JPS61227598A - 選定蛋白質およびそれをコードする組替えｄｎａ分子 - Google Patents

選定蛋白質およびそれをコードする組替えｄｎａ分子

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JPS61227598A
JPS61227598A JP61066115A JP6611586A JPS61227598A JP S61227598 A JPS61227598 A JP S61227598A JP 61066115 A JP61066115 A JP 61066115A JP 6611586 A JP6611586 A JP 6611586A JP S61227598 A JPS61227598 A JP S61227598A
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bacterial gene
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 褒肌盆既！ 外賓もしくは細胞外の細菌蛋白質に対するプラスミドも
しくはファージ遺伝子を開裂させ、成熟核細胞からのた
とえばインシュリンのような選定蛋白質またはその一部
についての遺伝情−報を伝える二重鎖ＤＮＡ配列を組替
えＤＮＡ技術により開裂遺伝子中に組み込み、これを使
用して細菌を形質転換させ、分泌された選定蛋白質を回
収する。
この発明はアメリカ合衆国厚生および文部省の認可補助
の下に行なわれた研究の成果である。
この発明は、特定の蛋白質を細菌中に生成させ、これを
細菌細胞から分泌させる方法に関するものであり、さら
に詳細には所望の非細菌性蛋白質またはその一部を再現
するＤＮＡを組替え技術により外質蛋白質もしくは細胞
外蛋白質（以後、「キャリヤ蛋白質」と云う）に関する
プラスミドもしくはファージ遺伝子中に組み込み、この
組替えた遺伝子により細菌宿主を形質転換させ、そして
形質転換された宿主を培養して蛋白質を分泌させる方法
に関するものである。
このようにして生成された蛋白質は、キャリヤ蛋白質遺
伝子の選択に応じて常法により培養基からまたは外賓空
間から回収することができる。
特定蛋白質を再現するＤＮＡを細胞内蛋白質に関する遺
伝子中に組み込むことは公知である〔イタクラ等、サイ
エンス、第１９８巻、第１０５６〜１０６３頁（１９７
７））。しかしながら、この場合の問題点は、このよう
にして作られた蛋白質は他の細胞内蛋白質と混ざり合い
、したがって細胞内の酵素により劣化され、その結果所
望の蛋白質生成物を純粋な形で得る際問題が生ずるとい
うことである。
前記の問題点を解消するため、本発明によれば選定蛋白
質またはその一部を再現するＤＮＡを細菌遺伝子中に組
み込むことにより選定蛋白質またはその一部を製造する
に際し、細胞外もしくは外賓のキャリヤ蛋白質に対する
細菌遺伝子を開裂させ、選定蛋白質またはその一部にっ
いての遺伝情報を伝える非細菌性ＤＮＡ断片を組替え手
段により開裂位置に組み込み、組替えられた遺伝子によ
り細菌宿主を形質転換させ、この形質転換された細菌を
培養して選定蛋白質またはその一部を分泌させることを
特徴とする選定蛋白質またはその一部の製造方法が提供
される。
実例として、キャリヤ蛋白質のアミノ酸末端に疏水性ア
ミノ酸のリーダー配列（１ｅａｄｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
）を有しかつ通常キャリヤ蛋白質を生成する細胞の膜を
通して分泌され、しかもこの分泌の際に疏水性リーダー
配列の開裂を伴なうようなこのキャリヤ蛋白質に関する
遺伝子を使用して選定蛋白質を生成させることができ、
この生成蛋白質をキャリヤ蛋白質の選択に応じて外賓空
間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　５ｐａｃｅ　）から或い
は細菌を繁殖させた培養基から回収することができる。
このようにして、細菌内における他の蛋白質による汚染
が避けられると共に異質蛋白質を劣化させるような細菌
細胞内の酵素を避けることにより大きな安定性が達成さ
れる。
本発明において使用しうるキャリヤ蛋白質に関する細菌
遺伝子としては、抗生物質耐性に関する遺伝子、たとえ
ばペニシリン耐性に関する遺伝子すなわちベニシリナー
ゼ、クロラムフェニコール耐性に関する遺伝子、或いは
テトラサイクリン耐性に関する遺伝子ならびにアルカリ
フォスファターゼに関する遺伝子およびバクテリアリボ
ヌクレアーゼに関する遺伝子が挙げられる。
各種の蛋白質もしくはその部分についての遺伝情報を伝
える遺伝子すなわちＤＮＡ断片を、本発明の方法により
細菌性キャリヤ蛋白質遺伝子に組み込むことができる。
上記の各種の蛋白質には、たとえば成熟核（真核）細胞
蛋白質およびウィルス蛋白質のような各種の非細菌性蛋
白質が包含される。特に重要なものは、たとえばインシ
ュリン、ヒト生育ホルモン、インターフェロンなど医薬
活性蛋白質のような成熟核細胞蛋白質である。これらは
、それぞれ各遺伝子によりアミノ酸末端に一連の疏水性
アミノ酸を有するプレ蛋白質（すなわち先駆蛋白質）と
して合成される。この疏水性リーダー配列は、細菌膜を
通して分泌される細菌蛋白質のリーダー配列と同一では
ない。したがって、ブレインシュリンなど高級細胞のプ
レ蛋白質が疏水性リーダー配列を有するという事実があ
り、しかもそのようなプレ蛋白質がたとえば細菌細胞内
で合成され得たとしても、このプレ蛋白質を細菌細胞内
で発達完成させ得ると期待することはできない。さらに
、本発明の方法は、細菌細胞内における成熟核細胞の完
成蛋白質（これらは有用であることが知られている）の
合成とその分泌を与える他に、産業上興味のあるその他
の細胞外生成物を細菌細胞内で合成しかつそこから生成
物を分泌することをも可能にさせる。これら生成物とし
ては、融合蛋白質および上記したようなキャリヤ蛋白質
よりなる融合蛋白質が挙げられ、これらは特定の決定因
子たとえばウィルス抗原　（たとえばコート蛋白質など
ウィルスの抗原蛋白質）を担持する。これら後者の融合
蛋白質はワクチン製造に有用であり、かつその抗原特性
のためウィルスに対して特異的な免疫反応の発生を誘起
させることができる。この種のワクチンは、如何なる生
ウィルスもまた不活性ウィルス材料も含有していないの
で、極めて安全である。さらに、この方法によれば、培
養によって繁殖させ得ないようなウィルスに対してもワ
クチンを作ることが可能である。
以下、実施例により本発明を一層詳細に説明するが、こ
れにより本発明は制限を受けるものではない。
実施例 キャリヤ蛋白質として、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ。
大腸菌）・ペニシリナーゼを使用し、これに対する遺伝
子を小さいプラスミドｐＢＲ３２２上に担持させた。こ
の遺伝子の制限酵素地図を図中に示す。このプラスミド
ベクターは、ポリヴアール等により記載されている（Ｂ
ｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｇｅｎｅ＋２．９５〜１
１３　（１９７７））、宿主細菌としては、イー・コリ
　（Ｅ、ｃｏｌｉＸ　１７７６＊〕を使用した〔カーチ
ス等、イン・レコンビナント・モレキュール：インパク
ト・オン・サイエンス・アンド・ソサイエティー、プロ
シーディンゲス・オン・テンス・マイルス・インターナ
ショナルシンポジウム、ベールス・アンド・バセント、
４５〜５６　　（１９７７）　　：　Ｃｕｒｔｉｓｓｅ
ｔ　ａｌ　、　ｉｎ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　Ｍｏ
１ｅｃｕｌｅｓ　：　Ｉｍｐａｃｔｏｎ　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　ａｎｄ　５ｏｃｉｅｔｙ　、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｔｅｎｔｈ　Ｍｉｌｅｓ　Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　＋ｅｄｓ、
　Ｂｅｅｒｓ　＆Ｒａ５ｓｅｔｔ　＋　４５〜５６　（
１９７７）　）。
＊　　Ｅ、ｃｏｌｉＸ　１７７６はアメリカ合衆国、メ
リーランド州、ロックヴイルのアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託されて一般に使用しうる
状態におがれており、ＡＴＣＣＮ［１３１２４４が付与
されたものである。
宿主−ベクターの組合せは確証されたＥＫ２システムで
あり、これはアメリカ合衆国ナショナル・インスチチュ
ート・オン・ヘルス（Ｎ　Ｔ　Ｈ）により１９７７年７
月７日付で保証されたちのである。
プラスミドは、図中に示すように、アミノ酸１８１およ
び１８２の位置に対応してペニシリナーゼ遺伝子のＰｓ
ｔＣプロビデンシア・スチュアルティイ・エンドヌクレ
アーゼ（ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａｓｔｕａｒｔｌｉ　ｅ
ｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　）　）制限位置を有する。
二重鎖ｃＤＮＡを、Ｘ線誘発させた移植可能のラッテＢ
−細胞腫瘍から単離されたプレプロインシュリンｍＲＮ
Ａ　（ＰＰ　Ｉ−ｍＲＮＡ）を含有するＲＮＡから合成
した〔チック等、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミ−・サイエンス・ＵＳＡ　（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、）、
７４゜６２８−６３２　（１９７７）：Ｃｈｉｃｋｅｔ
ａｌ　、。
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　Ｕ
ＳＡ）　、凍結腫瘍スライス物の各２０ｇを乳鉢と乳棒
により滅菌砂と共に磨砕し、Ｍｇ　　での沈澱によりボ
スト−ヌクレア（ｐｏｓｔ　−ｎｕｃｌｅａｒ　）上澄
液から細胞質ＲＮＡを精製し〔バルミター、バイオケミ
ストリー、１３，３６０３〜ｊ６１５（１９７４）：　
Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　＋
次いでフェノ−ルとクロロホルムで抽出した。このＲＮ
ＡをアリゴーｄＴ−セルロース・クロマトグラフィーに
よりさらに精製し〔アヴイブ等、Ｐ、Ｎ、Ａ。
Ｓ、、６９．１４０８−１４１２　（１９７２））、二
重鎖ｃＤＮＡ合成に対するひな型としてそのまま使用し
た〔エフストラチアディス等、セル。
７、　２７９〜２８８　（１９７６）　　ＨＥｆｓｔｒ
ａｔｉａｄｉｓｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ）が、ただし特
定のＰ　（ｄＴ）ｇｄＧ−ｄＣブライマー（共同研究）
を用いて逆転写させた。ＲＮＡとブライマーの濃度はそ
れぞれ７■／μｌおよび１■／μｌであった。全ての４
種のα−Ｐ−ｄＮＴＰｓは１．２５ｍＭであった（最終
比活性０．８５Ｃｉ／ｓモル）。逆転写はＲＮＡインプ
ットの２％であり、その２５％が二重鎖ＤＮＡ生成物中
に最終的に回収された。
二重鎖ｃＤＮＡを次の手順によりプラスミドｐＢＲ３２
２のＰｓｔ位置に組み込んだ。すなわち、ｐＢＲ３２２
ＤＮＡ　（５，Ｏｐｇ）をＰｓｔで線状化し、約１５ｄ
Ｇ残基を１ｍＭの００２＋〔ロイチョウドハリー等、核
酸研究、３．１０１〜１１６（１９７６））およびオー
トクレーブにかけた１００μｇ／ｍｌのゼラチンの存在
下に１５℃で末端トランスフェラーゼにより３　末端に
対して付加した。同じ手順を用いてｄＣ残基を２．０μ
ｇの二重鎖ｃＤＮＡに付加した。反応混合物をフェノー
ルで抽出し、エタノールで沈澱させた。ｄＣ末端の二重
鎖ｃＤＮＡを６％ポリアクリルアミドゲル中において自
然条件下で電気泳動させた。放射線写真に従って、３０
０〜６００塩基対の寸法範囲の分子（０，５μｇ）をゲ
ルから溶出させた〔エフストラチアジス等、メソッド・
イン・モレキュラー・バイオロジー、８、　１〜１２４
　（１９７６）　　；　ＩＥｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ　
ｅｔａｌ、＋ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）　＊溶出された二重鎖ｃ
ＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮し、ｐＨ８のトリス
緩衝液１０ｍＭ中に再溶解させ、ｄＧ末端のｐＢＲ３２
２の５μｇと混合し、次いで０．１ＭのＮａＣｊ！、１
０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８の１０ｍＭのトリスに対して
透析した。次いで、混合物（４ｍｌ）を５６°の温度で
２分間加熱し、４２°の温度でアニールを２時間行なっ
た。このハイブリッドＤＮＡを使用してイー・コリＸ１
７７６を形質転換させた。
オリゴｄＣ−ｄＧ結合を用いて、後に組み込みを行ない
うるようにＰｓｔカットを再生させる。
イー・コリＸ１７７６の形質転換（ｐＢＲ３２２を有す
るＥＫ−２宿主、ＥＫ−２ベクター）を、フィーデラル
レジスター（Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｉｓｔｅｒ）中に
１９７６年７月７日付で発行された組替えＤＮＡ研究に
関するＮ、１．Ｈ，ガイドラインに従って、Ｐ３物理的
封鎖施設における生物学的安全装置内で行なった。
イー・コリＸ１７７６をトランスフェクション法〔エネ
ア等、ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー
、９６．４９５〜５０９（１９７５）　　；Ｂｎｅａｅ
ｔａｌ　、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）により
形質転換させたが、ただしこの方法を次のように僅かに
変えた。すなわち、イー・コリＸ１７７６を、１０μｇ
／ｍｌのジアミノ−ピメリン酸と４０μｇ／ｍｌのチア
ミジン（シグマ）とをＡ　５９０が０．５になるよう加
えたＬ型培養基〔トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、
ＮａＣ４２５ｇ（ディフコ社）〕中で繁殖させた。２０
０ｍ１部の細胞を３０００　ｒｐ−にて沈降させ、Ｍ　
ｎ　Ｃ１２７０ｍＭとｐＨ５，６のＮａＡｃ４０ｍＭと
Ｃａ　Ｃ１ｇＬ３０ｍＭとを含有する冷緩衝液１／１０
容量中にスワールにより再懸濁させ、氷上に２０分間保
った。これら細胞を再ペレット化し、次いで同じ緩衝液
における元の容量の１／３０中に再懸濁させた。アニー
ルされたＤＮＡ　（２ｍｌ）　ヲこれら細胞に加えた。
この混合物の一部（０，３ｍ１）を滅菌試験管中に入れ
て氷上で６０分間培養した。次いでこの細胞を３７°の
温度に２分間置いた。培養基を各試験管に加え（０，７
ｍｌ）、この試験管を温度３７°で１５分間培養した。
２００μｍ部の細胞を、テトラサイクリン１５μｇ／ｎ
＋１を含有する寒天板の上に置かれた滅菌ニトロセルロ
ースフィルター（ミリボア社）の上に展延させた〔この
フィルターは使用前に煮沸して洗剤を除去した〕。この
寒天板を３７゜で４８時間培養した。フィルターのレプ
リカを作った。形質転換体を含有するニトロセルロース
フィルターを寒天から外し、滅菌ワットマン濾紙の層上
に置いた。コロニーを含むフィルターの上部に新たな無
菌フィルターを置き、無菌ベルベット布と二重ブロック
とを用いて圧力をかけた。無菌針を用いてフィルターを
止めた。
第二のフィルターを新たな寒天板の上に置き、３７°で
４８時間培養した。第一のフィルター上のコロニーをグ
ルンスタインーホグネス（Ｐ。
Ｎ、Ａ、Ｓ、７２．３９６１−３９６５　（１９７５）
）の技術によりスクリーニングし、この場合試料として
はラッチのオリゴ−ｄＴ結合ＲＮＡから転写された高比
活性ｃＤＮＡの　Ｈａ　ｅＷ１切断により生成された８
０ヌクレオチソド長さの断片を使用した。陽性コロニー
を次のようにしてハルト（ＨＡＲＴ）法〔パターマン等
、Ｐ、Ｎ。
Ａ、Ｓ、７４．４３７０〜４３７４　（１９７７）　）
により再スクリーニングにかけた。プラスミドＤＮＡ　
（約３μｇ）をＰｓｔで切断させ、エタノール沈澱させ
、次いで２０μｌのジオン化ホルムアミド中に直接に熔
解させた。９５°で１分間加熱した後、各試料を氷上に
置いた。１．５μｇのオリゴ（ｄＴ）−セルロース結合
ＲＮＡと１０ｍＭまでのｐＨ６，４のパイブス（ＰＩＦ
ＥＳ）と０．４ＭまでのＮａＣｆとを添加した後、混合
物を５０°で２時間培養した。次いで、これを水７５μ
Ｅの添加により希釈し、１０μｇの麦芽ｔＲＮＡの存在
下でエタノール沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、
Ｈ，Ｏ中に溶解させ、麦芽の無細胞翻訳混合物に加えた
〔ロバート等、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　７ｏ、２３３０〜２
３３４（１９７３））。２３℃で３時間の後、２μβづ
つ２回取り出してトリクロル酢酸により沈澱させ、残余
の反応混合物をリボヌクレアーゼで処理し、免疫分析用
緩衝液で希釈し、そして二重抗体免疫沈澱〔ロメジコ等
、核酸研究、３．３８１〜３９１　（１９７６）　　；
　Ｌｏｎ＋５ｄｉｃ。
ｅｔ　ａｌ　＋ｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、）により免疫反応性プレプロインシュリンの合成の
分析を行なった。洗浄した免疫沈澱物を１ｍｌの　ＮＣ
３（アメルシャム）中に熔解させ、液体シンチレーショ
ンにより１０μｌのオムニフルオール（Ｏｍｎｉｆｌｕ
ｏｒ）　　（−ニー・イングランド・ヌクレア）中で計
数した。
１つのコロニーをハルト・スクリーニング法で同定した
。Ｐｓｔに作用しうるインサートは、マキサムおよびギ
ルバートの方法（Ｐ、Ｎ、Ａ。
Ｓ、７４．５６０〜５６４　（１９７７））により配列
決定を行なって、それがラッチのプレプロインシュリン
■の配列に相当することを示した。ニックトランスレー
ション（Ｎ１ｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　）によりＤ
ＮＡポリメラーゼＩでラベルしたこのインサートを使用
して、グルンスタインーホグネス分析法により２００種
の形質転換体をスクリーニングした。ラッチのプレプロ
インシュリンｃＤＮＡプローブにバイブリド化する４８
種のクローンが同定された。
形質転換されたイー・コリＸ１７７６のこれら４８種の
クローンをその場で放射線免疫技術によりスクリーニン
グして、これらクローンがインシュリン抗原を生成して
いるかどうか、またこれらクローンが融合ポリペプ多イ
ド鎖〔この−末端はインシュリン抗原であり、他端はペ
ニシリナーゼ（バクテリヤキャリヤ蛋白質）抗原である
〕を生成しているがどうかを決定した。
融合ポリペブタイド鎖が存在することは、これらクロー
ンがペニシリナーゼに関するバクテリヤ遺伝子とインシ
ュリンに関する成熟核細胞遺伝子との融合生成物である
遺伝子を含有することを示している。このような融合ポ
リペブタイド鎖は、下記する技術により実際に見出され
た。
この技術は、探求されている融合蛋白質が２種の抗原末
端を含み、そのそれぞれがそれぞれ特定の抗体に結合す
るという事実を利用する。特定抗体をプラスチック円板
の上に置き、熔解バクテリヤ細胞からの抗原蛋白質をこ
の円板と接触させて載置し、次いでこの円板を洗い、放
射性抗体に曝した。蛋白質分子は一方の抗原決定因子を
有するプラスチックに固定された抗体に結合し、次いで
第二の決定因子を有する放射性抗体を結合するであろう
。もし抗ベニシリナーゼが円板上に存在しかつ抗インシ
ュリンがラベルされるならば、「サンドインチ」を洗浄
した後、残存する放射活性の点のみが融合蛋白質の存在
を示すであろう。さらに詳細には、この方法は次のよう
にして行なわれた。
それぞれ直径８．２５ａｍ、厚さ８ｆｉの透明ポリビニ
ル（ＰＶ）の円板（ドラ・メイ社、ニューヨーク）を平
滑な紙シートの間で平板にした。次いでガラス製ペトリ
血中において、この円板を６０μｇ１０＋１のＩｇＧを
含有するｐＨ９，２の０．２ＭのＮａＨＣＯ３１０ａ＋
１を含む液体の表面上に載置した。室温に２分間以上置
いた後、円板を取出し、冷洗浄緩衝液（ＷＢ）１０ｍｌ
で２回洗浄した。ここで用いた緩衝液は燐酸緩衝塩水と
０．５％正常モルモット血清と０．１％子牛血清アルブ
ミンと０．３■／１Ｉ１１硫酸ストレプトマイシンとか
らなるものである。各円板を、洗浄後に直ちに使用した
。
リゾチーム０．５ｍｇ／ｍｌと３０ｍＭのトリス（ｐＨ
８）とｌＱｍＭのＥＤＴＡとを含有する１、５％アガロ
ース上にコロニーを移すことにより、抗原を細菌細胞か
ら遊離させた。ＩｇＧ被覆されたＰＶ円板表面をアガロ
ースと細菌コロニーの面に向けて載置し、４°の温度で
６０分間放置した。次いで、各円板を取外し、冷ＷＢＩ
Ｏｍｌで３回洗浄した。この段階で、固相抗体層上への
抗原の免疫吸着を完了した。
かくして円板に付着しているＩ　でラベルした抗体と抗
原との反応は、５Ｘ１０ｃｐｍ（γ放射）のＩ　　−Ｉ
ｇＧを含有する１、５　ｍｌのＷＢを、ペトリ皿の底部
に置かれた通常のナイロンメツシュからなる直径８．２
５ｃｍの平たい円板の中心部に固定することにより行な
った。ナイロンメツシュは離間材として作用した。前記
段階におけるように処理した円板を、次いでメツシュと
溶液との面に向けて載置し、４°で一晩培養した０次い
で各円板を１０ｏ＋１の冷ＷＢで２回および水で２回洗
浄し、室温にて乾燥させた。この時点で、融合蛋白質は
ＩｇＧの通常の層と放射線ラベルした層の両者に結合さ
れている。次いで、これら蛋白質を通常の放射線写真技
術により検出した。この放射線写真技術としては、たと
えばラスキー等（Ｌａｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ　、、Ｆ　Ｅ
　Ｂ　５Ｌｅｔｔ、、８２．３１４〜３１６　（１９７
７））。
により記載されているような、コダック患スクリーンフ
ィルムまたはコダックＸ−ＯＭＡＴＲフィルムとデュポ
ン・クロネソクス照射および増強スクリーンとを用いた
。抗インシュリンと抗ペニシリナーゼの両ＩｇＧ部分が
上記の方法に必要とされた。抗インシュリン抗血清はモ
ルモットから得られる市販品とした。兎抗ベニシリナー
ゼ抗血清は１■の純ペニシリナーゼ（完全フロインドア
ジュバント（ディフコ社）中のもの）をニューシーラン
ト産の白兎に注射して生成させた。最初の注射後２．３
週間でブースター注射を不完全フロインドアジュバント
（ディフコ社）において施こし、１週間後に兎を出血さ
せた。
硫酸アンモニウムによる沈澱および続いて０．０２５　
Ｍの燐酸カリウム（ｐＨ７，３）　、１％グリセリンに
おけるＤＥＡＥ−セルロース（ワットマンＤＥ−５２）
のクロマトグラフィーにより各免疫血清からＩｇＧ部分
を調製した。大部分の溶出物質を含有する両分を集め、
硫酸アンモニウムを４０％飽和まで加えて蛋白質を沈澱
させた。得られたベレットを元の血清容量の１／３の０
．０２５　Ｍ燐酸カリウム（ｐＨ７，３”）　、０．１
　ＭＮａＣｌ、１％グリセリンに再懸濁させ、同じ緩衝
液に対して透析した。透析後、遠心分離により全ての残
留沈澱物を除去し、ＩｇＧ部分を一７０°に貯蔵した。
各ＩｇＧ部分をハンター等（）ｌｕｎｔｅｒ　ｅｔ　ａ
ｌ、。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、９１　．４３〜４６　（１９
６４）　）の常法により沃素放射能分析にかけた。２５
μ！の反応混合物は０．５Ｍの燐酸カリウム（ｐＨ７，
５）と、２ｍＣ１のキャリヤフリーのＮａｆ　　と、１
５０μｇのＩｇＧと２μｇのクロラミンＴとを含有した
。室温にて３分間の後、ＰＢＳ　２５μｌ中のメタ重亜
硫酸ナトリウム８μｇを加え、次いで２％正常モルモッ
ト血清を含有するＰＢ３２００μｌを加えた。■１”で
ラベルしたＩｇＧを、２％正常モルモット血清を含有す
るＰＢＳで平衡状態にしたセファデックスＧ−５０のカ
ラムにおけるクロマトグラフィーにより精製した。Ｔ　
　−１ｇＧ溶出画分を、１０％正常モルモット血清を含
有するＰＢＳで５ｍｌに希釈し、滅菌ミリポアＶＣフィ
ルター（０，１，ｃｒｍ孔径）を通して濾過し、幾つか
の部分に分けて−７０”で貯蔵した。比活性は１．５　
Ｘ　１０　　ｃｐＩｌ／μｇであった。
このスクリーニングにより、ペニシリナーゼおよびイン
シュリン抗原決定因子を示す融合蛋白質を合成かつ分泌
する１種類のイー・コリ×１７７６のクローンが検出さ
れた。外賓系から回収されたこの蛋白質は放射線免疫分
析においてインシュリンに似ている。ＤＮＡ配列が示す
ところでは、この蛋白質はベニシリナーゼとプロインシ
ュリンとの間の融合体であり、この２種類の蛋白質はペ
ニシリナーゼのアミノ酸１８２（アラニン）とプロイン
シュリンのアミノ酸４（グルタミン）との間で６つのグ
リシンにより結合されている。かくして、より高度の細
胞ホルモンが細菌中において抗原活性型として合成され
た。
所望の成熟核細胞蛋白質に対するＤＮＡ配列を、このｐ
ＢＲ３２２プラスミドが情報伝達する蛋白質のアミノ酸
１０１と１０２との間の位置に相当する）（ｉｎｄＩＩ
カット中に、或いはアミノ酸４５に相当する位置のＴａ
ｑカット中に組み込むことができることが判るであろう
。全ての場合、もし成熟核細胞ＤＮＡを末端のランダム
付加によりまたは他の方法により相の中に配列するなら
ば、これはキャリヤ蛋白質の融合部分として表現され、
その蛋白質は細胞から分泌されるであろう。さらに、こ
のプラスミド中にまたはその他の中に存在するペニシリ
ナーゼ遺伝子の配列は、突然変異により或いはたとえば
接合に便利な新規の制限カットを組み込むような方法で
遺伝子の持点個所にＤＮＡ断片を組み込む直接組替えＤ
ＮＡ技術により改変させることができる。たとえば、プ
ラスミドｐＢＲ３２２上のＲ１カットは突然変異により
除去することができ、またＲ１配列を結合（ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ）によりベニシリナーゼ遺伝子中に組み込むこと
ができる。これは恐らく遺伝子を不活性化させるであろ
うが、ＤＮＡのこの領域をキャリヤ蛋白質の合成のため
に使用することを妨げないであろう。
疏水性リーダーの末端に位置するアミノ酸２３に対する
コード（ｃｏｄｅ）と、たとえばＴａｑカットに位置す
るアミノ酸４５に対するコードとの間に存在するベニシ
リナーゼ遺伝子ＤＮＡの断片は、適当な酵素の混合物に
よるＤＮＡの切除により除去することができる。この種
の１つの混合物はラムダエキソヌクレアーゼであり、こ
れは酵素Ｓ１と共同して５　末端からＤＮＡ鎖を切断し
、一本鎖オーバーハングを除去する。
この種の他の混合物としてはＴ４ＤＮＡポリメラーゼが
あり、これはＳｌと共に１本のＤＮＡ鎖の３　末端を切
断し、同様に一重鎖オーバーハングを除去する。調節切
断により、プラスミドＤＮＡ分子を適当に短縮して、Ｒ
１カットからアミノ酸２３に符号する点まで或いは疏水
性リーダー配列上の他の点まで延在する断片にすること
ができ、このような断片を融合させてインシュリン配列
を有する同様に発生された断片にし、これを便利な初期
点、すなわち成熟インシュリン分子が始まる点まで酵素
的に切断することができる。これら２つの断片を、たと
えばＴ４ＤＮＡリガーゼによる末端結合により融合させ
、この融合体をプラスミド中に組み込むことができる。
この融合体は、キャリヤ遺伝子がイー・コリの疏水性リ
ーダー配列にのみ符号しかつ成熟核細胞遺伝子が残余の
構造情報を与えるような形質転換体のキャリヤ蛋白質を
もたらす。このような構成は原則的には正確に行なうこ
ともできるが、実用的には恐らくランダムに行なわれ、
興味ある領域に末端部を有する各種の遺伝子断片を接合
させる操作を含み、また融合断片により形質転換された
バクテリヤクローンを囲む培地を検査して、たとえば上
記したようなＲＩＡにより抗原活性を蛋白合成の証拠と
して検出する。
本発明の方法はイー・コリ・ペニシリナーゼ遺伝子を使
用することのみに限定されるものではなく、多重転写プ
ラスミド上またはファージ上に担持された任意の分泌蛋
白質に対する遺伝子にも応用することができる。また本
発明の方法はインシュリンのみに限定されるものではな
く、相中に翻訳された場合ウィルス蛋白質中または成熟
核細胞蛋白質中の抗原決定因子に符号するコード領域を
有するようなウィルスまたは成熟核細胞の任意のＤＮＡ
断片の融合蛋白質を発現させるためにも使用することが
できる。たとえば、もし動物ウィルスＤＮＡの断片をペ
ニシリナーゼ遺伝子のＰｓｔもしくは１（ｉｎｄｌｌの
位置に組み込むならば、成る感受性バクテリヤは融合蛋
白質を合成し、この蛋白質はウィルス抗原に対して特異
的な抗体を用いＲＩＡ技術により確認することができる
。この融合蛋白質を次いで精製しかつ使用して動物また
は人間における抗体反応を刺戟し、ウィルス蛋白質上の
特定位置に向けられた抗体を生産させるかまたはウィル
ス抗原に対するワクチン接種として利用することができ
る。融合蛋白質はこの種のワクチン接種に際し補助決定
因子を与えて免疫反応を促進させるが、恐らく集合状態
の融合蛋白質をワクチン中に使用しなければならないで
あろう。使用しうると思われる特定のキャリヤ蛋白質は
細菌蛋白質自体であるか或いはさらに細菌蛋白質とキャ
リヤ蛋白質中に有用な補助決定因子を与えるような他の
便利な配列との間の融合体である。
【図面の簡単な説明】
第１図、第２図および第３図はプラスミドｐＢＲ３２２
上に担持されたイー・コリ（大腸菌）のベニシリナーゼ
遺伝子に関する完全な基本配列ならびに遺伝情報となる
蛋白質の対応アミノ酸配列を示す説明図である。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）細胞外もしくは外質のキャリヤ蛋白質に対する細
    菌遺伝子と、選定蛋白質もしくはポリペプチドをコード
    する非細菌性遺伝子とからなり、前記非細菌性遺伝子が
    前記細菌遺伝子中に挿入されてその一部と末端対末端に
    て結合されていることを特徴とする組替えＤＮＡ分子。
  2. （２）非細菌性遺伝子が細菌遺伝子中へその制限エンド
    ヌクレアーゼ部位にて挿入されている特許請求の範囲第
    １項記載の組替えＤＮＡ分子。
  3. （３）制限エンドヌクレアーゼ部位がＰｓｔ部位である
    特許請求の範囲第２項記載の組替えＤＮＡ分子。
  4. （４）細菌遺伝子がイー・コリペニシリナーゼに対する
    遺伝子である特許請求の範囲第１項記載の組替えＤＮＡ
    分子。
  5. （５）細胞外もしくは外質のキャリヤ蛋白質に対する細
    菌遺伝子と、選定蛋白質もしくはポリペプチドをコード
    する非細菌性遺伝子とからなり、前記非細菌性遺伝子が
    前記細菌遺伝子中に挿入されてその一部と末端対末端に
    て結合されている組替えＤＮＡ分子によりコードされる
    、細菌性の細胞外もしくは外質蛋白質の一部に末端対末
    端結合された非細菌性の蛋白質もしくはポリペプチド。
  6. （６）非細菌性蛋白質がインシュリンである特許請求の
    範囲第５項記載の蛋白質もしくはポリペプチド。
  7. （７）細菌性の細胞外もしくは外質ポリペプチドがイー
    ・コリペニシリナーゼの一部である特許請求の範囲第５
    項記載の蛋白質もしくはポリペプチド。
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