JPS61260900A - γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法 - Google Patents
γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は、基質としてγ−Ｌ−グルタミルーｐ−二トロ
アニリドを用いる、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性の測定方法に関する。
アニリドを用いる、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性の測定方法に関する。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下、γ−ＧＴ
Ｐと略称する。）の酵素活性の測定は、臨床的には肝胆
道疾患の診断、アルコール飲用者のスクリーニングなど
に広く利用され、種々の方法が発表されているが、γ−
Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを基質とする反応
速度測定法が最も一般的であり、現在も盛んに行なわれ
ている。
Ｐと略称する。）の酵素活性の測定は、臨床的には肝胆
道疾患の診断、アルコール飲用者のスクリーニングなど
に広く利用され、種々の方法が発表されているが、γ−
Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを基質とする反応
速度測定法が最も一般的であり、現在も盛んに行なわれ
ている。
しかしながら、基質のγ−Ｌ−グルタミルーＰ−ニトロ
アニリド（以下、本基質という、）は、基質安定化及び
酵素反応の至適ＰＨである中性付近（ｐＨ＝約８．３）
に於て極めて溶解性が悪く、そのため溶解度が比較的高
い低ｐ）！域で予め基質を充分に溶解しておき、使用時
、中性付近（ｐＨ＝約８．５）の緩衝液と混合して使用
する酸溶解法が一般的な使用方法である。
アニリド（以下、本基質という、）は、基質安定化及び
酵素反応の至適ＰＨである中性付近（ｐＨ＝約８．３）
に於て極めて溶解性が悪く、そのため溶解度が比較的高
い低ｐ）！域で予め基質を充分に溶解しておき、使用時
、中性付近（ｐＨ＝約８．５）の緩衝液と混合して使用
する酸溶解法が一般的な使用方法である。
このため、本基質は、溶解した強酸により加水分解をう
けて、ブランク値が徐々に上昇し、その製剤の有効期間
は調液後約５時間程度である。
けて、ブランク値が徐々に上昇し、その製剤の有効期間
は調液後約５時間程度である。
そこで、本基質の溶解性の改善が種々試みられており、
次の（１）〜（３）の方法が夫々提案され、実用化され
ている。
次の（１）〜（３）の方法が夫々提案され、実用化され
ている。
（１） カチオン系界面活性剤又はアニオン系界面活
性剤を添加して基質の水に対する溶解性を改善し、これ
らイオン系界面活性剤の酵素反応阻害作用をノニオン系
界面活性剤で緩和する方法。
性剤を添加して基質の水に対する溶解性を改善し、これ
らイオン系界面活性剤の酵素反応阻害作用をノニオン系
界面活性剤で緩和する方法。
（２）本基質の−ＮＯ２基のオルト位に−ＣＯ２Ｈ基。
−５０３Ｈ基などの水溶性基を付与し、基質の水に対す
る溶解性を改善する方法。
る溶解性を改善する方法。
（３） シクロデキストリンの包接力を利用して基質
の水に対する溶解性を改善する方法。
の水に対する溶解性を改善する方法。
しかしながら、これら従来の方法にも種々の欠点が存在
する。
する。
例えば、（１）の界面活性剤を用いる方法では、イオン
系界面活性剤の酵素阻害力が非常に強く、ノニオン系界
面活性剤を添加しても、その回復率は約７０〜８０％で
ある上、界面活性剤の添加によりヘモグロビンの吸収が
経時的に変化し、ｐ−ニトロアニリンの生成速度を追跡
する４１０ｎ腸でのヘモグロビンの吸収が経時的に減少
するため、結果的に、γ−ＧＴＰの酵素活性測定値に負
誤差を与える。また、（２）の水溶性基を付与する方法
では、γ−ＧＴＰの酵素活性測定値が高く測定されるこ
と及び基質剤調液後数日で基質が変質し、γ−ＧＴＰの
酵素活性測定値の低下が観測され、場合によっては変質
による沈澱が析出する等の問題を生じる。更にまた、（
３）のシクロデキストリンの包接力を利用する方法では
、ヘモグロビンの影響やγ−ＧＴＰの酵素活性測定値の
変動の問題はないが、肝心の水に対する溶解性の改善が
充分ではなく、特に、シクロデキストリンの基質包接化
合物を凍結乾燥する場合は、最終使用液濃度の製剤乃至
はその二倍程度の濃縮液の製剤の調製が限界である。即
ち、これら（１）〜（３）のいずれの方法も、到底、充
分に改善された満足すべき測定方法であるとはいえない
現状にある。
系界面活性剤の酵素阻害力が非常に強く、ノニオン系界
面活性剤を添加しても、その回復率は約７０〜８０％で
ある上、界面活性剤の添加によりヘモグロビンの吸収が
経時的に変化し、ｐ−ニトロアニリンの生成速度を追跡
する４１０ｎ腸でのヘモグロビンの吸収が経時的に減少
するため、結果的に、γ−ＧＴＰの酵素活性測定値に負
誤差を与える。また、（２）の水溶性基を付与する方法
では、γ−ＧＴＰの酵素活性測定値が高く測定されるこ
と及び基質剤調液後数日で基質が変質し、γ−ＧＴＰの
酵素活性測定値の低下が観測され、場合によっては変質
による沈澱が析出する等の問題を生じる。更にまた、（
３）のシクロデキストリンの包接力を利用する方法では
、ヘモグロビンの影響やγ−ＧＴＰの酵素活性測定値の
変動の問題はないが、肝心の水に対する溶解性の改善が
充分ではなく、特に、シクロデキストリンの基質包接化
合物を凍結乾燥する場合は、最終使用液濃度の製剤乃至
はその二倍程度の濃縮液の製剤の調製が限界である。即
ち、これら（１）〜（３）のいずれの方法も、到底、充
分に改善された満足すべき測定方法であるとはいえない
現状にある。
ところで、シクロデキストリン（以下、ＣＤと略称する
。）は、Ｄ−グルコビラノースがα−１゜４−グルコシ
ド結合により環状に結合した環状オリゴ糖同族体であり
、結合したＤ−グルコビラノースが、６．７及び８個の
、α−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤ、の三種のものがよ
く知られている。
。）は、Ｄ−グルコビラノースがα−１゜４−グルコシ
ド結合により環状に結合した環状オリゴ糖同族体であり
、結合したＤ−グルコビラノースが、６．７及び８個の
、α−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤ、の三種のものがよ
く知られている。
これら、一連のＣＤは、水溶液中で有機化合物と混合す
ると速やかに包接体を形成し、製剤の安定化、溶解性の
調節、液状薬品の粉末化、刺激性や悪臭などのマスク、
或いは揮発性の調節等に優れた効果を有する為に、これ
らの用途に広く利用されている。そうして、その構造は
、ＣＤ空洞の一端の開口部にグルコビラノースの２−及
び３−位の−ＯＨを有し、他端の開口部に６−位の−Ｏ
Ｈを有する、疎水性ＣＤ空洞を有する環状構造であるこ
とが、そのＸ線解析の結果などから推定されている。
ると速やかに包接体を形成し、製剤の安定化、溶解性の
調節、液状薬品の粉末化、刺激性や悪臭などのマスク、
或いは揮発性の調節等に優れた効果を有する為に、これ
らの用途に広く利用されている。そうして、その構造は
、ＣＤ空洞の一端の開口部にグルコビラノースの２−及
び３−位の−ＯＨを有し、他端の開口部に６−位の−Ｏ
Ｈを有する、疎水性ＣＤ空洞を有する環状構造であるこ
とが、そのＸ線解析の結果などから推定されている。
このＣＤは、でん粉或いはでん粉の加水分解物にＢ Ｍ
Ａ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ ａｍ７
１ａｇｅ ）を作用させると、α−１β−１γ−の混合
物として得られるが、近年は、β−ＣＤのみを高収率で
与えるＣＤ生成酵素がＢａｃｉｌｌｕＳｍｅｇａｔａｒ
ｉｕｍやＢａｃｉｌｌｕｓ属の好アルカリ性菌のある種
のものから見出され、β−ＣＤが安価に製造されるよう
になってきている。その為、研究対象としては溶解性が
高いα−ＣＤを扱ったものが多いが、実用的には、製造
、分離精製の容易なβ−ＣＤが一般に用いられるように
なっている。
Ａ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ ａｍ７
１ａｇｅ ）を作用させると、α−１β−１γ−の混合
物として得られるが、近年は、β−ＣＤのみを高収率で
与えるＣＤ生成酵素がＢａｃｉｌｌｕＳｍｅｇａｔａｒ
ｉｕｍやＢａｃｉｌｌｕｓ属の好アルカリ性菌のある種
のものから見出され、β−ＣＤが安価に製造されるよう
になってきている。その為、研究対象としては溶解性が
高いα−ＣＤを扱ったものが多いが、実用的には、製造
、分離精製の容易なβ−ＣＤが一般に用いられるように
なっている。
β−ＣＤの水に対する溶解度は、α−ＣＤ、γ−ＣＤの
溶解度に比べて著しく低く、例えば、α−ＣＤが０．５
℃に於て６，８％、γ−ＣＤは同温度に於て９．１％溶
解するのに対し、β−ＣＤは僅かに０．８％溶解するに
すぎず、また、７０℃に於てもα−ＣＤが８７．６％、
γ−ＣＤは実に １８３．７％溶解するのに対し、β−
ＣＤは僅かに１５．３％溶解するにすぎない。
溶解度に比べて著しく低く、例えば、α−ＣＤが０．５
℃に於て６，８％、γ−ＣＤは同温度に於て９．１％溶
解するのに対し、β−ＣＤは僅かに０．８％溶解するに
すぎず、また、７０℃に於てもα−ＣＤが８７．６％、
γ−ＣＤは実に １８３．７％溶解するのに対し、β−
ＣＤは僅かに１５．３％溶解するにすぎない。
このようなβ−ＣＤの水に対する溶解度をモル濃度に換
算すると、０．５℃に於て７ｍＭ、７０℃に於て１３５
ｍＭとなり、ホスト分子β−ＣＤによって包接された水
難溶性ゲスト分子の水溶解性は、当然、このβ−ＣＤの
溶解度以下に限られる。
算すると、０．５℃に於て７ｍＭ、７０℃に於て１３５
ｍＭとなり、ホスト分子β−ＣＤによって包接された水
難溶性ゲスト分子の水溶解性は、当然、このβ−ＣＤの
溶解度以下に限られる。
一方、 木ｘ質γ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリ
ドはＣＤによって包接され、本基質単独では、水又は緩
衝液に対して、精々４ｍＭまでの溶解性しか示さなかっ
たのに対し、ＣＤ０．３％（Ｗ／Ｖ）の添加で１６ｍＭ
（４倍以上）という本基質単独の場合と比べれば、比較
的高い溶解度を得ることができることが知られている。
ドはＣＤによって包接され、本基質単独では、水又は緩
衝液に対して、精々４ｍＭまでの溶解性しか示さなかっ
たのに対し、ＣＤ０．３％（Ｗ／Ｖ）の添加で１６ｍＭ
（４倍以上）という本基質単独の場合と比べれば、比較
的高い溶解度を得ることができることが知られている。
（特開昭５７−７４０９９号公報、）
しかしながら、この程度の溶解度では水溶性の改善は充
分ではなく、特に、ＣＤ本基質包接化合物を凍結乾燥す
る場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程度の
濃縮液の製剤の調製が限界であり、側底、満足すべきも
のではないことは、既に述べたとおりである。
分ではなく、特に、ＣＤ本基質包接化合物を凍結乾燥す
る場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程度の
濃縮液の製剤の調製が限界であり、側底、満足すべきも
のではないことは、既に述べたとおりである。
また、一般に、包接体形成機構に関しては、従来から種
々の分子間力の関与が提唱され、ＣＤ包接体形成には分
散力、双極子開力、水素結合、疎水結合、電荷移動力等
種々の分子間力の一部またはすべてが関与している可能
性があり、それ故分子の化学構造が相違すれば、当然、
その包接体形成機構も相違し、又、たとえ包接体が形成
されたとしても、ゲスト分子である本基質γ−Ｌ−グル
タミルーｐ−ニトロアニリド全体が、或いはγ−ＧＴＰ
との酵素反応活性部位が、ホスト分子であるＣＤ空洞内
に包接され、酵素反応が抑制されてしまうおそれが存在
する。（有機合成化学 第３５巻第２号１１９ （３７
）頁及び１２３ （４１）頁（１９？？）、 ）従って
、本基質γ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドがＣ
Ｄによって包接されたからといって、他のＣＤ誘導体が
本基質を効果的に包接できるか否か、或いは、もし他の
ＣＤ１Ｊ導体が本基質を包接できたとしても、その包接
された本基質に対し、γ−ＧＴＰの酵素活性が抑制され
ないで残っているか否かは、側底予測できるものではな
かった。
々の分子間力の関与が提唱され、ＣＤ包接体形成には分
散力、双極子開力、水素結合、疎水結合、電荷移動力等
種々の分子間力の一部またはすべてが関与している可能
性があり、それ故分子の化学構造が相違すれば、当然、
その包接体形成機構も相違し、又、たとえ包接体が形成
されたとしても、ゲスト分子である本基質γ−Ｌ−グル
タミルーｐ−ニトロアニリド全体が、或いはγ−ＧＴＰ
との酵素反応活性部位が、ホスト分子であるＣＤ空洞内
に包接され、酵素反応が抑制されてしまうおそれが存在
する。（有機合成化学 第３５巻第２号１１９ （３７
）頁及び１２３ （４１）頁（１９？？）、 ）従って
、本基質γ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドがＣ
Ｄによって包接されたからといって、他のＣＤ誘導体が
本基質を効果的に包接できるか否か、或いは、もし他の
ＣＤ１Ｊ導体が本基質を包接できたとしても、その包接
された本基質に対し、γ−ＧＴＰの酵素活性が抑制され
ないで残っているか否かは、側底予測できるものではな
かった。
本発明は、上記した如き基質としてγ−Ｌ−グルタミル
ーｐ−ニトロアニリドを用いるγ−ＧＴＰの測定方法に
於ける基質の溶解性の問題点を解決すべくなされたもの
で、γ−ＧＴＰの酵素活性を容易に且つ定量的に測定す
る方法を提供することを目的とする。
ーｐ−ニトロアニリドを用いるγ−ＧＴＰの測定方法に
於ける基質の溶解性の問題点を解決すべくなされたもの
で、γ−ＧＴＰの酵素活性を容易に且つ定量的に測定す
る方法を提供することを目的とする。
で表わされる修飾シクロデキストリンの存在下に、γ−
Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを基質として用い
ることを特徴とする、γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ活性の測定方法である。
Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを基質として用い
ることを特徴とする、γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ活性の測定方法である。
即ち１本発明は、基質としてγ−Ｌ−グルタミルーｐ−
ニトロアニリドを用いるγ−ＧＴＰの測定方法に於て、
一般式［Ｉ］又は［■Ｉで表わされる特定の修飾ＣＤが
、木基質γ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを効
果的に包接し、且つ包接された本基質に対するγ−ＧＴ
Ｐの酵素活性は何ら抑制されることなく、従ってこのよ
うな特定の修飾ＣＤの存在下に、本基質γ−Ｌ−グルタ
ミル−ｐ−ニトロアニリドを基質として用いると１本基
質の水溶性が飛躍的に改善されるばかりでなく、γ−Ｇ
ＴＰの酵素活性を容易に定量的に測定することができる
ことを本発明者らが見出し、完成した発明である。
ニトロアニリドを用いるγ−ＧＴＰの測定方法に於て、
一般式［Ｉ］又は［■Ｉで表わされる特定の修飾ＣＤが
、木基質γ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを効
果的に包接し、且つ包接された本基質に対するγ−ＧＴ
Ｐの酵素活性は何ら抑制されることなく、従ってこのよ
うな特定の修飾ＣＤの存在下に、本基質γ−Ｌ−グルタ
ミル−ｐ−ニトロアニリドを基質として用いると１本基
質の水溶性が飛躍的に改善されるばかりでなく、γ−Ｇ
ＴＰの酵素活性を容易に定量的に測定することができる
ことを本発明者らが見出し、完成した発明である。
本発明は、上記特定の修飾ＣＤを本基質γ−り一グルタ
“ミル−ｐ−ニトロアニリドと共にγ−ＧＴＰの酵素反
応系に存在させる点に特徴を有する発明であり、γ−Ｇ
ＴＰの酵素活性の測定操作自体は、グリシルグリシンな
どのグルタミン酸の受容体の存在下に汎用の緩衝液（ト
リス−塩酸緩衝液など、）中で反応させる一般法に従う
ことで足りる。
“ミル−ｐ−ニトロアニリドと共にγ−ＧＴＰの酵素反
応系に存在させる点に特徴を有する発明であり、γ−Ｇ
ＴＰの酵素活性の測定操作自体は、グリシルグリシンな
どのグルタミン酸の受容体の存在下に汎用の緩衝液（ト
リス−塩酸緩衝液など、）中で反応させる一般法に従う
ことで足りる。
一般式 ［Ｉ］で表わされる本発明の修飾シクロデキス
トリンに於て、ｍは通常１−１０、好ましくは１〜５の
整数であり、ｎは通常１〜５、好ましくは２〜４の整数
であって、２ｎ−（ｍ−１）≧Ｏを満足するものである
ことを要し、Ｘは通常３〜２１、好ましくは５〜２１、
更に好ましくは、７〜１８である。また、一般式［１１
に於ける１は通常０〜３゜ｊは通常１〜５であり、ｋは
通常２〜５である。
トリンに於て、ｍは通常１−１０、好ましくは１〜５の
整数であり、ｎは通常１〜５、好ましくは２〜４の整数
であって、２ｎ−（ｍ−１）≧Ｏを満足するものである
ことを要し、Ｘは通常３〜２１、好ましくは５〜２１、
更に好ましくは、７〜１８である。また、一般式［１１
に於ける１は通常０〜３゜ｊは通常１〜５であり、ｋは
通常２〜５である。
これら本発明に係る修＃ＣＤは１例えば、米国特許第３
，４５３，２８５号明細書；米国特許第３．４３５．２
５９号明細書； Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ、
Ｖｏｌ、１３． Ｎｏ、８゜ｐ、７７７〜７８１（１
９８１） 等に記載の一般的製造方法により、容易に
製造することができる。
，４５３，２８５号明細書；米国特許第３．４３５．２
５９号明細書； Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ、
Ｖｏｌ、１３． Ｎｏ、８゜ｐ、７７７〜７８１（１
９８１） 等に記載の一般的製造方法により、容易に
製造することができる。
本基質及びこれら本発明に係る特定の修ＭＣＤを用いる
γ−ＧＴＰの酵素活性の測定値は、従来の酸溶解法の測
定値とよい相関を示しく第１図）、また、現在実用化さ
れている他の三法（１）、（２）及び（３）の方法と比
較して、ヘモグロビンの影響やγ−〇ＴＰの酵素活性値
の変動の問題もない０本発明に係る特定の修飾ＣＤを用
いることにより、極めて効果的に本基質γ−Ｌ−グルタ
ミルーＰ−ニトロアニリドが包接され、飛躍的に基質溶
解性が改善され、且つ溶解後の基質液の安定性も改善さ
れる。また、γ−ＧＴＰの酵素活性は、これにより何ら
の抑制もうけず、容易に定量的にγ−ＧＴＰの酵素活性
測定値を与える。更に１本発明に係る特定の修飾ＣＤを
用いることにより本基質の基質溶解性が１５０ｍＭ以上
と飛躍的に改善されただけでなく、低温に於けるその溶
解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥された基質
製剤の調製も極めて容易となった。（表１参照）以下に
実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明
はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
γ−ＧＴＰの酵素活性の測定値は、従来の酸溶解法の測
定値とよい相関を示しく第１図）、また、現在実用化さ
れている他の三法（１）、（２）及び（３）の方法と比
較して、ヘモグロビンの影響やγ−〇ＴＰの酵素活性値
の変動の問題もない０本発明に係る特定の修飾ＣＤを用
いることにより、極めて効果的に本基質γ−Ｌ−グルタ
ミルーＰ−ニトロアニリドが包接され、飛躍的に基質溶
解性が改善され、且つ溶解後の基質液の安定性も改善さ
れる。また、γ−ＧＴＰの酵素活性は、これにより何ら
の抑制もうけず、容易に定量的にγ−ＧＴＰの酵素活性
測定値を与える。更に１本発明に係る特定の修飾ＣＤを
用いることにより本基質の基質溶解性が１５０ｍＭ以上
と飛躍的に改善されただけでなく、低温に於けるその溶
解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥された基質
製剤の調製も極めて容易となった。（表１参照）以下に
実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明
はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１゜
〔試薬の調製〕
■基質緩衝液
ヘプタキス−（６−Ｏ−ヒドロキシプロピル）−β−シ
クロデキストリン〔一般式［Ｉ］ に於てｍ＝１．ｎ＝
３．Ｘ＝７としたもの〕をｌ０１１ｉ＋ｏｌ／Ｉ、 γ
−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを５ ｇａｏｌ
／Ｉの濃度になるように溶解した０、 １ Ｍ ）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ５−４ｏ）をＩＩ！Ｉした。
クロデキストリン〔一般式［Ｉ］ に於てｍ＝１．ｎ＝
３．Ｘ＝７としたもの〕をｌ０１１ｉ＋ｏｌ／Ｉ、 γ
−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを５ ｇａｏｌ
／Ｉの濃度になるように溶解した０、 １ Ｍ ）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ５−４ｏ）をＩＩ！Ｉした。
■グリシルグリシン溶液
グリシルグリシン １Ｂ２＋ｓｍｏｌ／ｌに水酸化ナト
リウムを加え、Ｐ）１ ８．４０に調製した。
リウムを加え、Ｐ）１ ８．４０に調製した。
試料５０ＩＬｉに基質緩衝液■２．０１を加え、３７℃
で３分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液：↓
、５ｍｌを加えてよく混合後、分光光度肝で４１０ ｎ
ｍの吸光度の増加を測定し、γ−ＧＴＰ活性値を算出し
た。
で３分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液：↓
、５ｍｌを加えてよく混合後、分光光度肝で４１０ ｎ
ｍの吸光度の増加を測定し、γ−ＧＴＰ活性値を算出し
た。
（３）活性値
単位時間（１分間）当りの吸光度の増加ΔＥ／ｗｉｎに
相当するγ−ＧＴＰ活性値（ｍＩＵ）は次式により算出
した。
相当するγ−ＧＴＰ活性値（ｍＩＵ）は次式により算出
した。
ｙ−ＧＴＰ活性値（ｍＩＵ）
比較例１
〔試薬の調製〕
■基質液
γ−Ｌ−グルタミルーＰ−二トロアニリド１ｇａｏｌ
（２８５Ｂ）を０．５ＮｊＪｉ酸１０ｍ１に溶解し、水
で全量５０１とした− （２０ｍＭ溶液）■緩衝液 グリシルグリシンを４０厘厘ｏｆ／Ｉの濃度になるよ−
）ニ溶解１．りｏ、 Ｉ Ｍ トＩＪ ス塩８１衝液（
ｐＨ８，４０）を調製した。
（２８５Ｂ）を０．５ＮｊＪｉ酸１０ｍ１に溶解し、水
で全量５０１とした− （２０ｍＭ溶液）■緩衝液 グリシルグリシンを４０厘厘ｏｆ／Ｉの濃度になるよ−
）ニ溶解１．りｏ、 Ｉ Ｍ トＩＪ ス塩８１衝液（
ｐＨ８，４０）を調製した。
試料５０ｐ文に緩衝液■２．０１を加え、３７℃で３分
間予備加温し、これに基質液■０．５１を加えてよく混
合後、分光光度計で４１０ｎｍの吸光度の増加を測定し
た。
間予備加温し、これに基質液■０．５１を加えてよく混
合後、分光光度計で４１０ｎｍの吸光度の増加を測定し
た。
実施例１．及び比較例１．の方法により、同一の６０検
体のγ−ＧＴＰ活性値を求め（表２）それらの相関関係
を第１図に示す。
体のγ−ＧＴＰ活性値を求め（表２）それらの相関関係
を第１図に示す。
第１図から明らかなように、本発明による測定値は、従
来の酸溶解法の測定値とよい絹瀾を示している。 （
γ−０，９８３，Ｙ−０，ｌ３８３Ｘ−０，８３５）実
施例２゜ 〔試薬の調製〕 ■基質緩衝液 ヘプタキス−（６−０−１，３−ジヒドロキシプロピル
）−β−シクロデキストリン〔一般式［Ｉ］に於てｍ＝
２．ｎ＝３．Ｘ＝７としたもの〕を１０ ｍｍｏｌ／］
、γ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを５ｍｍｏ
ｌ／Ｉの濃度になるように溶解した０、１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，４０）を調製した。
来の酸溶解法の測定値とよい絹瀾を示している。 （
γ−０，９８３，Ｙ−０，ｌ３８３Ｘ−０，８３５）実
施例２゜ 〔試薬の調製〕 ■基質緩衝液 ヘプタキス−（６−０−１，３−ジヒドロキシプロピル
）−β−シクロデキストリン〔一般式［Ｉ］に於てｍ＝
２．ｎ＝３．Ｘ＝７としたもの〕を１０ ｍｍｏｌ／］
、γ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを５ｍｍｏ
ｌ／Ｉの濃度になるように溶解した０、１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，４０）を調製した。
■グリシルグリシン溶液
塩酸でｐＨ８，４０に調製したグリシルグリシン１６２
ｍＭ溶液を調製した。
ｍＭ溶液を調製した。
試料５０ｇ見に基質緩衝液■２．０１を加え、３７℃で
３分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液■０．
５１を加えてよく混合後１分光光度計で４１０ｎｍの吸
光度の増加を測定し、γ−ＧＴＰ活性値を算出した。
３分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液■０．
５１を加えてよく混合後１分光光度計で４１０ｎｍの吸
光度の増加を測定し、γ−ＧＴＰ活性値を算出した。
実施例２．によっても、実施例１．と同様な結果が得ら
れた。
れた。
実施例３゜
〔試薬の調製〕
■基質液
γ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを２００ｍｍ
ｏｌ／ｌ、ヘプタキス−（２，６−ジー０−ヒドロキシ
エチル）−β−シクロデキストリン〔一般式％式％ の〕を４００腸層ｏ１／Ｉの濃度になるように水に溶解
した。この混合液中には、不溶物の存在は全く認められ
ず、基質が完溶していることがわかった。この混合液を
２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥して基質剤を得た。尚、凍
結乾燥基材の調製中、沈澱の析出は全く認められなかっ
た。
ｏｌ／ｌ、ヘプタキス−（２，６−ジー０−ヒドロキシ
エチル）−β−シクロデキストリン〔一般式％式％ の〕を４００腸層ｏ１／Ｉの濃度になるように水に溶解
した。この混合液中には、不溶物の存在は全く認められ
ず、基質が完溶していることがわかった。この混合液を
２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥して基質剤を得た。尚、凍
結乾燥基材の調製中、沈澱の析出は全く認められなかっ
た。
これを、使用時、０．１ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，４０） ２０ ｍｌに溶解し、基質液を調製した。
８，４０） ２０ ｍｌに溶解し、基質液を調製した。
■緩衝液
グリシルグリシンを４０ ｇａｏｌ／Ｉの濃度になるよ
うに溶解した０、 １ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨａ
、ｔｏ）を調製した。
うに溶解した０、 １ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨａ
、ｔｏ）を調製した。
試料５０ＩＬ！Ｌに緩衝液■２．Ｏｍｌを加え、３７℃
で３分間予備加温し、これに基質液■０．５１を加えて
よく混合後、分光光度計で４１Ｏｎ鳳の吸光度の増加を
測定した。
で３分間予備加温し、これに基質液■０．５１を加えて
よく混合後、分光光度計で４１Ｏｎ鳳の吸光度の増加を
測定した。
実施例４゜
〔試薬の調製〕
■基質液
γ−Ｌ−グルタミルーｐ−二トロアニリドを１００ｍｍ
ｏｌ／ｌ、β−シクはデキストリン−エピクロルヒドリ
ン縮合物〔平均分子量約３０００；β−シクロデキスト
リン−エピクロルヒドリンのモル比１：２；一般式［川
に於て、ｋ〜２．ｉ＋ｊキ４と］、たもの〕を２００ｓ
濡ｏ１／ｌの濃度になるように水に溶解した。この混合
液中には、不溶物の存在は全７認められず、基質が完溶
していることがわかった。この混合液を２ｍｌずつ分注
し、凍結乾燥して基質剤を得た。この場合にも、凍結乾
燥基材の調製中、沈澱の析出は全く認められなかった。
ｏｌ／ｌ、β−シクはデキストリン−エピクロルヒドリ
ン縮合物〔平均分子量約３０００；β−シクロデキスト
リン−エピクロルヒドリンのモル比１：２；一般式［川
に於て、ｋ〜２．ｉ＋ｊキ４と］、たもの〕を２００ｓ
濡ｏ１／ｌの濃度になるように水に溶解した。この混合
液中には、不溶物の存在は全７認められず、基質が完溶
していることがわかった。この混合液を２ｍｌずつ分注
し、凍結乾燥して基質剤を得た。この場合にも、凍結乾
燥基材の調製中、沈澱の析出は全く認められなかった。
これを使用時、Ｑ、 Ｉ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，４０）１０１に溶解し、基質液を調製した。
８，４０）１０１に溶解し、基質液を調製した。
■緩衝液
グリシルグリシンを４０鳳諺ｏ１／ｌの濃度になるよう
に溶解したＯ、 ｌ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
４０）を調製した。
に溶解したＯ、 ｌ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
４０）を調製した。
試料５０ｇＭに緩衝液■２．０１を加え、３７℃で３分
間予備加温し、これに基質液■Ｑ、５１Ｉを加えてよく
混合後、分光光度計で４１０ｎｍの吸光度の増加を測定
し、γ−ＧＴＰ活性値を算出した。
間予備加温し、これに基質液■Ｑ、５１Ｉを加えてよく
混合後、分光光度計で４１０ｎｍの吸光度の増加を測定
し、γ−ＧＴＰ活性値を算出した。
実施例３．及び実施例４．からも明らかなように、本発
明の修ｆｉｃＤを用いることにより、本基質γ−グルタ
ミルーｐ−ニトロアニリドを１００〜２００ｍｍｏｌ／
ｌと、飛躍的に可溶化することができ、凍結乾燥をより
効率的に行なうことができた。
明の修ｆｉｃＤを用いることにより、本基質γ−グルタ
ミルーｐ−ニトロアニリドを１００〜２００ｍｍｏｌ／
ｌと、飛躍的に可溶化することができ、凍結乾燥をより
効率的に行なうことができた。
以上述べた如く、本発明は、基質としてγ−Ｌ−グルタ
ミルーｐ−ニトロアニリドを用いるγ−ＧＴＰ活性測定
法に於ける基質の溶解性の問題点を解決した。γ−ＧＴ
Ｐの改善された測定方法を提供するものであり、 １）本発明に係る特定の修＃ＣＤを用いることにより極
めて効果的にγ−Ｌ−グルタミルーｐ−二トロアニリド
が包接され、飛躍的に基質溶解性が改善され、且つ溶解
後の基質液の安定性も改善された点。
ミルーｐ−ニトロアニリドを用いるγ−ＧＴＰ活性測定
法に於ける基質の溶解性の問題点を解決した。γ−ＧＴ
Ｐの改善された測定方法を提供するものであり、 １）本発明に係る特定の修＃ＣＤを用いることにより極
めて効果的にγ−Ｌ−グルタミルーｐ−二トロアニリド
が包接され、飛躍的に基質溶解性が改善され、且つ溶解
後の基質液の安定性も改善された点。
２）γ−ＧＴＰの酵素活性はこれにより何らの抑制も受
けず、容易に且つ定量的にγ−ＧＴＰの酵素活性測定値
を与える点。
けず、容易に且つ定量的にγ−ＧＴＰの酵素活性測定値
を与える点。
３）本発明の修ｆｓＣＤを用いることにより、基質溶解
性が１５０ｍＭ以上と飛躍的に改善され、更に低温に於
けるその溶解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥
された基質製剤の調製も極めて容易となった点。
性が１５０ｍＭ以上と飛躍的に改善され、更に低温に於
けるその溶解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥
された基質製剤の調製も極めて容易となった点。
に顕著な効果を奏する発明であり、斯業に貢献するとこ
ろ大なるものである。
ろ大なるものである。
第１図は、実施例１．（末法）で得られたγ−ＧＴＰの
酵素活性値と比較例１．（酸溶解法）で得られたγ−Ｇ
ＴＰの酵素活性値との相関を表わし、横軸Ｘは比較例１
．に於けるγ−ＧＴＰ活性値（ｎ＞ＩＵ）を、縦軸Ｙは
実施例１．に於けるγ−ＧＴＰ活性値（ｍＩＵ）を夫々
表わす。 特許出願人和光純薬工業株式会社 高 １０ 比彰し＃］ ｔ、 ｔ＝於＋７るｒ−Ｃｔ丁Ｐ５４ａＱ
しｙｎＩυ）特許出願人 相光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和６１年 ８月 ｇ日 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１０００３４号 ２、発明の名称 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ 活性測定方法 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ５４１ 住所大阪府大阪市東区道修町３丁目１０番地連絡先置
０３−２７０−８５７１ ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書１２頁２行目から同頁３行目にかけて記載
の「米国特許第３，４５３，２８５号明細書；」を「米
国特許第３，４５３，２５８号明細書；」と補正する。 （２）明細書１２頁３行目から同頁４行目にかけて記載
の「米国特許第３，４３５，２５９号明細書；」を「米
国特許第３，４５３，２５９号明細書；」と補正する。 （３）明細書１９頁４行目に記載の「塩酸」を「水酸化
ナトリウム」と補正する。 （４）明細書２２頁７行目に記載の「行なうことができ
た。」の後に、改行して以下の文章を挿入する。 「実施例５゜ 試料として、意図的に溶血させた血清（ヘモグロビン濃
度１００，２００，４００，６００，８００．１０００
８９７ｄｔのもの。）及びヘモグロビン濃度Ｏの血清を
用い、実施例１の方法によりγ−ＧＴＰ活性値を測定し
たａ 比較例２゜ 〔試液の調製〕 ｒ−Ｌ−グルタミル−３−カルボキシ−４−二トロアニ
リド３ｍｍｏＪ、グリシルグリシン４０ｍｍａＪ、トリ
スヒドロキシメチルアミノメタン１００ｍｍｏｌを水ｓ
ｏｏｍｇに溶解し、塩酸で−８，０に調整した後、水で
全量１１とした。 〔測定操作〕 試液２゜５ ｍｌを３７℃で３分間予備加温し、これに
試料５０μノを加えてよく混合した後、分光光度計で４
１０ ｎｍの吸光度の増加を測定した。 実施例５．の結果及び、実施例５．と同一の検体を用い
て比較例２．の方法によりγ−ＧＴＰ活性値を求めた結
果を表３に併せて示す。 表３より明らかなように、水溶性基を導入した基質を用
いた比較例２の方法と比べ、本発明の方法は溶血の影響
が遥かに低いことがわかる。」以上
酵素活性値と比較例１．（酸溶解法）で得られたγ−Ｇ
ＴＰの酵素活性値との相関を表わし、横軸Ｘは比較例１
．に於けるγ−ＧＴＰ活性値（ｎ＞ＩＵ）を、縦軸Ｙは
実施例１．に於けるγ−ＧＴＰ活性値（ｍＩＵ）を夫々
表わす。 特許出願人和光純薬工業株式会社 高 １０ 比彰し＃］ ｔ、 ｔ＝於＋７るｒ−Ｃｔ丁Ｐ５４ａＱ
しｙｎＩυ）特許出願人 相光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和６１年 ８月 ｇ日 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１０００３４号 ２、発明の名称 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ 活性測定方法 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ５４１ 住所大阪府大阪市東区道修町３丁目１０番地連絡先置
０３−２７０−８５７１ ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、補正の内容 （１）明細書１２頁２行目から同頁３行目にかけて記載
の「米国特許第３，４５３，２８５号明細書；」を「米
国特許第３，４５３，２５８号明細書；」と補正する。 （２）明細書１２頁３行目から同頁４行目にかけて記載
の「米国特許第３，４３５，２５９号明細書；」を「米
国特許第３，４５３，２５９号明細書；」と補正する。 （３）明細書１９頁４行目に記載の「塩酸」を「水酸化
ナトリウム」と補正する。 （４）明細書２２頁７行目に記載の「行なうことができ
た。」の後に、改行して以下の文章を挿入する。 「実施例５゜ 試料として、意図的に溶血させた血清（ヘモグロビン濃
度１００，２００，４００，６００，８００．１０００
８９７ｄｔのもの。）及びヘモグロビン濃度Ｏの血清を
用い、実施例１の方法によりγ−ＧＴＰ活性値を測定し
たａ 比較例２゜ 〔試液の調製〕 ｒ−Ｌ−グルタミル−３−カルボキシ−４−二トロアニ
リド３ｍｍｏＪ、グリシルグリシン４０ｍｍａＪ、トリ
スヒドロキシメチルアミノメタン１００ｍｍｏｌを水ｓ
ｏｏｍｇに溶解し、塩酸で−８，０に調整した後、水で
全量１１とした。 〔測定操作〕 試液２゜５ ｍｌを３７℃で３分間予備加温し、これに
試料５０μノを加えてよく混合した後、分光光度計で４
１０ ｎｍの吸光度の増加を測定した。 実施例５．の結果及び、実施例５．と同一の検体を用い
て比較例２．の方法によりγ−ＧＴＰ活性値を求めた結
果を表３に併せて示す。 表３より明らかなように、水溶性基を導入した基質を用
いた比較例２の方法と比べ、本発明の方法は溶血の影響
が遥かに低いことがわかる。」以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を測定
するに当り、一般式［ I ］ β−ＣＤ（−ＯＨ）＿２＿１＿−＿Ｘ［−ＯＣ＿ｎＨ＿
２＿ｎ＿−＿（＿ｍ＿−＿１＿）（−ＯＨ）＿ｍ］＿Ｘ
［ I ］〔但し、ＣＤはシクロデキストリン残基を、ｍ
、ｎは夫々ｍ＝１〜１０、ｎ＝１〜５、２ｎ−（ｍ−１
）≧０なる整数を示し、Ｘ＝３〜２１を示す。〕 又は、一般式［II］ ▲数式、化学式、表等があります▼［II］ 〔但し、ｉ＝０〜３、ｊ＝１〜５を示し、ｋ＝２〜５を
示す。〕 で表わされる修飾シクロデキストリンの存在下に、γ−
Ｌ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを基質として用い
ることを特徴とする、γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ活性の測定方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60100034A JPS61260900A (ja) | 1985-05-11 | 1985-05-11 | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法 |
| EP86112097A EP0258473B1 (en) | 1985-05-11 | 1986-09-01 | Process for determination of gamma-gtp activity |
| US06/902,897 US4879221A (en) | 1985-05-11 | 1986-09-02 | Process for determination of γ-GTP activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60100034A JPS61260900A (ja) | 1985-05-11 | 1985-05-11 | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61260900A true JPS61260900A (ja) | 1986-11-19 |
Family
ID=14263240
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60100034A Pending JPS61260900A (ja) | 1985-05-11 | 1985-05-11 | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4879221A (ja) |
| EP (1) | EP0258473B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61260900A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6460400A (en) * | 1987-05-12 | 1989-03-07 | Shino Test Corp | Determination of amylase |
| JPH0284199A (ja) * | 1988-09-20 | 1990-03-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 酸性ホスフアターゼ活性測定用試液 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5116730A (en) * | 1988-06-15 | 1992-05-26 | Board Of Governors Of Wayne State University | Amino acid substituted 4-aminophenazones for measuring enzyme activity |
| US5474906A (en) * | 1993-03-26 | 1995-12-12 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Reagent for determining γ-glutamyl transpeptidase activity |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3453258A (en) * | 1967-02-20 | 1969-07-01 | Corn Products Co | Reaction products of cyclodextrin and unsaturated compounds |
| US3453259A (en) * | 1967-03-22 | 1969-07-01 | Corn Products Co | Cyclodextrin polyol ethers and their oxidation products |
| US4511651A (en) * | 1982-07-30 | 1985-04-16 | American Monitor Corporation | Reagent composition and assay for the determination of γ-glutamyltransferase activity |
| US4596795A (en) * | 1984-04-25 | 1986-06-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services | Administration of sex hormones in the form of hydrophilic cyclodextrin derivatives |
-
1985
- 1985-05-11 JP JP60100034A patent/JPS61260900A/ja active Pending
-
1986
- 1986-09-01 EP EP86112097A patent/EP0258473B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-02 US US06/902,897 patent/US4879221A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6460400A (en) * | 1987-05-12 | 1989-03-07 | Shino Test Corp | Determination of amylase |
| JPH0284199A (ja) * | 1988-09-20 | 1990-03-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 酸性ホスフアターゼ活性測定用試液 |
| JP2797102B2 (ja) * | 1988-09-20 | 1998-09-17 | 和光純薬工業株式会社 | 酸性ホスフアターゼ活性測定用試液 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0258473A1 (en) | 1988-03-09 |
| EP0258473B1 (en) | 1991-07-24 |
| US4879221A (en) | 1989-11-07 |
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