JPS611399A - r−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法 - Google Patents
r−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法Info
- Publication number
- JPS611399A JPS611399A JP10192784A JP10192784A JPS611399A JP S611399 A JPS611399 A JP S611399A JP 10192784 A JP10192784 A JP 10192784A JP 10192784 A JP10192784 A JP 10192784A JP S611399 A JPS611399 A JP S611399A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substrate
- glutamyl
- nitroanilide
- present
- solubility
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、基5としてL−γ−グルタミル−p−ニトロ
アニリドを用いる、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性の測定方法に関する。
アニリドを用いる、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性の測定方法に関する。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(以下、γ−GT
Pと略称する。)の酵素活性の測定は、臨床8的には肝
胆道疾患の診断、アルコール飲用者のスクリーニングな
どに広く利用され、種々の方法が発表されているが、L
−γ−グルタミル−p −ニトロアニリドを基質とする
反応速度測定法が最も一般的であり、現在も盛んに行な
われている0しかしながら、基質のし一γ−グルタミル
−p−ニトロアニリド(以下、本基質という。)は、基
質安定化及び酵素反応の至適pHである中性付近(pH
−約8.3)に於て極めて溶解性が悪く、そのだめ溶解
度が比較的高い低pH域で予め基質を充分に溶解してお
き、使用時、中性付近(pH−約85)の緩衝液と混合
して使用する酸溶解法が一般的な使用方法である○ このため、本基質は、溶解した強酸により加水分解をう
けて、ブランク値が徐々に上昇し、その製剤の有効期間
は調液後約5時間程度である。
Pと略称する。)の酵素活性の測定は、臨床8的には肝
胆道疾患の診断、アルコール飲用者のスクリーニングな
どに広く利用され、種々の方法が発表されているが、L
−γ−グルタミル−p −ニトロアニリドを基質とする
反応速度測定法が最も一般的であり、現在も盛んに行な
われている0しかしながら、基質のし一γ−グルタミル
−p−ニトロアニリド(以下、本基質という。)は、基
質安定化及び酵素反応の至適pHである中性付近(pH
−約8.3)に於て極めて溶解性が悪く、そのだめ溶解
度が比較的高い低pH域で予め基質を充分に溶解してお
き、使用時、中性付近(pH−約85)の緩衝液と混合
して使用する酸溶解法が一般的な使用方法である○ このため、本基質は、溶解した強酸により加水分解をう
けて、ブランク値が徐々に上昇し、その製剤の有効期間
は調液後約5時間程度である。
そこで、本基質の溶解性の改善が種々試みられており、
次の(1)〜(3)の方法が夫々提案され、実用化され
ている〇 (1) カチオン系界面活性剤又はアニオン系界面活
性剤を添加して基質の水に対する溶解性を改善し、これ
らイオン系界面活性剤の酵素反応阻害作用をノニオン系
界面活性剤で緩和する方法。
次の(1)〜(3)の方法が夫々提案され、実用化され
ている〇 (1) カチオン系界面活性剤又はアニオン系界面活
性剤を添加して基質の水に対する溶解性を改善し、これ
らイオン系界面活性剤の酵素反応阻害作用をノニオン系
界面活性剤で緩和する方法。
(2)本基質の−NO2基のオルト位に−C02H基、
−8O3H基などの水溶性基を付与し、基質の水に対す
る溶解性を改善する方法。
−8O3H基などの水溶性基を付与し、基質の水に対す
る溶解性を改善する方法。
(3) シクロデキストリンの包接力を利用して基質
の水に対する溶解性を改善する方法。
の水に対する溶解性を改善する方法。
しかしながら、これら従来の方法にも種々の欠点が存在
する。
する。
例えば、(1)の界面活性剤を用いる方法では、イオン
系界面活性剤の酵素阻害力が非常に強く、ノニオン系界
面活性剤を添加しても、その回復率は約70〜80%で
ある上、界面活性剤の添加によりヘモグロビンの吸収が
経時的に変化し、p−ニトロアニリンの生成速度を追跡
する4 10 nmでのヘモグロビンの吸収が経時的に
減少するため、結果的に、γ−GTPの酵素活性測定値
に負誤差を与え、(2)の水溶性基を付与する方法では
、γ−GTPの酵素活性測定値が高く測定されること及
び基質剤調液後数日で基質が変質し、γ−GTPの酵素
活性測定値の低下が観測され、場合によっては変質によ
る沈澱が析出する等の問題を生じ、又、(3)のシクロ
デキストリンの包接力を利用する方法では、ヘモグロビ
ンの影響やγ−GTPの酵素活性測定値の変動の問題は
ないが、肝心の水に対する溶解性の改善が充分ではなく
、特に、シクロデキストリンの基質包接化合物を凍結乾
燥する場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程
度の濃縮液の製剤の調製が限界であり、これら(1)〜
(3)のいずれの方法も、到底、充分に改善された満足
すべき測定方法であるとはいえない現状にある。
系界面活性剤の酵素阻害力が非常に強く、ノニオン系界
面活性剤を添加しても、その回復率は約70〜80%で
ある上、界面活性剤の添加によりヘモグロビンの吸収が
経時的に変化し、p−ニトロアニリンの生成速度を追跡
する4 10 nmでのヘモグロビンの吸収が経時的に
減少するため、結果的に、γ−GTPの酵素活性測定値
に負誤差を与え、(2)の水溶性基を付与する方法では
、γ−GTPの酵素活性測定値が高く測定されること及
び基質剤調液後数日で基質が変質し、γ−GTPの酵素
活性測定値の低下が観測され、場合によっては変質によ
る沈澱が析出する等の問題を生じ、又、(3)のシクロ
デキストリンの包接力を利用する方法では、ヘモグロビ
ンの影響やγ−GTPの酵素活性測定値の変動の問題は
ないが、肝心の水に対する溶解性の改善が充分ではなく
、特に、シクロデキストリンの基質包接化合物を凍結乾
燥する場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程
度の濃縮液の製剤の調製が限界であり、これら(1)〜
(3)のいずれの方法も、到底、充分に改善された満足
すべき測定方法であるとはいえない現状にある。
ところで、シクロデキストリン(以下、CDと略称する
。)は、D−グルコビラノースがα−1,4−グルコシ
ド結合により環状に結合した環状オリゴ糖同族体であり
、結合したD−グルコビラノースが、6.7及び8個の
、α−CD、 β−CD及びγ−CD、の三種のものが
よく知られている。
。)は、D−グルコビラノースがα−1,4−グルコシ
ド結合により環状に結合した環状オリゴ糖同族体であり
、結合したD−グルコビラノースが、6.7及び8個の
、α−CD、 β−CD及びγ−CD、の三種のものが
よく知られている。
これら、一連のCDは、水溶液中で有機化合物と混合す
ると速やかに包接体を形成し、製剤の安定化、溶解性の
調節、液状薬品の粉末化、刺激性や悪臭などのマスク、
或いは揮発性の調節等に優れた効果を有する為に、これ
らの用途に広く利用され、その構造は、CD空洞の一端
の開口部にグルコビラノースの2−及び3−位の−01
−]を有し、他端の開口部に6−位の−OHを有する、
疎水性CD空洞を有する環状構造であることが、そのX
線解析の結果などから推定されているOこのCDは、で
ん粉或いはでん粉の加水分解物にBMA (Bacil
lus macerans amylase )を作用
させると、α−1β−1γ−の混合物として得られるが
、近年は、β−CDのみを高収率で与えるCD生成酵素
がBacillus megaleriumやBaci
llus属の好アルカリ性菌のある種のものから見出さ
れ、β−CDが安価に製造されるようになった為、研究
対象としては溶解性が高いα−CDを扱ったものが多い
が、実用的には、製造、分離精製の容易なβ−CDが一
般に用いられるようになっているOβ−COの水に対す
る溶解度は、α−CD、 γ−CDの溶解度に比べて
著しく低く、例えば、α−CDが0.5℃に於て6.8
係、γ−CDは同温度に於て9.1係溶解するのに対し
、β−CDは僅かに0.8係溶解するにすぎず、又、7
0℃に於てもα−C,Dが87.6%、γ−CDは実に
163.7%溶解するのに対し、β−CDは僅かに15
.3%溶解するにすぎない。
ると速やかに包接体を形成し、製剤の安定化、溶解性の
調節、液状薬品の粉末化、刺激性や悪臭などのマスク、
或いは揮発性の調節等に優れた効果を有する為に、これ
らの用途に広く利用され、その構造は、CD空洞の一端
の開口部にグルコビラノースの2−及び3−位の−01
−]を有し、他端の開口部に6−位の−OHを有する、
疎水性CD空洞を有する環状構造であることが、そのX
線解析の結果などから推定されているOこのCDは、で
ん粉或いはでん粉の加水分解物にBMA (Bacil
lus macerans amylase )を作用
させると、α−1β−1γ−の混合物として得られるが
、近年は、β−CDのみを高収率で与えるCD生成酵素
がBacillus megaleriumやBaci
llus属の好アルカリ性菌のある種のものから見出さ
れ、β−CDが安価に製造されるようになった為、研究
対象としては溶解性が高いα−CDを扱ったものが多い
が、実用的には、製造、分離精製の容易なβ−CDが一
般に用いられるようになっているOβ−COの水に対す
る溶解度は、α−CD、 γ−CDの溶解度に比べて
著しく低く、例えば、α−CDが0.5℃に於て6.8
係、γ−CDは同温度に於て9.1係溶解するのに対し
、β−CDは僅かに0.8係溶解するにすぎず、又、7
0℃に於てもα−C,Dが87.6%、γ−CDは実に
163.7%溶解するのに対し、β−CDは僅かに15
.3%溶解するにすぎない。
このようなβ−CDの水に対する溶解度をモル濃度に換
算すると、0.5℃に於て7mM、70℃に於て135
mMとなり、ホスト分子β−CDによって包接された
水難溶性ゲスト分子の水溶解性は、当然、このβ−CD
の溶解度以下に限られる〇一方、本基質L−γ−グルタ
ミル−p−ニトロアニリドはCDによって包接され、本
基質単独では、水又は緩衝液に対して、精々4mMまで
の溶解性しか示さなかったのに対し、CD 0.3 %
(W/v)の添加で16mM(4倍以上)という本基質
単独の場合と比べれば、比較的高い溶解度を得ることが
できることが知られている。(特開昭57−74099
号公報。) しかしながら、この程度の溶解度では水溶性の改善は充
分ではなく、鋳に、CD本基質包接化合物を凍結乾燥す
る場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程度の
濃縮液の製剤の調製が限界であり、到底、満足すべきも
のではないことは、既に述べたとおりである。
算すると、0.5℃に於て7mM、70℃に於て135
mMとなり、ホスト分子β−CDによって包接された
水難溶性ゲスト分子の水溶解性は、当然、このβ−CD
の溶解度以下に限られる〇一方、本基質L−γ−グルタ
ミル−p−ニトロアニリドはCDによって包接され、本
基質単独では、水又は緩衝液に対して、精々4mMまで
の溶解性しか示さなかったのに対し、CD 0.3 %
(W/v)の添加で16mM(4倍以上)という本基質
単独の場合と比べれば、比較的高い溶解度を得ることが
できることが知られている。(特開昭57−74099
号公報。) しかしながら、この程度の溶解度では水溶性の改善は充
分ではなく、鋳に、CD本基質包接化合物を凍結乾燥す
る場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程度の
濃縮液の製剤の調製が限界であり、到底、満足すべきも
のではないことは、既に述べたとおりである。
かかる状況に於て、本発明者らは、本基質り一γ−グル
タミル−p−ニトロアニリドの水溶性を充分満足すべき
程度に改善する方法として、低温での水溶解性にすぐれ
た、メチル基で修飾されたシクロデキストリンの使用に
着目した。
タミル−p−ニトロアニリドの水溶性を充分満足すべき
程度に改善する方法として、低温での水溶解性にすぐれ
た、メチル基で修飾されたシクロデキストリンの使用に
着目した。
しかしながら、本基質り一γ−グルタミル−1−ニトロ
アニリドがCDによって包接されたからといって、CH
3基のような置換基を導入したCDが、本基質を効果的
に包接するとはいえない。
アニリドがCDによって包接されたからといって、CH
3基のような置換基を導入したCDが、本基質を効果的
に包接するとはいえない。
即ち、包接体形成機構に関しては、従来から種々の分子
間力の関与が提唱され、CD包接体形成には分散力、双
極子開力、水素結合、疎水結合、電荷移動力等種々の分
子間力の一部またはすべてが関与している可能性があり
、それ故分子の化学構造が相違すれば、当然、その包接
体形成機構も相違し、又、だとえ包接体が形成されたと
しても、ゲスト分子である本基質り一γ−グルタミル−
p−ニトロアニリド全体が、或いはγ−GTPとの酵素
反応活性部位が1、ホスト分子であるCD空洞内に包接
され、酵素反応が抑制されてしまうおそれが存在する。
間力の関与が提唱され、CD包接体形成には分散力、双
極子開力、水素結合、疎水結合、電荷移動力等種々の分
子間力の一部またはすべてが関与している可能性があり
、それ故分子の化学構造が相違すれば、当然、その包接
体形成機構も相違し、又、だとえ包接体が形成されたと
しても、ゲスト分子である本基質り一γ−グルタミル−
p−ニトロアニリド全体が、或いはγ−GTPとの酵素
反応活性部位が1、ホスト分子であるCD空洞内に包接
され、酵素反応が抑制されてしまうおそれが存在する。
(有機合成化学 第35巻第2号119(37)頁及び
123 (41)頁(1977)O)本発明者らは、前
記欠点を解決すべく鋭意研究の結果、基質としてL−γ
−グルタミル−p−ニトロアニリドを用いるγ−GTP
O測定方法に於て、β−CD (−OR)2s−m (
−0CH3)m [:但し、m−10〜21を示す。]
なる特定の修飾CDが、本基質り一γ−グルタミル−p
−ニトロアニリドを効果的に包接し、且つ包接された本
基質に対するγ−GTPO酵素活性は何ら抑制されるこ
となく、従ってこのような特定の修飾CDの存在下に、
本基質り一γ−グルタミル−p−ニトロアニリドを基質
として用いると、本基質の水溶性が飛躍的に改善される
ばかりでなく、γ−〇TPの酵素活性を容易に定量的に
測定することができることを見出し、本発明を完成する
に到った。
123 (41)頁(1977)O)本発明者らは、前
記欠点を解決すべく鋭意研究の結果、基質としてL−γ
−グルタミル−p−ニトロアニリドを用いるγ−GTP
O測定方法に於て、β−CD (−OR)2s−m (
−0CH3)m [:但し、m−10〜21を示す。]
なる特定の修飾CDが、本基質り一γ−グルタミル−p
−ニトロアニリドを効果的に包接し、且つ包接された本
基質に対するγ−GTPO酵素活性は何ら抑制されるこ
となく、従ってこのような特定の修飾CDの存在下に、
本基質り一γ−グルタミル−p−ニトロアニリドを基質
として用いると、本基質の水溶性が飛躍的に改善される
ばかりでなく、γ−〇TPの酵素活性を容易に定量的に
測定することができることを見出し、本発明を完成する
に到った。
即ち、本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
(γ−GTP )の酵素活性を測定するに当り、β−C
D(OH)21−m(−0CH3)m[但し、m−10
〜21を示す。〕なる修修飾シクロデキストリンの存在
下に、L−γ−グルタミル−p−ニトロアニリドを基質
として用いることを特徴とする、γ−グルタミルトラン
スペプチターゼ(γ−GTP )活性の測定方法である
。
(γ−GTP )の酵素活性を測定するに当り、β−C
D(OH)21−m(−0CH3)m[但し、m−10
〜21を示す。〕なる修修飾シクロデキストリンの存在
下に、L−γ−グルタミル−p−ニトロアニリドを基質
として用いることを特徴とする、γ−グルタミルトラン
スペプチターゼ(γ−GTP )活性の測定方法である
。
本発明は、上記特定の修飾CDを本基質り一γ−グルタ
ミル−p−ニトロアニリドと共にγ−GTPの酵素反応
系に存在させる点に特徴を有する発明であり、γ−GT
Pの酵素活性の測定操作自体は、グリシルグリンンなど
のグルタミン酸の受容体の存在下に汎用の緩衝液(トリ
ス−塩酸緩衝液など。)中で反応させる一般法に従うと
と゛で足りる。
ミル−p−ニトロアニリドと共にγ−GTPの酵素反応
系に存在させる点に特徴を有する発明であり、γ−GT
Pの酵素活性の測定操作自体は、グリシルグリンンなど
のグルタミン酸の受容体の存在下に汎用の緩衝液(トリ
ス−塩酸緩衝液など。)中で反応させる一般法に従うと
と゛で足りる。
本発明に用いる特定の修飾CDとは、一般式β−CD
(−OH)21−m (−0CH3)mで表わされるも
ので、mは通常10〜21、好ましくは12〜21であ
り、これらは、例えば、5tarch /s+Mrke
32(1980)Nr、5. 8.165−169
; B、Ca5u eL、a+、、Tetrahe
dron、 24゜803 (1968)’、H,5
chenk eL、at、、Abslr。
(−OH)21−m (−0CH3)mで表わされるも
ので、mは通常10〜21、好ましくは12〜21であ
り、これらは、例えば、5tarch /s+Mrke
32(1980)Nr、5. 8.165−169
; B、Ca5u eL、a+、、Tetrahe
dron、 24゜803 (1968)’、H,5
chenk eL、at、、Abslr。
Pap、Amer、Soc、、 149.’IIC(
1965)等に記載の一般的製造方法により、容易に製
造することができる。
1965)等に記載の一般的製造方法により、容易に製
造することができる。
本基質及びこれら本発明に係る特定の修飾CDを用いる
γ−GTPO酵素活性の測定値は、従来の酸溶解法の測
定値とよい相関を示しく第1図、)、又、現在実用化さ
れている他の三法(1)、(2)及び(3)の方法と比
較して、ヘモグロビンの影響やγ−GTPO酵素活性値
の変動の問題もない。本発明に係る特定の修飾CDを用
いることにより、極めて効果的に本基質り一γ−グルタ
ミル−p−ニトロアニリドが包接され、飛躍的に基質溶
解性が改善され、且つ溶解後の基質液の安定性も改善さ
れる。又、γ−GTPO酵素活性は、これにより伺らの
抑制をもうけず、容易に定量的にγ−GTPO酵素活性
測定値を与える。更に、本発明に係る特定の修飾CDを
用いることにより本基質の基質溶解性が400mM以上
と飛躍的に改善されただけでなく、低温に於けるその溶
解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥された基質
製剤の調製も極めて容易となった。(表1参照) 以上述べたとおり、本発明は、現在盛んに行なわれてい
る、L−γ−ダルタミルーp−ニトロアニリドを基質と
するγ−GTPの酵素活性測定法に於て、本発明に係る
特定の修飾CDを用いることにより、従来の方法を極め
て効果的に改良したものであり、斯業に貢献するところ
大なるものである0 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。
γ−GTPO酵素活性の測定値は、従来の酸溶解法の測
定値とよい相関を示しく第1図、)、又、現在実用化さ
れている他の三法(1)、(2)及び(3)の方法と比
較して、ヘモグロビンの影響やγ−GTPO酵素活性値
の変動の問題もない。本発明に係る特定の修飾CDを用
いることにより、極めて効果的に本基質り一γ−グルタ
ミル−p−ニトロアニリドが包接され、飛躍的に基質溶
解性が改善され、且つ溶解後の基質液の安定性も改善さ
れる。又、γ−GTPO酵素活性は、これにより伺らの
抑制をもうけず、容易に定量的にγ−GTPO酵素活性
測定値を与える。更に、本発明に係る特定の修飾CDを
用いることにより本基質の基質溶解性が400mM以上
と飛躍的に改善されただけでなく、低温に於けるその溶
解性が著しく向上したことにより、凍結乾燥された基質
製剤の調製も極めて容易となった。(表1参照) 以上述べたとおり、本発明は、現在盛んに行なわれてい
る、L−γ−ダルタミルーp−ニトロアニリドを基質と
するγ−GTPの酵素活性測定法に於て、本発明に係る
特定の修飾CDを用いることにより、従来の方法を極め
て効果的に改良したものであり、斯業に貢献するところ
大なるものである0 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。
実施例1
(1)試薬の調製
■ 基質緩衝液
ヘプタキス−(2,3,6−1リ−0−メチル)−β−
シクロデキストリン[m=21置換体〕を10mMX
L−γ−グルタミル−p−ニトロアニリドを5mMの濃
度になるように溶解した、0、1 M )リス塩酸緩衝
液(pI−18,40)を調製するO ■ グリシルグリシン@液 塩酸でpH8,4,0に調整したグリシルグリシン16
2mM溶液を調製する。
シクロデキストリン[m=21置換体〕を10mMX
L−γ−グルタミル−p−ニトロアニリドを5mMの濃
度になるように溶解した、0、1 M )リス塩酸緩衝
液(pI−18,40)を調製するO ■ グリシルグリシン@液 塩酸でpH8,4,0に調整したグリシルグリシン16
2mM溶液を調製する。
(2)測定操作
試料50μlに基質緩衝液■2.077+7!を加え、
37℃で3分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶
液■0.57を加えてよく混合後、分光光度計で410
nmの吸光度の増加を測定し、γ−GTP活性値を算
出する。
37℃で3分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶
液■0.57を加えてよく混合後、分光光度計で410
nmの吸光度の増加を測定し、γ−GTP活性値を算
出する。
(3)活性値
単位時間(1分間)当りの吸光度の増加ΔE/m I
nに相当するγ−GTP活性値(mIU )は次式で与
えられる。
nに相当するγ−GTP活性値(mIU )は次式で与
えられる。
γ−GTP活性値(mIU)
比較例1
(1)試薬の調製
■ 基質液:L−γ−ダルタミルーp−二トロアニリド
1 mmoj?(285mLりを0.5N塩酸10tn
、lに溶解し、水で全量50m1とする。(20mM溶
液) ■ 緩衝液ニゲリシルグリシンを40mMの濃度になる
ように溶解した、0.IMFリス塩酸緩衝液(pH8,
40)を調製する。
1 mmoj?(285mLりを0.5N塩酸10tn
、lに溶解し、水で全量50m1とする。(20mM溶
液) ■ 緩衝液ニゲリシルグリシンを40mMの濃度になる
ように溶解した、0.IMFリス塩酸緩衝液(pH8,
40)を調製する。
(2) 測定操作
試料50μtに緩衝液■2.0−を加え、37℃で3分
間予備加温し、これに基質液■0.5 mを加えてよく
混合後、分光光度計で410 nmの吸光度の増加を測
定する。
間予備加温し、これに基質液■0.5 mを加えてよく
混合後、分光光度計で410 nmの吸光度の増加を測
定する。
実施例1.及び比較例1. の方法により、同一の60
検体のγ−GTP活性値を求め(表2)、それらの相関
関係を第1図に示す。
検体のγ−GTP活性値を求め(表2)、それらの相関
関係を第1図に示す。
第1図から明らかなように、本発明による測定値は、従
来の酸溶解法の測定値とよい相関を示しているo (r
=0.9988.Y=1.016X+1.1.56) 表 2 実施例2 (1) 試薬の調製 ■ 基質緩衝液 ヘプタキス−(2,6−ジー0−メチル−β−シクロデ
キストリン(m = 14置換体〕を10m1vl、L
−γ−グルタミル−p−ニトロアニリドを5mMの濃度
になるように溶解した、0.1M トI)ス塩酸緩衝液
(pH8,40)を調製する。
来の酸溶解法の測定値とよい相関を示しているo (r
=0.9988.Y=1.016X+1.1.56) 表 2 実施例2 (1) 試薬の調製 ■ 基質緩衝液 ヘプタキス−(2,6−ジー0−メチル−β−シクロデ
キストリン(m = 14置換体〕を10m1vl、L
−γ−グルタミル−p−ニトロアニリドを5mMの濃度
になるように溶解した、0.1M トI)ス塩酸緩衝液
(pH8,40)を調製する。
■ グリシルグリシン溶液
塩酸でpH8,40に調整したクリシルク922162
mM心液を調製する。
mM心液を調製する。
(2)測定操作
試料50μtに基質緩衝液■2.0−を加え、37℃で
3分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液■0.
5 rnlを加えてよく混合後、分光光度計で410
nmの吸光度の増加を測定し、γ−GTP活性値を算出
する。
3分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液■0.
5 rnlを加えてよく混合後、分光光度計で410
nmの吸光度の増加を測定し、γ−GTP活性値を算出
する。
実施例2.によっても、実施例1 と同様な結果が得ら
れた。
れた。
実施例3
(1)試薬の調製
■ 基質液=L−γ−グルタミル−p−ニトロアニリド
を200mM1ヘプタキス−(2,3゜6− ) IJ
−0−メチル)−β−シクロデキストリン[m=21置
換体〕を400 mMの濃度になるように水に溶解する
。この混合液中には、不溶物の存在は全く認められず、
基質が完溶していることがわかる。この混合液を2−ず
つ分注し、凍結乾燥して基質剤を得る。伺、凍結乾燥中
、沈澱の析出は全く認められない。
を200mM1ヘプタキス−(2,3゜6− ) IJ
−0−メチル)−β−シクロデキストリン[m=21置
換体〕を400 mMの濃度になるように水に溶解する
。この混合液中には、不溶物の存在は全く認められず、
基質が完溶していることがわかる。この混合液を2−ず
つ分注し、凍結乾燥して基質剤を得る。伺、凍結乾燥中
、沈澱の析出は全く認められない。
これを、使用時、01Mトリス塩酸緩衝液(pH8、4
0) 20−に醇解し、基質液を調製する。
0) 20−に醇解し、基質液を調製する。
■ 緩衝液ニゲリシルグリシンを4QmMの濃度になる
ように溶解した、0.1M)IJス塩酸緩衝液(pH8
,40)を調製する。
ように溶解した、0.1M)IJス塩酸緩衝液(pH8
,40)を調製する。
(2) 測定操作
試料50μtに緩衝液■2. Omlを加え、37℃で
3分間予備加温し、これに基質液■0.5−を加えてよ
く混合後、分光光度計で410 nmの吸光度の増加を
測定する。
3分間予備加温し、これに基質液■0.5−を加えてよ
く混合後、分光光度計で410 nmの吸光度の増加を
測定する。
実施例4
(1)試薬の調製
■ 基質液:L−γ−グルタミル−p−ニトロアニリド
を200 mM、ヘプタキス−(2,6−ジー0−メチ
ル−β−シクロデキストリン〔m=14置換体〕を40
0 mMの濃度になるように水に溶解する。この混合液
中には、不溶物の存在は全く認められず、基質が完溶し
ていることがわかる。この混合液を2ml+ずつ分注し
、凍結乾燥して基質剤を得る0この場合も、凍結乾燥中
、沈澱の析出は全く認められない。これを使用時、0.
IMFリス塩酸緩衝1(1)H8,40) 20ml!
、に溶解し、基質液を調製する。
を200 mM、ヘプタキス−(2,6−ジー0−メチ
ル−β−シクロデキストリン〔m=14置換体〕を40
0 mMの濃度になるように水に溶解する。この混合液
中には、不溶物の存在は全く認められず、基質が完溶し
ていることがわかる。この混合液を2ml+ずつ分注し
、凍結乾燥して基質剤を得る0この場合も、凍結乾燥中
、沈澱の析出は全く認められない。これを使用時、0.
IMFリス塩酸緩衝1(1)H8,40) 20ml!
、に溶解し、基質液を調製する。
■ 緩衝液ニゲリシルグリシンを40mM(7)濃度に
なるように溶解した、01Mトリス塩酸緩衝!(pH8
,40)を調製する。
なるように溶解した、01Mトリス塩酸緩衝!(pH8
,40)を調製する。
(2)測定操作
試料50μLに緩衝液の2.0mlを加え、37℃で3
分間予備加温し、これに基質液■0.5−を加えてよく
混合後、分光光度計で410nmの吸光度の増加を測定
し、γ−GTP活性値を算出する0 実施例3.及び実施例4.からも明らかなように、本発
明の修飾CDを用いることにより、本基質γ−グルタミ
ル−p−ニトロアニリドを、200mMと、飛躍的に可
鹸化することができ、凍結乾燥をより効率的に行なうこ
とができる。
分間予備加温し、これに基質液■0.5−を加えてよく
混合後、分光光度計で410nmの吸光度の増加を測定
し、γ−GTP活性値を算出する0 実施例3.及び実施例4.からも明らかなように、本発
明の修飾CDを用いることにより、本基質γ−グルタミ
ル−p−ニトロアニリドを、200mMと、飛躍的に可
鹸化することができ、凍結乾燥をより効率的に行なうこ
とができる。
第1図は、実施例1.(拳法)で得られたγ−GTPの
酵素活性値と比較例1.(酸溶解法)で得られだγ−G
TPの酵素活性値との相関を表わし、横軸Xは比較例1
. に於けるγ−0TP活性値(mIU )を、縦軸Y
は実施例1.に於けるγ−GTP活性値(mIU )を
表わす。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 !1 図 比較例1.に於けるγ−GTP活性値(mIU)手続補
正書 昭和〆θ年 7月/2日 1 事件の表示 2 発明の名称 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 連絡装置 03−270−11571 5、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、及び発明の詳細な説明の
欄。 6、補正の内容 (1)特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 (2)明細書8頁10行目から同頁111行目かけて記
載の「β−CD(−0H)21−m(−0CH3)ff
l[但し、m=10〜21を示す。]」を「β−Cyd
(−0H)21−+a(−0CH3)m[但し、Gyd
はシクロデキストリン残基を示し、m=10〜21を示
す。]」と補正する。 (3)明細書9頁3行目から同頁4行目にかけて記載の
「β−CD(−0H)211(−0CH3)IIlr但
し、m=l0〜21を示す。]」を「β−Cyd(−0
8)2+−m(−0CH3)111[但し、Gydはシ
クロデキストリン残基を示しlm=10〜21を示す。 ]」と補正する。 (4)明細書9頁17行目から同頁188行目かけて記
載の「β−CD(OH)21−1m(−0GH3)BJ
を「β−cyct(−o)1)211(−0C)13)
。」と補正する。 (5)明細書11頁の表1中の方法の欄に記載の(2)
水溶性基法に於ける基質「L−γ−G−p−N−〇−カ
ルボン酸」を「L−γ−Q −p −N −m −カル
ボン酸」と補正し、又「L−γ−G−p−N−〇−スル
ホン酸」を「L−γ−G−p −N −m−スルホン酸
」と補正する。 以上 別 紙 2、特許請求の範囲 γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を測定
するに当り、β−ごd(−OH)21−+a(−CIC
:H3)mm−10〜21を示す。]なる修修飾シクロ
デキストリンの存在下に、L−γ−グルタミル−p−ニ
トロアニリドを基質として用いることを特徴とする、γ
−グルタミルトランスペプチダーゼ活性のll定方!去
。 以上
酵素活性値と比較例1.(酸溶解法)で得られだγ−G
TPの酵素活性値との相関を表わし、横軸Xは比較例1
. に於けるγ−0TP活性値(mIU )を、縦軸Y
は実施例1.に於けるγ−GTP活性値(mIU )を
表わす。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 !1 図 比較例1.に於けるγ−GTP活性値(mIU)手続補
正書 昭和〆θ年 7月/2日 1 事件の表示 2 発明の名称 3 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 連絡装置 03−270−11571 5、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、及び発明の詳細な説明の
欄。 6、補正の内容 (1)特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 (2)明細書8頁10行目から同頁111行目かけて記
載の「β−CD(−0H)21−m(−0CH3)ff
l[但し、m=10〜21を示す。]」を「β−Cyd
(−0H)21−+a(−0CH3)m[但し、Gyd
はシクロデキストリン残基を示し、m=10〜21を示
す。]」と補正する。 (3)明細書9頁3行目から同頁4行目にかけて記載の
「β−CD(−0H)211(−0CH3)IIlr但
し、m=l0〜21を示す。]」を「β−Cyd(−0
8)2+−m(−0CH3)111[但し、Gydはシ
クロデキストリン残基を示しlm=10〜21を示す。 ]」と補正する。 (4)明細書9頁17行目から同頁188行目かけて記
載の「β−CD(OH)21−1m(−0GH3)BJ
を「β−cyct(−o)1)211(−0C)13)
。」と補正する。 (5)明細書11頁の表1中の方法の欄に記載の(2)
水溶性基法に於ける基質「L−γ−G−p−N−〇−カ
ルボン酸」を「L−γ−Q −p −N −m −カル
ボン酸」と補正し、又「L−γ−G−p−N−〇−スル
ホン酸」を「L−γ−G−p −N −m−スルホン酸
」と補正する。 以上 別 紙 2、特許請求の範囲 γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を測定
するに当り、β−ごd(−OH)21−+a(−CIC
:H3)mm−10〜21を示す。]なる修修飾シクロ
デキストリンの存在下に、L−γ−グルタミル−p−ニ
トロアニリドを基質として用いることを特徴とする、γ
−グルタミルトランスペプチダーゼ活性のll定方!去
。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 γ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性を測定
するに当り、β−CD(−OH)_2_1−m(−OC
H_3)m〔但し、m=10〜21を示す。〕なる修飾
シクロデキストリンの存在下に、L−γ−グルタミル−
p−ニトロアニリドを基質として用いることを特徴とす
る、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測定方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10192784A JPS611399A (ja) | 1984-05-21 | 1984-05-21 | r−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10192784A JPS611399A (ja) | 1984-05-21 | 1984-05-21 | r−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS611399A true JPS611399A (ja) | 1986-01-07 |
Family
ID=14313543
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10192784A Pending JPS611399A (ja) | 1984-05-21 | 1984-05-21 | r−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS611399A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63129999A (ja) * | 1986-11-20 | 1988-06-02 | Shinotesuto Kenkyusho:Kk | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法 |
-
1984
- 1984-05-21 JP JP10192784A patent/JPS611399A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63129999A (ja) * | 1986-11-20 | 1988-06-02 | Shinotesuto Kenkyusho:Kk | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Reynolds et al. | Inhibition of venom phospholipases A2 by manoalide and manoalogue. Stoichiometry of incorporation. | |
JPS611399A (ja) | r−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定法 | |
JPH0424999B2 (ja) | ||
JPS61236802A (ja) | 新規な分岐γ―サイクロデキストリンの製造方法 | |
Whelan et al. | The amylase of Clostridium butyricum | |
US3694318A (en) | Substrate and method for alpha-amylase assay | |
EP0989189B1 (en) | Reagent compositions for assaying electrolytes | |
JP2838866B2 (ja) | 酸化発色分析における還元物質の活性抑制方法 | |
JP3310008B2 (ja) | オリゴ糖酸化酵素、オリゴ糖酸化酵素の製造方法、オリゴ糖の測定方法、オリゴ糖酸の製造方法、アミラーゼ活性測定法及び新規微生物 | |
JPS61260900A (ja) | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定方法 | |
JPS5931699A (ja) | α−アミラ−ゼ活性の測定法 | |
JPH0373276B2 (ja) | ||
JPS5939300A (ja) | α−アミラ−ゼ活性の測定方法 | |
JPS60160896A (ja) | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性の測定方法 | |
Serre et al. | Specific assay of α-dextrin 6-glucanohydrolase using labeled pullulan | |
Grunwald et al. | Immobilized bovine lactose synthase A method of topographical analysis of the active site | |
JP3124435B2 (ja) | α‐アミラーゼアイソザイム活性の分別定量法 | |
EP0104780A1 (en) | Measurement of alpha-amylase activity | |
JPS63214193A (ja) | 6−グルコシルマルトオリゴ糖誘導体の製法およびそれを用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 | |
JP2562085B2 (ja) | 酵素の安定化方法 | |
JP3511211B2 (ja) | アミラーゼ活性測定用試薬 | |
JPS60120984A (ja) | 耐熱性サイクロデキストリン・グリコシルトランスフェラ−ゼ及びその製造方法 | |
JP3862034B2 (ja) | グルコースの測定方法 | |
JPH04229196A (ja) | α‐アミラーゼアイソザイム活性の分別定量法 | |
JP3120892B2 (ja) | α−アミラーゼの活性測定用試薬 |