JPH0643440B2 - ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法 - Google Patents
ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法Info
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- JPH0643440B2 JPH0643440B2 JP60131991A JP13199185A JPH0643440B2 JP H0643440 B2 JPH0643440 B2 JP H0643440B2 JP 60131991 A JP60131991 A JP 60131991A JP 13199185 A JP13199185 A JP 13199185A JP H0643440 B2 JPH0643440 B2 JP H0643440B2
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- plasmin
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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Description
【発明の詳細な説明】 ａ．産業上の利用分野 本発明は、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対する
選択的吸着体およびその吸着体を用いるヒトα２−プラ
スミンインヒビター含有液体からのヒトα２−プラスミ
ンインヒビターの分離回収法に関するものである。
選択的吸着体およびその吸着体を用いるヒトα２−プラ
スミンインヒビター含有液体からのヒトα２−プラスミ
ンインヒビターの分離回収法に関するものである。
ヒトのα２−プラスミンインヒビターは青木と諸井によ
つて、最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラス
ミン（plasmin）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害す
る強力なプラスミンヒビターであり、11.7％の糖を含む
分子量約67,000の一本鎖の糖蛋白質であることが知られ
ている〔Moroi＆Aoki；The Journal of Biological Che
mistry，２５１，５９５６−５９６５（１９７６）参
照〕。
つて、最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラス
ミン（plasmin）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害す
る強力なプラスミンヒビターであり、11.7％の糖を含む
分子量約67,000の一本鎖の糖蛋白質であることが知られ
ている〔Moroi＆Aoki；The Journal of Biological Che
mistry，２５１，５９５６−５９６５（１９７６）参
照〕。
一方、ヒトα２−プラスミンインヒビターには、３種類
の活性部位があることが知られている。第１は、プラス
ミンの線維素溶解作用阻害部位（以下これを“リアクテ
イブサイト”ということがある。）〔B.Wiman & D.Coll
en；The Joural of Biological Chemistry，２５４，９
２９１−９２９７（１９７９）参照〕であり、第２はカ
ルボキシル基未満側のプラスミン結合部位〔B.Wiman &
D.Collen；European Journal of Bioehemistry，８４，
５７３−５７８（１９７８）参照〕であり、第３はアミ
ノ基末端のフイブリン結合部位である〔Y.Sakata，eta
l.Thrombosis Rescarch，１６，２７９−２８２（１９
７９）参照〕。
の活性部位があることが知られている。第１は、プラス
ミンの線維素溶解作用阻害部位（以下これを“リアクテ
イブサイト”ということがある。）〔B.Wiman & D.Coll
en；The Joural of Biological Chemistry，２５４，９
２９１−９２９７（１９７９）参照〕であり、第２はカ
ルボキシル基未満側のプラスミン結合部位〔B.Wiman &
D.Collen；European Journal of Bioehemistry，８４，
５７３−５７８（１９７８）参照〕であり、第３はアミ
ノ基末端のフイブリン結合部位である〔Y.Sakata，eta
l.Thrombosis Rescarch，１６，２７９−２８２（１９
７９）参照〕。
従来、ヒト血漿中からのα２−プラスミンインヒビター
の精製には、このインヒビターのプラスミノーゲンへの
親和性を利用したアフイニテイ−クロマトグラフイーが
用いられている〔Moroi & Aoki；The Journal of Biolo
gical Chemistry，２５１，５９５６−５９６５（１９
７６）参照〕。
の精製には、このインヒビターのプラスミノーゲンへの
親和性を利用したアフイニテイ−クロマトグラフイーが
用いられている〔Moroi & Aoki；The Journal of Biolo
gical Chemistry，２５１，５９５６−５９６５（１９
７６）参照〕。
しかし、この方法は、精製に要するステツプが多く、且
つ時間も長くかかるという欠点があつた。
つ時間も長くかかるという欠点があつた。
一方、α２−プラスミンインヒビターに対するモノクロ
ーナル抗体をリガンドとして不溶性担体（例えばセフア
ロース）に結合させた吸着体を用いれば、ヒトα２−α
２プラスミンインヒビター含有液体、例えばヒト血漿中
のα２−プラスミンインヒビターを容易に、短時間で分
離または精製することができると考えられる。
ーナル抗体をリガンドとして不溶性担体（例えばセフア
ロース）に結合させた吸着体を用いれば、ヒトα２−α
２プラスミンインヒビター含有液体、例えばヒト血漿中
のα２−プラスミンインヒビターを容易に、短時間で分
離または精製することができると考えられる。
ｂ．発明の構成 そこで、本発明者らは、ヒトα２−プラスミンインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体について研究を重ねた
ところ、ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線維素溶解作用阻止部位（第１の活性部位）
を特異的に認識し、しかして第２及び第３の活性部位を
即ちプラスミン結合部位及びフィブリン結合部位を認識
せず、ヒトα２−プラスミンインヒビターの線維素溶解
阻止作用を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を
見出し、またこのモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を創作し得、既に提案した。
ターに対するモノクローナル抗体について研究を重ねた
ところ、ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線維素溶解作用阻止部位（第１の活性部位）
を特異的に認識し、しかして第２及び第３の活性部位を
即ちプラスミン結合部位及びフィブリン結合部位を認識
せず、ヒトα２−プラスミンインヒビターの線維素溶解
阻止作用を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を
見出し、またこのモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を創作し得、既に提案した。
本発明者らは、かくして得られたモノクローナル抗体の
特異的な作用の利用について更に研究を進めた結果、ヒ
トα２−プラスミンインヒビターを特異的に吸着し得る
吸着体およびそれを用いると、ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビター含有液体からヒトα２−プラスミンインヒビ
ターを選択的に分離・回収することができることを見出
し本発明に到達した。
特異的な作用の利用について更に研究を進めた結果、ヒ
トα２−プラスミンインヒビターを特異的に吸着し得る
吸着体およびそれを用いると、ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビター含有液体からヒトα２−プラスミンインヒビ
ターを選択的に分離・回収することができることを見出
し本発明に到達した。
すなわち、本発明はヒトα２−プラスミンインヒビター
におけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異
的に認識して結合し得、且つプラスミン結合部位及びフ
ィブリン結合部位に結合しないヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体またはそのFab
部分を少くとも含有する該モノクローナル抗体の断片を
不溶性固体担体に固定化させたヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターに対する選択的吸着体を、ヒトα２−プラス
ミンインヒビターを含有する液体と接触させて、該担体
にヒトα２−プラスミンインヒビターを吸着させた後、
該液体から該担体を分離し、そして必要により該担体か
らヒトα２−プラスミンインヒビターを脱着させて該ヒ
トα２−プラスミンインヒビターを回収することを特徴
とするヒトα２−プラスミンインヒビター含有液体から
の該ヒトα２−プラスミンインヒビターの分離回収方法
である。
におけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異
的に認識して結合し得、且つプラスミン結合部位及びフ
ィブリン結合部位に結合しないヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体またはそのFab
部分を少くとも含有する該モノクローナル抗体の断片を
不溶性固体担体に固定化させたヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターに対する選択的吸着体を、ヒトα２−プラス
ミンインヒビターを含有する液体と接触させて、該担体
にヒトα２−プラスミンインヒビターを吸着させた後、
該液体から該担体を分離し、そして必要により該担体か
らヒトα２−プラスミンインヒビターを脱着させて該ヒ
トα２−プラスミンインヒビターを回収することを特徴
とするヒトα２−プラスミンインヒビター含有液体から
の該ヒトα２−プラスミンインヒビターの分離回収方法
である。
一般に、吸着体の生物学的親和力を生体物質の分離・精
製に利用するクロマトグラフイーは、アフイニテイ−ク
ロマトグラフイーと呼ばれている〔例えば、千畑一郎，
土佐哲也，松尾雄志著「実験と応用アフイニテイークロ
マトグラフイー」購談社サイエンテイフイツク参照〕。
製に利用するクロマトグラフイーは、アフイニテイ−ク
ロマトグラフイーと呼ばれている〔例えば、千畑一郎，
土佐哲也，松尾雄志著「実験と応用アフイニテイークロ
マトグラフイー」購談社サイエンテイフイツク参照〕。
本発明におけるアフイニテイ−，リガンド，不溶性担
体，吸着体なる語は、それぞれ下記に意味に解するもの
とする。
体，吸着体なる語は、それぞれ下記に意味に解するもの
とする。
アフイニテイー； ２種物質間に存在する特異的親和力リガンド； 吸着あるいは精製を目的とする物質とアフイニテイーを
有する物質 不溶性固体担体； 水に不溶性の支持体（これにはリガンドは含まれない） 吸着体； リガンドを不溶性固体担体に固定化したもの 次に本発明に用いるヒトα２−プラスミンインヒビター
に対する選択的吸着体およびそれを用いたヒトα２−プ
ラスミンインヒビター含有液体よりヒトα２−プラスミ
ンインヒビターを分離回収する方法について詳細に説明
する。
有する物質 不溶性固体担体； 水に不溶性の支持体（これにはリガンドは含まれない） 吸着体； リガンドを不溶性固体担体に固定化したもの 次に本発明に用いるヒトα２−プラスミンインヒビター
に対する選択的吸着体およびそれを用いたヒトα２−プ
ラスミンインヒビター含有液体よりヒトα２−プラスミ
ンインヒビターを分離回収する方法について詳細に説明
する。
ヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体またはそのFab部分を少くとも含有する断片を
適当な不溶性担体（例えばセフアロース）に化学的にリ
ガンドとして結合させ、これをカラムに詰め適当な緩衝
溶液（例えば５０ｍＭトリス緩衝液pH7.4，0.15ＭNaC
l）によつて平衝化する。この吸着体に検体試料（例え
ばヒト血漿）を添加して検体試料中のヒトα２−プラス
ミンインヒビターを吸着させる。次に適当な洗浄溶液
（例えば、５０ｍＭトリス緩衝液，pH7.4，0.15ＭNaC
l）によつて、不純物を吸着体から除去する。最後に吸
着体に存在するα２−プラスミンインヒビターを適当な
溶液（例えば５０％エチレングリコールpH11.5）で吸着
体から溶出させる。溶出面分中のα２−プラスミンイン
ヒビターの抗原量及び活性を測定すれば溶出したα２−
プラスミンインヒビターの割合を算出することができ
る。
ナル抗体またはそのFab部分を少くとも含有する断片を
適当な不溶性担体（例えばセフアロース）に化学的にリ
ガンドとして結合させ、これをカラムに詰め適当な緩衝
溶液（例えば５０ｍＭトリス緩衝液pH7.4，0.15ＭNaC
l）によつて平衝化する。この吸着体に検体試料（例え
ばヒト血漿）を添加して検体試料中のヒトα２−プラス
ミンインヒビターを吸着させる。次に適当な洗浄溶液
（例えば、５０ｍＭトリス緩衝液，pH7.4，0.15ＭNaC
l）によつて、不純物を吸着体から除去する。最後に吸
着体に存在するα２−プラスミンインヒビターを適当な
溶液（例えば５０％エチレングリコールpH11.5）で吸着
体から溶出させる。溶出面分中のα２−プラスミンイン
ヒビターの抗原量及び活性を測定すれば溶出したα２−
プラスミンインヒビターの割合を算出することができ
る。
本発明に用いる選択的吸着体に用いられる不溶性固体担
体としては、種々のものが使用できるが、例えば材質と
してアガロース，ポリアクリルアミド，セルロース，デ
キストラン，またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの
混合物が好ましく用いられる。これら不溶性固体担体の
形状としては、粉末状，粒状，ペレツト状，ビーズ状，
フイルム状，繊維状など種々の形態があることができ
る。
体としては、種々のものが使用できるが、例えば材質と
してアガロース，ポリアクリルアミド，セルロース，デ
キストラン，またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの
混合物が好ましく用いられる。これら不溶性固体担体の
形状としては、粉末状，粒状，ペレツト状，ビーズ状，
フイルム状，繊維状など種々の形態があることができ
る。
本発明に用いる吸着体に使用されるヒトα２−プラスミ
ンインヒビターに対するモノクローナル抗体は、本発明
者らによつて見出され、先に特許出願された（昭和５９
年４月１７日付出願昭５９−７５７７８号；発明の名称
“モノクロ−ナル抗体の製造方法”）。
ンインヒビターに対するモノクローナル抗体は、本発明
者らによつて見出され、先に特許出願された（昭和５９
年４月１７日付出願昭５９−７５７７８号；発明の名称
“モノクロ−ナル抗体の製造方法”）。
本発明の前記モノクロナーナル抗体及びその製造方法に
ついては前記特許出願明細書に詳細に説明されている
が、以下にその内容を簡単に説明する。
ついては前記特許出願明細書に詳細に説明されている
が、以下にその内容を簡単に説明する。
《モノクローナル抗体及びその製造方法》 Ａ．抗原の単離，精製； 抗原に用いるヒトα２−プラスミンインヒビターは、前
記青木と諸井の方法によりヒト血漿中より単離精製され
た。
記青木と諸井の方法によりヒト血漿中より単離精製され
た。
Ｂ．ヒトα２−プラスミンインヒビターによるマウスの
免疫； 雄Ba1b/cマウスを用いるが、他の系（strains）のマウ
スを使用することもできる。その際、免疫計画及びヒト
α２−プラスミンインヒビターの濃度は十分な量の抗原
刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきで
ある。例えばマウスに少量のヒトα２−プラスミンイン
ヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さらに数回
静脈に投与した。最後免疫の数日後に融合の為に脾臓細
胞を取り出す。
免疫； 雄Ba1b/cマウスを用いるが、他の系（strains）のマウ
スを使用することもできる。その際、免疫計画及びヒト
α２−プラスミンインヒビターの濃度は十分な量の抗原
刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきで
ある。例えばマウスに少量のヒトα２−プラスミンイン
ヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さらに数回
静脈に投与した。最後免疫の数日後に融合の為に脾臓細
胞を取り出す。
Ｃ．細胞融合 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸濁液を調製
する。それらの脾臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。脾臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい比率は約２０：１
〜約２：１の範囲である。約１０３個の脾臓細胞につい
て0.5〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。
する。それらの脾臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。脾臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい比率は約２０：１
〜約２：１の範囲である。約１０３個の脾臓細胞につい
て0.5〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。
細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られているが、本
発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ag8−U1細胞（以下Ｐ３−Ｕ
１と略記する）〔Yelton,D.E et al.,Current Topics i
n Microbiology and Immunology８１，１（１９７９）
参照〕を用いた。これは８−アザグアニン耐性の細胞ラ
インであり、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフエラーゼ（hypoxanthine-guanine-phosp
horibosyl transferase）が欠失しており、それゆえに
ＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン）
培地中では生存しない。また、この細胞ラインはそれ自
体抗体を分泌しない、いわゆる非分泌型である。
発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ag8−U1細胞（以下Ｐ３−Ｕ
１と略記する）〔Yelton,D.E et al.,Current Topics i
n Microbiology and Immunology８１，１（１９７９）
参照〕を用いた。これは８−アザグアニン耐性の細胞ラ
インであり、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフエラーゼ（hypoxanthine-guanine-phosp
horibosyl transferase）が欠失しており、それゆえに
ＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン）
培地中では生存しない。また、この細胞ラインはそれ自
体抗体を分泌しない、いわゆる非分泌型である。
好ましい融合促進剤としては、例えば平均分子量が１０
００〜４０００のポリエチレングリコールを有利に使用
できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を使
用することもできる。
００〜４０００のポリエチレングリコールを有利に使用
できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を使
用することもできる。
Ｄ．融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の脾臓細胞，未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地
で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間
（約１時間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しな
いもの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用される。この選
択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。また未融
合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間後（約
１週間後）死滅する。これらに対して融合した細胞は骨
髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ持つ
ために選択培地中で生存できる。
合の脾臓細胞，未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地
で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間
（約１時間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しな
いもの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用される。この選
択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。また未融
合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間後（約
１週間後）死滅する。これらに対して融合した細胞は骨
髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ持つ
ために選択培地中で生存できる。
Ｅ．各容器中のα２−プラスミンインヒビターに対する
抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対
する抗体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immu
no Sorbent Assay）によりスクリーニングする。
抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対
する抗体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immu
no Sorbent Assay）によりスクリーニングする。
Ｆ．目的の抗体を産出するハイブリドーマ細胞のクロー
ン化； 目的の抗体を産出するハイプリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なつた方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とによりその培養上清から、そのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子又は半
同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、そ
のハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を
得ることができる。
ン化； 目的の抗体を産出するハイプリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なつた方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とによりその培養上清から、そのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子又は半
同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、そ
のハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を
得ることができる。
本発明においては、上記の如くして得たモノクローナル
抗体自体を使用することもでき、またそのFab部分を少
くとも含有する該モノクローナル抗体の断片も同様に使
用することができる。
抗体自体を使用することもでき、またそのFab部分を少
くとも含有する該モノクローナル抗体の断片も同様に使
用することができる。
かゝる断片としては、上記モノクローナル抗体を蛋白分
解酵素であるパパインを用いて切断したFab部分を少く
とも含むものであればよく、その他へプシン，トリプシ
ンまたはプラスミンなどの酵素で分解した後に得られる
Fab部分を少くとも含する断片であつても差支えがな
い。抗体をパパインを用いて分解しFab部分を得ること
に関してはそれ自体ポーターらによつて既に知られてい
る方法である〔R.R.Porter,Biochemical Journal７３，
１１９〜１２６（１９５９）参照〕。
解酵素であるパパインを用いて切断したFab部分を少く
とも含むものであればよく、その他へプシン，トリプシ
ンまたはプラスミンなどの酵素で分解した後に得られる
Fab部分を少くとも含する断片であつても差支えがな
い。抗体をパパインを用いて分解しFab部分を得ること
に関してはそれ自体ポーターらによつて既に知られてい
る方法である〔R.R.Porter,Biochemical Journal７３，
１１９〜１２６（１９５９）参照〕。
これらの不溶性固体担体へのモノクローナル抗体又はそ
の断片の固定化は、一般に該モノクローナル抗体又は断
片を該不溶性固体担体に化学的に結合することにより行
なわれる。例えば、上記の如く、ヒトα２−プラスミン
インヒビター含有液体との接触によりヒトα２−プラス
ミンインヒビターを吸着した吸着体は、該液体から分離
すれば、該液体中のヒトα２−プラスミンインヒビター
は除去される。これにより、該液体としてヒト血漿又は
ヒト血清を用いた場合には、ヒトα２−プラスミンイン
ヒビターを実質的に含まないヒト血漿又はヒト血清が得
られ、このようなヒトα２−プラスミンインヒビターを
含まないヒト血漿又はヒト血清は、例えば血漿交換又は
血清交換療法に有利に用いることができる。
の断片の固定化は、一般に該モノクローナル抗体又は断
片を該不溶性固体担体に化学的に結合することにより行
なわれる。例えば、上記の如く、ヒトα２−プラスミン
インヒビター含有液体との接触によりヒトα２−プラス
ミンインヒビターを吸着した吸着体は、該液体から分離
すれば、該液体中のヒトα２−プラスミンインヒビター
は除去される。これにより、該液体としてヒト血漿又は
ヒト血清を用いた場合には、ヒトα２−プラスミンイン
ヒビターを実質的に含まないヒト血漿又はヒト血清が得
られ、このようなヒトα２−プラスミンインヒビターを
含まないヒト血漿又はヒト血清は、例えば血漿交換又は
血清交換療法に有利に用いることができる。
一方、該液体から分離したヒトα２−プラスミンインヒ
ビターを吸着した吸着体は、脱着処理に付すことによ
り、吸着体からヒトα２−プラスミンインヒビターを溶
離させて、ヒトα２−プラスミンインヒビターを回収す
ることができる。回収されたヒトα２−プラスミンイン
ヒビターは、例えば先天性α２−プラスミンインヒビタ
ー欠損症，肝疾患等に於ける補充剤、或いは止血剤等と
して使用することができる。
ビターを吸着した吸着体は、脱着処理に付すことによ
り、吸着体からヒトα２−プラスミンインヒビターを溶
離させて、ヒトα２−プラスミンインヒビターを回収す
ることができる。回収されたヒトα２−プラスミンイン
ヒビターは、例えば先天性α２−プラスミンインヒビタ
ー欠損症，肝疾患等に於ける補充剤、或いは止血剤等と
して使用することができる。
上記の脱着処理は、ヒトα２−プラスミンインヒビター
を吸着した吸着体を溶離液で処理することにより行なう
ことができる。用いうる溶離液としては、pHが2.5〜12.
5、好ましくは5.0〜11.5のエチレングリコール水溶液が
有利に用いられるが、この他に、グリコール水溶液，グ
リシン水溶液，プロピオン酸水溶液，チオシアン酸塩溶
液，グアニジン水溶液等を使用することもできる。
を吸着した吸着体を溶離液で処理することにより行なう
ことができる。用いうる溶離液としては、pHが2.5〜12.
5、好ましくは5.0〜11.5のエチレングリコール水溶液が
有利に用いられるが、この他に、グリコール水溶液，グ
リシン水溶液，プロピオン酸水溶液，チオシアン酸塩溶
液，グアニジン水溶液等を使用することもできる。
上記エチレングリコール水溶液中のエチレングリコール
の濃度は２０〜８０％、好ましくは４０〜６０％が有利
に用いられる。またこの水溶液にはpHの調整のために適
宜、水酸化ナトリウム，水酸化カリウム等の水酸塩，Tr
is塩，リン酸塩，ベロナール塩等の塩類、塩酸，硫酸，
硝酸，酢酸，クエン酸，シユウ酸等の酸類、エタノール
アミン等のアミン類、アンモニア，尿素等を含ませるこ
とができる。脱着処理は、氷点以上３７℃以下でおこな
われ、好ましくは２〜１０℃がより有利に行われる。脱
着処理はカラム法，バツチ法等の方法によりおこない、
溶出に要する時間は短かい事が望ましいが、２日間程要
してもよい。
の濃度は２０〜８０％、好ましくは４０〜６０％が有利
に用いられる。またこの水溶液にはpHの調整のために適
宜、水酸化ナトリウム，水酸化カリウム等の水酸塩，Tr
is塩，リン酸塩，ベロナール塩等の塩類、塩酸，硫酸，
硝酸，酢酸，クエン酸，シユウ酸等の酸類、エタノール
アミン等のアミン類、アンモニア，尿素等を含ませるこ
とができる。脱着処理は、氷点以上３７℃以下でおこな
われ、好ましくは２〜１０℃がより有利に行われる。脱
着処理はカラム法，バツチ法等の方法によりおこない、
溶出に要する時間は短かい事が望ましいが、２日間程要
してもよい。
脱着されたヒトα２−プラスミンインヒビターの分離回
収はそれ自体既知の方法、例えば透析，濃縮液体クロマ
トグラフイーなどにより行なうことができる。
収はそれ自体既知の方法、例えば透析，濃縮液体クロマ
トグラフイーなどにより行なうことができる。
以上本発明によればヒトα２−プラスミンインヒビター
含有液体からヒトα２−プラスミンインヒビターを簡単
な手段で短時間に分離・回収することができる。
含有液体からヒトα２−プラスミンインヒビターを簡単
な手段で短時間に分離・回収することができる。
以下実施例を掲げて本発明を詳述する。
実施例１ α２−プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体を
用いたヒト血漿中からのα２−プラスミンインヒビター
の分離及び溶出 α２−プラスミンインヒビターに対するモノクローナル
抗体をリガンドとして化学的に結合させた吸着体（1.0m
l）をカラムに詰め適当な緩衝液（0.01Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液，0.15ＭNaCl pH7.2）で平衡化後、ヒト血漿
2.0mlを吸着体をつめたカラムに添加した。吸着体に吸
着されずに溶出した画分を集め「素通り画分」とした。
次に上記緩衝液１０mlを添加し、吸着体に非特異的に吸
着（結合）している物質を溶出し、集め、「洗浄画分」
とした。
用いたヒト血漿中からのα２−プラスミンインヒビター
の分離及び溶出 α２−プラスミンインヒビターに対するモノクローナル
抗体をリガンドとして化学的に結合させた吸着体（1.0m
l）をカラムに詰め適当な緩衝液（0.01Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液，0.15ＭNaCl pH7.2）で平衡化後、ヒト血漿
2.0mlを吸着体をつめたカラムに添加した。吸着体に吸
着されずに溶出した画分を集め「素通り画分」とした。
次に上記緩衝液１０mlを添加し、吸着体に非特異的に吸
着（結合）している物質を溶出し、集め、「洗浄画分」
とした。
最後に適用な溶出液を用いて吸着体に結合したヒトα２
−プラスミンインヒビターを溶出し、「溶出画分」とし
た。
−プラスミンインヒビターを溶出し、「溶出画分」とし
た。
溶出後としては、(a)〜(c)３種類用いた。
(a)５０％，Ｖ／ＶエチレングリコールpH11.5 (b)５０％，Ｖ／Ｖエチレングリコール−ＰＢＳpH7.4 (c)５０％，Ｖ／Ｖエチレングリコール−ＰＢＳ，0.05
％Tween８０pH7.4 それぞれ溶出が終わるごとに、カラム（吸着体）を再
生，平衡化し、上記と同じ操作でヒトα２−プラスミン
インヒビターを吸着体に結合させ、次の溶出液で溶出
し、これら３種類の溶出液を用いた時の〔溶出画分」中
のα２−プラスミンインヒビターの抗原量を酵素免疫定
量法（ＥＬＩＳＡ）で、α２−プラスミンインヒビター
の活性は、合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ
−ロイシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸
塩）を用いた残存プラスミン活性の測定により求め、結
果をまとめて表１に示す。尚、上記、酵素免疫定量法
は、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモノク
ローナル抗体を用いたサンドイツチ法であり、本発明者
らが先に提案した（昭和５９年５月１日付出願、特願昭
５９−86101号：発明の名称“ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクロマーナル抗体を用いた免疫
学的測定試薬及びキツト”）。
％Tween８０pH7.4 それぞれ溶出が終わるごとに、カラム（吸着体）を再
生，平衡化し、上記と同じ操作でヒトα２−プラスミン
インヒビターを吸着体に結合させ、次の溶出液で溶出
し、これら３種類の溶出液を用いた時の〔溶出画分」中
のα２−プラスミンインヒビターの抗原量を酵素免疫定
量法（ＥＬＩＳＡ）で、α２−プラスミンインヒビター
の活性は、合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ
−ロイシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸
塩）を用いた残存プラスミン活性の測定により求め、結
果をまとめて表１に示す。尚、上記、酵素免疫定量法
は、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモノク
ローナル抗体を用いたサンドイツチ法であり、本発明者
らが先に提案した（昭和５９年５月１日付出願、特願昭
５９−86101号：発明の名称“ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクロマーナル抗体を用いた免疫
学的測定試薬及びキツト”）。
表１に、この測定法を用いて求めた各画分中のα２−プ
ラスミンインヒビター抗原量を、表２には、合成基質を
用いて求めた活性を有するα２−プラスミンインヒビタ
ー量をまとめて示す。
ラスミンインヒビター抗原量を、表２には、合成基質を
用いて求めた活性を有するα２−プラスミンインヒビタ
ー量をまとめて示す。
これらの結果から、(a)〜(c)の溶出液を吸着体に添加す
ることによつてヒトα２−プラスミンインヒビターを溶
出，精製することができ、特に、溶出液として(c)を用
いた時、ヒト血漿2.0ml中のα２−プラスミンインヒビ
ター126μｇのうち、29.7％に当たる37.4μｇが溶出し
活性を有するα２−ＰＩ量は37.2μｇで、溶出したα２
−プラスミンインヒビターは約１００％活性を有してい
た。
ることによつてヒトα２−プラスミンインヒビターを溶
出，精製することができ、特に、溶出液として(c)を用
いた時、ヒト血漿2.0ml中のα２−プラスミンインヒビ
ター126μｇのうち、29.7％に当たる37.4μｇが溶出し
活性を有するα２−ＰＩ量は37.2μｇで、溶出したα２
−プラスミンインヒビターは約１００％活性を有してい
た。
実施例２ ヒト血漿中のα２−プラスミンインヒビターの精製 実施例１で記載した吸着体（2.0ml）を詰めたカラムを
使用し、ヒト血漿4.0mlを添加し、同様に洗浄後、溶出
後(c)、すなわち５０％，Ｖ／Ｖエチレングリコール−
ＰＢＳ，0.05％Tween８０pH7.4を用いて、ヒト血漿中よ
りα２−プラスミンインヒビター画分を得た。この画分
を濃縮後、高液液体クロマトグラフイー（東洋遭達
（株）ＨＬＣ−８０３Ｄ）を用いてさらに精製を行なつ
た。0.1Ｍトリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶
媒系でα２−プラスミンインヒビターを分離，分取し
た。濃縮し、溶媒を水で置換後凍結乾燥し、70.4μｇの
α２−プラスミンインヒビター精製標品を得た。この標
品の１０％ゲル濃度のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動を行なつた結果、その結果から分子量67,000のα２
−プラスミンインヒビターが精製できたことが確められ
た。
使用し、ヒト血漿4.0mlを添加し、同様に洗浄後、溶出
後(c)、すなわち５０％，Ｖ／Ｖエチレングリコール−
ＰＢＳ，0.05％Tween８０pH7.4を用いて、ヒト血漿中よ
りα２−プラスミンインヒビター画分を得た。この画分
を濃縮後、高液液体クロマトグラフイー（東洋遭達
（株）ＨＬＣ−８０３Ｄ）を用いてさらに精製を行なつ
た。0.1Ｍトリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶
媒系でα２−プラスミンインヒビターを分離，分取し
た。濃縮し、溶媒を水で置換後凍結乾燥し、70.4μｇの
α２−プラスミンインヒビター精製標品を得た。この標
品の１０％ゲル濃度のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動を行なつた結果、その結果から分子量67,000のα２
−プラスミンインヒビターが精製できたことが確められ
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＡ 8314−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 青木 延雄 東京都文京区本郷４−20―２―304
Claims (1)
- 【請求項１】ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけ
るプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認
識し、かつプラスミン結合部位及びフィブリン結合部位
のいずれをも認識しない、ヒトα２−プラスミンインヒ
ビターに対するモノクローナル抗体またはそのＦａｂ部
分を少くとも含有する該モノクローナル抗体の断片を不
溶性固体担体に固定化させたヒトα２−プラスミンイン
ヒビターに対する選択的吸着体を、ヒトα２−プラスミ
ンインヒビターを含有する液体と接触させて、該担体に
ヒトα２−プラスミンインヒビターを吸着させた後、該
液体から該担体を分離し、そして必要により、該担体か
らヒトα２−プラスミンインヒビターを脱着させて該ヒ
トα２−プラスミンインヒビターを回収することを特徴
とするヒトα２−プラスミンインヒビター含有液体から
の該ヒトα２−プラスミンインヒビターの分離回収法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60131991A JPH0643440B2 (ja) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60131991A JPH0643440B2 (ja) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61291527A JPS61291527A (ja) | 1986-12-22 |
| JPH0643440B2 true JPH0643440B2 (ja) | 1994-06-08 |
Family
ID=15070997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60131991A Expired - Fee Related JPH0643440B2 (ja) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | ヒトα２―プラスミンインヒビターの分離回収法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0643440B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0455200A (ja) * | 1990-06-21 | 1992-02-21 | Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd | 宇宙機における機器固定装置 |
-
1985
- 1985-06-19 JP JP60131991A patent/JPH0643440B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0455200A (ja) * | 1990-06-21 | 1992-02-21 | Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd | 宇宙機における機器固定装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61291527A (ja) | 1986-12-22 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |