgM
の検出のためにはμ鎖を、IgGの検出のためにはγ−鎖
等を使用することができる。
人のクラス特異的抗体は、試料溶液中で期待される免
疫グロブリンの量に関して２〜100:1の過剰で使用する
のが有利である。
疫グロブリンの量に関して２〜100:1の過剰で使用する
のが有利である。
有利にまず、レセプターR1及び過剰のクラス特異的抗
体からなる溶液を作る。この際、レセプターR1の測定す
べき抗体と結合可能の区分は加えられたクラス特異的抗
体と反応する。つづいて試料溶液を添加する。ところで
試料溶液中で不足しているクラス特異的抗体は、過剰に
存在する非特異的抗体を複合体から部分的に排除する。
この際この排除反応は、R1に対するクラス特異的抗体の
活性が小さい程迅速に進行する。従つて、R1に対して５
×10-11l/mol以下の活性を有するクラス特異的抗体が有
利に使用される。引続くレセプターR2の添加後に、R2は
測定すべき抗体とレセプターR1とからの複合体に結合す
る。固定化後に、結合した標識分は周知の方法で測定で
き、かつ試料溶液中のクラス特異的抗体量に関する直後
の尺度である。
体からなる溶液を作る。この際、レセプターR1の測定す
べき抗体と結合可能の区分は加えられたクラス特異的抗
体と反応する。つづいて試料溶液を添加する。ところで
試料溶液中で不足しているクラス特異的抗体は、過剰に
存在する非特異的抗体を複合体から部分的に排除する。
この際この排除反応は、R1に対するクラス特異的抗体の
活性が小さい程迅速に進行する。従つて、R1に対して５
×10-11l/mol以下の活性を有するクラス特異的抗体が有
利に使用される。引続くレセプターR2の添加後に、R2は
測定すべき抗体とレセプターR1とからの複合体に結合す
る。固定化後に、結合した標識分は周知の方法で測定で
き、かつ試料溶液中のクラス特異的抗体量に関する直後
の尺度である。
加えられたクラス特異的抗体の量は重要ではない。そ
の量は、通常、血清中のこのクラスの免疫グロブリンに
対して期待され得る上限の値の少くとも２倍の大きさで
あるべきである。従つて、期待される免疫グロブリン量
に対して2:1〜100:1の過剰が有利である。100倍以上の
過剰の場合には、それ以上の改善はみられないので、こ
れ以上の過剰は不経済である。
の量は、通常、血清中のこのクラスの免疫グロブリンに
対して期待され得る上限の値の少くとも２倍の大きさで
あるべきである。従つて、期待される免疫グロブリン量
に対して2:1〜100:1の過剰が有利である。100倍以上の
過剰の場合には、それ以上の改善はみられないので、こ
れ以上の過剰は不経済である。
二番目のレセプターとして、標識されたレセプターが
使用される。標識は公知の方法で行われ、放射性のアイ
ソトープ、化学発光又は螢光物質、色素生成物質又は酵
素であつてよい。これらの標識を検出するための方法
は、同様に周知であり詳細に説明するまでもない。レセ
プターR2は測定すべき抗体と又はこの抗体に対して特異
的な抗原と結合可能である。これの最初の変法では、レ
セプターR2として、周知の方法で標識されている測定す
べき抗体に対して特異的な抗原を使用するのが有利であ
る。もう１つの他の変法においては、レセプターR2とし
て、測定すべき抗体に対して特異的抗原にむけられた抗
体又はそのフラグメントを使用するのが有利である。抗
体は、その際、モノクロナール又はポリクロナールであ
つてよい。この第２の実施形においては、この測定に対
して測定すべき抗体及びR2と特異的に結合可能の物質で
あるもう１つのレセプターR3が必要である。R3は測定す
べき抗体に対して特異的な抗原を含有することが特に重
要である。この抗原が測定すべき抗体及びレセプターR2
に対する結合部位（エピトープ）を有するならば、この
抗原を直接R3として使用可能である。
使用される。標識は公知の方法で行われ、放射性のアイ
ソトープ、化学発光又は螢光物質、色素生成物質又は酵
素であつてよい。これらの標識を検出するための方法
は、同様に周知であり詳細に説明するまでもない。レセ
プターR2は測定すべき抗体と又はこの抗体に対して特異
的な抗原と結合可能である。これの最初の変法では、レ
セプターR2として、周知の方法で標識されている測定す
べき抗体に対して特異的な抗原を使用するのが有利であ
る。もう１つの他の変法においては、レセプターR2とし
て、測定すべき抗体に対して特異的抗原にむけられた抗
体又はそのフラグメントを使用するのが有利である。抗
体は、その際、モノクロナール又はポリクロナールであ
つてよい。この第２の実施形においては、この測定に対
して測定すべき抗体及びR2と特異的に結合可能の物質で
あるもう１つのレセプターR3が必要である。R3は測定す
べき抗体に対して特異的な抗原を含有することが特に重
要である。この抗原が測定すべき抗体及びレセプターR2
に対する結合部位（エピトープ）を有するならば、この
抗原を直接R3として使用可能である。
発明による方法の実施に対して、試料溶液をまず、レ
セプターR1及び過剰のクラス特異的抗体とインキュベー
トし、つづいてレセプターR2を添加する。レセプターR3
の使用されるこの変法においては、R3をレセプターR2の
添加の前に試料溶液に添加する。
セプターR1及び過剰のクラス特異的抗体とインキュベー
トし、つづいてレセプターR2を添加する。レセプターR3
の使用されるこの変法においては、R3をレセプターR2の
添加の前に試料溶液に添加する。
二個のレセプターのみ必要とし、その結果として反応
が２つの段階で実施できそれによつて自動分析器にかけ
ることの可能な本発明法の実施形式は殊に有利である。
が２つの段階で実施できそれによつて自動分析器にかけ
ることの可能な本発明法の実施形式は殊に有利である。
この免疫反応は、均質な相で行われるが、これは、均
質は反応がより迅速にかつ再現性をもつて進行するの
で、極めて有益である。
質は反応がより迅速にかつ再現性をもつて進行するの
で、極めて有益である。
本発明の対象は、体液中の或る抗原に対してクラス特
異的抗体の測定のための試薬でもあるが、これは固定化
可能でかつ測定すべき抗体と結合可能なレセプターR1及
び抗原Ａと結合することのできない過剰の人クラス特異
的抗体及び溶液２として、標識されかつ抗原Ａを有する
レセプターR2を含有する。
異的抗体の測定のための試薬でもあるが、これは固定化
可能でかつ測定すべき抗体と結合可能なレセプターR1及
び抗原Ａと結合することのできない過剰の人クラス特異
的抗体及び溶液２として、標識されかつ抗原Ａを有する
レセプターR2を含有する。
もう１つの他の変法では、本発明による試薬は、溶液
１としてレセプターR1と過剰の人クラス特異的抗体との
混合物、溶液２として標識され抗原Ａに対する抗体を含
有するレセプターR2及び溶液R3として抗原Ａを有するレ
セプターR3を含有する。
１としてレセプターR1と過剰の人クラス特異的抗体との
混合物、溶液２として標識され抗原Ａに対する抗体を含
有するレセプターR2及び溶液R3として抗原Ａを有するレ
セプターR3を含有する。
この変法において、レセプターR3は少くとも特異的結
合能を有する抗体に対して又レセプターR2に対して夫々
１個の結合部位を有すべきである。従つてレセプターR3
に対して、自身多価の抗原が使用されるか又は一価の一
つの抗原に対して一つの抗体が検出されるべき場合に
は、レセプターR3に対してポリマーの形の抗原が使用さ
れる。このために、この抗原は、例えばRSA、（ウシ血
清アルブミン）、ラテツクス又はマイクロキヤリアの如
き坦体に結合し又は交差網状に結合していてよい。この
ための方法は専問家に周知である。
合能を有する抗体に対して又レセプターR2に対して夫々
１個の結合部位を有すべきである。従つてレセプターR3
に対して、自身多価の抗原が使用されるか又は一価の一
つの抗原に対して一つの抗体が検出されるべき場合に
は、レセプターR3に対してポリマーの形の抗原が使用さ
れる。このために、この抗原は、例えばRSA、（ウシ血
清アルブミン）、ラテツクス又はマイクロキヤリアの如
き坦体に結合し又は交差網状に結合していてよい。この
ための方法は専問家に周知である。
有利な実施形では、試薬の溶液２及び３を前もつて混
合することができる。本試薬は、従つて溶液１としてレ
セプターR1と過剰の人クラス特異的抗体との混合物、及
び溶液２として、標識され、抗原Ａに対する抗体を含有
するレセプター2及び抗原Ａを有するレセプターR3を含
有する。
合することができる。本試薬は、従つて溶液１としてレ
セプターR1と過剰の人クラス特異的抗体との混合物、及
び溶液２として、標識され、抗原Ａに対する抗体を含有
するレセプター2及び抗原Ａを有するレセプターR3を含
有する。
本試薬は、試料溶液中における免疫グロブリンの期待
量に対して人クラス特異的抗体の２〜100倍量が反応溶
液中に存在する程度の過剰に人クラス特異的抗体を含有
する。更に、試料10μｌを試薬1mlに加える場合の試薬
は、１につき抗体20〜2000mgを含有するのが有利であ
る。
量に対して人クラス特異的抗体の２〜100倍量が反応溶
液中に存在する程度の過剰に人クラス特異的抗体を含有
する。更に、試料10μｌを試薬1mlに加える場合の試薬
は、１につき抗体20〜2000mgを含有するのが有利であ
る。
本発明による試薬は、２もしくは３種の別々の溶液の
中にクラス特異的抗体の測定のために必要な成分を含有
する。溶液は、物理的に互に分離して保存しかつ測定に
際しては順時に試料溶液とインキユベートする。本溶液
は貯蔵に安定である。
中にクラス特異的抗体の測定のために必要な成分を含有
する。溶液は、物理的に互に分離して保存しかつ測定に
際しては順時に試料溶液とインキユベートする。本溶液
は貯蔵に安定である。
本発明を次の例によつて詳述する。
例１ 血清中の免疫グロブリンクラスＭの抗−HBcAg抗体（A
nti−HBcAg−Antikoer per）を測定した。このために固
相としてストレプトアビヂン（Streptavidin）で被覆さ
れた小管を使用した。この小管中に試料10μｌを次の組
成の試薬1000μｌと共に入れた： 試薬1:燐酸緩衝液（pH7.0）40m mol/l、プルロニツク
（Pluronic）F68 0.5％、牛血清アルブミン0.2％、石炭
酸0.01％、HBcAgと結合能のない人IgM40mg/l、ビオチン
と結合したIgMに対するモノクロナール抗体2mg/l。
nti−HBcAg−Antikoer per）を測定した。このために固
相としてストレプトアビヂン（Streptavidin）で被覆さ
れた小管を使用した。この小管中に試料10μｌを次の組
成の試薬1000μｌと共に入れた： 試薬1:燐酸緩衝液（pH7.0）40m mol/l、プルロニツク
（Pluronic）F68 0.5％、牛血清アルブミン0.2％、石炭
酸0.01％、HBcAgと結合能のない人IgM40mg/l、ビオチン
と結合したIgMに対するモノクロナール抗体2mg/l。
インキユベーシヨンは、室温で30分間行つた。水で３
回洗つた後、次の組成の試薬1mlを加えた： 試薬2:燐酸緩衝液（pH7.0）40m mol/l、牛血清アルブ
ミン0.2％、石炭酸0.01％、ヘパチチスコア抗原（Hepat
itis Core）75μg/l、モノクローナルAnti−HBcAg−抗
体及びペルオキシダーゼからなる複合体25U/l。
回洗つた後、次の組成の試薬1mlを加えた： 試薬2:燐酸緩衝液（pH7.0）40m mol/l、牛血清アルブ
ミン0.2％、石炭酸0.01％、ヘパチチスコア抗原（Hepat
itis Core）75μg/l、モノクローナルAnti−HBcAg−抗
体及びペルオキシダーゼからなる複合体25U/l。
20〜22℃で60分間インキユベートし、水で３回洗つて
からABTS溶液1mlを基質として加えた。吸光度を一時間
後405nmで測定し、検量曲線により評価した。結果は次
表から推定される： 例２ 血清中のIgMクラスの抗−HBc−抗体を例１と同様に測
定したが、その際人IgMに対するビオチン結合モノクロ
ナール抗体の代りにビオチン結合のポリクローナル抗Ig
M抗体を試薬１中で使用した。評価は例１の記載と同様
に行つた。
からABTS溶液1mlを基質として加えた。吸光度を一時間
後405nmで測定し、検量曲線により評価した。結果は次
表から推定される： 例２ 血清中のIgMクラスの抗−HBc−抗体を例１と同様に測
定したが、その際人IgMに対するビオチン結合モノクロ
ナール抗体の代りにビオチン結合のポリクローナル抗Ig
M抗体を試薬１中で使用した。評価は例１の記載と同様
に行つた。
例３ 血清中のIgMクラスの抗−HBcAg抗体を例１記載と同様
にして検出したがこの際には、試薬２に抗体POD−複合
体及び血清肝炎コア抗原の代りに、HBcAg及びペルオキ
ダーゼからなる複合体を使用した。評価は例１に記載の
如くに行なつた。
にして検出したがこの際には、試薬２に抗体POD−複合
体及び血清肝炎コア抗原の代りに、HBcAg及びペルオキ
ダーゼからなる複合体を使用した。評価は例１に記載の
如くに行なつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−22186（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−177264（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−269070（ＪＰ，Ａ) 米国特許4661444（ＵＳ，Ａ) Ｊａｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．24，Ｎｏ．２（1986）Ｐ．288−293
Claims (11)
- 【請求項１】免疫検定法の原理に従って、試料溶液を、
同定化可能で、測定すべき抗体及びこれと同じ免疫グロ
ブリンクラスに属するヒト特異的抗体又はそのフラグメ
ントと結合能を有するレセプターR1及び標識されてい
て、測定すべき抗体又はその抗原Ａと結合能を有するレ
セプターR2と共に固相の存在下にインキュベートし、固
相を液相から分離し、かつ双方の相の一種における標識
を測定することにより、体液中の、抗原Ａと反応性の特
定の免疫グロブリンクラスの抗体を測定する場合に、試
料溶液を、まず、レセプターR1及び試料溶液中に期待さ
れる量の免疫グロブリンに対して過剰の、測定すべき抗
体と同じ免疫グロブリンクラスに属し、かつ抗原Ａと結
合能を有しないヒト特異的抗体又はそのフラグメントを
同時に含有する試薬溶液と共にインキュベートして、免
疫反応を均質相で実施し、続いてレセプターR2を添加
し、更にR2が抗原Ａと結合能を有するレセプターである
場合には、測定すべき抗体及びレセプターR2に対して少
なくとも夫々１個の結合部位を有するもう１つのレセプ
ターR3を、R2を添加する前に試料溶液に添加することを
特徴とする、体液中の特定の免疫グロブリンクラスの抗
体を測定する方法。 - 【請求項２】IgM−抗体の測定のために使用する、請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】レセプターR1として、ビオチンと抗−IgM
−抗体又はその誘導体とからなる複合体を用い、固相と
して、多数のストレプトアビジン分子が結合しているマ
トリックスを使用する、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】レセプターR2として、標識と抗原Ａとから
なる複合体を使用する、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】レセプターR2として、抗原Ａと結合能を有
する抗体と標識とからなる複合体を使用し、レセプター
R3として抗原Ａを使用する、請求項１から３までのいず
れか１項記載の方法。 - 【請求項６】ヒト特異的抗体として、Fcγ−フラグメン
ト又はそれぞれのＨ−鎖を使用する、請求項１から５ま
でのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】ヒト特異的抗体を試料溶液中で期待される
免疫グロブリンの量に対して2:1〜100:1の過剰量で使用
する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】溶液１として、固定可能でありかつ測定す
べき抗体及びこれと同じ免疫グロブリンクラスに属する
ヒト特異的抗体又はそのフラグメントと結合能を有する
レセプターR1及び試料溶液中に期待される免疫グロブリ
ンの量に対して過剰の、測定すべき抗体と同じ免疫グロ
ブリンクラスに属し、抗原Ａと結合能を有しないヒト特
異的抗体の混合物を含有し、溶液２として、標識されて
いて、かつ測定すべき抗体と結合能を有するレセプター
R2を含有することを特徴とする、請求項１から７までの
いずれか１項記載の方法により特定の免疫グロブリンク
ラスの抗体を測定するための試薬。 - 【請求項９】レセプターR2として、標識と抗原Ａとから
なる複合体を含有する、請求項８記載の試薬。 - 【請求項１０】溶液１として、固定可能でありかつ測定
すべき抗体及びこれと同じ免疫グロブリンクラスに属す
るヒト特異的抗体又はそのフラグメントと結合能を有す
るレセプターR1及び試料溶液中に期待される免疫グロブ
リンの量に対して過剰の、測定すべき抗体と同じ免疫グ
ロブリンクラスに属し、抗原Ａと結合能を有しないヒト
特異的抗体の混合物を含有し、溶液２として、標識され
ていて、抗原Ａと結合能を有するレセプターR2を含有
し、溶液３として、測定すべき抗体及びレセプターR2に
対して少なくとも夫々１個の結合部位を有するレセプタ
ーR3を含有することを特徴とする、請求項１から７まで
のいずれか１項記載の方法により特定の免疫グロブリン
クラスの抗体を測定するための試薬。 - 【請求項１１】レセプターR2として、抗原Ａと結合能を
有する抗体と標識とからなる複合体を含有し、レセプタ
ーR3として抗原Ａを含有する、請求項10記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3836348A DE3836348A1 (de) | 1988-10-25 | 1988-10-25 | Verfahren zur bestimmung von fuer ein antigen klassenspezifischen antikoerpern und dazu geeignetes reagenz |
| DE3836348.8 | 1988-10-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02159562A JPH02159562A (ja) | 1990-06-19 |
| JP2613109B2 true JP2613109B2 (ja) | 1997-05-21 |
Family
ID=6365891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1276197A Expired - Lifetime JP2613109B2 (ja) | 1988-10-25 | 1989-10-25 | 抗原に対してクラス特異的抗体の測定法及びこのために好適な試薬 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5376557A (ja) |
| EP (1) | EP0366092B1 (ja) |
| JP (1) | JP2613109B2 (ja) |
| KR (1) | KR920005964B1 (ja) |
| AT (1) | ATE102357T1 (ja) |
| AU (1) | AU618137B2 (ja) |
| CA (1) | CA2001253C (ja) |
| DE (2) | DE3836348A1 (ja) |
| ES (1) | ES2061881T3 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3822750A1 (de) * | 1988-07-05 | 1990-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| EP0507587A3 (en) * | 1991-04-03 | 1993-03-03 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Immunoassay for immunoglubulins |
| DE4212706A1 (de) * | 1992-04-16 | 1993-10-21 | Behringwerke Ag | Diagnostisches Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten |
| EP0683396A1 (en) * | 1993-02-04 | 1995-11-22 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Method of assaying specific antibody |
| DE19649390A1 (de) * | 1996-11-29 | 1998-06-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | Antigenspezifischer IgG-Nachweis |
| US6153392A (en) * | 1997-07-30 | 2000-11-28 | Bionova Corporation | Devices and methods comprising an HBcAg from hepatitis B virus |
| ITTO980473A1 (it) * | 1998-06-02 | 1999-12-02 | Sorin Diagnostics S R L | Nuovo procedimento per la rivelazione di anticorpi e/o isotipi di anticorpi specifici per almeno due differenti fasi di un'infezione |
| US6379909B1 (en) * | 1998-06-24 | 2002-04-30 | Alk-Abello A/S | Method of detecting an antibody in a liquid sample |
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| US4600690A (en) * | 1978-08-07 | 1986-07-15 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University | Immunoassay |
| US4292403A (en) * | 1978-08-24 | 1981-09-29 | Akzona Incorporated | Detection and/or determination of IgM, IgA, IgD and IgE immunoglobulins |
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-
1988
- 1988-10-25 DE DE3836348A patent/DE3836348A1/de not_active Withdrawn
-
1989
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-
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- 1992-07-30 US US07/923,026 patent/US5376557A/en not_active Expired - Lifetime
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|---|
| Ｊａｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．２（１９８６）Ｐ．２８８−２９３ |
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| EP0366092A3 (de) | 1991-04-03 |
| DE3836348A1 (de) | 1990-04-26 |
| AU4365689A (en) | 1990-05-03 |
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| EP0366092A2 (de) | 1990-05-02 |
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