JPS6135358A - 過酸化性作用物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、カップリング成分（Ｋｕｐｐｌｕｎｇｓ−ｋ
ＯｍｐＯｎｅｎｔｅ　）としてアニリン誘導体を使用す
る酸化的発色反応の実施方法に関する。

フェノール又はアニリンと、適当な漣Ｉ成分、例えば４
−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）又はメチル４ンゾ
チアゾロンーヒｒラゾン（ＭＢＴＨ）との酸化的発色反
応〔エマーソンートリンダー反応（Ｅｍｅｒｓｏｎ−Ｔ
ｒ　１ｎｄｅｒ　−Ｒｅａｃｔ　ｉｏｎ　）は、発色反
応のために使用される酸化剤の検出及び測定のために使
用することができる。この反応は、酸素分析又は他の分
野、例えば免疫学における化学的診断法の基礎として利
用することができる。例えば同反応は、体液中のグルコ
ース、尿酸又はコレステリンの、酵素例えばグルコース
オキシダーーキ、ウリカーゼ及びコリンエステラーゼに
よる酸化の際に形成される過酸化水素の測定による体液
中の前記物質の測定のため、酸化剤としての過酸化水素
を用いる基質及び／又はペルオキシダーゼの測定のため
又は例えば体液中のリビＰペルオキシダーゼのようなペ
ルオキシＰの測定のだめに利用することができる（例え
ば***国特許出願公開第３０３７３４２号明細書参照）
。この種の測定法の重要な前提は、高い感光性、つｔ−
ｂ高い吸光係数を有しかつ高い収量で得られる色素の形
成である。これは例えば特に臨床化学的診断で、体液中
に少量しか存在しない物質の測定の場合に重要である、
それというのもこの場合には例えば血清成分による障害
が十分に除去されうるからである。

しかしまだ前記診断法の場合と同様に他の分野でも、例
えば標識酵素としてベルオキシダーぜが頻繁に使用され
る免疫学においても鋭敏な発色系を必要としている。

フェノールと、発色のために適当なカップリング成分、
例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ　）又はメ
チルペンゾチアゾロンヒＰラゾン（ＭＢＴＨ）との酸化
的発色反応の場合、４位で塩素化又は臭素化されたフェ
ノールを発色反応に投入すると、酸化剤の量に対して色
素の収量が増大されうることは公知である。この効果は
、ハロゲン化フェノールを用いる発色反応は２電子酸化
法であるが、４位ｆ置換されていないフェノールは４電
子酸化法で有色化合物に変化されるという事実に起因し
ている〔例えば特開昭５４−９８２１号参照〕。つまり
、酸化剤、例えばＦｅ３＋又は酵素的に形成されたＨ０
の測定時の感光性は、発色反応の際に４−ハロゲンフェ
ノールを使用すると倍加される。

４−　ＡＡＰ又はＭＢＴＨを用いる酸化的発色反応の際
、ハロゲンフェノールに対して、４位で塩素又は臭累で
置換されたアニリン誘導体は、発色反応を示さないか又
は僅かしか示さない（Ｊ。

Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　３　（１９３８’）、１５３頁
；アナリテイカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２３（１９６１）、７２２頁
参照〕が、水素で置換されているがその点手は類似して
いる化合物は一般に、特に中性乃至弱酸性ｐＨ範囲で、
フェノールよりも高い吸光係数及びより−長い波長の最
大吸収幅を有する電床を供給する。また０位又はｐ位で
低級アルキル基によって置換されたＮ　−１ｉ換アニリ
ンを用いても、感光性及び呈色安定性の点で満足すべき
成果が得られなかつた（***国特許出願公告第２８３３
６１２号）。

従って、例えば過酸化水素及びベルオキシダーぜ（ＰＯ
Ｄ　）のような酸化剤の測定のために新規の鋭敏な発色
系を開発するという実験はなかった。酸化的発色反応の
場合、諸開発により、改善されたアニリン系カップリン
グ成分を生シ、この際感受性の増大は、大低、アニリン
窒素又はＣ−３一原子における置換分の変化によって得
られた〔例えば***国特許出願公開第３０３７３４２号
及び同第２８３３６１２号；ヨーロッパ特許出願公開第
０００７７　’８７号参照〕。

発明の解決しようとする問題点 本発明の課題は、酸化的発色反応の際に高い収量及び選
択性をもって、高い吸光度及び呈色安定性を有する色素
を生じ、かつそれ故に酸化的発色反応の際に鋭敏な発色
系を形成する新規なアニリン誘導体を提供することであ
る。

問題点を解決するための手段 前記課題は本発明により解決される。本発明の対象は、
酸化的発色反応におけるカップリング成分として、一般
式Ｉ： Ｃ式中８１＝Ｈ又１ｅ　（Ｃ）（２）、−Ｘ−Ｃ−６り
、コノ際ｎ　＝　１〜３　Ｆ）整数、Ｘ＝Ｈ，０８％Ｎ
Ｈ３、ＣＨＣｏＮＨ％ＣＨＳｏ　Ｎ）−１％Ｃ０ＯＨ％
５ｏ３Ｈ又はＡｒＳＯ３Ｈ（Ａｒ　＝場合により置換さ
れたアリーレン基であり、ｍは２〜４の整数ヤあり、好
ましくは３であり、Ｒ３””　Ｈ、炭素原子１〜３個を
有スルアルキル基、ＯＣＲ３、ＣＩ（３ＣＯＮＨ，Ｃｏ
２Ｈ又ハＳＯＨであり、かツＲ’　＝Ｈ，Ｃｔ、　Ｂｒ
　、　Ｃ０ＯＨ又は５ｏ３Ｈである〕で示されるアニリ
ン誘導体を使用する酸化的発色反応の実施法である。

Ａｒ基は置換されているか又は好ましくは未１！であっ
てよくかつ例えば１，４−ナフチレｙ、４Ｈｃｔ、４−
フェニレンである。置換されたアリーレン基は１個以上
の置換分、好ましくは１又は２個の置換分、例えば炭素
原子１〜３個ヲ有スルアルキル基、０Ｈ１ＯＣＨ３，５
０３Ｈ及ヒ／又はハロゲン、特に塩素を有していてもよ
い。

Ｒ３を表わす炭素原子１〜３個を有するアルキル基は、
メチル基、エチル基、プロピル基又はイソプロピル基で
ある。

特に一般式■； 〔式中Ｒ及びＲは式■に関して記載したものを表わ踵Ｒ
は特に（ＣＨ２）ｎ−Ｘ（ｎは２又は３を表わし、Ｘ＝
ＯＨ，Ｎ１−１　、　ＣＨ３ＧＯ＋Ｎ１−１゜ＣＨ３５
ｏ２１ＮＨ、Ｃ０ＯＨである）及びＲ４は特にＨである
〕で示されるアニリン誘導体が有利に使用される。

式Ｉで示されるアニリン誘導体と発色剤との酸化的発色
反応の際に生じる色素のスペクトルは、意外にも比較的
高い８値及び極めて広い最大吸光幅を示し；後者は極め
て特定された波長の依存性を減少することが判明した（
例えば第１図乃至第３図参照）。さらに本発明による式
■のアニリン誘導体は、相応の非環状Ｎ−アルキル−又
はＮ、Ｎ−−，７アルキル化合物と比べると、発色剤、
例えばメチルペンゾチアゾロンヒＰラゾン（ＭＢＴＨ）
又はスルホン化メチレンペンゾチアゾロンヒＰラゾン（
ＳＩＴ／１８ＴＨ）との酸化的発色反応の際に意外にも
また著しく良好な呈色安定性及びよシ小さい９値遅延（
Ｌｅｅｒｗｅｒｔ−ｓｃｈｌｅｉｃｈ）を示し、これに
よってよシ高い選択性が得られる。

まだ極性基によって置換された一般式■の化合物は、部
分的には、特にアルキルスルホン酸基又はスルホン酸基
によって十分でさえある改善された水溶性も示す；しか
しまたあまシ溶解しない式■の化合物も、適当な常用の
洗浄剤を発色剤を含有する、Ｈ２Ｏ２／ＰＯＤで酸化さ
れた発色系のλｍａｘで測定された吸光係数ｇ　（ｃｒ
ｌ／ｐ　ｍｏ　ｌ　Ｈ２Ｏ，）と、常用ノアニリン系カ
ップリング成分の代シに相応に置換された本発明のアニ
リン誘導体を含有する、その他の点では同じ発色系の吸
光係数とが比較されている。発色剤としてはスルホン化
メチルペンゾチアゾロンヒＰラゾン（ＳＭＢＴＨ）を使
用した。

発色反応は自体公知のようにして行われる（例えば***
国特許出願公告第２８３３６１２号明細書）。好壕しく
は室温で作業されるが、カップリング成分／発色剤の濃
度割合〉５が極めて有利であることが判明した。ｐＨ値
は好ましくは中性範囲にある。次の値（反応混合物中の
各濃度）が表１の基礎になっている： 燐酸カリウム緩衝液　　ｐＨ７，０：　０．１　ｍｏ　
ｌ／ｌアニリンカップリング成分：３・１０　　ｍｏｌ
／Ａ発色剤（ＳＭＢＴＨ）　　　　　：３−１０　　ｍ
ｏｆ／を過酸化水素　　・　　　１．５−１０　　ｍｍ
ｏｌ／ｚペルオキシダーゼ　　：　１．２　Ｕ／ｆｎｔ
表　　１ １）　　Ｎ−（２−アセトアミＰエチル）−Ｎ−エチル
−３−、メチル−アニリン ２）　　Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒＰロキシエチル）−
３−メチル−アニリン ３）　　Ｎ−エチル−ＩＮ　−（３メーチルフエニル）
−２−アミノエタン−スルホン酸 表１から判るように、本発明によシ使用されるアニリン
誘導体を用いるとその他の点では同じ条件下で著しく高
い吸光係数（１，３〜１．８倍）が得られる：従って本
発明による化合物を用いると、常用の発色剤と一緒に使
用することによシ酸化的発色反応用の極めて鋭敏な発色
系を与えるカップリング成分が提供される。一般式■で
示される化合物は特にＨ２Ｏ２及びＰＯＤの測定のため
に使用される。

本発明の対象はまた、酸化的発色反応による成分として
式Ｉ又は好ましくは式■で示される化合物を含有するこ
とである。

発色剤としては、このような発色反応に関して慣用の発
色剤、例えばスルホン化メチルペンゾチアゾロンヒＰラ
ゾン（ＳＭＩ＝３７Ｈ）が使用されうる。

酸化的発色反応の際に本発明により使用されるカップリ
ング成分及び発色剤から得られる色素は、相応の白色色
素に容易に還元され、このものはさらに再酸化されうる
ので、酸化性物質、例えば体液中のＨ２Ｏ２の検出のた
めにも同様に使用することができる。

＜Ｉで示される化合物は、公知であるか又は自体公知の
合成法により、例えば式■のアニリン誘導体（式中Ｒ１
＝Ｈ）を、式：ＣＬ−（鑓、）。−Ｘ（式中Ｘ及びｎは
前記のものを表わす）で示される化合物でアルキル化す
ることによって製造することができる〔例えばフーペン
ーノ々イル（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ　）、メトーデン
・デルΦオルサニツシエン・ヒエミー（Ｍｅｔｈｏｄｅ
ｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａ−ｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ
　）、巻１１／１、第２及び３章；巻２／２．２５１頁
参照〕。

出発物質として使用されるＲ　＝）−１である式■のア
ニリン誘導体は、例えば相応のキノリン誘導体の接触水
素化によって製造することができる〔ツーペン−パイル
、巻４／ＩＣ，２７１頁〕。

分と発色剖としてのスルホン化メチルベンゾチアゾロン
ヒドラゾン（ＳＭＢＴ？−１）とから成る発色系のスペ
クトルを示す。反応混合物中の濃度はで得られる′スペ
クトルを表わし、図中吸光度Ｅは波長λ（ｎｍ）に対し
てプロットしである：Ａ：式■、Ｒ１＝ＣＨ２ＣＨ２０
Ｈ，Ｒ’＝ＨＢ　：　ＥＨＴ Ｃ：式■、Ｒ１＝　ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２５ｏ３Ｈ、Ｒ’
　＝　ＨＤ　　：　　ＥＳＴ ′Ｅ：式■、Ｒ１−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ３、Ｒ’
＝ＨＦ　：　Ｅ＋１／ｌＡＥ スペクトルの比較により、本発明により使用よるスペク
トルと比較して特に著しく高いε値及びよシ広い最大吸
光幅を有することが判る。

実施例 例　　１ １．２，３．４−テトラヒドロキノリン１３．３ｆ（ｏ
、ｔｍｏ＋）及び２−クロルエタノール１６．１？　（
０，２ｍｏｆ　）を、１２０℃に４時間加熱する。

冷却後に反応混合物に水２００　ｍｌを加えかつ２Ｎ苛
性ソーダ溶液でアルカリ性にする。次にクロロホルムを
用いて抽出を施し、有機相を硫酸ナトリウムを介して乾
燥しかつ回転蒸発器で蒸発する。残留物をＡゲルによる
カラムクロマトグラフィーにより（キジロール／メチル
エチルケトン＝］／１を用いて溶離）精製する。

収量す：１０．５Ｆ＝理論値の５９係 質量スペクトル：Ｍ＋＝１７７゜ 同様にして１，２，３．４−テトラヒＰロキノリンと２
−アセトアミド−プロピルクロリドとの反応によってＮ
−（２−アセトアミドプロピル）−１，２，３，４−テ
トラヒドロキノリンが得られる。

例　　２ ５００−フラスコ中で１．　２．　３．　４−テトラヒ
Ｐロキノリン５Ｂ、４ｆに溶融した１、３−プロノぐン
スルホン４８．４ｆを、６０〜８０℃で５０分以内に滴
加した。反応混合物を約７０℃で３．４５時間放置し、
次に還流下にメタノール４７０−を少しずつ加え、固体
のガラス状液底体が完全溶解するまで還流下に引続き攪
拌した。次いで攪拌下に室温に冷却すると、急速な結晶
化が起こる。冷却器での約１２時間の放置後に結晶を濾
取した。

収址：約５０２１融点：２３３〜２３７℃例　　３ 化： 氷酢酸６〇−中の１．　２．　３．　４−テトラヒドロ
キノリン１３．３ｆの溶液に、氷酢酸７〇−中（で溶し
た臭素１６ｆを、１０〜１５℃で（氷水を用いて冷却）
激しい攪拌下に５０分以内に滴加した。形成された結晶
スラッジを氷酢酸３×３０ｆｎｔで希釈し、さらに１０
〜１５分攪拌し、飽和酢酸ナトリウム溶液２００ｍＡ及
び次いでエーテル３００１ｎ１．を加えた。水で２ｔに
希釈した後エーテル相を分離し、水で２回洗浄し、Ｎａ
２５ｏ、を用いて乾燥しかつ３０℃で真空蒸発した。褐
色油状の残留物１９．３ｆが得られた。

残留物にカラムクロマトグラフィーを施した（珪酸ゲル
；ジイソプロピルエーテル／クロロホルム／氷酢酸）。

最初の物質含有画分（画分１〜８、各１５ｔｎｔ）から
５，６−ジブロム−１゜２．３．４−テトラヒドロキノ
リン６．２３Ｆが得られ、最後の両分（１６〜２８、各
１５−）からは６−ブロム−１，２，３，４−テトラヒ
ドロキノリン（融点：３０〜３４℃）３．７５ｒが得ら
れた。

キノリン−Ｎ−プロノぐンスルホン酸 ａ）により得られた６−ブロム−１，２，３，４−テト
ラヒドロキノリン４．２１を、アセトン２〇−中に溶か
しかつ攪拌下にアセトン２０ｆｎｔ中に溶カした溶融１
．３−プロパンスルホン２．４４２を５０℃で３０分以
内に滴加した。２４時間の還流煮沸後にもう一度、アセ
トン２０ｔｎｔ中に溶カシた溶融プロパンスルホン２．
４４４を前記と同じ条件下で滴加した。４８時間の速流
煮沸後に反応混合物にカラムクロマトグラフィーを施し
た（ＳｉＯ；溶離剤ＣＨＣ４／メタノール−１／１、画
分２５ゴ）。両分６〜１０を３５℃で真空蒸発し、得ら
れた赤喝色残留物（１，８ｒ）をメタノール約２０−と
−緒に攪拌し、砂色の結晶１．０！Ｍ’が得られた。融
点＝２１７℃（分解）。

同様にしてａ）によシ得られだ５，６−ジプロムー１．
２，３．４−テトラヒドロキノリンからは、５，６−ジ
プロムー１．２，３．４−テトラヒドロキノリン−Ｎ−
プロパンスルホン酸が得れる。

例　　４ メタノール（無水）２００−中の１．２，３゜４−テト
ラヒｒロキノリ７１３．３　ｙ　（ｏ、ｔｍｏｌ　）及
びアセチルアジリジｙ９．４　ｆ　（０，１１ｍｏｌ　
）を、夜通し還流煮沸する。回転蒸発器での蒸発後に得
られる、未反応出発物質と反応生成物とから成る混合物
（１３Ｆ）を珪酸ゲルによるカラムクロマトグラフィー
（展開剤：クロロホルム／アセトン−４：１）によって
精製する。融点：１０２℃。

例　　５ 無水エタノール１００ゴ中の７−メチル−１，２，３，
４−テトラヒドロキノリン４ｔ（２７ｍｍｏ＋）及びＮ
−７セチ＃７ジリジ７２．５ｔ（３０ｍｍｏｌ’）を、
１時間還流下に煮沸し、次いで真空蒸発する。反応生成
物を、珪酸ゲルによるカラムクロマトグラフィー（展開
剤クロロホルム／アセトン＝４７１　）及びジイソプロ
ピルエーテルカラの再結晶化によって精製する。収量：
１．３ｒｉ融点：９９℃。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図は、本発明により使用される
化合物を用いて得られるスペクトル（点線）及び類似の
常用アニリン系カップリング成分を用いて得られるスペ
クトル（笑線）の吸収曲線を示すグラフである。 ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酸化的発色反応におけるカップリング成分として、
   一般式 I ： （ I ） 〔式中Ｒ＾１＝Ｈ又は（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｘ、この際ｎ
   ＝１〜３の整数、Ｘ＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ＿２、 ＣＨ＿３ＣＯＮＨ、ＣＨ＿３ＳＯ＿２ＮＨ、ＣＯＯＨ、
   ＳＯ＿３Ｈ又はＡｒＳＯ＿３Ｈ（Ａｒ＝場合により置換
   されたアリーレン基）、ｍ＝２〜４の整数、Ｒ＾３＝Ｈ
   、炭素原子１〜３個を有するアルキル基、ＯＣＨ＿３Ｃ
   Ｈ＿３ＣＯＮＨ、ＣＯ＿２Ｈ又はＳＯ＿３Ｈ、Ｒ＾４＝
   Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯＯＨ又はＳＯ＿３Ｈ〕で示される
   アニリン誘導体を使用することを特徴とする酸化的発色
   反応の実施方法。 ２、一般式II： （II） 〔式中Ｒ＾１＝（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｘ（ｎ＝２又は３、
   Ｘ＝ＯＨ）ＮＨ＿２、ＣＨ＿３ＣＯＮＨ、ＣＨ＿３ＳＯ
   ＿２ＮＨ、ＣＯＯＨ又はＳＯ＿３Ｈ）、Ｒ＾４＝Ｈ、Ｃ
   ｌ、Ｂｒ、ＣＯＯＨ又はＳＯ＿３Ｈ〕で示されるアニリ
   ン誘導体を使用する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、式IIにおいてＲ＾１が（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｘ（ｎ＝
   ２又は３、Ｘ＝ＯＨ、ＮＨ＿２、ＣＨ＿３ＣＯＮＨ、Ｃ
   Ｈ＿３ＳＯ＿２ＮＨ、ＣＯＯＨ又はＳＯ＿３Ｈ）を表わ
   しかつＲ＾４＝Ｈである式IIのアニリン誘導体を使用す
   る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、過酸化水素及びＰＯＤを測定するための特許請求の
   範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の方法。 ５、酸化的発色反応によって酸化性物質を分析的に測定
   するための器具において、該器具がカップリング 成分として一般式 I ： （ I ） 〔式中Ｒ＾１＝Ｈ又は（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｘ、この際ｎ
   ＝１〜３の整数、Ｘ＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ＿２、ＣＨ＿３Ｃ
   ＯＮＨ、ＣＨ＿３ＳＯ＿２ＮＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ＿３Ｈ
   又はＡｒＳＯ＿３Ｈ（Ａｒ＝場合により置換されたアリ
   ーレン基）、ｍ＝２〜４の整数、Ｒ＾３＝ＨＮ炭素原子
   １〜３個を有するアルキル基、ＯＣＨ＿３、ＣＨ＿３Ｃ
   ＯＮＨ、ＣＯ＿２、Ｈ又はＳＯ＿３Ｈ、Ｒ＾４＝Ｈ、Ｃ
   ｌ、Ｂｒ、ＣＯＯＨ又はＳＯ＿３Ｈ〕又は一般式II： （II） 〔式中Ｒ＾１＝（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｘ（ｎ＝２又は３、
   Ｘ＝ＯＨ、ＮＨ＿２、ＣＨ＿３ＣＯＮＨ、ＣＨ＿３ＳＯ
   ＿２、ＮＨ、ＣＯＯＨ又はＳＯ＿３Ｈ）、Ｒ＾４＝Ｈ、
   Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯＯＨ又はＳＯ＿３Ｈ〕で示されるアニ
   リン誘導体を含有することを特徴とする前記器具。