JP4180243B2

JP4180243B2 - 酸化発色試薬

Info

Publication number: JP4180243B2
Application number: JP2000571738A
Authority: JP
Inventors: 誠溝口
Original assignee: Dojindo Laboratory and Co Ltd
Current assignee: Dojindo Laboratory and Co Ltd
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2008-11-12
Anticipated expiration: 2018-04-16
Also published as: WO1998049137A1; AU6852398A

Description

技術分野
本発明は酸化発色試薬に関するものである。より詳しく言うと、本発明は、酵素イムノアッセイ法によるペルオキシダーゼ活性の測定試薬などに有用な酸化発色試薬に関するものである。
背景技術
バイオメディカル領域においける生体成分などの高感度微量分析には、主として酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ法）が用いられている。この方法は非放射性イムノアッセイ法の中では最も感度に優れる方法の一つであり、一般的には、標識酵素を用いて抗原抗体反応を定量的に追跡し、抗原あるいは抗体を定量する工程を含んでいる。標識酵素としてはペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）が汎用されており（全体の約５０％）、ペルオキシダーゼ活性を吸光光度法で測定するための発色試薬が数多く市販されている。このような発色試薬としては酸化発色試薬が最も多く用いられており、例えば、ｏ−トリジン、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）などが用いられている。
また、臨床化学分析においても、目的成分を認識して過酸化水素を発生する各種の酵素を用いる方法が利用されている。この方法では、発生させた過酸化水素をペルオキシダーゼの触媒作用にって酸化発色試薬と反応させ、吸光度を測定することによって目的成分を定量するのが一般的である。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）は臨床化学分析においても用いられている。
しかしながら、これらの酸化発色試薬はいずれも水溶性に乏しく、反応液の濃度調節が困難であったり、予め溶液を調製して保存すると沈殿が生じる場合があった。溶解性を改善するために界面活性剤を用いる方法もあるが、ピペット操作の際に発泡することがあり、界面活性剤が酵素反応に影響を及ぼす可能性があるので一般的な方法ではない。また、これらの試薬は光や溶存酸素によってペルオキシダーゼ活性のない状態においても発色してしまい、バックグラウンドの上昇を招いて測定精度を低下させてしまうという問題も有している。さらに、生成する色素の安定性が乏しく、経時的に退色や沈殿を生じる場合があり、反応終了後の時間管理が煩雑になるという問題もあった。
臨床化学分析においては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）を用いる場合には、各種オキシダーゼと基質とを反応させることにより発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で反応させ、生成する青色色素（６５０ｎｍ付近）の吸光度測定を行うのが一般的であるが、この色素のモル吸光係数はそれほど大きくないので十分な感度が得られないという問題がある。従って、これらの問題を解決した酸化発色試薬の開発が求められていた。ベンジジン誘導体として、アミノ基上にスルホアルキル基を有する３，３’，５，５’−テトラアルキルベンジジン誘導体が提案されているが（特開昭６１−５２３００号公報）、この化合物も上記の問題点を解決しているとはいえない。
発明の開示
本発明の課題は、酵素イムノアッセイ法及び臨床化学分析などの分析方法に用いられる酸化発色試薬を提供することにある。より具体的には、水溶性が改善されており、保存中における光分解や酸化分解に対して高い抵抗性を有する酸化発色試薬を提供することが本発明の課題である。
また、本発明の別の課題は、反応後の色素の安定性に優れる酸化発色試薬を提供することにある。
本発明のさらに別の課題は、通常測定に用いられる波長において大きなモル吸光係数を有する色素を与える酸化発色試薬を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、下記の一般式で表わされる３，３’−ジアルキルベンジジン化合物が上記の特徴を備えており、酸化発色試薬として極めて有用であることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち本発明は、下記の一般式：

（式中、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立にＣ_１−６アルキル基を示し；Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立に水素原子又はＣ_１−６アルキル基を示し；Ｒ^５及びＲ^６はそれぞれ独立に水素原子、１個若しくは２個以上の水酸基を有することもあるモノスルホン酸置換Ｃ_１−６アルキル基、１個若しくは２個以上の水酸基を有することもあるカルボキシ置換Ｃ_１−６アルキル基、又は１個若しくは２個以上の水酸基を有するＣ_１−６アルキル基を示すが、Ｒ^５及びＲ^６が同時に水素原子であることはない）で表わされる化合物又はその塩を提供するものである。
この発明の好ましい態様によれば、Ｒ^１及びＲ^２がそれぞれ独立にＣ_１−６アルキル基であり；Ｒ^３及びＲ^４がそれぞれ独立に水素原子又はＣ_１−６アルキル基であり；Ｒ^５及びＲ^６がそれぞれ独立に１個若しくは２個以上の水酸基を有することもあるモノスルホン酸置換Ｃ_１−６アルキル基である上記化合物又はその塩が提供される。さらに好ましい態様によれば、Ｒ^１及びＲ^２がそれぞれ独立にＣ_１−４アルキル基であり、Ｒ^３及びＲ^４がそれぞれ独立に水素原子又はＣ_１−４アルキル基であり、Ｒ^５及びＲ^６がそれぞれ独立に１個の水酸基を有することもあるモノスルホン酸置換Ｃ_２−４アルキル基である上記化合物又はその塩が提供される。
本発明の別の観点からは、上記化合物またはその塩を含む酸化発色試薬が提供され、その好ましい態様によれば、過酸化水素測定用試薬又はペルオキシダーゼ測定用試薬として用いる上記酸化発色試薬が提供される。この試薬は粉末状または溶液状などの各種の形態で提供される。
発明を実施するための最良の形態
上記の一般式中、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立にＣ_１−６アルキル基、好ましくはそれぞれ独立にＣ_１−４アルキル基を示す。アルキル基としては直鎖又は分枝鎖のいずれを用いてもよい。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などを用いることができるが、Ｒ^１及びＲ^２がともにメチル基であることが好ましい。Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立に水素原子又はＣ_１−６アルキル基、好ましくはそれぞれ独立に水素原子又はＣ_１−４アルキル基を示す。アルキル基としては直鎖又は分枝鎖のいずれを用いてもよく、例えば上記に例示したものを用いることができる。Ｒ^３及びＲ^４がともに水素原子であるか、又は、Ｒ^３及びＲ^４がともにメチル基又はエチル基である場合が好ましい。
Ｒ^５及びＲ^６はそれぞれ独立に水素原子、１個若しくは２個以上の水酸基を有することもあるモノスルホン酸置換Ｃ_１−６アルキル基、１個若しくは２個以上の水酸基を有することもあるカルボキシ置換Ｃ_１−６アルキル基、又は１個若しくは２個以上の水酸基を有するＣ_１−６アルキル基を示すが、Ｒ^５及びＲ^６が同時に水素原子であることはない。Ｒ^５及びＲ^６が示す置換基において、Ｃ_１−６アルキル部分は直鎖又は分枝鎖のいずれでもよく、例えば、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、又はｎ−ヘキシル基、好ましくはエチル基又はｎ−プロピル基を用いることができる。
モノスルホン酸置換Ｃ_１−６アルキル基におけるスルホン酸基の置換位置は特に限定されないが、Ｃ_１−６アルキル基の末端に置換していることが好ましい。該モノスルホン酸置換Ｃ_１−６アルキル基は１個又は２個以上の水酸基を有していてもよい。このような水酸基の置換位置および個数は特に限定されないが、一例として、Ｃ_１−６アルキル基上においてスルホン酸基が置換する炭素原子に隣接する炭素原子上に１個の水酸基が置換している場合を挙げることができる。水酸基を有しないモノスルホン酸置換Ｃ_１−６アルキル基も本発明に好適に用いることができる。
１個又は２個以上の水酸基を有することもあるカルボキシ置換Ｃ_１−６アルキル基に存在するカルボキシル基の個数は特に限定されないが、好ましくは１個又は２個、より好ましくは１個である。カルボキシル基の置換位置は特に限定されないが、少なくとも１個のカルボキシル基がＣ_１−６アルキル基の末端に置換していることが好ましい。カルボキシ置換Ｃ_１−６アルキル基は１個又は２個以上の水酸基を有していてもよい。このような水酸基の置換位置および個数は特に限定されないが、一例として、Ｃ_１−６アルキル基上においてカルボキシル基が置換する炭素原子に隣接する炭素原子上に１個の水酸基が置換している場合を挙げることができる。カルボキシ置換Ｃ_１−６アルキル基として、例えば、３−カルボキシ−１−プロピル基などを挙げることができる。
１個又は２個以上の水酸基を有するＣ_１−６アルキル基に存在する水酸基の個数は、好ましくは１個又は２個である。水酸基の置換位置は特に限定されないが、２個の水酸基を有する場合にはＣ_１−６アルキル基の隣接する炭素原子上にそれぞれ１個の水酸基が存在していることが好ましく、１個の水酸基を有する場合にはＣ_１−６アルキル基の末端に置換していることが好ましい。１個又は２個以上の水酸基を有するＣ_１−６アルキル基として、例えば、２，３−ジヒドロキシ−１−プロピル基、３−ヒドロキシ−１−プロピル基などを挙げることができる。
本発明の化合物は塩の形態で存在する場合もあるが、いかなる形態の塩も本発明の範囲に包含される。塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩などの有機アミン塩などの塩基付加塩、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸塩を挙げることができる。これらのうち、ナトリウム塩を好適に用いることができる。また、本発明の化合物は置換基の種類により１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、これらの１個又は２個以上の不斉炭素原子に基づく任意の光学活性体や、２個以上の不斉炭素に基づく任意のジアステレオ異性体などの任意の異性体、またはラセミ体などの異性体混合物はいずれも本発明の範囲に包含される。さらに、任意の水和物、任意の溶媒和物も本発明の範囲に包含される。
本発明の化合物の特に好ましい例を以下に示すが、本発明の化合物はこれらの化合物に限定されることはない。

本発明の化合物の製造方法は特に限定されず、任意の製造方法を採用することができる。本明細書の実施例には、本発明の代表的な化合物について製造方法の具体例を示したが、本発明の化合物の製造方法はこれらの製造方法に限定されることはない。これらの具体例の記載を参考にして、必要に応じて出発原料や反応条件などを適宜修飾ないし変更することにより、本発明の上記一般式に包含される任意の化合物を製造できることが当業者には理解されよう。
本発明の化合物は、例えば、酸化発色試薬として用いることができ、例えば、過酸化水素濃度やペルオキシダーゼ活性の測定に用いることができる。酸化発色試薬としての使用方法の具体例を本明細書の実施例に示したが、本発明の化合物の用途はこれらの特定の用途に限定されることはなく、また、使用方法も実施例の細部に限定されることはない。本発明の化合物を上記の測定試薬として用いる場合には２種以上の化合物を適宜組み合わせて用いてもよい。
また、必要に応じて、例えば、緩衝剤、溶解補助剤、酸化防止剤などの安定化剤、防腐剤などの成分の１種又は２種以上と組み合わせて、粉末や凍結乾燥品などの形態の固形組成物、または溶液状の組成物を製造して用いてもよい。粉末状又は溶液状などのいかなる形態の試薬も本発明の範囲に包含されることろ理解すべきである。本発明の化合物は保存安定性に優れるという特徴を有しているが、溶液状態で長期保存する場合には、一般的には遮光容器内に保存することが望ましい。もっとも、試薬の組成や形態、及び保存形態はこれらに限定されることはなく、当業者が適宜選択可能であることは言うまでもない。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。なお、実施例中の化合物Ａ〜Ｃは、上記に好ましい化合物として例示した化合物Ａ〜Ｃに対応している。
例１：化合物Ｃの製造
オルトトリジン３ｇ（１４．１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム３ｇ（２８．３ｍｍｏｌ）、３−クロロヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム５．６ｇ（２８．５ｍｍｏｌ）の混合物にイソプロパノール３０ｍｌを加え、７０℃で１６時間攪拌した。その後、反応液を濃縮乾固し、残さにクロロホルムを加えて未反応物を除去した。水相を濃縮してゲル濾過に付し、目的物のフラクションを分離して濃縮乾固し、白色粉末４．８ｇ（９．０１ｍｍｏｌ）を得た（収率６３．９％）。
薄層クロマトグラフィー（メルク社製シリカゲルプレート、展開溶媒：アンモニア飽和ブタノール、検出ＵＶ吸収）：Ｒｆ＝０．３５
元素分析理論値（ｆｏｒＣ_２０Ｈ_２６Ｎ_２Ｎａ_２Ｏ_８Ｓ_２）Ｃ：４５．１１％，Ｈ：４．９２％，Ｎ：５．２６％；実測値Ｃ：４５．２２％，Ｈ：４．８９％，Ｎ：５．１７％．
ＩＲ（ｃｍ^−１）３５００（ＯＨ），３４１０（ＮＨ），１６２２（Ｃ＝Ｃ），１２５５（ＣＮ），１２１０（ＳＯ_３），１０５０（ＳＯ_３）．
例２：化合物Ｄ及び化合物Ｆの製造
オルトトリジン３ｇ（１４．１ｍｍｏｌ）、１，４−ブタンスルトン３．９ｇ（２８，６ｍｍｏｌ）の混合物にイソプロパノール３０ｍｌを加え、６０℃で２０時間攪拌した。その後、反応液を濃縮乾固し、残さにクロロホルムを加えて未反応物を除去した。水相を１Ｎ水酸化ナトリウムで中和した後に濃縮してゲル濾過に付した。目的物のフラクションを分離して濃縮乾固し、白色粉末５．３ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）を得た（収率７１．１％）。
薄層クロマトグラフィー（メルク社製シリカゲルプレート、展開溶媒：アンモニア飽和ブタノール、検出ＵＶ吸収）：Ｒｆ＝０．３０
元素分析理論値（ｆｏｒＣ_２２Ｈ_３０Ｎ_２Ｎａ_２Ｏ_６Ｓ_２）Ｃ：４９．９９％，Ｈ：５．７２％，Ｎ：５．３０％；実測値Ｃ：４９．３３％，Ｈ：５．７７％，Ｎ：５．２０％．
ＩＲ（ｃｍ^−１）３４００（ＮＨ），１６１５（Ｃ＝Ｃ），１２４０（ＣＮ），１２００（ＳＯ_３），１０４０（ＳＯ_３）．
同様にして、Ｒ^１及びＲ^２がメチル基であり、Ｒ^３及びＲ^４が水素原子であり、Ｒ^５及びＲ^６が３−ヒドロキシ−１−プロピル基である化合物Ｆを製造した。
オルトトリジン３ｇ（１４．１ｍｍｏｌ）をイソプロパノール１５０ｍｌ、純水５０ｍｌの混合溶媒に溶解し、１００℃に加温して溶解後、３−クロロプロパノール３ｇ（３１．７ｍｍｏｌ）を加えた。１００℃を保ちながら、この混合物に１Ｎ−ＮａＯＨ溶液を３０ｍｌ滴下し、滴下終了後、１００℃を保ちながら、２時間撹拌を続けた。その後、反応混合物を室温まで放冷し、濃縮乾固して白色粉末を得た。その粉末をメタノールに溶解して、シリカゲルカラムにより分離精製して、目的物３．１ｇ（９．４５ｍｍｏｌ）を白色粉末として得た。（収率６７％）
薄層クロマトグラフィー（メルク製シリカゲルプレート、展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝７：３）Ｒｆ＝０．４５
元素分析理論値（ｆｏｒＣ_２０Ｈ_２８Ｎ_２Ｏ_２）Ｃ：７３．１４％，Ｈ：８．５９％，Ｎ：８．５３％；実測値Ｃ：７３．３５％，Ｈ：８．４２％，Ｎ：８．６０％
ＩＲ（ｃｍ^−１）３５２０（ＯＨ），３４００（ＮＨ），１６２８（Ｃ＝Ｃ），１２５５（ＣＮ）
例３：本発明の化合物を用いた過酸化水素濃度測定
バッファー溶液３ｍｌ（５０ｍＭ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）にペルオキシダーゼ（３．３Ｕ／ｍｌ）と化合物Ａ〜Ｃ又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）（各１００μＭ）を加えて３７℃で５分間プレインキュベートした。その後、過酸化水素を１，２，５，１０，２０μＭになるように加え、３７℃で１分間反応させた。各々の化合物の極大吸収波長（化合物Ａ：６６０ｎｍ；化合物Ｂ：６７２ｎｍ；化合物Ｃ：６７４ｎｍ；ＴＭＢＺ：６５０ｎｍ）での吸光度を測定した。結果を第１図に示す。本発明の化合物から生成する色素が通常測定に用いられる波長においてＴＭＢＺよりも大きなモル吸光係数を有していることが明らかである。
例４：本発明の化合物を用いた過酸化水素濃度測定（硫酸存在下）
バッファー溶液３ｍｌ（５０ｍＭ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）にペルオキシダーゼ（３．３Ｕ／ｍｌ）と化合物Ｃ又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）（各１００μＭ）を加えて３７℃で５分間プレインキュベートした。その後、過酸化水素を１，２，５，１０μＭになるように加え、３７℃で１分間反応させた。ストッパーとして硫酸を各々２％になるように加え、各々の化合物の極大吸収波長（化合物Ｃ：６７４ｎｍ；ＴＭＢＺ：６５０ｎｍ）での吸光度を測定した。結果を第２図に示す。本発明の化合物から生成する色素は酸の存在下においても安定であり、大きなモル吸光係数を有していることが明らかである。
例５：本発明の化合物から形成される色素の安定性
バッファー溶液３ｍｌ（５０ｍＭ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）にペルオキシダーゼ（３．３Ｕ／ｍｌ）と化合物Ｃ又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）（各１００μＭ）を加えて３７℃で５分間プレインキュベートした。過酸化水素を１０μＭになるように加えて３７℃で１分間反応させ、硫酸を各々２％になるように加え、再び３７℃でインキュベートして一定時間毎に各々の化合物の極大吸収波長（化合物Ｃ：６７４ｎｍ；ＴＭＢＺ：６５０ｎｍ）での吸光度を測定した。結果を第３図に示す。本発明の化合物から生成する色素はＴＭＢＺから生成する色素に比べて安定性に優れていることが明らかである。
例６：本発明の化合物を用いたペルオキシダーゼ活性の測定
９６穴マイクロプレートにバッファー溶液７００μｌ（５０ｍＭ−リン酸緩衝液、ｐＨ４．０）を加え、化合物Ａ〜Ｃの保存溶液１００μｌ（各１０ｍＭ）と過酸化水素溶液１００μｌ（３ｍＭ）を加えた。ペルオキシダーゼ溶液１００μｌ（１．６７×１０^−２ＩＵ／ｍｌ，７．８０×１０^−３ＩＵ／ｍｌ，３．９０×１０^−３ＩＵ／ｍｌ，１．６７×１０^−３ＩＵ／ｍｌ，６．６０×１０^−４ＩＵ／ｍｌ，３．３０×１０^−４ＩＵ／ｍｌ）を加えて室温で３０分間放置した後、濃硫酸を２μｌ加えてマイクロプレートリーダーにより４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果を第４図に示す。
産業上の利用可能性
本発明の化合物は過酸化水素の測定及びペルオキシダーゼの測定用試薬として用いることができる。本発明の化合物は高い水溶性を有しており、光分解や酸化分解に対して高い抵抗性を示すという特徴がある。また、測定試薬として用いた場合には、反応後に安定で大きなモル吸光係数を有する色素を生成できるという特徴がある。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の化合物を用いて過酸化水素濃度測定を行った結果を示す図である。
第２図は、本発明の化合物を用いて過酸化水素濃度測定を行った結果（ストッパーとして硫酸の存在下）を示す図である。
第３図は、本発明の化合物から形成される色素の安定性を示した図である。
第４図は、本発明の化合物を用いてペルオキシダーゼ活性を測定した結果を示す図である。

Claims

下記の式で表される化合物又はその塩。
ナトリウム塩である請求項１に記載の塩。
請求項１又は２に記載の化合物又はその塩を含む酸化発色試薬。
ペルオキシダーゼ測定用試薬として用いる請求項３に記載の酸化発色試薬。