JPH0745477B2 - イミダゾ−ル誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法 - Google Patents

イミダゾ−ル誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法

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JPH0745477B2
JPH0745477B2 JP60070296A JP7029685A JPH0745477B2 JP H0745477 B2 JPH0745477 B2 JP H0745477B2 JP 60070296 A JP60070296 A JP 60070296A JP 7029685 A JP7029685 A JP 7029685A JP H0745477 B2 JPH0745477 B2 JP H0745477B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、新規なイミダゾール誘導体、及び該化合物を
発色成分として用いる酸化性物質の定量方法並びにペル
オキシダーゼ様物質の定量方法に関する。
〔発明の背景〕
生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定するこ
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行なう上で、必
須なものとなっている。例えば、血液中のコレステロー
ル、トリグリセライト、グルコース、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼなどを始め、非常に多
種類の微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断
上役立っていることは周知の通りである。
現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行ない、これに
よる生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素
法”が一般に広く普及している。なかでも、H2O2生成酵
素、例えば、オキシダーゼを働かせて目的成分に相当す
るH2O2を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及び発色
成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、そ
の呈色を比色定量することにより目的成分量を求める方
法が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増加しつつあ
る。例えば、コレステロール−コレステロールオキシダ
ーゼ、トリグリセライド−リポプロテインリパーゼ−グ
リセロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼなどの組合
せで発生するH2O2を、ペルオキシダーゼ（POD）、被酸
化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色の吸光度
を測定することにより目的成分量を求める方法である。
この方法に於て用いられる発色成分である被酸化性呈色
試薬の代表的なものとしては、４−アミノアンチピリン
と、フェノール系化合物又はN,N−ジ置換アニリン系化
合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチルベンゾ
チアゾリノンヒドラジン（MBTH）とアニリン系化合物と
の組合せ試薬、2,2′−アジノビス（３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）、トリフェニル
メタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、ｏ−トリジン
誘導体、ジフェニルアミン誘導体、ｏ−フェニレンジア
ミン等が挙げられる。しかしながら、これら従来から用
いられている被酸化性呈色試薬は、ジフェニルアミン誘
導体を除いて大部分がその呈色波長が600nm以下であ
り、ビリルビン、ヘモグロビン等の血清成分の影響を受
け易く（尿中成分測定時には尿中の色素体の影響を受け
易い）、又、４−アミノアンチピリンとの組合せ試薬や
トリフェニルメタン系ロイコ色素の一部を除いて、いず
れも色原体の安定性が低い等の問題点を有する。一方、
比較的色原体の安定性が良く、又呈色波長が比較的長波
長側にある色原体として染料前駆体（ロイコ色素）のト
リアリルイミダゾール誘導体が開示されている。（特公
昭57-5519号公報、特公昭57-26118号公報、特開昭58-45
557号公報、米国特許第3297710号明細書等） これらのイミダゾール誘導体は、いずれもその呈色波長
が600nm以上と比較的長波長側にあり感度も比較的高い
が、色原体の安定性は必ずしも未だ充分満足のいくもの
であるとは云えず、感度の高いものは特に色原体の安定
性に問題が残る。
〔発明の目的〕
本発明の目的は、呈色時の極大吸収波長が600nm以上の
長波長側にあり、感度も高く、しかも色原体が極めて安
定なイミダゾール誘導体の開発と、該化合物を用いる酸
化性物質及びペルオキシダーゼ様物質の精度の高い定量
法を提供することにある。
〔発明の構成〕
上記目的を達成するため、本発明は次の構成からなる。
下記一般式〔Ｉ〕 ［式中、R1,R2及びR3は夫々有機の基であって、R1,R2及
びR3のうち１つがそのオルト位又はパラ位のどちらかが
水酸基で置換されたアリール基を表わし、１つがそのオ
ルト位又はパラ位のどちらかが、アルコキシ基、アリー
ルオキシ基又は置換基を有していてもよいアミノ基で置
換されたアリール基を表わし、残りの１つがそのオルト
位又はパラ位のどちらかが水酸基で置換されたアリール
基、又はそのオルト位又はパラ位のどちらかが、アルコ
キシ基、アリールオキシ基又は置換基を有していてもよ
いアミノ基で置換されたアリール基、又はベンジル基を
表わす。また、R4は置換基を有していてもよいフェニル
基、アルケニル基、アシル基、アルキル置換カルバモイ
ル基、置換基を有していてもよいフェニル置換カルバモ
イル基を表わす。］で示されるイミダゾール誘導体及び
該化合物を発色成分として用いる酸化性物質並びにペル
オキシダーゼ様物質の定量法。
本発明は上記一般式〔Ｉ〕で示されるイミダゾール誘導
体が、いずれもその呈色波長が600nm以上の長波長側に
あり、しかもイミダゾール環の３位のＮにR4で表わされ
る基をつけることによって、呈色感度に拘わらず色原体
として極めて安定となり、これを酸化性物質やペルオキ
シダーゼ様物質の定量に於ける発色成分として用いるこ
とにより、より精度の高い測定を行い得ることを本発明
者らが見出し、完成するに到ったものである。
一般式〔Ｉ〕で示される本発明のイミダゾール誘導体に
於て、R1,R2及びR3で表わされるそのオルト位又はパラ
位のどちらかが水酸基で置換されたアリール基、及びそ
のオルト位又はパラ位のどちらかがアルコキシ基、アリ
ールオキシ基又は置換基を有していてもよいアミノ基で
置換されたアリール基のオルト位又はパラ位以外の置換
基としては、例えば、メチル基，エチル基，プロピル
基，ブチル基，ペンチル基等炭素数１〜５の低級アルキ
ル基（直鎖状、分枝状のいずれにても可。）、例えばメ
トキシ基，エトキシ基，プロポキシ基，ブトキシ基等炭
素数１〜４の低級アルコキシ基（直鎖状、分枝状のいず
れにても可。）、例えばフェノキシ基，メチルフェノキ
シ基，カルボキシフェノシキ基，クロロフェノキシ基等
のアリールオキシ基、塩素，臭素，弗素，沃素等のハロ
ゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基、例えばメチル
基，エチル基，プロピル基，ブチル基等の低級アルキル
基又は例えば-C2H4OH基，-C3H6OH基，-C2H4NHSO2CH
3基，-C2H4NHCOCH3基，-C2H4SO3H基（又は-C2H4SO3Na基
等），-C3H6SO3H基（又は-C3H6SO3Na基等）， の置換低級アルキル基等で置換されたアミノ基、例えば
メトキシカルボニル基，エトキシカルボニル基，イソプ
ロポキシカルボニル基等低級アルコキシカルボニル基、
スルホニル基、例えばメチルスルホニル基，エチルスル
ホニル基等低級アルキルスルホニル基等が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。又、R1,R2及びR
3に於けるオルト位又はパラ位の置換基であるアルコキ
シ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポ
キシ基、ブトキシ基等が挙げられ、アリールオキシ基と
しては、フェノキシ基、例えばメチルフェノキシ基，カ
ルボキシフェノキシ基，スルホフェノキシ基，クロロフ
ェノキシ基等の置換フェノキシ基等が挙げられ、置換基
を有していてもよいアミノ基の置換基としては、例えば
メチル基，エチル基，プロピル基，ブチル基等の低級ア
ルキル基，-C2H4OH基，-C3H6OH基，-C2H4NHSO2CH3基，-
C2H4NHCOCH3基，-C2H4SO3H基（又は-C2H4SO3Na基），-C
3H6SO3H基（又は-C3H6SO3Na基）， の置換低級アルキル基等が挙げられる。
R4で表わされる置換基を有していてもよいフェニル基と
しては例えば、フェニル基、メチルフェニル基、クロロ
フェニル基、カルボキシフェニル基、スルホフェニル基
等が挙げられ、アルケニル基としては、例えば、ビニル
基、プロペニル基、ブテニル基等が挙げられ、アシル基
としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチ
リル基、バレリル基、ベンゾイル基、トルオイル基、サ
リチロイル基、フタロイル基等が挙げられる。又、アル
キル置換カルバモイル基としては、例えば、Ｎ−メチル
カルバモイル基,N−エチルカルバモイル基,N−イソプロ
ピルカルバモイル基,N,N−ジメチルカルバモイル基,N,N
−ジエチルカルバモイル基,N,N−ジイソプロピルカルバ
モイル基等の低級アルキル置換カルバモイル基が挙げら
れ、置換基を有していてもよいフェニル置換カルバモイ
ル基の置換基としては、例えばメチル基，エチル基，プ
ロピル基等の低級アルキル基、例えばメトキシ基，エト
キシ基等の低級アルコキシ基、塩素，臭素，弗素，沃素
等のハロゲン原子等が挙げられ、これらの置換基を有し
ていてもよいフェニル基のモノ又はジ置換カルバモイル
基が用いられる。又、Ｎ−アルキル−Ｎ−フェニルカル
バモイル基も同様に用い得ることはいうまでもない。
一般式〔Ｉ〕で示される本発明のイミダゾール誘導体
は、例えば、ペルオキシダーゼの存在下過酸化水素を作
用させると、下記の如く反応する。
即ち、例えば一般式〔Ｉ〕に於て、 は置換基を有していてもよいアミノ基を表わす。）、 （但し、R7はアルキル基又は置換基を有していてもよい
フェニル基を表わす。）とすると、 キル基又は置換基を有していてもよいフェニル基を表わ
す。）とすると、 更に又、例えば R4=-CH=CH2とすると、 即ち、R4がアルキル置換カルバモイル基、又は置換基を
有していてもよいフェニル置換カルバモイル基のとき
は、これらの基は酸化反応の際にイミダゾール基より外
れて、例えば過酸化水素で酸化した場合にはRNHCOOHと
なり、酸化により生成した色素とは全く別の存在とな
る。即ち、R4で表わされるアルキル置換カルバモイル
基、又は置換基を有していてもよいフェニル置換カルバ
モイル基は、色原体の安定化（ブランクの安定化）にの
み関与し、発色には何ら影響を与えない。一方、R4が置
換基を有していてもよいフェニル基、アルケニル基、ア
シル基の場合には、少くとも過酸化水素−ペルオキシダ
ーゼ系の酸化反応に於てはイミダゾール基からは外れず
にそのまま残っており、色原体の安定化と共にH2O2当り
の感度を２倍にする役目を果している。
表１に、一般式〔Ｉ〕で示される本発明化合物の具体例
数例と、その呈色時の極大吸収波長及び分子吸光係数ε
（H2O2当り）、並びに色原体の安定性（ブランクの安定
性）を示すが、本発明化合物はこれらに限定されるもの
でないことはいうまでもない。
＊ブランクの安定性 50mMリン酸緩衝液（pH7.0）にPOD 2000U/l,各々のロイコ体300μmol/lを溶解して試液と
し、この試液の吸光度と25℃24時間後の吸光度を比較し
て差が0.100以上のときを−,0.050〜0.100のときを±,
0.050以下のときを＋とした。
表１より明らかな如く比較例で示される既存のトリアリ
ルイミダゾール誘導体のR4（＝水素）を本発明に係る種
々の置換基（アルキル置換カルバモイル基及び置換基を
有していてもよいフェニル置換カルバモイル基を除く）
で置きかえることによりH2O2当りの感度が約２倍とな
る。
一般式〔Ｉ〕で示される本発明化合物は、公知の方法に
より容易に合成することができる。即ち、例えば、Orga
nic Syntheses Vol.5,111頁1973年に記載の方法に準じ
て、式〔II〕で示されるエタンジオンを合成し、 （式中、R2,R3，は前記と同じ。） 次いで、これを例えば米国特許第3297710号明細書に記
載の方法に準じてR1−CHO（R1は前記と同じ）なるアル
デヒド類及び酢酸アンモニウムと、酢酸溶媒中数時間加
熱（要すれば還流）反応させれば式〔III〕で示される
イミダゾール誘導体が得られるから、 （式中、R1,R2,R3は前記と同じ。） 得られたイミダゾール誘導体を適当な溶媒の存在下、室
温乃至溶媒の沸点でイソシアン酸アルキル（又はイソシ
アン酸フェニル、ハロゲン化アシル等）と数時間乃至十
数時間反応させれば、目的物が収率よく得られる。要す
ればこれを適当な精製方法、例えば再結晶、カラムクロ
マトグラフィー等により精製すれば精製品が容易に得ら
れる。
本発明のイミダゾール誘導体は、酸化性物質の定量やペ
ルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色成分として有
効に用いる得るが、とりわけ酵素反応により生成した過
酸化水素をペルオキシダーゼの存在下発色系に導き、そ
の呈色を比色定量することにより行う生体試料中の微量
成分の定量に於ける発色成分として特に有効に使用し得
る。
即ち、本発明の酸化性物質の定量法は、基質、又は酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成す
る過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の基
質又は酵素活性の定量法として特に効果的に使用し得
る。
本発明の方法により測定可能な生体試料中の微量成分と
して、例えば、コレステロール、グルコース、グリセリ
ン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリン
エステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されるも
のではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定量
することによって測定が可能な生体成分は全て定量可能
である。
本発明の方法による生体成分の定量に於て、過酸化水素
を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキシダ
ーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵素
反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用量
は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の定量
法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜選択す
ればよい。又、本発明による過酸化水素の定量に於て用
いられるペルオキシダーゼとしては、その起源、由来に
特に限定はなく、植物、動物、微生物起源のペルオキシ
ダーゼ又はペルオキシダーゼ様物質が、一種若しくは要
すれば二種以上組合せて用いられる。又、その使用量は
目的に応じて適宜定められ、特に限定されない。
本発明の方法による生体成分の定量は、通常、pH4.0〜1
0.0、より好ましくはpH6.0〜8.0で実施される。用いら
れる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸
塩、炭酸塩、トリス緩衝液、グッド（Good's）緩衝液な
どが挙げられるが、特にこれらに限定されない。
本発明のイミダゾール誘導体は、過酸化水素等酸化性物
質の定量に有効に用い得るが、又、これと過酸化水素と
を組み合せることによりペルオキシダーゼ様物質の定量
を行うことも可能である。ペルオキシダーゼ様物質とし
ては、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグロビンそ
の他のヘム化合物が挙げられる。
即ち、本発明のイミダゾール誘導体は、例えば、ペルオ
キシダーゼを標識化合物に用いた酵素免疫測定法にも応
用可能であり、又、血清中のヘモグロビンを過酸化水素
若しくは過硼素酸ナトリウムのような酸化性物質を用い
て測定する場合などにも有効に使用し得る。
以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例により
何ら制約を受けるものではない。
〔実施例〕
実施例1. ２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフ
ェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−4,5−ビス
（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール〔本発明
化合物（１）〕の合成 （ｉ） 1,2−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）エ
タン−1,2−ジオンの合成 無水塩化アルミニウム6.7gに二硫化炭素20mlを加え氷冷
下、N,N−ジエチルアニリン20gを滴下した。さらに撹拌
下、氷冷しながらオキザリルクロリド1.5gを滴下し、60
分間撹拌反応させた。反応後、水50ml及びクロロホルム
100mlを加え、分液して得たクロロホルム層を減圧濃縮
して結晶を析出せしめた。析出した結晶を取し酢酸エ
チルから再結晶して黄色の目的物5.0gを得た。
（ii） ２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェ
ニル）−4,5−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イ
ミダゾールの合成 （ｉ）で得た1,2−ビス（４−ジエチルアミノフェニ
ル）エタン−1,2−ジオン1.5gと４−ヒドロキシ−3,5−
ジメトキシベンズアルデヒド0.8g、酢酸アンモニウム5g
を酢酸30ml中で２時間加熱還流して反応させた。冷却
後、水60mlを加え氷冷下アンモニア水で中和したところ
結晶が析出した。析出した結晶を取、水洗、乾燥後、
ヘキサンで処理し微赤色の目的化合物0.8gを得た。
（iii） ２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェ
ニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−4,5−ビス（４
−ジエチルアミノフェニル）イミダゾールの合成 （ii）で得た２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシ
フェニル）−4,5−ビス（４−ジエチルアミノフェニ
ル）イミダゾール0.8gをクロロホルム50mlに溶解し、撹
拌下、イソシアン酸メチル5mlを加え室温で12時間放置
した。次いで、メタノール50mlを加え反応を停止後濃縮
した。濃縮物を、クロロホルムを溶離液に用いたシリカ
ゲルカラムで精製し、目的物（微赤色粉末）760mgを得
た。
実施例2. ２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフ
ェニル）−３−アセチル−4,5−ビス（４−ジエチルア
ミノフェニル）イミダゾール〔本発明化合物（２）〕の
合成 実施例１と同様にして得た２−（４−ヒドロキシ−3,5
−ジメトキシフェニル）−4,5−ビス（４−ジエチルア
ミノフェニル）イミダゾール1.0g、ピリジン0.4mlをテ
トラヒドロフラン200mlに溶解し、塩化アセチル0.2mlを
加え室温で12時間撹拌反応させた。次いで、氷水300ml
を加え反応を停止後クロロホルム500mlを加え、クロロ
ホルム層を分取し濃縮した。濃縮物を、クロロホルムを
溶離液に用いたシリカゲルカラムで精製し、目的物（微
赤色粉末）800mgを得た。
実施例3. ２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフ
ェニル）−３−ベンゾイル−4,5−ビス（４−ジエチル
アミノフェニル）イミダゾール〔本発明化合物（３）〕
の合成 実施例１と同様にして得た２−（４−ヒドロキシ−3,5
−ジメトキシフェニル）−4,5−ビス（４−ジエチルア
ミノフェニル）イミダゾール1.0g、ピリジン0.4mlをテ
トラヒドロフラン200mlに溶解し、塩化ベンゾイル0.2ml
を加え室温で12時間撹拌反応させた。次いで、氷水300m
lを加え反応を停止後クロロホルム500mlを加え、クロロ
ホルム層を分取し濃縮した。濃縮物を、クロロホルムを
溶離液に用いたシリカゲルカラムで精製し、目的物（微
赤色粉末）850mgを得た。
NMR（CDCl3,TMS）ppm:1.2（12H,t,CH3 −Ｃ−）、3.6（8
H,q,C−CH2 −）、3.9（6H,s,−Ｏ−CH3 ）、6.5〜7.5（1
5H,broad,フェニル水素）、7.9（1H,s,−OH） 実施例４ 尿酸の定量 （１） 試液 50mmol/lMES〔２−（Ｎ−モルホリノ）
エタンスルホン酸〕緩衝液（pH6.5）にウリカーゼ100U/
l、ペルオキシダーゼ2000U/l、本発明化合物（６）100
μmol/lの濃度になるように溶解し調製した。
（２） 試料 尿酸を蒸留水で10,7.5,5,2.5mg/dlにな
るように溶解し調製した。
（３） 測定操作 各試料液及び蒸留水各50μｌに試液
3.0mlを加え、37℃で５分間加温し700nmの吸光度を盲検
を対照に測定した。
第１図に尿酸濃度と吸光度との関係を示す。第１図より
明らかな如く、各尿酸濃度に対してプロットした吸光度
を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量線は良好な
定量性を示している。
実施例５ 過酸化水素の定量 （１） 試液 50mmol/lリン酸緩衝液（pH7.0）にペル
オキシダーゼ2000U/l、本発明化合物（２）100μmol/l
の濃度になるように溶解し調製した。
（２） 試料 市販過酸化水素水を蒸留水で希釈し2.0,
1.5,1.0,0.5mmol/lになるように溶解し調製した。
（３） 測定操作 各試料液及び蒸留水各20μｌに試液
3.0mlを加え、37℃で３分間加温し670nmの吸光度を盲検
を対照に測定した。
第２図に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示す。第２
図より明らかな如く、各過酸化水素濃度に対してプロッ
トした吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検
量線は良好な定量性を示している。
〔発明の効果〕
以上述べた如く、本発明の新規イミダゾール誘導体は、
その殆どが呈色時の極大吸収波長が、600nm以上の長波
長側にある為，例えば血清，尿等生体試料中の微量成分
の定量に於ける発色成分としてこれを用いた場合には、
試料中に共存する有色の妨害物質の影響をさほど受けず
に測定を行うことができるという点、及びイミダゾール
環の３位の窒素に前述の如き置換基をつけたことにより
色原体として安定化されたイミダゾール誘導体となり得
た点、更に又、その置換基が置換基を有していてもよい
フェニル基、アルケニル基及びアシル基のときには、例
えば過酸化水素−ペルオキシダーゼ系での酸化反応に於
ては過酸化水素当りの呈色の感度が、置換基のない既存
のイミダゾール誘導体に比べ２倍になる点等に顕著な効
果を奏するものであり、斯業に貢献するところ大なるも
のである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例４に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各尿酸濃度（mg/dl）について得られた吸光度を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第２図は、実施例５に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各過酸化水素濃度（mmol/l）について得られた吸光
度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記一般式〔Ｉ〕 ［式中、R1,R2及びR3は夫々有機の基であって、R1,R2及
    びR3のうち１つがそのオルト位又はパラ位のどちらかが
    水酸基で置換されたアリール基を表わし、１つがそのオ
    ルト位又はパラ位のどちらかが、アルコキシ基、アリー
    ルオキシ基又は置換基を有していてもよいアミノ基で置
    換されたアリール基を表わし、残りの１つがそのオルト
    位又はパラ位のどちらかが水酸基で置換されたアリール
    基、又はそのオルト位又はパラ位のどちらかが、アルコ
    キシ基、アリールオキシ基又は置換基を有していてもよ
    いアミノ基で置換されたアリール基、又はベンジル基を
    表わす。また、R4は置換基を有していてもよいフェニル
    基、アルケニル基、アシル基、アルキル置換カルバモイ
    ル基、置換基を有していてもよいフェニル置換カルバモ
    イル基を表わす。］で示されるイミダゾール誘導体。
  2. 【請求項２】下記一般式〔Ｉ〕 ［式中、R1,R2及びR3は夫々有機の基であって、R1,R2及
    びR3のうち１つがそのオルト位又はパラ位のどちらかが
    水酸基で置換されたアリール基を表わし、１つがそのオ
    ルト位又はパラ位のどちらかが、アルコキシ基、アリー
    ルオキシ基又は置換基を有していてもよいアミノ基で置
    換されたアリール基を表わし、残りの１つがそのオルト
    位又はパラ位のどちらかが水酸基で置換されたアリール
    基、又はそのオルト位又はパラ位のどちらかが、アルコ
    キシ基、アリールオキシ基又は置換基を有していてもよ
    いアミノ基で置換されたアリール基、又はベンジル基を
    表わす。また、R4は置換基を有していてもよいフェニル
    基、アルケニル基、アシル基、アルキル置換カルバモイ
    ル基、置換基を有していてもよいフェニル置換カルバモ
    イル基を表わす。］で示されるイミダゾール誘導体を発
    色成分として用いることを特徴とする酸化性物質の定量
    法。
  3. 【請求項３】酸化性物質が過酸化水素である、特許請求
    の範囲第２項記載の定量法。
  4. 【請求項４】ペルオキシダーゼの存在下、発色成分を酸
    化発色させてその呈色を比色定量する特許請求の範囲第
    ３項記載の定量法。
  5. 【請求項５】過酸化水素が、酵素反応により生成する過
    酸化水素である特許請求の範囲第３項又は第４項記載の
    定量法。
  6. 【請求項６】過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定
    量に於て酵素反応により生成する過酸化水素である特許
    請求の範囲第５項記載の定量法。
  7. 【請求項７】生体試料中の微量成分の定量が、基質、又
    は酵素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生
    成する過酸化水素を定量することにより行う生体試料中
    の基質又は酵素活性の定量である特許請求の範囲第６項
    記載の定量法。
  8. 【請求項８】下記一般式〔Ｉ〕 ［式中、R1,R2及びR3は夫々有機の基であって、R1,R2及
    びR3のうち１つがそのオルト位又はパラ位のどちらかが
    水酸基で置換されたアリール基を表わし、１つがそのオ
    ルト位又はパラ位のどちらかが、アルコキシ基、アリー
    ルオキシ基又は置換基を有していてもよいアミノ基で置
    換されたアリール基を表わし、残りの１つがそのオルト
    位又はパラ位のどちらかが水酸基で置換されたアリール
    基、又はそのオルト位又はパラ位のどちらかが、アルコ
    キシ基、アリールオキシ基又は置換基を有していてもよ
    いアミノ基で置換されたアリール基、又はベンジル基を
    表わす。また、R4は置換基を有していてもよいフェニル
    基、アルケニル基、アシル基、アルキル置換カルバモイ
    ル基、置換基を有していてもよいフェニル置換カルバモ
    イル基を表わす。］で示されるイミダゾール誘導体を発
    色成分として用いることを特徴とするペルオキシダーゼ
    様物質の定量法。
  9. 【請求項９】ペルオキシダーゼ様物質がペルオキシダー
    ゼである特許請求の範囲第８項記載の定量法。
  10. 【請求項１０】ペルオキシダーゼ様物質がヘモグロビン
    又はその他のヘム化合物である特許請求の範囲第８項記
    載の定量法。
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