JPS611399A - ｒ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、基５としてＬ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロ
アニリドを用いる、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性の測定方法に関する。

γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下、γ−ＧＴ
Ｐと略称する。）の酵素活性の測定は、臨床８的には肝
胆道疾患の診断、アルコール飲用者のスクリーニングな
どに広く利用され、種々の方法が発表されているが、Ｌ
−γ−グルタミル−ｐ　−ニトロアニリドを基質とする
反応速度測定法が最も一般的であり、現在も盛んに行な
われている０しかしながら、基質のし一γ−グルタミル
−ｐ−ニトロアニリド（以下、本基質という。）は、基
質安定化及び酵素反応の至適ｐＨである中性付近（ｐＨ
−約８．３）に於て極めて溶解性が悪く、そのだめ溶解
度が比較的高い低ｐＨ域で予め基質を充分に溶解してお
き、使用時、中性付近（ｐＨ−約８５）の緩衝液と混合
して使用する酸溶解法が一般的な使用方法である○ このため、本基質は、溶解した強酸により加水分解をう
けて、ブランク値が徐々に上昇し、その製剤の有効期間
は調液後約５時間程度である。

そこで、本基質の溶解性の改善が種々試みられており、
次の（１）〜（３）の方法が夫々提案され、実用化され
ている〇 （１）　　カチオン系界面活性剤又はアニオン系界面活
性剤を添加して基質の水に対する溶解性を改善し、これ
らイオン系界面活性剤の酵素反応阻害作用をノニオン系
界面活性剤で緩和する方法。

（２）本基質の−ＮＯ２基のオルト位に−Ｃ０２Ｈ基、
−８Ｏ３Ｈ基などの水溶性基を付与し、基質の水に対す
る溶解性を改善する方法。

（３）　　シクロデキストリンの包接力を利用して基質
の水に対する溶解性を改善する方法。

しかしながら、これら従来の方法にも種々の欠点が存在
する。

例えば、（１）の界面活性剤を用いる方法では、イオン
系界面活性剤の酵素阻害力が非常に強く、ノニオン系界
面活性剤を添加しても、その回復率は約７０〜８０％で
ある上、界面活性剤の添加によりヘモグロビンの吸収が
経時的に変化し、ｐ−ニトロアニリンの生成速度を追跡
する４　１０　ｎｍでのヘモグロビンの吸収が経時的に
減少するため、結果的に、γ−ＧＴＰの酵素活性測定値
に負誤差を与え、（２）の水溶性基を付与する方法では
、γ−ＧＴＰの酵素活性測定値が高く測定されること及
び基質剤調液後数日で基質が変質し、γ−ＧＴＰの酵素
活性測定値の低下が観測され、場合によっては変質によ
る沈澱が析出する等の問題を生じ、又、（３）のシクロ
デキストリンの包接力を利用する方法では、ヘモグロビ
ンの影響やγ−ＧＴＰの酵素活性測定値の変動の問題は
ないが、肝心の水に対する溶解性の改善が充分ではなく
、特に、シクロデキストリンの基質包接化合物を凍結乾
燥する場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程
度の濃縮液の製剤の調製が限界であり、これら（１）〜
（３）のいずれの方法も、到底、充分に改善された満足
すべき測定方法であるとはいえない現状にある。

ところで、シクロデキストリン（以下、ＣＤと略称する
。）は、Ｄ−グルコビラノースがα−１，４−グルコシ
ド結合により環状に結合した環状オリゴ糖同族体であり
、結合したＤ−グルコビラノースが、６．７及び８個の
、α−ＣＤ、　β−ＣＤ及びγ−ＣＤ、の三種のものが
よく知られている。

これら、一連のＣＤは、水溶液中で有機化合物と混合す
ると速やかに包接体を形成し、製剤の安定化、溶解性の
調節、液状薬品の粉末化、刺激性や悪臭などのマスク、
或いは揮発性の調節等に優れた効果を有する為に、これ
らの用途に広く利用され、その構造は、ＣＤ空洞の一端
の開口部にグルコビラノースの２−及び３−位の−０１
−］を有し、他端の開口部に６−位の−ＯＨを有する、
疎水性ＣＤ空洞を有する環状構造であることが、そのＸ
線解析の結果などから推定されているＯこのＣＤは、で
ん粉或いはでん粉の加水分解物にＢＭＡ　（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ　ａｍｙｌａｓｅ　）を作用
させると、α−１β−１γ−の混合物として得られるが
、近年は、β−ＣＤのみを高収率で与えるＣＤ生成酵素
がＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｌｅｒｉｕｍやＢａｃｉ
ｌｌｕｓ属の好アルカリ性菌のある種のものから見出さ
れ、β−ＣＤが安価に製造されるようになった為、研究
対象としては溶解性が高いα−ＣＤを扱ったものが多い
が、実用的には、製造、分離精製の容易なβ−ＣＤが一
般に用いられるようになっているＯβ−ＣＯの水に対す
る溶解度は、α−ＣＤ、　　γ−ＣＤの溶解度に比べて
著しく低く、例えば、α−ＣＤが０．５℃に於て６．８
係、γ−ＣＤは同温度に於て９．１係溶解するのに対し
、β−ＣＤは僅かに０．８係溶解するにすぎず、又、７
０℃に於てもα−Ｃ，Ｄが８７．６％、γ−ＣＤは実に
１６３．７％溶解するのに対し、β−ＣＤは僅かに１５
．３％溶解するにすぎない。

このようなβ−ＣＤの水に対する溶解度をモル濃度に換
算すると、０．５℃に於て７ｍＭ、７０℃に於て１３５
　ｍＭとなり、ホスト分子β−ＣＤによって包接された
水難溶性ゲスト分子の水溶解性は、当然、このβ−ＣＤ
の溶解度以下に限られる〇一方、本基質Ｌ−γ−グルタ
ミル−ｐ−ニトロアニリドはＣＤによって包接され、本
基質単独では、水又は緩衝液に対して、精々４ｍＭまで
の溶解性しか示さなかったのに対し、ＣＤ　０．３　％
（Ｗ／ｖ）の添加で１６ｍＭ（４倍以上）という本基質
単独の場合と比べれば、比較的高い溶解度を得ることが
できることが知られている。（特開昭５７−７４０９９
号公報。） しかしながら、この程度の溶解度では水溶性の改善は充
分ではなく、鋳に、ＣＤ本基質包接化合物を凍結乾燥す
る場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程度の
濃縮液の製剤の調製が限界であり、到底、満足すべきも
のではないことは、既に述べたとおりである。

かかる状況に於て、本発明者らは、本基質り一γ−グル
タミル−ｐ−ニトロアニリドの水溶性を充分満足すべき
程度に改善する方法として、低温での水溶解性にすぐれ
た、メチル基で修飾されたシクロデキストリンの使用に
着目した。

しかしながら、本基質り一γ−グルタミル−１−ニトロ
アニリドがＣＤによって包接されたからといって、ＣＨ
３基のような置換基を導入したＣＤが、本基質を効果的
に包接するとはいえない。

即ち、包接体形成機構に関しては、従来から種々の分子
間力の関与が提唱され、ＣＤ包接体形成には分散力、双
極子開力、水素結合、疎水結合、電荷移動力等種々の分
子間力の一部またはすべてが関与している可能性があり
、それ故分子の化学構造が相違すれば、当然、その包接
体形成機構も相違し、又、だとえ包接体が形成されたと
しても、ゲスト分子である本基質り一γ−グルタミル−
ｐ−ニトロアニリド全体が、或いはγ−ＧＴＰとの酵素
反応活性部位が１、ホスト分子であるＣＤ空洞内に包接
され、酵素反応が抑制されてしまうおそれが存在する。

（有機合成化学　第３５巻第２号１１９（３７）頁及び
１２３　（４１）頁（１９７７）Ｏ）本発明者らは、前
記欠点を解決すべく鋭意研究の結果、基質としてＬ−γ
−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを用いるγ−ＧＴＰ
Ｏ測定方法に於て、β−ＣＤ　（−ＯＲ）２ｓ−ｍ　（
−０ＣＨ３）ｍ　［：但し、ｍ−１０〜２１を示す。］
なる特定の修飾ＣＤが、本基質り一γ−グルタミル−ｐ
−ニトロアニリドを効果的に包接し、且つ包接された本
基質に対するγ−ＧＴＰＯ酵素活性は何ら抑制されるこ
となく、従ってこのような特定の修飾ＣＤの存在下に、
本基質り一γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを基質
として用いると、本基質の水溶性が飛躍的に改善される
ばかりでなく、γ−〇ＴＰの酵素活性を容易に定量的に
測定することができることを見出し、本発明を完成する
に到った。

即ち、本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γ−ＧＴＰ　）の酵素活性を測定するに当り、β−Ｃ
Ｄ（ＯＨ）２１−ｍ（−０ＣＨ３）ｍ［但し、ｍ−１０
〜２１を示す。〕なる修修飾シクロデキストリンの存在
下に、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを基質
として用いることを特徴とする、γ−グルタミルトラン
スペプチターゼ（γ−ＧＴＰ　）活性の測定方法である
。

本発明は、上記特定の修飾ＣＤを本基質り一γ−グルタ
ミル−ｐ−ニトロアニリドと共にγ−ＧＴＰの酵素反応
系に存在させる点に特徴を有する発明であり、γ−ＧＴ
Ｐの酵素活性の測定操作自体は、グリシルグリンンなど
のグルタミン酸の受容体の存在下に汎用の緩衝液（トリ
ス−塩酸緩衝液など。）中で反応させる一般法に従うと
と゛で足りる。

本発明に用いる特定の修飾ＣＤとは、一般式β−ＣＤ　
（−ＯＨ）２１−ｍ　（−０ＣＨ３）ｍで表わされるも
ので、ｍは通常１０〜２１、好ましくは１２〜２１であ
り、これらは、例えば、５ｔａｒｃｈ　／ｓ＋Ｍｒｋｅ
　　３２（１９８０）Ｎｒ、５．　８．１６５−１６９
　；　Ｂ、Ｃａ５ｕ　　ｅＬ、ａ＋、、Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ、　　２４゜８０３　（１９６８）’、Ｈ，５
ｃｈｅｎｋ　　ｅＬ、ａｔ、、Ａｂｓｌｒ。

Ｐａｐ、Ａｍｅｒ、Ｓｏｃ、、　　１４９．’ＩＩＣ（
１９６５）等に記載の一般的製造方法により、容易に製
造することができる。

本基質及びこれら本発明に係る特定の修飾ＣＤを用いる
γ−ＧＴＰＯ酵素活性の測定値は、従来の酸溶解法の測
定値とよい相関を示しく第１図、）、又、現在実用化さ
れている他の三法（１）、（２）及び（３）の方法と比
較して、ヘモグロビンの影響やγ−ＧＴＰＯ酵素活性値
の変動の問題もない。本発明に係る特定の修飾ＣＤを用
いることにより、極めて効果的に本基質り一γ−グルタ
ミル−ｐ−ニトロアニリドが包接され、飛躍的に基質溶
解性が改善され、且つ溶解後の基質液の安定性も改善さ
れる。又、γ−ＧＴＰＯ酵素活性は、これにより伺らの
抑制をもうけず、容易に定量的にγ−ＧＴＰＯ酵素活性
測定値を与える。更に、本発明に係る特定の修飾ＣＤを
用いることにより本基質の基質溶解性が４００ｍＭ以上
と飛躍的に改善されただけでなく、低温に於けるその溶
解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥された基質
製剤の調製も極めて容易となった。（表１参照） 以上述べたとおり、本発明は、現在盛んに行なわれてい
る、Ｌ−γ−ダルタミルーｐ−ニトロアニリドを基質と
するγ−ＧＴＰの酵素活性測定法に於て、本発明に係る
特定の修飾ＣＤを用いることにより、従来の方法を極め
て効果的に改良したものであり、斯業に貢献するところ
大なるものである０ 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。

実施例１ （１）試薬の調製 ■　基質緩衝液 ヘプタキス−（２，３，６−１リ−０−メチル）−β−
シクロデキストリン［ｍ＝２１置換体〕を１０ｍＭＸ　
Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを５ｍＭの濃
度になるように溶解した、０、１　Ｍ　）リス塩酸緩衝
液（ｐＩ−１８，４０）を調製するＯ ■　グリシルグリシン＠液 塩酸でｐＨ８，４，０に調整したグリシルグリシン１６
２ｍＭ溶液を調製する。

（２）測定操作 試料５０μｌに基質緩衝液■２．０７７＋７！を加え、
３７℃で３分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶
液■０．５７を加えてよく混合後、分光光度計で４１０
　ｎｍの吸光度の増加を測定し、γ−ＧＴＰ活性値を算
出する。

（３）活性値 単位時間（１分間）当りの吸光度の増加ΔＥ／ｍ　Ｉ　
ｎに相当するγ−ＧＴＰ活性値（ｍＩＵ　）は次式で与
えられる。

γ−ＧＴＰ活性値（ｍＩＵ） 比較例１ （１）試薬の調製 ■　基質液：Ｌ−γ−ダルタミルーｐ−二トロアニリド
１　ｍｍｏｊ？（２８５ｍＬりを０．５Ｎ塩酸１０ｔｎ
、ｌに溶解し、水で全量５０ｍ１とする。（２０ｍＭ溶
液） ■　緩衝液ニゲリシルグリシンを４０ｍＭの濃度になる
ように溶解した、０．ＩＭＦリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
４０）を調製する。

（２）　　測定操作 試料５０μｔに緩衝液■２．０−を加え、３７℃で３分
間予備加温し、これに基質液■０．５　ｍを加えてよく
混合後、分光光度計で４１０　ｎｍの吸光度の増加を測
定する。

実施例１．及び比較例１．　の方法により、同一の６０
検体のγ−ＧＴＰ活性値を求め（表２）、それらの相関
関係を第１図に示す。

第１図から明らかなように、本発明による測定値は、従
来の酸溶解法の測定値とよい相関を示しているｏ　（ｒ
＝０．９９８８．Ｙ＝１．０１６Ｘ＋１．１．５６） 表　　　　　２ 実施例２ （１）　　試薬の調製 ■　基質緩衝液 ヘプタキス−（２，６−ジー０−メチル−β−シクロデ
キストリン（ｍ　＝　１４置換体〕を１０ｍ１ｖｌ、Ｌ
−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを５ｍＭの濃度
になるように溶解した、０．１Ｍ　トＩ）ス塩酸緩衝液
（ｐＨ８，４０）を調製する。

■　グリシルグリシン溶液 塩酸でｐＨ８，４０に調整したクリシルク９２２１６２
ｍＭ心液を調製する。

（２）測定操作 試料５０μｔに基質緩衝液■２．０−を加え、３７℃で
３分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液■０．
５　ｒｎｌを加えてよく混合後、分光光度計で４１０　
ｎｍの吸光度の増加を測定し、γ−ＧＴＰ活性値を算出
する。

実施例２．によっても、実施例１　と同様な結果が得ら
れた。

実施例３ （１）試薬の調製 ■　基質液＝Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド
を２００ｍＭ１ヘプタキス−（２，３゜６−　）　ＩＪ
−０−メチル）−β−シクロデキストリン［ｍ＝２１置
換体〕を４００　ｍＭの濃度になるように水に溶解する
。この混合液中には、不溶物の存在は全く認められず、
基質が完溶していることがわかる。この混合液を２−ず
つ分注し、凍結乾燥して基質剤を得る。伺、凍結乾燥中
、沈澱の析出は全く認められない。

これを、使用時、０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８、４
０）　２０−に醇解し、基質液を調製する。

■　緩衝液ニゲリシルグリシンを４ＱｍＭの濃度になる
ように溶解した、０．１Ｍ）ＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，４０）を調製する。

（２）　　測定操作 試料５０μｔに緩衝液■２．　Ｏｍｌを加え、３７℃で
３分間予備加温し、これに基質液■０．５−を加えてよ
く混合後、分光光度計で４１０　ｎｍの吸光度の増加を
測定する。

実施例４ （１）試薬の調製 ■　基質液：Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド
を２００　ｍＭ、ヘプタキス−（２，６−ジー０−メチ
ル−β−シクロデキストリン〔ｍ＝１４置換体〕を４０
０　ｍＭの濃度になるように水に溶解する。この混合液
中には、不溶物の存在は全く認められず、基質が完溶し
ていることがわかる。この混合液を２ｍｌ＋ずつ分注し
、凍結乾燥して基質剤を得る０この場合も、凍結乾燥中
、沈澱の析出は全く認められない。これを使用時、０．
ＩＭＦリス塩酸緩衝１（１）Ｈ８，４０）　２０ｍｌ！
、に溶解し、基質液を調製する。

■　緩衝液ニゲリシルグリシンを４０ｍＭ（７）濃度に
なるように溶解した、０１Ｍトリス塩酸緩衝！（ｐＨ８
，４０）を調製する。

（２）測定操作 試料５０μＬに緩衝液の２．０ｍｌを加え、３７℃で３
分間予備加温し、これに基質液■０．５−を加えてよく
混合後、分光光度計で４１０ｎｍの吸光度の増加を測定
し、γ−ＧＴＰ活性値を算出する０ 実施例３．及び実施例４．からも明らかなように、本発
明の修飾ＣＤを用いることにより、本基質γ−グルタミ
ル−ｐ−ニトロアニリドを、２００ｍＭと、飛躍的に可
鹸化することができ、凍結乾燥をより効率的に行なうこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１．（拳法）で得られたγ−ＧＴＰの
酵素活性値と比較例１．（酸溶解法）で得られだγ−Ｇ
ＴＰの酵素活性値との相関を表わし、横軸Ｘは比較例１
．　に於けるγ−０ＴＰ活性値（ｍＩＵ　）を、縦軸Ｙ
は実施例１．に於けるγ−ＧＴＰ活性値（ｍＩＵ　）を
表わす。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 ！１　図 比較例１．に於けるγ−ＧＴＰ活性値（ｍＩＵ）手続補
正書 昭和〆θ年　７月／２日 １　事件の表示 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡装置　０３−２７０−１１５７１ ５、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、及び発明の詳細な説明の
欄。 ６、補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２）明細書８頁１０行目から同頁１１１行目かけて記
載の「β−ＣＤ（−０Ｈ）２１−ｍ（−０ＣＨ３）ｆｆ
ｌ［但し、ｍ＝１０〜２１を示す。］」を「β−Ｃｙｄ
（−０Ｈ）２１−＋ａ（−０ＣＨ３）ｍ［但し、Ｇｙｄ
はシクロデキストリン残基を示し、ｍ＝１０〜２１を示
す。］」と補正する。 （３）明細書９頁３行目から同頁４行目にかけて記載の
「β−ＣＤ（−０Ｈ）２１１（−０ＣＨ３）ＩＩｌｒ但
し、ｍ＝ｌ０〜２１を示す。］」を「β−Ｃｙｄ（−０
８）２＋−ｍ（−０ＣＨ３）１１１［但し、Ｇｙｄはシ
クロデキストリン残基を示しｌｍ＝１０〜２１を示す。 ］」と補正する。 （４）明細書９頁１７行目から同頁１８８行目かけて記
載の「β−ＣＤ（ＯＨ）２１−１ｍ（−０ＧＨ３）ＢＪ
を「β−ｃｙｃｔ（−ｏ）１）２１１（−０Ｃ）１３）
。」と補正する。 （５）明細書１１頁の表１中の方法の欄に記載の（２）
水溶性基法に於ける基質「Ｌ−γ−Ｇ−ｐ−Ｎ−〇−カ
ルボン酸」を「Ｌ−γ−Ｑ　−ｐ　−Ｎ　−ｍ　−カル
ボン酸」と補正し、又「Ｌ−γ−Ｇ−ｐ−Ｎ−〇−スル
ホン酸」を「Ｌ−γ−Ｇ−ｐ　−Ｎ　−ｍ−スルホン酸
」と補正する。 以上 別　　　紙 ２、特許請求の範囲 γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を測定
するに当り、β−ごｄ（−ＯＨ）２１−＋ａ（−ＣＩＣ
：Ｈ３）ｍｍ−１０〜２１を示す。］なる修修飾シクロ
デキストリンの存在下に、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニ
トロアニリドを基質として用いることを特徴とする、γ
−グルタミルトランスペプチダーゼ活性のｌｌ定方！去
。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を測定
   するに当り、β−ＣＤ（−ＯＨ）＿２＿１−ｍ（−ＯＣ
   Ｈ＿３）ｍ〔但し、ｍ＝１０〜２１を示す。〕なる修飾
   シクロデキストリンの存在下に、Ｌ−γ−グルタミル−
   ｐ−ニトロアニリドを基質として用いることを特徴とす
   る、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測定方
   法。