JPS61291527A - Selective adsorbent and separation and recovery of human alpha-plasmin inhibitor - Google Patents
Selective adsorbent and separation and recovery of human alpha-plasmin inhibitorInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
ａ、産業上の利用分野
本発明は、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対する
選択的吸着体およびその吸着体を用いるヒトαオープラ
スミンインヒビタ−含有液体からのヒトα２−プラスミ
ンインヒビターの分離回収法に関するものである。Detailed Description of the Invention a. Industrial Application Field The present invention relates to a selective adsorbent for human α2-plasmin inhibitor and the separation of human α2-plasmin inhibitor from a liquid containing human α-plasmin inhibitor using the adsorbent. It concerns the collection law.
ヒトの一−プラスミンインヒビターは青水と諸井によっ
て、最初に単離・精製され、ｍ雑木溶解＃累のプラスミ
ン（ｐｌａａｍｉｎ）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻
害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、１１．７
９６の糖を含む分子量約６ ＬＯＧ ００１本鎖０糖蛋
白質であることが知られている（ Ｍｏｒｏｉ ＆ Ａ
ｏｋｉ ；Ｔｈ＠Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＋２５１ｔ５９５６−
５９６５（１９７６）参照〕。Human monoplasmin inhibitor was first isolated and purified by Aomizu and Moroi, and is a strong plasmin inhibitor that instantly inhibits the esterase activity of plasmin in the human body.
It is known to be a single chain zero glycoprotein with a molecular weight of approximately 6 LOG 00 containing 96 sugars (Moroi & A
oki ;Th@Journal of Biolog
ical Chemistry +251t5956-
5965 (1976)].
一方、ヒトα２−プラスミンインヒビターには、３ｆ！
１類の活性部位があることが知られている。第１は、プ
ラスミンの線維素溶解作用阻害部位（以下これを１リア
クテイプサイビということがある。） ＣＢ、Ｗｉｍａ
ｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１＠ｎ；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙｓ２
５４ ＄９２９１−９２９７（１９７９）参照〕であり
、第２はカルボキシル基未満側のプラスミン結合部位（
Ｂ、Ｗｌｍａｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ； Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｌｏｅｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ＋ ８ ４ ＋ ５ ７ ３−５ ７８
（１９７８）参照〕であり、ｗ、３はアミ７基末端のフ
ィブリン結合部位である（ Ｙ、５ａｋａｔａ＋ｅｔａ
１．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｌｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋
１ ６ ｖ ２７９−２ ８２（１９７９）参照〕
。On the other hand, human α2-plasmin inhibitor has 3f!
It is known that there is one type of active site. The first is a site that inhibits the fibrinolytic action of plasmin (hereinafter this may be referred to as 1-reactapecybi) CB, Wima
n & D, Co11@n; The Journal
of Biological Ch@m1strys2
54 $9291-9297 (1979)], and the second is the plasmin binding site on the side less than the carboxyl group (see
B, Wlman & D, Co11en; Europe
eanJournal of Bloehemi
stry+ 8 4 + 5 7 3-5 78
(1978)], w, 3 is the fibrin binding site at the end of the ami7 group (Y, 5akata+eta
1. Thrombosls Re5search+
1 6 v 279-2 82 (1979)]
.
従来、ヒト血漿中からの侑−プラスミンインヒビタ−の
精製には、このインヒビターのプラスミノーゲンへの親
和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーが用
いられている（ Ｍｏｒｏｉ ＆ Ａｏｋｉ ；Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙｓ ２５１ ＋ ５９５６−５９６５（１
９７６）参照〕。Conventionally, affinity chromatography, which utilizes the affinity of this inhibitor for plasminogen, has been used to purify Yu-plasmin inhibitor from human plasma (Moroi &Aoki;
Journal of Biological Che
mistrys 251 + 5956-5965 (1
976)].
しかし、この方法は、精製ＫｉＦするステップが多く、
且つ時間も長くかかるという欠点があった。However, this method requires many steps to purify KiF,
Moreover, it has the disadvantage that it takes a long time.
一方ｓａ、−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロ
ーナル抗体をリガンドとして不溶性担体（例えばセファ
ロース）Ｋ結合させた吸海体を用いれば、ヒトα、−α
、プラスミンインヒビタ−含有液体１例えばヒト血漿中
のα！−プラスミンインヒビターを容易に、短時間で分
離または精製することができると考えられる。On the other hand, if a monoclonal antibody against sa, -plasmin inhibitor is used as a ligand and is bound to an insoluble carrier (e.g. Sepharose), human α, -α
, plasmin inhibitor-containing fluid 1 such as α in human plasma! - It is believed that plasmin inhibitors can be easily separated or purified in a short time.
ｂ０発明の構底
そこで１本発明者らは、ヒトａ雪−プラスミンインヒビ
ターに対する七ツクローナル抗体について研究を１ねた
ところ、ヒトα會−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線維素溶解作用阻止部位を特異的にｇ識し、
ヒトａ茸−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻止作
用を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を見出し
、またこのモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドー
マ細胞を創作し得、既に提案した。The present inventors conducted research on seven clonal antibodies against human α-plasmin inhibitor, and found that they specifically inhibited the fibrinolytic action of plasmin in human α-plasmin inhibitor. g-aware,
We have discovered a monoclonal antibody that has the activity of suppressing the fibrinolysis-inhibiting effect of a human A-mushroom plasmin inhibitor, and have also created and previously proposed a hybridoma cell that produces this monoclonal antibody.
本発明者らは、かくして得られたモノクローナル抗体の
特異的な作用の利用について叉に研究を進めた結果、ヒ
ト偽−プラスミンインヒビターを特異的に吸着し得る吸
着体およびそれを用いると、ヒトα２−プラスミンイン
ヒビター含有液体からヒト偽−プラスミンインヒビター
を選択的に分離・回収することができることを見出し本
発明圧到達した。The present inventors have conducted research on the use of the specific action of the monoclonal antibody thus obtained, and have found that an adsorbent that can specifically adsorb human pseudoplasmin inhibitor and the use of the adsorbent to specifically adsorb human α2 The present invention has been achieved by discovering that human pseudo-plasmin inhibitor can be selectively separated and recovered from a liquid containing plasmin inhibitor.
すなわち２本発明はヒトα２−プラスミンインヒビター
におけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異
的に＆！繊して結合し得るヒト偽−プラスミンインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体またはそのＦａｂ部分
を少（とも含有する該モノクローナル抗体の断片を不溶
性固体担体に固定化させたヒトα２−プラスミンインヒ
ビターに対する選択的吸着体であり、またこの選択的吸
着体を、ヒトα２−プラスミンインヒビターを含有する
液体と接触させて、紋担体にヒトα２−プラスミンイン
ヒビターを吸着させた後、該液体から該担体を分離し、
そして必！！により該担体からヒトａ、−プラスミンイ
ンヒビタ−を脱着させて討ヒトα、−プラスミンインヒ
ビタ−を回収することを特徴とするヒトαオープラスミ
ンインヒビタ−含有液体からの該ヒトα、−プラスミン
インヒビターの分離回収方法である。That is, the present invention specifically targets the site of inhibition of the fibrinolytic action of plasmin in human α2-plasmin inhibitor &! A selective adsorbent for human α2-plasmin inhibitor in which a monoclonal antibody against human pseudo-plasmin inhibitor or a fragment of the monoclonal antibody containing at least a small amount of its Fab portion is immobilized on an insoluble solid support. Further, this selective adsorbent is brought into contact with a liquid containing human α2-plasmin inhibitor to adsorb the human α2-plasmin inhibitor on the patterned carrier, and then the carrier is separated from the liquid,
And a must! ! A method for separating and recovering human α,-plasmin inhibitor from a liquid containing human α,-plasmin inhibitor, which comprises desorbing human α,-plasmin inhibitor from the carrier and recovering human α,-plasmin inhibitor. be.
一般に、吸着体の生物学的親和力を生体物質の分離・精
製に利用するクロマトグラフィーは、アフィニティーク
ロマトグラフィーと呼ばれている〔例えば、千畑一部、
土佐哲也。In general, chromatography that utilizes the biological affinity of adsorbents for the separation and purification of biological substances is called affinity chromatography [for example, Chibata,
Tetsuya Tosa.
松尾雄志著「実験と応用アフィニティークロマトグラフ
ィー」購餘社サイエンティフィック参照〕。Yushi Matsuo, “Experimental and Applied Affinity Chromatography” (Refer to Kyushusha Scientific).
本発明におけるアフィニティー、リガンド９不溶性担体
、吸着体なる飴は、それぞれ下記に意味に解するものと
する。In the present invention, the meanings of affinity, ligand 9-insoluble carrier, and adsorbent are defined as follows.
アフィニティー；
２種物質問に存在する巷異的観和カ
リガント；
吸着あるいは精製を目的とする物質と７フイニテイーを
有する物質
不溶性固体担体：
水に不溶性の支持体（これにはりガントは含まれない）
吸 着 体 ：
リガンドを不溶性固体担体に固定化したもの
次に本発明におけるヒトαオープラスミンインヒビタ−
に対する選択的吸着体およびヒトαオープラスミンイン
ヒビタ−含有液体よりヒト丙−プラスミンインヒビター
を分離回収する方法について絆ｍく説明する。Affinity; a widely differing affinity that exists in a binary question; a substance that has 7 affinity with the substance to be adsorbed or purified; Insoluble solid support: a support that is insoluble in water (this does not include a binder) Adsorbent: Ligand immobilized on an insoluble solid carrier Next, the human α-oplasmin inhibitor of the present invention
A selective adsorbent for the present invention and a method for separating and recovering human α-plasmin inhibitor from a liquid containing human α-plasmin inhibitor will be explained in detail.
ヒトαオープラスミンインヒビタ−に対スルモノクロー
ナル抗体またはそのＦａｂ部分を少くとも含有する断片
を適当な不溶性担体（例えばセファ０−ス）に化学的に
リガンドとして結合させ、これをカラムに詰め適当な緩
衝浴＊（例えば５０ ｍ Ｍ ）リス緩衝液ｐＨ７，４
ｗ０．１５ Ｍ ＮａＣｌ ）によって平衝化する。こ
の吸着体に検体試料（例えばヒト血秦）を添加して検体
試料中のヒトαオープラスミンインヒビタ−を吸着させ
る。次に適当な洗浄浴液（例えば、５０ｍＭ）リス緩衝
液、ｐＨ７，４＋０．１５ ＭＮａＣＪ ） Ｋよって
、不純物を吸着体から除去する。最後に吸着体に存在す
るα、−プラスミンインヒビタ−を適当な溶液（例えば
５０％エチレングリコールｐＨ１１，５）で吸着体から
溶出させる。溶出画分中のα、−プラスミンインヒビタ
−の抗原量及び活性な測定゛すれば溶出したα、−プラ
スミンインヒビタ−の割合を算出することができる。A monoclonal antibody against human α-oplasmin inhibitor or a fragment containing at least its Fab portion is chemically coupled as a ligand to an appropriate insoluble carrier (e.g. Sepharose), and this is packed in a column and placed in an appropriate buffer bath. *(e.g. 50mM) Squirrel buffer pH 7.4
Equilibrate with w0.15 M NaCl). A specimen sample (for example, human blood cells) is added to this adsorbent, and the human α-oplasmin inhibitor in the specimen sample is adsorbed. Impurities are then removed from the adsorbent by a suitable wash bath solution (eg 50mM Lys buffer, pH 7.4+0.15 MNaCJ)K. Finally, the α,-plasmin inhibitor present in the adsorbent is eluted from the adsorbent with a suitable solution (for example, 50% ethylene glycol pH 11.5). By measuring the antigen amount and activity of α,-plasmin inhibitor in the eluted fraction, the proportion of eluted α,-plasmin inhibitor can be calculated.
本発明における選択的吸着体に用いられる不溶性固体担
体とし【は１種々のものが使用できるが、例えば材質と
してアガロース、ポリアクリルアミド、セルロース、デ
キストラン、またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの
混合物が好ましく用いられる。これら不溶性固体担体の
形状としては、粉末状９粒状。Various types of insoluble solid carriers can be used for the selective adsorbent in the present invention, and for example, agarose, polyacrylamide, cellulose, dextran, maleic acid polymer, or a mixture thereof is preferably used as the material. These insoluble solid carriers are in the form of 9 powdery particles.
ペレット状、ビーズ状、フィルム状、＊繊状など麺々の
形態であることができる。It can be in the form of noodles such as pellets, beads, films, and fibers.
本発明の吸着体に使用されるヒトαオープラスミンイン
ヒビタ−に対するモノクローナル抗体は、本発明者らに
よって見出され、先に特許出願された（昭和５９年４月
１７日付出願昭５９−７５７７８号；発明の名称１モノ
クー−ナル抗体の製造方法′）。The monoclonal antibody against human α-oplasmin inhibitor used in the adsorbent of the present invention was discovered by the present inventors, and a patent application was previously filed (Application No. 75778-1978 dated April 17, 1980; Invention Name 1. Method for producing monoclonal antibodies').
本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造方法につ
いては前記特許出願明細書く詳細に説明されているが、
以下にその内容を簡単に説明する。The monoclonal antibody of the present invention and the method for producing the same are explained in detail in the patent application specification,
The contents will be briefly explained below.
（モノクローナル抗体及びその製造方法）抗ｆｆ１Ｋ用
いるヒトαオープラスミンインヒビタ−は、＃記青水と
諸井の方法によりヒト血漿中より単離精泉された。(Monoclonal antibody and method for producing the same) Human α-oplasmin inhibitor used for anti-ff1K was isolated and purified from human plasma by the method of Seimizu and Moroi.
１１ｉ−Ｂａ １ ｂ／ｃマウスを用いるが、他の系（
５ｔｒａｉｎｓ ）の、マウスを使用することもできる
。その際、免疫計−及びヒトαオープラスミンインヒビ
タ−の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形
成されるよう選ばれるべきである。例えばマウスに少量
のヒトα、−プラスミンインヒビタ−で成る間隔で腹腔
に数回免疫の後、さらに数回静脈に投与した。最終免疫
の数日後に融合の為に膵臓細胞を取り出す。11i-Ba 1 b/c mice are used, but other strains (
5 trains) can also be used. In this case, the concentration of the immunometer and human alpha plasmin inhibitor should be chosen so that a sufficient number of antigen-stimulated lymphocytes are formed. For example, mice were immunized several times intraperitoneally with a small amount of human α,-plasmin inhibitor at intervals, followed by intravenous administration several times. Pancreatic cells are removed for fusion several days after the final immunization.
膵臓を無菌的に取り出し、それから単
細胞懸濁液を調製する。それらの牌ａｍ胞を適当なライ
ンからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用に
より細胞融合させる。膵臓細胞対骨髄朧細胞の好ましい
比率は約２０：１〜約２：１の範囲である。約１０’個
の膵臓細胞について０．５〜１．５紅の融合媒体の使用
が適当である。The pancreas is aseptically removed and a single cell suspension prepared from it. These splenic cells are fused with mouse myeloma cells from an appropriate line by using an appropriate fusion promoter. A preferred ratio of pancreatic cells to myeloid cells ranges from about 20:1 to about 2:1. It is appropriate to use 0.5-1.5 ml of fusion medium for about 10' pancreatic cells.
細胞融合に用いる骨髄Ｗ１１細胞は多く知られているが
、本発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩＩＩａ胞（
以下Ｐ３−Ｕｌと略記する） （Ｙｅｌｔｏｎ＋ Ｄ、
Ｅ ｅｔａｌ、、ｃｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ８１１１（１９７８）参照〕を用いた。これは８−７
ザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒポキサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ）が
欠失しており、それゆえにＨＡＴ（ヒポキサンチン！ア
ミノプテリン！チミジン）培地中では生存しない。Many bone marrow W11 cells used for cell fusion are known, but in the present invention, P3-X63-Ag8-UIIIa cells (
(hereinafter abbreviated as P3-Ul) (Yelton+D,
E etal, currentTopics in
Microbiology and Immunology
y8111 (1978)] was used. This is 8-7
This is a zaguanine-resistant cell line that is resistant to the enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (hypoxanthine-guanine pho
sporibosyltransferase) and therefore does not survive in HAT (hypoxanthine! aminopterin! thymidine) medium.
また、この細胞ラインはそれ自体抗体を分泌しない、い
わゆる非分泌製である。Furthermore, this cell line itself does not secrete antibodies, so-called non-secreting cells.
好ましい融合促進剤としては、例えば
平均分子量が１０００〜４０００のポリエチレングリコ
ールを有利に使用できるが。As a preferable fusion promoter, for example, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 4000 can be advantageously used.
この分野で知られている他の融合促進剤を使用すること
もできる。Other fusion promoters known in the art can also be used.
別の容器内（例えばマイクロタイター
プレート）で未融合の牌ｌ１１１１ｍ胞、未融合の骨髄
腫細胞および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのく十分な時間（約１週間）培養する。培地は
薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未融合
の骨髄腫細胞を支持しないもの（例えば的紀ＨＡＴ培地
）が使用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫細
胞は死滅する。また未融合の膵臓細胞は非腫瘍性細胞な
のである一定期間後（約１週間後）死滅する。In a separate container (e.g., a microtiter plate), dilute the mixture of unfused cells, unfused myeloma cells, and fused cells with selective medium that does not support unfused myeloma cells, and Culture for a sufficient period of time (about 1 week) to kill the cells. The medium used is one that is drug resistant (eg, 8-azaguanine resistant) and does not support unfused myeloma cells (eg, Matoki HAT medium). Unfused myeloma cells die in this selective medium. Furthermore, unfused pancreatic cells are non-tumorous cells and die after a certain period of time (about one week).
これらに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性
と観牌臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中で生
存できろ。Cells fused to these cells can survive in selective media because they have both the neoplastic properties of myeloma parent cells and the properties of splenic cells.
かくしてハイプリドーマ細胞が検出さ
れた後、その培養上清を採取し、ヒト偽−プラスミンイ
ンヒビターに対する抗体について酵素免疫定量法（Ｅｎ
ｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ ５ｏｒｂｅｎｔ
Ａｓ５ａｙ ） Ｋよりスクリーニングする。After hybridoma cells have been detected, their culture supernatants are collected and assayed for antibodies to human pseudo-plasmin inhibitor by enzyme immunoassay (Enzyme immunoassay).
zymeLinked Immune 5orbent
As5ay) Screen from K.
目的の抗体を産出するハイプリドーマ
細胞を適当な方法（例えば限定希釈法）でクローン化す
ると、抗体は２つの異なった方法で産生される。その第
１の方法によればハイプリドーマ細胞を一定時間適当な
培地で培養することによりその培養上清から、そのハイ
プリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を得るこ
とができる。第２の方法によればノ１イプリドーマ細胞
は同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注
射することができる。一定時間後の宿主動物の血液中及
び腹水中より、そのハイプリドーマ細胞の産生するモノ
クローナル抗体を得ることができる。When hybridoma cells producing antibodies of interest are cloned by an appropriate method (eg, limited dilution), antibodies can be produced in two different ways. According to the first method, monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells can be obtained from the culture supernatant by culturing the hybridoma cells in an appropriate medium for a certain period of time. According to a second method, No. 1 iploidoma cells can be injected into the peritoneal cavity of isogenic or semi-isogenic mice. Monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells can be obtained from the blood and ascites of the host animal after a certain period of time.
本発明においては、上記の如（して得たモノクローナル
抗体自体を使用することもでき。In the present invention, the monoclonal antibodies themselves obtained as described above can also be used.
また七〇Ｆａｂ部分を少くとも含有する該モノクローナ
ル抗体の断片も同様に使用することができる。Fragments of the monoclonal antibody containing at least the 70 Fab portion can also be used as well.
か〜る断片としては、上記モノクローナル抗体を蛋白分
解酵素であるパパインを用いて切断したＦａｂ部分を少
くとも含むものであればよく、その他ヘプシン、トリプ
シンまたはプラスミンなどの酵素で分解した後に得られ
るＦａｂ部分を少くとも含する断片であっても差支えが
ない。抗体をパパインを用いて分解しＦａｂ部分を得る
ことに関してはそれ自体ポーターらによって既に知られ
ている方法である（ Ｒ，Ｒ，Ｐｏｒｔｅｒ＊Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ７３ ＋１１９〜１
２６（１９５９）参照〕。Such fragments may include at least a Fab portion obtained by cleaving the above monoclonal antibody using the proteolytic enzyme papain, and other Fab fragments obtained by cleaving the monoclonal antibody with an enzyme such as hepsin, trypsin, or plasmin. There is no problem even if it is a fragment containing at least a part. The method of decomposing antibodies using papain to obtain Fab portions is a method already known by Porter et al. (R, R, Porter*Bioc.
Chemical Journal 73 +119~1
26 (1959)].
これらの不溶性固体担体へのモノクローナル抗体又はそ
の断片の固定化は、一般ＫＭモノクローナル抗体ヌは断
片を該不溶性固体担体に化学的に結合することＫより行
なわれる。Immobilization of monoclonal antibodies or fragments thereof onto these insoluble solid supports is generally carried out by chemically bonding the monoclonal antibody fragments to the insoluble solid support.
例えば、上記の如く、ヒトａ、−プラスミンインヒビタ
−含有液体との接触によりヒトα２−プラスミンインヒ
ビターを吸着した吸着体は。For example, as described above, an adsorbent adsorbs human α2-plasmin inhibitor by contacting with a liquid containing human α2-plasmin inhibitor.
該液体から分離すれば、該液体中のヒトα２−プラスミ
ンインヒビターは除去される。これＫより、＃液体とし
てヒト血漿又はヒト血清を用いた場合には、ヒトα２−
プラスミンインヒビターを実質的に含まないヒト血漿又
はヒト血清が得られ、このようなヒトら一プラスミンイ
ンヒビターを含まないヒト血漿又はヒト血清は、例えば
血漿交換又は血清交換療法に有利に用いることができる
。Once separated from the liquid, the human α2-plasmin inhibitor in the liquid is removed. From this K, #if human plasma or human serum is used as the liquid, human α2-
Human plasma or human serum that is substantially free of plasmin inhibitors is obtained, and such human plasma or human serum that is substantially free of plasmin inhibitors can be advantageously used, for example, in plasmapheresis or serum exchange therapy.
一方、皺液体から分離したヒトα２−プラスミンインヒ
ビターを吸着した吸着体は、脱着処理に付すことにより
、吸着体からヒトα２−プラスミンインヒビターを溶離
させて、ヒトα２−プラスミンインヒビターを回収する
ことができる。回収されたヒトα２−プラスミンインヒ
ビターは１例えば先天性α２−プラスミンインヒビター
欠損症、肝疾患等に於ける補充剤、或いは止血剤等とし
て使用することができる。On the other hand, by subjecting the adsorbent that has adsorbed human α2-plasmin inhibitor separated from the wrinkled liquid to a desorption treatment, the human α2-plasmin inhibitor can be eluted from the adsorbent and the human α2-plasmin inhibitor can be recovered. . The recovered human α2-plasmin inhibitor can be used as a supplement for, for example, congenital α2-plasmin inhibitor deficiency, liver diseases, or as a hemostatic agent.
上記の脱着処理は、ヒトα２−プラスミンインヒビター
を吸着した吸着体を溶離液で処理することＫより行なう
ことができる。用いうる溶離液としては、ｐＨが２．５
〜１２．５ 、好ましくは５．θ〜１１．５のエチレン
グリコール水浴液が有利に用いられるが、この他に、グ
リセリン水浴液、グリシン水溶液、プロピオン酸水溶液
、チオシアン酸塩溶液、グアニジン水溶液等を使用する
こともできる。The above desorption treatment can be carried out by treating the adsorbent adsorbed with human α2-plasmin inhibitor with an eluent. The eluent that can be used is one with a pH of 2.5.
~12.5, preferably 5. An ethylene glycol water bath solution having a temperature of θ to 11.5 is advantageously used, but in addition to this, a glycerin water bath solution, a glycine aqueous solution, a propionic acid aqueous solution, a thiocyanate solution, a guanidine aqueous solution, etc. can also be used.
上記エチレングリコール水浴液中のエチレングリコール
の濃度は２０〜８０％、好ましくは４０〜６０５＋６が
有利に用いられる。またこの水溶液にはｐＨの調整のた
めに適宜、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸
塩、 ＩＴｒｉｇ塩、リン酸塩、ペロナール塩等の塩
類、塩ｍ、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸等の
酸類、エタノールアミン等のアミン類。The concentration of ethylene glycol in the ethylene glycol water bath solution is preferably 20 to 80%, preferably 40 to 605+6. In addition, to adjust the pH of this aqueous solution, hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, salts such as ITrig salt, phosphate, and Peronal salt, salt m, sulfuric acid, nitric acid, acetic acid, and citric acid are added to this aqueous solution. , acids such as oxalic acid, and amines such as ethanolamine.
７ンモニ７９尿素等を含ませることができる。7, 79, 79 urea, etc. can be included.
脱着処理は、氷点以上３７℃以下でおこなわれ、好まし
くは２〜１０℃がより有利に行われる。脱着処理はカラ
ム法、バッチ法等の方法によりおこない、溶出Ｋｉｔ’
する時間は短かい事が望ましいが、２日問程要してもよ
い。The desorption treatment is carried out at a temperature above the freezing point and below 37°C, preferably between 2 and 10°C. Desorption treatment is performed using methods such as column method and batch method.
It is desirable that the time required for this is short, but it may take up to two days.
ｋｍされたヒトα２−プラスミンインヒビターの分離回
収はそれ自体既知の方法１例えば透析＊’ａ１Ｍ液体ク
ロマトグラフィーなどにより行なうことができる。The separated and recovered human α2-plasmin inhibitor can be carried out by methods known per se, such as dialysis*'a1M liquid chromatography.
以上本発明によればヒトα２−プラスミンインヒビター
含有液体からヒトα２−プラスミンインヒビターを簡単
な手段で短時間に分離・回収することができる。As described above, according to the present invention, human α2-plasmin inhibitor can be separated and recovered from a human α2-plasmin inhibitor-containing liquid by simple means and in a short time.
以下実施例を掲げて本発明を詳述する。The present invention will be described in detail below with reference to Examples.
屹施例１
α、−プラスミンインヒビタ−に対するモノクローナル
抗体 をリガンドとして化学的に結合させた
吸着体（１，０１ｊ）をカラムに結め過当な緩衝液（０
，０１Ｍ ！Ｊン酸ナトリウム緩衝液＊ ０．１５ Ｍ
ＮａＣｌ ｐＨ７，２３で平衡化後、ヒト血漿２．０
１をａ着体をつめたカラムに添加した。吸着体に吸着さ
れずに溶出した画分を集め「素通り画分」とした。次に
上記緩衝液１０１１７を添加し、吸着体に非特異的に吸
着（結合）している物質を溶出し、築め、「洗浄画分」
とした。Example 1 An adsorbent (1,01j) chemically bound to a monoclonal antibody against α,-plasmin inhibitor as a ligand was attached to a column, and an excessive buffer solution (0
,01M! Sodium J phosphate buffer* 0.15 M
After equilibration with NaCl pH 7,23, human plasma 2.0
1 was added to a column packed with a-adherent. The fractions that eluted without being adsorbed to the adsorbent were collected and designated as the "pass-through fraction." Next, the above-mentioned buffer solution 10117 is added, and the substances that are non-specifically adsorbed (bound) to the adsorbent are eluted and collected, resulting in a "washed fraction".
And so.
最後に通用な溶出液を用いて吸着体に結合したヒトα２
−プラスミンインヒビターを溶出し、「溶出画分コとし
た。Finally, human α2 bound to the adsorbent using a common eluent.
- Plasmin inhibitor was eluted and used as an eluted fraction.
溶出液としては、仏）〜（ｅ） ３ ｍ如月いた。The eluate was 3 m Kisaragi (French) to (e).
（ａ） ５．Ｏｊ６＋Ｖ／ｖ工＋し７グ！Ｊ”−ル
ｐＨ１１，５（ｃ） ５０Ｘ＋Ｖ／Ｖｚ＋しｙグ’
） ＝ −ルーＰ Ｂ Ｓ ＋０．０５ Ｘ Ｔｗｅａ
ｎ ８０ ｐＨ７，４それぞれ溶出が終わるごとに、
カラム（吸着体）を再生、平衡化し、上記と同じ操作で
ヒトα２−プラスミンインヒビターを吸着体に結合させ
２次の溶出液で溶出し、これら３種類の溶出液を用いた
時の「溶出画分」中のα。(a) 5. Oj6 + V/v engineering + Shi7g! J"-le pH11,5 (c) 50X+V/Vz+shiygu'
) = -P B S +0.05 X Twea
n 80 pH 7, 4 After each elution,
Regenerate and equilibrate the column (adsorbent), bind human α2-plasmin inhibitor to the adsorbent using the same procedure as above, and elute with the secondary eluent. α in “minute”.
−プラスミンインヒビタ−の抗原量を＃嵩免疫定量法Ｃ
ＥＬＩＳＡ ）で、偽−プラスミンインヒビタ−の活性
は、合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイ
シル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトクアニリド・二塩酸塩）を
用いた残存プラスミン活性の測定により求め、結果をま
とめて表ＩＫ示す。尚、上記、酵素免疫定量法は、ヒト
α２−プラスミンインヒビターに対するモノクー−ナル
抗体を用いたサンドインチ法であり、本発明者らが先に
提案した（昭和５９年５月１日付出願、！！＃願昭５９
−８６１０１、発明の名称１ヒトα、−プラスミンイン
ヒビタ−に対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的
測定試薬及びキット”）。- Antigen amount of plasmin inhibitor #bulk immunoassay method C
ELISA), the activity of pseudo-plasmin inhibitor was determined by measuring residual plasmin activity using the synthetic substrate S-2251 (HD-valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitoquanilide dihydrochloride). , the results are summarized in Table IK. The above-mentioned enzyme immunoassay method is a sandwich method using a monoclonal antibody against human α2-plasmin inhibitor, and was previously proposed by the present inventors (filed on May 1, 1980)!! #Gansho59
-86101, title of the invention 1 "Immunological assay reagent and kit using monoclonal antibody against human α, -plasmin inhibitor").
表１に、この測定法を用いて求めた各画分中のα１−プ
ラスミンインヒビタ−抗原量を、表２には、合成基質を
用いて求めた活性を有する一−プラスミンインヒビター
量をまとめて示す。Table 1 summarizes the amount of α1-plasmin inhibitor antigen in each fraction determined using this measurement method, and Table 2 summarizes the amount of 1-plasmin inhibitor having activity determined using the synthetic substrate.
これらの結果から、（ａ）〜（ｃ）の溶出液を吸着体に
添加することによってヒトα２−プラスミンインヒビタ
ーを溶出、精製することができ、特に、溶出液として（
ｅ）を用いた時、ヒト血漿２、Ｏｍ 中の一−プラスミ
ンインヒビター１２６μＩのうち、 ２９．７％に轟た
る３７．４ ｓｌが溶出し活性を有するα、−ＰＩ量は
３７．２μＩで、溶出したα、−プラスミンインヒビタ
−は約１００９６活性を有していた。From these results, human α2-plasmin inhibitor can be eluted and purified by adding the eluates (a) to (c) to the adsorbent, and in particular, the eluate (
When using e), out of 126 μI of mono-plasmin inhibitor in human plasma 2,0m, 37.4 sl, which accounts for 29.7%, was eluted, and the amount of α,-PI having activity was 37.2 μI; The eluted α,-plasmin inhibitor had approximately 10096 activity.
表１ 各画分中に含まれる
α、−プラス雫ミンインヒビター抗原量表２ 各画分中
に含まれる活性を有する一−プラスミンインヒビター量
実施例２
精製
実施例１で記載した吸着体（２，０１１７’）を詰めた
カラムを使用し、ヒト血漿４．０ＩＩＪｆｔ添加し、同
様に洗浄後、溶出液（ｃ）、すなわち５゜Ｘ ｅ Ｖ／
Ｖ ｘ−＋ Ｌ／ ７ ｆ ！ｊ ：ｌ −ルー Ｐ
Ｂ Ｓ ｔＯ，０５Ｘ Ｔｗｅｅｎ ８０ ｐＨ７，４
を用いて、ヒト血漿中より偽−プラスミンインヒビタ−
画分を得た。この画分を濃縮後、高液液体クロマトグラ
フィー（東洋曹達■ＨＬＣ−８０３Ｄ）を用いてさらＫ
１１ｔｌ製を行なった。０．１ Ｍ ）リフルオロ酢酸
−５０％アセトニトリル溶媒系でｍ−プラスミンインヒ
ビターを分離９分取した。Table 1 Amount of α,-plasmin inhibitor antigen contained in each fraction Table 2 Amount of active 1-plasmin inhibitor contained in each fraction Example 2 Adsorbent (2, Using a column packed with 0117'), 4.0 IIJft of human plasma was added, and after washing in the same manner, the eluate (c), that is, 5°X e V/
Vx-+L/7f! j : l - Roux P
B S tO,05X Tween 80 pH7,4
pseudo-plasmin inhibitor was extracted from human plasma using
A fraction was obtained. After concentrating this fraction, it was further purified using high liquid chromatography (Toyo Soda HLC-803D).
11 tl production was carried out. Nine fractions of m-plasmin inhibitor were separated using a 0.1 M) refluoroacetic acid-50% acetonitrile solvent system.
濃縮し、溶媒を水で置換後凍結乾燥し、７０．４ＩｊＪ
Ｉのα！−プラスミンインヒビター精製標品を得た。こ
の標品の１０％ゲル濃度の５ＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動を行なった結果、その結果から分子量６７．０
００のα鵞−プラスミンインヒビターが精製できたこと
が確められた。Concentrate, replace the solvent with water and lyophilize to give 70.4IjJ
α of I! - A purified sample of plasmin inhibitor was obtained. As a result of 5DS-polyacrylamide electrophoresis at 10% gel concentration of this sample, the molecular weight was 67.0.
It was confirmed that 00 α-plasmin inhibitor could be purified.
Claims (1)
スミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して
結合し得るヒトα＿２−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体またはそのＦａｂ部分を少くとも
含有する該モノクローナル抗体の断片を不溶性固体担体
に固定化させたヒトα＿２−プラスミンインヒビターに
対する選択的吸着体。 ２、該不溶性固体担体がアガロース、ポリアクリルアミ
ド、セルロース、デキストラン、マレイン酸ポリマーお
よびこれらの混合物からなる群から選ばれたものである
第１項記載の選択的吸着体。 ３、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターにおけるプラ
スミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して
結合し得るヒトα＿２−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体またはそのＦａｂ部分を少くとも
含有する該モノクローナル抗体の断片を不溶性固体担体
に固定化させたヒトα＿２−プラスミンインヒビターに
対する選択的吸着体を、ヒトα＿２−プラスミンインヒ
ビターを含有する液体と接触させて、該担体にヒトα＿
２−プラスミンインヒビターを吸着させた後、該液体か
ら該担体を分離し、そして必要により、該担体からヒト
α＿２−プラスミンインヒビターを脱着させて該ヒトα
＿２−プラスミンインヒビターを回収することを特徴と
するヒトα＿２−プラスミンインヒビター含有液体から
の該ヒトα＿２−プラスミンインヒビターの分離回収法
。[Scope of Claims] 1. Contains at least a monoclonal antibody against human α_2-plasmin inhibitor or its Fab portion capable of specifically recognizing and binding to the site for blocking the fibrinolytic action of plasmin in human α_2-plasmin inhibitor. A selective adsorbent for human α_2-plasmin inhibitor comprising a fragment of the monoclonal antibody immobilized on an insoluble solid carrier. 2. The selective adsorbent according to item 1, wherein the insoluble solid support is selected from the group consisting of agarose, polyacrylamide, cellulose, dextran, maleic acid polymers, and mixtures thereof. 3. A monoclonal antibody against human α_2-plasmin inhibitor that can specifically recognize and bind to the site for inhibiting the fibrinolytic action of plasmin in human α_2-plasmin inhibitor, or a fragment of the monoclonal antibody containing at least its Fab portion. A selective adsorbent for human α_2-plasmin inhibitor immobilized on an insoluble solid carrier is brought into contact with a liquid containing human α_2-plasmin inhibitor, and the human α_2-plasmin inhibitor is immobilized on the carrier.
After adsorbing the 2-plasmin inhibitor, the carrier is separated from the liquid and, if necessary, the human α_2-plasmin inhibitor is desorbed from the carrier to release the human α_2-plasmin inhibitor.
A method for separating and recovering human α_2-plasmin inhibitor from a liquid containing human α_2-plasmin inhibitor, the method comprising recovering the human α_2-plasmin inhibitor.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60131991A JPH0643440B2 (en) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | Method for separating and recovering human α2-plasmin inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60131991A JPH0643440B2 (en) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | Method for separating and recovering human α2-plasmin inhibitor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61291527A true JPS61291527A (en) | 1986-12-22 |
| JPH0643440B2 JPH0643440B2 (en) | 1994-06-08 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP60131991A Expired - Fee Related JPH0643440B2 (en) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | Method for separating and recovering human α2-plasmin inhibitor |
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|---|---|
| JP (1) | JPH0643440B2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0455200A (en) * | 1990-06-21 | 1992-02-21 | Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd | Apparatus fixing device in spaceshuttle |
-
1985
- 1985-06-19 JP JP60131991A patent/JPH0643440B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0455200A (en) * | 1990-06-21 | 1992-02-21 | Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd | Apparatus fixing device in spaceshuttle |
Also Published As
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| JPH0643440B2 (en) | 1994-06-08 |
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