JPS61260900A - γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法 - Google Patents
γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は、基質としてγ−L−グルタミルーp−二トロ
アニリドを用いる、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性の測定方法に関する。
アニリドを用いる、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性の測定方法に関する。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(以下、γ−GT
Pと略称する。)の酵素活性の測定は、臨床的には肝胆
道疾患の診断、アルコール飲用者のスクリーニングなど
に広く利用され、種々の方法が発表されているが、γ−
L−グルタミルーp−ニトロアニリドを基質とする反応
速度測定法が最も一般的であり、現在も盛んに行なわれ
ている。
Pと略称する。)の酵素活性の測定は、臨床的には肝胆
道疾患の診断、アルコール飲用者のスクリーニングなど
に広く利用され、種々の方法が発表されているが、γ−
L−グルタミルーp−ニトロアニリドを基質とする反応
速度測定法が最も一般的であり、現在も盛んに行なわれ
ている。
しかしながら、基質のγ−L−グルタミルーP−ニトロ
アニリド(以下、本基質という、)は、基質安定化及び
酵素反応の至適PHである中性付近(pH=約8.3)
に於て極めて溶解性が悪く、そのため溶解度が比較的高
い低p)!域で予め基質を充分に溶解しておき、使用時
、中性付近(pH=約8.5)の緩衝液と混合して使用
する酸溶解法が一般的な使用方法である。
アニリド(以下、本基質という、)は、基質安定化及び
酵素反応の至適PHである中性付近(pH=約8.3)
に於て極めて溶解性が悪く、そのため溶解度が比較的高
い低p)!域で予め基質を充分に溶解しておき、使用時
、中性付近(pH=約8.5)の緩衝液と混合して使用
する酸溶解法が一般的な使用方法である。
このため、本基質は、溶解した強酸により加水分解をう
けて、ブランク値が徐々に上昇し、その製剤の有効期間
は調液後約5時間程度である。
けて、ブランク値が徐々に上昇し、その製剤の有効期間
は調液後約5時間程度である。
そこで、本基質の溶解性の改善が種々試みられており、
次の(1)〜(3)の方法が夫々提案され、実用化され
ている。
次の(1)〜(3)の方法が夫々提案され、実用化され
ている。
(1) カチオン系界面活性剤又はアニオン系界面活
性剤を添加して基質の水に対する溶解性を改善し、これ
らイオン系界面活性剤の酵素反応阻害作用をノニオン系
界面活性剤で緩和する方法。
性剤を添加して基質の水に対する溶解性を改善し、これ
らイオン系界面活性剤の酵素反応阻害作用をノニオン系
界面活性剤で緩和する方法。
(2)本基質の−NO2基のオルト位に−CO2H基。
−503H基などの水溶性基を付与し、基質の水に対す
る溶解性を改善する方法。
る溶解性を改善する方法。
(3) シクロデキストリンの包接力を利用して基質
の水に対する溶解性を改善する方法。
の水に対する溶解性を改善する方法。
しかしながら、これら従来の方法にも種々の欠点が存在
する。
する。
例えば、(1)の界面活性剤を用いる方法では、イオン
系界面活性剤の酵素阻害力が非常に強く、ノニオン系界
面活性剤を添加しても、その回復率は約70〜80%で
ある上、界面活性剤の添加によりヘモグロビンの吸収が
経時的に変化し、p−ニトロアニリンの生成速度を追跡
する410n腸でのヘモグロビンの吸収が経時的に減少
するため、結果的に、γ−GTPの酵素活性測定値に負
誤差を与える。また、(2)の水溶性基を付与する方法
では、γ−GTPの酵素活性測定値が高く測定されるこ
と及び基質剤調液後数日で基質が変質し、γ−GTPの
酵素活性測定値の低下が観測され、場合によっては変質
による沈澱が析出する等の問題を生じる。更にまた、(
3)のシクロデキストリンの包接力を利用する方法では
、ヘモグロビンの影響やγ−GTPの酵素活性測定値の
変動の問題はないが、肝心の水に対する溶解性の改善が
充分ではなく、特に、シクロデキストリンの基質包接化
合物を凍結乾燥する場合は、最終使用液濃度の製剤乃至
はその二倍程度の濃縮液の製剤の調製が限界である。即
ち、これら(1)〜(3)のいずれの方法も、到底、充
分に改善された満足すべき測定方法であるとはいえない
現状にある。
系界面活性剤の酵素阻害力が非常に強く、ノニオン系界
面活性剤を添加しても、その回復率は約70〜80%で
ある上、界面活性剤の添加によりヘモグロビンの吸収が
経時的に変化し、p−ニトロアニリンの生成速度を追跡
する410n腸でのヘモグロビンの吸収が経時的に減少
するため、結果的に、γ−GTPの酵素活性測定値に負
誤差を与える。また、(2)の水溶性基を付与する方法
では、γ−GTPの酵素活性測定値が高く測定されるこ
と及び基質剤調液後数日で基質が変質し、γ−GTPの
酵素活性測定値の低下が観測され、場合によっては変質
による沈澱が析出する等の問題を生じる。更にまた、(
3)のシクロデキストリンの包接力を利用する方法では
、ヘモグロビンの影響やγ−GTPの酵素活性測定値の
変動の問題はないが、肝心の水に対する溶解性の改善が
充分ではなく、特に、シクロデキストリンの基質包接化
合物を凍結乾燥する場合は、最終使用液濃度の製剤乃至
はその二倍程度の濃縮液の製剤の調製が限界である。即
ち、これら(1)〜(3)のいずれの方法も、到底、充
分に改善された満足すべき測定方法であるとはいえない
現状にある。
ところで、シクロデキストリン(以下、CDと略称する
。)は、D−グルコビラノースがα−1゜4−グルコシ
ド結合により環状に結合した環状オリゴ糖同族体であり
、結合したD−グルコビラノースが、6.7及び8個の
、α−CD、β−CD及びγ−CD、の三種のものがよ
く知られている。
。)は、D−グルコビラノースがα−1゜4−グルコシ
ド結合により環状に結合した環状オリゴ糖同族体であり
、結合したD−グルコビラノースが、6.7及び8個の
、α−CD、β−CD及びγ−CD、の三種のものがよ
く知られている。
これら、一連のCDは、水溶液中で有機化合物と混合す
ると速やかに包接体を形成し、製剤の安定化、溶解性の
調節、液状薬品の粉末化、刺激性や悪臭などのマスク、
或いは揮発性の調節等に優れた効果を有する為に、これ
らの用途に広く利用されている。そうして、その構造は
、CD空洞の一端の開口部にグルコビラノースの2−及
び3−位の−OHを有し、他端の開口部に6−位の−O
Hを有する、疎水性CD空洞を有する環状構造であるこ
とが、そのX線解析の結果などから推定されている。
ると速やかに包接体を形成し、製剤の安定化、溶解性の
調節、液状薬品の粉末化、刺激性や悪臭などのマスク、
或いは揮発性の調節等に優れた効果を有する為に、これ
らの用途に広く利用されている。そうして、その構造は
、CD空洞の一端の開口部にグルコビラノースの2−及
び3−位の−OHを有し、他端の開口部に6−位の−O
Hを有する、疎水性CD空洞を有する環状構造であるこ
とが、そのX線解析の結果などから推定されている。
このCDは、でん粉或いはでん粉の加水分解物にB M
A (Bacillus macerans am7
1age )を作用させると、α−1β−1γ−の混合
物として得られるが、近年は、β−CDのみを高収率で
与えるCD生成酵素がBacilluSmegatar
iumやBacillus属の好アルカリ性菌のある種
のものから見出され、β−CDが安価に製造されるよう
になってきている。その為、研究対象としては溶解性が
高いα−CDを扱ったものが多いが、実用的には、製造
、分離精製の容易なβ−CDが一般に用いられるように
なっている。
A (Bacillus macerans am7
1age )を作用させると、α−1β−1γ−の混合
物として得られるが、近年は、β−CDのみを高収率で
与えるCD生成酵素がBacilluSmegatar
iumやBacillus属の好アルカリ性菌のある種
のものから見出され、β−CDが安価に製造されるよう
になってきている。その為、研究対象としては溶解性が
高いα−CDを扱ったものが多いが、実用的には、製造
、分離精製の容易なβ−CDが一般に用いられるように
なっている。
β−CDの水に対する溶解度は、α−CD、γ−CDの
溶解度に比べて著しく低く、例えば、α−CDが0.5
℃に於て6,8%、γ−CDは同温度に於て9.1%溶
解するのに対し、β−CDは僅かに0.8%溶解するに
すぎず、また、70℃に於てもα−CDが87.6%、
γ−CDは実に 183.7%溶解するのに対し、β−
CDは僅かに15.3%溶解するにすぎない。
溶解度に比べて著しく低く、例えば、α−CDが0.5
℃に於て6,8%、γ−CDは同温度に於て9.1%溶
解するのに対し、β−CDは僅かに0.8%溶解するに
すぎず、また、70℃に於てもα−CDが87.6%、
γ−CDは実に 183.7%溶解するのに対し、β−
CDは僅かに15.3%溶解するにすぎない。
このようなβ−CDの水に対する溶解度をモル濃度に換
算すると、0.5℃に於て7mM、70℃に於て135
mMとなり、ホスト分子β−CDによって包接された水
難溶性ゲスト分子の水溶解性は、当然、このβ−CDの
溶解度以下に限られる。
算すると、0.5℃に於て7mM、70℃に於て135
mMとなり、ホスト分子β−CDによって包接された水
難溶性ゲスト分子の水溶解性は、当然、このβ−CDの
溶解度以下に限られる。
一方、 木x質γ−L−グルタミルーp−ニトロアニリ
ドはCDによって包接され、本基質単独では、水又は緩
衝液に対して、精々4mMまでの溶解性しか示さなかっ
たのに対し、CD0.3%(W/V)の添加で16mM
(4倍以上)という本基質単独の場合と比べれば、比較
的高い溶解度を得ることができることが知られている。
ドはCDによって包接され、本基質単独では、水又は緩
衝液に対して、精々4mMまでの溶解性しか示さなかっ
たのに対し、CD0.3%(W/V)の添加で16mM
(4倍以上)という本基質単独の場合と比べれば、比較
的高い溶解度を得ることができることが知られている。
(特開昭57−74099号公報、)
しかしながら、この程度の溶解度では水溶性の改善は充
分ではなく、特に、CD本基質包接化合物を凍結乾燥す
る場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程度の
濃縮液の製剤の調製が限界であり、側底、満足すべきも
のではないことは、既に述べたとおりである。
分ではなく、特に、CD本基質包接化合物を凍結乾燥す
る場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程度の
濃縮液の製剤の調製が限界であり、側底、満足すべきも
のではないことは、既に述べたとおりである。
また、一般に、包接体形成機構に関しては、従来から種
々の分子間力の関与が提唱され、CD包接体形成には分
散力、双極子開力、水素結合、疎水結合、電荷移動力等
種々の分子間力の一部またはすべてが関与している可能
性があり、それ故分子の化学構造が相違すれば、当然、
その包接体形成機構も相違し、又、たとえ包接体が形成
されたとしても、ゲスト分子である本基質γ−L−グル
タミルーp−ニトロアニリド全体が、或いはγ−GTP
との酵素反応活性部位が、ホスト分子であるCD空洞内
に包接され、酵素反応が抑制されてしまうおそれが存在
する。(有機合成化学 第35巻第2号119 (37
)頁及び123 (41)頁(19??)、 )従って
、本基質γ−L−グルタミルーp−ニトロアニリドがC
Dによって包接されたからといって、他のCD誘導体が
本基質を効果的に包接できるか否か、或いは、もし他の
CD1J導体が本基質を包接できたとしても、その包接
された本基質に対し、γ−GTPの酵素活性が抑制され
ないで残っているか否かは、側底予測できるものではな
かった。
々の分子間力の関与が提唱され、CD包接体形成には分
散力、双極子開力、水素結合、疎水結合、電荷移動力等
種々の分子間力の一部またはすべてが関与している可能
性があり、それ故分子の化学構造が相違すれば、当然、
その包接体形成機構も相違し、又、たとえ包接体が形成
されたとしても、ゲスト分子である本基質γ−L−グル
タミルーp−ニトロアニリド全体が、或いはγ−GTP
との酵素反応活性部位が、ホスト分子であるCD空洞内
に包接され、酵素反応が抑制されてしまうおそれが存在
する。(有機合成化学 第35巻第2号119 (37
)頁及び123 (41)頁(19??)、 )従って
、本基質γ−L−グルタミルーp−ニトロアニリドがC
Dによって包接されたからといって、他のCD誘導体が
本基質を効果的に包接できるか否か、或いは、もし他の
CD1J導体が本基質を包接できたとしても、その包接
された本基質に対し、γ−GTPの酵素活性が抑制され
ないで残っているか否かは、側底予測できるものではな
かった。
本発明は、上記した如き基質としてγ−L−グルタミル
ーp−ニトロアニリドを用いるγ−GTPの測定方法に
於ける基質の溶解性の問題点を解決すべくなされたもの
で、γ−GTPの酵素活性を容易に且つ定量的に測定す
る方法を提供することを目的とする。
ーp−ニトロアニリドを用いるγ−GTPの測定方法に
於ける基質の溶解性の問題点を解決すべくなされたもの
で、γ−GTPの酵素活性を容易に且つ定量的に測定す
る方法を提供することを目的とする。
で表わされる修飾シクロデキストリンの存在下に、γ−
L−グルタミルーp−ニトロアニリドを基質として用い
ることを特徴とする、γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ活性の測定方法である。
L−グルタミルーp−ニトロアニリドを基質として用い
ることを特徴とする、γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ活性の測定方法である。
即ち1本発明は、基質としてγ−L−グルタミルーp−
ニトロアニリドを用いるγ−GTPの測定方法に於て、
一般式[I]又は[■Iで表わされる特定の修飾CDが
、木基質γ−L−グルタミルーp−ニトロアニリドを効
果的に包接し、且つ包接された本基質に対するγ−GT
Pの酵素活性は何ら抑制されることなく、従ってこのよ
うな特定の修飾CDの存在下に、本基質γ−L−グルタ
ミル−p−ニトロアニリドを基質として用いると1本基
質の水溶性が飛躍的に改善されるばかりでなく、γ−G
TPの酵素活性を容易に定量的に測定することができる
ことを本発明者らが見出し、完成した発明である。
ニトロアニリドを用いるγ−GTPの測定方法に於て、
一般式[I]又は[■Iで表わされる特定の修飾CDが
、木基質γ−L−グルタミルーp−ニトロアニリドを効
果的に包接し、且つ包接された本基質に対するγ−GT
Pの酵素活性は何ら抑制されることなく、従ってこのよ
うな特定の修飾CDの存在下に、本基質γ−L−グルタ
ミル−p−ニトロアニリドを基質として用いると1本基
質の水溶性が飛躍的に改善されるばかりでなく、γ−G
TPの酵素活性を容易に定量的に測定することができる
ことを本発明者らが見出し、完成した発明である。
本発明は、上記特定の修飾CDを本基質γ−り一グルタ
“ミル−p−ニトロアニリドと共にγ−GTPの酵素反
応系に存在させる点に特徴を有する発明であり、γ−G
TPの酵素活性の測定操作自体は、グリシルグリシンな
どのグルタミン酸の受容体の存在下に汎用の緩衝液(ト
リス−塩酸緩衝液など、)中で反応させる一般法に従う
ことで足りる。
“ミル−p−ニトロアニリドと共にγ−GTPの酵素反
応系に存在させる点に特徴を有する発明であり、γ−G
TPの酵素活性の測定操作自体は、グリシルグリシンな
どのグルタミン酸の受容体の存在下に汎用の緩衝液(ト
リス−塩酸緩衝液など、)中で反応させる一般法に従う
ことで足りる。
一般式 [I]で表わされる本発明の修飾シクロデキス
トリンに於て、mは通常1−10、好ましくは1〜5の
整数であり、nは通常1〜5、好ましくは2〜4の整数
であって、2n−(m−1)≧Oを満足するものである
ことを要し、Xは通常3〜21、好ましくは5〜21、
更に好ましくは、7〜18である。また、一般式[11
に於ける1は通常0〜3゜jは通常1〜5であり、kは
通常2〜5である。
トリンに於て、mは通常1−10、好ましくは1〜5の
整数であり、nは通常1〜5、好ましくは2〜4の整数
であって、2n−(m−1)≧Oを満足するものである
ことを要し、Xは通常3〜21、好ましくは5〜21、
更に好ましくは、7〜18である。また、一般式[11
に於ける1は通常0〜3゜jは通常1〜5であり、kは
通常2〜5である。
これら本発明に係る修#CDは1例えば、米国特許第3
,453,285号明細書;米国特許第3.435.2
59号明細書; Polymer Journal、
Vol、13. No、8゜p、777〜781(1
981) 等に記載の一般的製造方法により、容易に
製造することができる。
,453,285号明細書;米国特許第3.435.2
59号明細書; Polymer Journal、
Vol、13. No、8゜p、777〜781(1
981) 等に記載の一般的製造方法により、容易に
製造することができる。
本基質及びこれら本発明に係る特定の修MCDを用いる
γ−GTPの酵素活性の測定値は、従来の酸溶解法の測
定値とよい相関を示しく第1図)、また、現在実用化さ
れている他の三法(1)、(2)及び(3)の方法と比
較して、ヘモグロビンの影響やγ−〇TPの酵素活性値
の変動の問題もない0本発明に係る特定の修飾CDを用
いることにより、極めて効果的に本基質γ−L−グルタ
ミルーP−ニトロアニリドが包接され、飛躍的に基質溶
解性が改善され、且つ溶解後の基質液の安定性も改善さ
れる。また、γ−GTPの酵素活性は、これにより何ら
の抑制もうけず、容易に定量的にγ−GTPの酵素活性
測定値を与える。更に1本発明に係る特定の修飾CDを
用いることにより本基質の基質溶解性が150mM以上
と飛躍的に改善されただけでなく、低温に於けるその溶
解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥された基質
製剤の調製も極めて容易となった。(表1参照)以下に
実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明
はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
γ−GTPの酵素活性の測定値は、従来の酸溶解法の測
定値とよい相関を示しく第1図)、また、現在実用化さ
れている他の三法(1)、(2)及び(3)の方法と比
較して、ヘモグロビンの影響やγ−〇TPの酵素活性値
の変動の問題もない0本発明に係る特定の修飾CDを用
いることにより、極めて効果的に本基質γ−L−グルタ
ミルーP−ニトロアニリドが包接され、飛躍的に基質溶
解性が改善され、且つ溶解後の基質液の安定性も改善さ
れる。また、γ−GTPの酵素活性は、これにより何ら
の抑制もうけず、容易に定量的にγ−GTPの酵素活性
測定値を与える。更に1本発明に係る特定の修飾CDを
用いることにより本基質の基質溶解性が150mM以上
と飛躍的に改善されただけでなく、低温に於けるその溶
解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥された基質
製剤の調製も極めて容易となった。(表1参照)以下に
実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明
はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例1゜
〔試薬の調製〕
■基質緩衝液
ヘプタキス−(6−O−ヒドロキシプロピル)−β−シ
クロデキストリン〔一般式[I] に於てm=1.n=
3.X=7としたもの〕をl011i+ol/I、 γ
−L−グルタミルーp−ニトロアニリドを5 gaol
/Iの濃度になるように溶解した0、 1 M )リス
塩酸緩衝液(pH5−4o)をII!Iした。
クロデキストリン〔一般式[I] に於てm=1.n=
3.X=7としたもの〕をl011i+ol/I、 γ
−L−グルタミルーp−ニトロアニリドを5 gaol
/Iの濃度になるように溶解した0、 1 M )リス
塩酸緩衝液(pH5−4o)をII!Iした。
■グリシルグリシン溶液
グリシルグリシン 1B2+smol/lに水酸化ナト
リウムを加え、P)1 8.40に調製した。
リウムを加え、P)1 8.40に調製した。
試料50ILiに基質緩衝液■2.01を加え、37℃
で3分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液:↓
、5mlを加えてよく混合後、分光光度肝で410 n
mの吸光度の増加を測定し、γ−GTP活性値を算出し
た。
で3分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液:↓
、5mlを加えてよく混合後、分光光度肝で410 n
mの吸光度の増加を測定し、γ−GTP活性値を算出し
た。
(3)活性値
単位時間(1分間)当りの吸光度の増加ΔE/winに
相当するγ−GTP活性値(mIU)は次式により算出
した。
相当するγ−GTP活性値(mIU)は次式により算出
した。
y−GTP活性値(mIU)
比較例1
〔試薬の調製〕
■基質液
γ−L−グルタミルーP−二トロアニリド1gaol
(285B)を0.5NjJi酸10m1に溶解し、水
で全量501とした− (20mM溶液)■緩衝液 グリシルグリシンを40厘厘of/Iの濃度になるよ−
)ニ溶解1.りo、 I M トIJ ス塩81衝液(
pH8,40)を調製した。
(285B)を0.5NjJi酸10m1に溶解し、水
で全量501とした− (20mM溶液)■緩衝液 グリシルグリシンを40厘厘of/Iの濃度になるよ−
)ニ溶解1.りo、 I M トIJ ス塩81衝液(
pH8,40)を調製した。
試料50p文に緩衝液■2.01を加え、37℃で3分
間予備加温し、これに基質液■0.51を加えてよく混
合後、分光光度計で410nmの吸光度の増加を測定し
た。
間予備加温し、これに基質液■0.51を加えてよく混
合後、分光光度計で410nmの吸光度の増加を測定し
た。
実施例1.及び比較例1.の方法により、同一の60検
体のγ−GTP活性値を求め(表2)それらの相関関係
を第1図に示す。
体のγ−GTP活性値を求め(表2)それらの相関関係
を第1図に示す。
第1図から明らかなように、本発明による測定値は、従
来の酸溶解法の測定値とよい絹瀾を示している。 (
γ−0,983,Y−0,l383X−0,835)実
施例2゜ 〔試薬の調製〕 ■基質緩衝液 ヘプタキス−(6−0−1,3−ジヒドロキシプロピル
)−β−シクロデキストリン〔一般式[I]に於てm=
2.n=3.X=7としたもの〕を10 mmol/]
、γ−L−グルタミルーp−ニトロアニリドを5mmo
l/Iの濃度になるように溶解した0、1Mトリス塩酸
緩衝液(pH8,40)を調製した。
来の酸溶解法の測定値とよい絹瀾を示している。 (
γ−0,983,Y−0,l383X−0,835)実
施例2゜ 〔試薬の調製〕 ■基質緩衝液 ヘプタキス−(6−0−1,3−ジヒドロキシプロピル
)−β−シクロデキストリン〔一般式[I]に於てm=
2.n=3.X=7としたもの〕を10 mmol/]
、γ−L−グルタミルーp−ニトロアニリドを5mmo
l/Iの濃度になるように溶解した0、1Mトリス塩酸
緩衝液(pH8,40)を調製した。
■グリシルグリシン溶液
塩酸でpH8,40に調製したグリシルグリシン162
mM溶液を調製した。
mM溶液を調製した。
試料50g見に基質緩衝液■2.01を加え、37℃で
3分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液■0.
51を加えてよく混合後1分光光度計で410nmの吸
光度の増加を測定し、γ−GTP活性値を算出した。
3分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液■0.
51を加えてよく混合後1分光光度計で410nmの吸
光度の増加を測定し、γ−GTP活性値を算出した。
実施例2.によっても、実施例1.と同様な結果が得ら
れた。
れた。
実施例3゜
〔試薬の調製〕
■基質液
γ−L−グルタミルーp−ニトロアニリドを200mm
ol/l、ヘプタキス−(2,6−ジー0−ヒドロキシ
エチル)−β−シクロデキストリン〔一般式%式% の〕を400腸層o1/Iの濃度になるように水に溶解
した。この混合液中には、不溶物の存在は全く認められ
ず、基質が完溶していることがわかった。この混合液を
2mlずつ分注し、凍結乾燥して基質剤を得た。尚、凍
結乾燥基材の調製中、沈澱の析出は全く認められなかっ
た。
ol/l、ヘプタキス−(2,6−ジー0−ヒドロキシ
エチル)−β−シクロデキストリン〔一般式%式% の〕を400腸層o1/Iの濃度になるように水に溶解
した。この混合液中には、不溶物の存在は全く認められ
ず、基質が完溶していることがわかった。この混合液を
2mlずつ分注し、凍結乾燥して基質剤を得た。尚、凍
結乾燥基材の調製中、沈澱の析出は全く認められなかっ
た。
これを、使用時、0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH
8,40) 20 mlに溶解し、基質液を調製した。
8,40) 20 mlに溶解し、基質液を調製した。
■緩衝液
グリシルグリシンを40 gaol/Iの濃度になるよ
うに溶解した0、 1 M )リス塩酸緩衝液(pHa
、to)を調製した。
うに溶解した0、 1 M )リス塩酸緩衝液(pHa
、to)を調製した。
試料50IL!Lに緩衝液■2.Omlを加え、37℃
で3分間予備加温し、これに基質液■0.51を加えて
よく混合後、分光光度計で41On鳳の吸光度の増加を
測定した。
で3分間予備加温し、これに基質液■0.51を加えて
よく混合後、分光光度計で41On鳳の吸光度の増加を
測定した。
実施例4゜
〔試薬の調製〕
■基質液
γ−L−グルタミルーp−二トロアニリドを100mm
ol/l、β−シクはデキストリン−エピクロルヒドリ
ン縮合物〔平均分子量約3000;β−シクロデキスト
リン−エピクロルヒドリンのモル比1:2;一般式[川
に於て、k〜2.i+jキ4と]、たもの〕を200s
濡o1/lの濃度になるように水に溶解した。この混合
液中には、不溶物の存在は全7認められず、基質が完溶
していることがわかった。この混合液を2mlずつ分注
し、凍結乾燥して基質剤を得た。この場合にも、凍結乾
燥基材の調製中、沈澱の析出は全く認められなかった。
ol/l、β−シクはデキストリン−エピクロルヒドリ
ン縮合物〔平均分子量約3000;β−シクロデキスト
リン−エピクロルヒドリンのモル比1:2;一般式[川
に於て、k〜2.i+jキ4と]、たもの〕を200s
濡o1/lの濃度になるように水に溶解した。この混合
液中には、不溶物の存在は全7認められず、基質が完溶
していることがわかった。この混合液を2mlずつ分注
し、凍結乾燥して基質剤を得た。この場合にも、凍結乾
燥基材の調製中、沈澱の析出は全く認められなかった。
これを使用時、Q、 I M トリス塩酸緩衝液(pH
8,40)101に溶解し、基質液を調製した。
8,40)101に溶解し、基質液を調製した。
■緩衝液
グリシルグリシンを40鳳諺o1/lの濃度になるよう
に溶解したO、 l M トリス塩酸緩衝液(pH8,
40)を調製した。
に溶解したO、 l M トリス塩酸緩衝液(pH8,
40)を調製した。
試料50gMに緩衝液■2.01を加え、37℃で3分
間予備加温し、これに基質液■Q、51Iを加えてよく
混合後、分光光度計で410nmの吸光度の増加を測定
し、γ−GTP活性値を算出した。
間予備加温し、これに基質液■Q、51Iを加えてよく
混合後、分光光度計で410nmの吸光度の増加を測定
し、γ−GTP活性値を算出した。
実施例3.及び実施例4.からも明らかなように、本発
明の修ficDを用いることにより、本基質γ−グルタ
ミルーp−ニトロアニリドを100〜200mmol/
lと、飛躍的に可溶化することができ、凍結乾燥をより
効率的に行なうことができた。
明の修ficDを用いることにより、本基質γ−グルタ
ミルーp−ニトロアニリドを100〜200mmol/
lと、飛躍的に可溶化することができ、凍結乾燥をより
効率的に行なうことができた。
以上述べた如く、本発明は、基質としてγ−L−グルタ
ミルーp−ニトロアニリドを用いるγ−GTP活性測定
法に於ける基質の溶解性の問題点を解決した。γ−GT
Pの改善された測定方法を提供するものであり、 1)本発明に係る特定の修#CDを用いることにより極
めて効果的にγ−L−グルタミルーp−二トロアニリド
が包接され、飛躍的に基質溶解性が改善され、且つ溶解
後の基質液の安定性も改善された点。
ミルーp−ニトロアニリドを用いるγ−GTP活性測定
法に於ける基質の溶解性の問題点を解決した。γ−GT
Pの改善された測定方法を提供するものであり、 1)本発明に係る特定の修#CDを用いることにより極
めて効果的にγ−L−グルタミルーp−二トロアニリド
が包接され、飛躍的に基質溶解性が改善され、且つ溶解
後の基質液の安定性も改善された点。
2)γ−GTPの酵素活性はこれにより何らの抑制も受
けず、容易に且つ定量的にγ−GTPの酵素活性測定値
を与える点。
けず、容易に且つ定量的にγ−GTPの酵素活性測定値
を与える点。
3)本発明の修fsCDを用いることにより、基質溶解
性が150mM以上と飛躍的に改善され、更に低温に於
けるその溶解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥
された基質製剤の調製も極めて容易となった点。
性が150mM以上と飛躍的に改善され、更に低温に於
けるその溶解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥
された基質製剤の調製も極めて容易となった点。
に顕著な効果を奏する発明であり、斯業に貢献するとこ
ろ大なるものである。
ろ大なるものである。
第1図は、実施例1.(末法)で得られたγ−GTPの
酵素活性値と比較例1.(酸溶解法)で得られたγ−G
TPの酵素活性値との相関を表わし、横軸Xは比較例1
.に於けるγ−GTP活性値(n>IU)を、縦軸Yは
実施例1.に於けるγ−GTP活性値(mIU)を夫々
表わす。 特許出願人和光純薬工業株式会社 高 10 比彰し#] t、 t=於+7るr−Ct丁P54aQ
しynIυ)特許出願人 相光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和61年 8月 g日 1、事件の表示 昭和60年特許願第100034号 2、発明の名称 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ 活性測定方法 3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 住所大阪府大阪市東区道修町3丁目10番地連絡先置
03−270−8571 5、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 6、補正の内容 (1)明細書12頁2行目から同頁3行目にかけて記載
の「米国特許第3,453,285号明細書;」を「米
国特許第3,453,258号明細書;」と補正する。 (2)明細書12頁3行目から同頁4行目にかけて記載
の「米国特許第3,435,259号明細書;」を「米
国特許第3,453,259号明細書;」と補正する。 (3)明細書19頁4行目に記載の「塩酸」を「水酸化
ナトリウム」と補正する。 (4)明細書22頁7行目に記載の「行なうことができ
た。」の後に、改行して以下の文章を挿入する。 「実施例5゜ 試料として、意図的に溶血させた血清(ヘモグロビン濃
度100,200,400,600,800.1000
897dtのもの。)及びヘモグロビン濃度Oの血清を
用い、実施例1の方法によりγ−GTP活性値を測定し
たa 比較例2゜ 〔試液の調製〕 r−L−グルタミル−3−カルボキシ−4−二トロアニ
リド3mmoJ、グリシルグリシン40mmaJ、トリ
スヒドロキシメチルアミノメタン100mmolを水s
oomgに溶解し、塩酸で−8,0に調整した後、水で
全量11とした。 〔測定操作〕 試液2゜5 mlを37℃で3分間予備加温し、これに
試料50μノを加えてよく混合した後、分光光度計で4
10 nmの吸光度の増加を測定した。 実施例5.の結果及び、実施例5.と同一の検体を用い
て比較例2.の方法によりγ−GTP活性値を求めた結
果を表3に併せて示す。 表3より明らかなように、水溶性基を導入した基質を用
いた比較例2の方法と比べ、本発明の方法は溶血の影響
が遥かに低いことがわかる。」以上
酵素活性値と比較例1.(酸溶解法)で得られたγ−G
TPの酵素活性値との相関を表わし、横軸Xは比較例1
.に於けるγ−GTP活性値(n>IU)を、縦軸Yは
実施例1.に於けるγ−GTP活性値(mIU)を夫々
表わす。 特許出願人和光純薬工業株式会社 高 10 比彰し#] t、 t=於+7るr−Ct丁P54aQ
しynIυ)特許出願人 相光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和61年 8月 g日 1、事件の表示 昭和60年特許願第100034号 2、発明の名称 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ 活性測定方法 3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 住所大阪府大阪市東区道修町3丁目10番地連絡先置
03−270−8571 5、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 6、補正の内容 (1)明細書12頁2行目から同頁3行目にかけて記載
の「米国特許第3,453,285号明細書;」を「米
国特許第3,453,258号明細書;」と補正する。 (2)明細書12頁3行目から同頁4行目にかけて記載
の「米国特許第3,435,259号明細書;」を「米
国特許第3,453,259号明細書;」と補正する。 (3)明細書19頁4行目に記載の「塩酸」を「水酸化
ナトリウム」と補正する。 (4)明細書22頁7行目に記載の「行なうことができ
た。」の後に、改行して以下の文章を挿入する。 「実施例5゜ 試料として、意図的に溶血させた血清(ヘモグロビン濃
度100,200,400,600,800.1000
897dtのもの。)及びヘモグロビン濃度Oの血清を
用い、実施例1の方法によりγ−GTP活性値を測定し
たa 比較例2゜ 〔試液の調製〕 r−L−グルタミル−3−カルボキシ−4−二トロアニ
リド3mmoJ、グリシルグリシン40mmaJ、トリ
スヒドロキシメチルアミノメタン100mmolを水s
oomgに溶解し、塩酸で−8,0に調整した後、水で
全量11とした。 〔測定操作〕 試液2゜5 mlを37℃で3分間予備加温し、これに
試料50μノを加えてよく混合した後、分光光度計で4
10 nmの吸光度の増加を測定した。 実施例5.の結果及び、実施例5.と同一の検体を用い
て比較例2.の方法によりγ−GTP活性値を求めた結
果を表3に併せて示す。 表3より明らかなように、水溶性基を導入した基質を用
いた比較例2の方法と比べ、本発明の方法は溶血の影響
が遥かに低いことがわかる。」以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を測定
するに当り、一般式[ I ] β−CD(−OH)_2_1_−_X[−OC_nH_
2_n_−_(_m_−_1_)(−OH)_m]_X
[ I ]〔但し、CDはシクロデキストリン残基を、m
、nは夫々m=1〜10、n=1〜5、2n−(m−1
)≧0なる整数を示し、X=3〜21を示す。〕 又は、一般式[II] ▲数式、化学式、表等があります▼[II] 〔但し、i=0〜3、j=1〜5を示し、k=2〜5を
示す。〕 で表わされる修飾シクロデキストリンの存在下に、γ−
L−グルタミル−p−ニトロアニリドを基質として用い
ることを特徴とする、γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ活性の測定方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60100034A JPS61260900A (ja) | 1985-05-11 | 1985-05-11 | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法 |
EP86112097A EP0258473B1 (en) | 1985-05-11 | 1986-09-01 | Process for determination of gamma-gtp activity |
US06/902,897 US4879221A (en) | 1985-05-11 | 1986-09-02 | Process for determination of γ-GTP activity |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60100034A JPS61260900A (ja) | 1985-05-11 | 1985-05-11 | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61260900A true JPS61260900A (ja) | 1986-11-19 |
Family
ID=14263240
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60100034A Pending JPS61260900A (ja) | 1985-05-11 | 1985-05-11 | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4879221A (ja) |
EP (1) | EP0258473B1 (ja) |
JP (1) | JPS61260900A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6460400A (en) * | 1987-05-12 | 1989-03-07 | Shino Test Corp | Determination of amylase |
JPH0284199A (ja) * | 1988-09-20 | 1990-03-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 酸性ホスフアターゼ活性測定用試液 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5116730A (en) * | 1988-06-15 | 1992-05-26 | Board Of Governors Of Wayne State University | Amino acid substituted 4-aminophenazones for measuring enzyme activity |
US5474906A (en) * | 1993-03-26 | 1995-12-12 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Reagent for determining γ-glutamyl transpeptidase activity |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3453258A (en) * | 1967-02-20 | 1969-07-01 | Corn Products Co | Reaction products of cyclodextrin and unsaturated compounds |
US3453259A (en) * | 1967-03-22 | 1969-07-01 | Corn Products Co | Cyclodextrin polyol ethers and their oxidation products |
US4511651A (en) * | 1982-07-30 | 1985-04-16 | American Monitor Corporation | Reagent composition and assay for the determination of γ-glutamyltransferase activity |
US4596795A (en) * | 1984-04-25 | 1986-06-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services | Administration of sex hormones in the form of hydrophilic cyclodextrin derivatives |
-
1985
- 1985-05-11 JP JP60100034A patent/JPS61260900A/ja active Pending
-
1986
- 1986-09-01 EP EP86112097A patent/EP0258473B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-02 US US06/902,897 patent/US4879221A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6460400A (en) * | 1987-05-12 | 1989-03-07 | Shino Test Corp | Determination of amylase |
JPH0284199A (ja) * | 1988-09-20 | 1990-03-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 酸性ホスフアターゼ活性測定用試液 |
JP2797102B2 (ja) * | 1988-09-20 | 1998-09-17 | 和光純薬工業株式会社 | 酸性ホスフアターゼ活性測定用試液 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0258473A1 (en) | 1988-03-09 |
EP0258473B1 (en) | 1991-07-24 |
US4879221A (en) | 1989-11-07 |
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