JPS61219384A - Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 - Google Patents
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法Info
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- JPS61219384A JPS61219384A JP6279485A JP6279485A JPS61219384A JP S61219384 A JPS61219384 A JP S61219384A JP 6279485 A JP6279485 A JP 6279485A JP 6279485 A JP6279485 A JP 6279485A JP S61219384 A JPS61219384 A JP S61219384A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法
、特にペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ）
属。
、特にペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ）
属。
フクトパチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属又は
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属
に属し、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を
有する一株によるＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
の製造法に関する。
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属
に属し、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を
有する一株によるＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
の製造法に関する。
（従来の技術）
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎ−ａｃｙ−１
ｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ） は別
名シアル酸リアーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素委
員会の酵素番号Ｅ、Ｃ，４，１，３，３Ｋ分類され、系
統名ではＮ−アＶＡ／ノイフミン酸：ピルビン峻リアー
ゼ（Ｎ−ａｃｙ−１ｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ：ｐｙｒｕ
ｖａｔｅ １ｙａｓｅ） と呼ばれている酵素である
。本酵素は下記の反応式に示す如く、シアル酸（Ｎ−ア
シルノイラミン酸）の分解及ヒ合成反応を触媒する酵素
である。
ｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ） は別
名シアル酸リアーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素委
員会の酵素番号Ｅ、Ｃ，４，１，３，３Ｋ分類され、系
統名ではＮ−アＶＡ／ノイフミン酸：ピルビン峻リアー
ゼ（Ｎ−ａｃｙ−１ｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ：ｐｙｒｕ
ｖａｔｅ １ｙａｓｅ） と呼ばれている酵素である
。本酵素は下記の反応式に示す如く、シアル酸（Ｎ−ア
シルノイラミン酸）の分解及ヒ合成反応を触媒する酵素
である。
クアｖａｌｔｗＮ−アシルアンノサミン＋ピルビン酸Ｎ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼは微生物界に広く見
い出されて釦凱既に工業的にもＨａされ、臨床検査試薬
としてシア／Ｉ’ｈｌ！の定量に使用されている。
−アシルノイラミン酸アルドラーゼは微生物界に広く見
い出されて釦凱既に工業的にもＨａされ、臨床検査試薬
としてシア／Ｉ’ｈｌ！の定量に使用されている。
Ｎ−アシルノイラミン酸を生産する微生物としては、今
までに次の如き菌、味が知られている。クロス）！Ｊ７
”４ウム・ヘルフリンゲンス（Ｃ１ｏｓｔｒｉ−ｄｉｕ
ｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ） （Ｄ、Ｇ、Ｃｏｍｂ
ａｎｄ Ｓ、Ｒｏｓｅｍａｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａｎ （：ｈｅｍｉｃａｌ ５ｏｃｉｅｔ
ｙｓ ８０＋４９７（１９５８））。ビブリオ・コレラ
（Ｖｉｂｒｉ。
までに次の如き菌、味が知られている。クロス）！Ｊ７
”４ウム・ヘルフリンゲンス（Ｃ１ｏｓｔｒｉ−ｄｉｕ
ｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ） （Ｄ、Ｇ、Ｃｏｍｂ
ａｎｄ Ｓ、Ｒｏｓｅｍａｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａｎ （：ｈｅｍｉｃａｌ ５ｏｃｉｅｔ
ｙｓ ８０＋４９７（１９５８））。ビブリオ・コレラ
（Ｖｉｂｒｉ。
ｃｈｏｌｅｒａｅ） （Ｒ、Ｈｅｉｍｅｒ ａｎｄ Ｋ
６Ｍｅｙｅｒ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉ−ｎｇｓ ｏｆ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ
、 ＵＳ＋ ４２ｔ７２８（１９５６））。エシェリヒ
ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）＋アエロハクｌ −（Ａ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒ）＋プロプウス（Ｐｒｏ−ｔｅｕｓ
） （特開昭５６−５４１５３号）。シュードモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） ｔマイクロコツカス（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏ−ｃｃｕｓ） 、サルシナ（Ｓａｒｃｉｎａ
） ＊バチルス（Ｂａｃｉｌ−１ｕｓ）、バクテリウム
（Ｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ） 、 ７− スロパクター（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ） ＋プレビパクテリウｔｈ
（Ｂｒｅ−ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリ
ウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ −ｔｅｒｉｕｍ） （特開
昭５６−５１７５１号）。
６Ｍｅｙｅｒ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉ−ｎｇｓ ｏｆ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ
、 ＵＳ＋ ４２ｔ７２８（１９５６））。エシェリヒ
ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）＋アエロハクｌ −（Ａ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒ）＋プロプウス（Ｐｒｏ−ｔｅｕｓ
） （特開昭５６−５４１５３号）。シュードモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） ｔマイクロコツカス（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏ−ｃｃｕｓ） 、サルシナ（Ｓａｒｃｉｎａ
） ＊バチルス（Ｂａｃｉｌ−１ｕｓ）、バクテリウム
（Ｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ） 、 ７− スロパクター（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ） ＋プレビパクテリウｔｈ
（Ｂｒｅ−ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリ
ウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ −ｔｅｒｉｕｍ） （特開
昭５６−５１７５１号）。
（発明の解決し工つとする問題点）
しかしながら、上述し友公知の各種菌株から精製さし九
市販Ｎ−アシｐノイフミン酸アルドラーゼは嫌気性菌由
来であシ、病原性の危惧されるもの、妬価であるなどの
問題が有シ、ま友、広いｐＨ域で安定であり、かつ広い
ｐＨ域で活性を示し、熱に対して安定なＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼは得られていない。
市販Ｎ−アシｐノイフミン酸アルドラーゼは嫌気性菌由
来であシ、病原性の危惧されるもの、妬価であるなどの
問題が有シ、ま友、広いｐＨ域で安定であり、かつ広い
ｐＨ域で活性を示し、熱に対して安定なＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼは得られていない。
本発明の目的は広いｐＨ域で安定で、かつ広いｐＨ域で
活性を示し、熱に対して安定な非病原性菌由来酵素をよ
り安価に製造することにある。
活性を示し、熱に対して安定な非病原性菌由来酵素をよ
り安価に製造することにある。
（問題を解決するための手段〉
本発明はペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）
属。
属。
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ス
トレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に
属し、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有
する菌株を栄養培地に培養し、培養物中にＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼを生成蓄積せしめ、培養物から
Ｎ−アシルノイラミン酸７′ルドフーゼを採取すること
を特徴とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製
造法である。
トレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に
属し、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有
する菌株を栄養培地に培養し、培養物中にＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼを生成蓄積せしめ、培養物から
Ｎ−アシルノイラミン酸７′ルドフーゼを採取すること
を特徴とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製
造法である。
本発明に使用する菌株はペディオコッカスらば何れでも
良いが、特にペディオコッカス・アＶデイラクテイｖ
（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ
）ＩＦＯ３８８５，ペディオコッカス・ダムノサスラク
トバチルス・エスピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｌ ）ＩＦ０３９５７ 等が好ましい。
良いが、特にペディオコッカス・アＶデイラクテイｖ
（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ
）ＩＦＯ３８８５，ペディオコッカス・ダムノサスラク
トバチルス・エスピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｌ ）ＩＦ０３９５７ 等が好ましい。
本発明を実施するに当って通常の栄養培地を使用できる
が、好ましくはシアル酸ｔｚはその誘導体を用いて培養
するのが好ましい。培地の炭素源としてシアル酸ま窺は
その誘導体、グルコース。
が、好ましくはシアル酸ｔｚはその誘導体を用いて培養
するのが好ましい。培地の炭素源としてシアル酸ま窺は
その誘導体、グルコース。
シュークロース、フラクトースｓ絨粉、廃穂密。
アルコール類、有機酸類などが利用でき、天然栄鴛源と
してはペプトン、肉エキス、酵母エキス。
してはペプトン、肉エキス、酵母エキス。
麦芽上キス等が利用できる。鴛素源としてはアンモニア
水硫安、硝安、塩安、尿素等が利用でき。
水硫安、硝安、塩安、尿素等が利用でき。
無機塩類としては、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、
ｆＲ酸マグネシウム等が利用できる。これらの栄養源は
それぞれ単独に用いることもでき、１穴１組み合せて用
いることもできる。
ｆＲ酸マグネシウム等が利用できる。これらの栄養源は
それぞれ単独に用いることもでき、１穴１組み合せて用
いることもできる。
ま九、培養中のｐＨの低下を防ぎｐＨを中性に保つ目的
で、必要に応じて炭酸カルシウムを添加することができ
る。
で、必要に応じて炭酸カルシウムを添加することができ
る。
菌株を培養するに当っては通常静置培養等の厳しくない
嫌気条件での培養、又は弱い好気条件下での培養を行う
ことができる。一般に培養温度は２０〜３５℃、培地ｐ
Ｈは６．０〜７．５であるのが好ましい。通常ｌ〜２０
日間培養を行うと困体内にＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼが生成蓄積する。培養条件は使用する菌株、培
地組成等に応じ、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
の生産量が最大になるように設定することは当然である
。
嫌気条件での培養、又は弱い好気条件下での培養を行う
ことができる。一般に培養温度は２０〜３５℃、培地ｐ
Ｈは６．０〜７．５であるのが好ましい。通常ｌ〜２０
日間培養を行うと困体内にＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼが生成蓄積する。培養条件は使用する菌株、培
地組成等に応じ、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
の生産量が最大になるように設定することは当然である
。
生成され′ｆｉ：、Ｎ−アシルノイツミン酸アルドフー
ゼを採取するに当っては、培養液を遠心分＊、 濾過等
の操作により、培養液から菌体を集め、集めル一体をビ
ーズ破砕もしくは超音波破砕等の操作をして画体中から
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを取り出す。この
工うにして得られｆｃ粗酵素液からＮ−７シルノイラミ
ン酸アルドラーゼを単離するに当っては１通常の酵素精
製に使用される方法を使用できる。例えば、塩析、有機
溶媒沈殿、透析１等電点沈殿、イオン交換法、ゲｉｖｐ
過等の方法を組合せて使用できる。例えば、粗酵素液を
遠心分離し、上清を得る。その上清液を硫安堰折し、Ｎ
−アクルノイラミン酸アルドラーゼ活！）＋画分を得る
。−夜、透析後、ＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−４Ｂ（
ファルマシア社製）イオン交換体に吸着、溶出させる。
ゼを採取するに当っては、培養液を遠心分＊、 濾過等
の操作により、培養液から菌体を集め、集めル一体をビ
ーズ破砕もしくは超音波破砕等の操作をして画体中から
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを取り出す。この
工うにして得られｆｃ粗酵素液からＮ−７シルノイラミ
ン酸アルドラーゼを単離するに当っては１通常の酵素精
製に使用される方法を使用できる。例えば、塩析、有機
溶媒沈殿、透析１等電点沈殿、イオン交換法、ゲｉｖｐ
過等の方法を組合せて使用できる。例えば、粗酵素液を
遠心分離し、上清を得る。その上清液を硫安堰折し、Ｎ
−アクルノイラミン酸アルドラーゼ活！）＋画分を得る
。−夜、透析後、ＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−４Ｂ（
ファルマシア社製）イオン交換体に吸着、溶出させる。
活性画分を濃縮後、セファクリ１ｖＳ−２００のゲルＰ
ｉを行うことにより、高度に精製され九Ｎ−アシルノイ
ラミン酸アルドヲーゼを単離することができる。
ｉを行うことにより、高度に精製され九Ｎ−アシルノイ
ラミン酸アルドヲーゼを単離することができる。
本発明の実施例２により得られ７ｊＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドフーゼの酵素化学的および理化学的性質は次
のと２りである。
ン酸アルドフーゼの酵素化学的および理化学的性質は次
のと２りである。
（１）作 用：
本発明の酵素は１モルのＮ−アシルノイラミン酸をアル
ドース分解して、１モルのＮ−アシルマンノサミンと１
モルのピルビン酸を生成スる口 （２）基質特異性： Ｎ−アシルノイラミン酸に特異的に作用する。
ドース分解して、１モルのＮ−アシルマンノサミンと１
モルのピルビン酸を生成スる口 （２）基質特異性： Ｎ−アシルノイラミン酸に特異的に作用する。
（３） 至適ｐＨ：
本発明の酵素の至適ｐＨは第１図の曲線に示される如く
、約ｐＨ５，５付近に高い活性を有している。
、約ｐＨ５，５付近に高い活性を有している。
（４）至適温度：
本発明の酵素の至適温度は第２図の１城で表わされる如
く、約７５℃付近にある。
く、約７５℃付近にある。
（５） ｐＨ安定性：
本発明の酵素を３７℃１時間それぞれのｐＨで放置し九
時のｐＨ安定性を第３図に示す。第３図より明らかな様
に本発明酵素はｐＨ５，５〜 。
時のｐＨ安定性を第３図に示す。第３図より明らかな様
に本発明酵素はｐＨ５，５〜 。
ｌ０５０の間で安定である。
（６）熱安定性二
本発明の酵素をＰＨ７，５においてそれぞれの温度で３
０分処理し九ときの熱安定性を第４図に示す。第４図か
ら明らかな如く１本発明の酵素は７０″Ｃまで安定であ
る。
０分処理し九ときの熱安定性を第４図に示す。第４図か
ら明らかな如く１本発明の酵素は７０″Ｃまで安定であ
る。
（７）阻害剤：
（８） Ｋｍ値：
約３．７ Ｘ Ｉ Ｏ−３Ｍ
（９） 分子量：
約５０＋ ０００ （セフｙクリ１ｖｓ−ａｏｏによる
ゲ／Ｉ／濾過） α０ 酵素活性測定法： 素ｆｉｔ−１単位とし、２，４−ジニトロフェニルヒド
ラジンを用いて比色定量する。
ゲ／Ｉ／濾過） α０ 酵素活性測定法： 素ｆｉｔ−１単位とし、２，４−ジニトロフェニルヒド
ラジンを用いて比色定量する。
試薬： （Ａ） ２４ｍＭ Ｎ−アシルノイラミン酸。
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
（Ｂ） ０．０２ ％ ２．４−ジニトロフェニルヒド
ラジン（ＤＮＰＨ）０．９ Ｎ ＨＣｊ（Ｃ） ０．
４ Ｎ ＮａＯＨ水溶液 （Ｄ）＃素溶７＆（５０ｍＭ！Ｊン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ７，０で０．５〜Ｉ Ｕ ／ ｍｌにキ稀釈する） 手順： （１） 試験管に上記基質溶液（Ａ） ２５０μノを
入れ、３７℃で２〜３分子備加温する。
ラジン（ＤＮＰＨ）０．９ Ｎ ＨＣｊ（Ｃ） ０．
４ Ｎ ＮａＯＨ水溶液 （Ｄ）＃素溶７＆（５０ｍＭ！Ｊン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ７，０で０．５〜Ｉ Ｕ ／ ｍｌにキ稀釈する） 手順： （１） 試験管に上記基質溶液（Ａ） ２５０μノを
入れ、３７℃で２〜３分子備加温する。
（２）上記酵素溶液（Ｄ） ５０μ！を加え１反応を開
始する。
始する。
（３）３７℃で正確に１５分間反応させ次後。
上記ＤＮＰＨ溶液ＣＢ）を２５０μ！加えて反応を停止
する。
する。
（４）２５℃で２０分間放置後０．４ Ｎ ＮａＯＨ水
溶液（Ｃ）を２．５ｙｘｌ加え発色させる。２〜３分放
置後５００ ｎｍにおける吸光度を測定する（ ＯＤ
ｔｅｓｔ）。
溶液（Ｃ）を２．５ｙｘｌ加え発色させる。２〜３分放
置後５００ ｎｍにおける吸光度を測定する（ ＯＤ
ｔｅｓｔ）。
（５）盲検は、上記基質溶液（Ａ） ２５０μＩを入れ
３７℃で１５分間放置後、上記ＤＮＰＨ溶液（Ｂ） ２
５０μノを加えて混相し１次いで酵素溶液（Ｄ） ５０
μｌを加えて調製する。
３７℃で１５分間放置後、上記ＤＮＰＨ溶液（Ｂ） ２
５０μノを加えて混相し１次いで酵素溶液（Ｄ） ５０
μｌを加えて調製する。
以下同様に２５℃で２０分間放置後０．４ ＮＮａＯＨ
水溶液（Ｃ） ２．５ ｍｌ ’に加え２〜３分放置後
５００ ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎ
ｋ）。
水溶液（Ｃ） ２．５ ｍｌ ’に加え２〜３分放置後
５００ ｎｍにおける吸光度を測定する（ＯＤｂｌａｎ
ｋ）。
計算式：
％式％
９．３９：赤色色素のミリモル分子吸光係数１．０二光
路長（−） （実施例） 以下に本発明によるＮ−アＶ／Ｌ／ノイラミン酸アμド
フーゼの製造法を実施例を挙げて説明する。
路長（−） （実施例） 以下に本発明によるＮ−アＶ／Ｌ／ノイラミン酸アμド
フーゼの製造法を実施例を挙げて説明する。
チは特に断わりのない限、０（Ｗ／Ｖ）％である。
実施例１゜
培地組成 ０．５ ％ Ｎ−ア七チ°μノイラミン酸。
０．２％酵母エキス、０゜１％ボリベブ上記の培地３
ｍｌを滅−済試験管に入れ、１２１℃で１５分間オート
クレーブ殺菌し友。表１に示される各種菌株の１白金耳
金上記培地に接種し３０℃１４日間培養した。
ｍｌを滅−済試験管に入れ、１２１℃で１５分間オート
クレーブ殺菌し友。表１に示される各種菌株の１白金耳
金上記培地に接種し３０℃１４日間培養した。
培養液を遠心分ｌｉ！（１２００ＯｒｐｍｘｌＯ分）に
て集菌し、：３ｗＪの５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝
液ｐＨ７，５に懸濁し友。超音波（３Ａ、５分）破砕後
。
て集菌し、：３ｗＪの５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝
液ｐＨ７，５に懸濁し友。超音波（３Ａ、５分）破砕後
。
遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分）し、上清を粗酵
素液とし、活性を測定し友。測定結果は表１の通りであ
つ友。
素液とし、活性を測定し友。測定結果は表１の通りであ
つ友。
表 １
実施例２゜
培地組成 ０．５％Ｎ−アセチルノイラミン酸、０．２
％酵素エキス、０．２％ボリベプ上記の培地６１を含む
ｌＯ１容ジャーファーメンタ−を１２１”ｃで２０分間
蒸気殺菌しに０あらかじめ、実施例１と同様に培養した
種菌〔ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄ
１ｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ） Ｉ
ＦＯ３８８５〕６０ ｍｌを植菌し。
％酵素エキス、０．２％ボリベプ上記の培地６１を含む
ｌＯ１容ジャーファーメンタ−を１２１”ｃで２０分間
蒸気殺菌しに０あらかじめ、実施例１と同様に培養した
種菌〔ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄ
１ｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ） Ｉ
ＦＯ３８８５〕６０ ｍｌを植菌し。
３０℃、１１００ｒｐ、通気４ｉｋｌｌ１分で４５時間
培養し友。得られ友培養液のＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼ活性はＩ Ｘ １０ ”Ｕ／ｓｌであった。
培養し友。得られ友培養液のＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼ活性はＩ Ｘ １０ ”Ｕ／ｓｌであった。
＠養液６ｊを遠心分離し菌体を集め５０７７７Ｍ！Ｊン
酸緩衝液ｐＨ７，５に懸濁し、１５０ｇ／として超音波
破砕（３Ａ、１５分）した。菌体破砕液を遠心分＠（１
２，００Ｏｒｐｍ、１０分）し、上滑を得九。５０ｍＭ
リン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化しｆｃ＋Ｌファデック
スＧ−２５カラムで脱塩しｍ０脱塩液ｉ ＤＥＡＥセフ
ァロースＣＬ−４Ｂカラム２Ｃ）ｘｌに吸着させ。
酸緩衝液ｐＨ７，５に懸濁し、１５０ｇ／として超音波
破砕（３Ａ、１５分）した。菌体破砕液を遠心分＠（１
２，００Ｏｒｐｍ、１０分）し、上滑を得九。５０ｍＭ
リン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化しｆｃ＋Ｌファデック
スＧ−２５カラムで脱塩しｍ０脱塩液ｉ ＤＥＡＥセフ
ァロースＣＬ−４Ｂカラム２Ｃ）ｘｌに吸着させ。
０．４ Ｍ ＮａＣｊにて溶出し友。溶出後の活性画分
を限外濾過にて濃縮し、セファクリＩｖＳ−２００カヲ
ムにて分子篩を行なった。
を限外濾過にて濃縮し、セファクリＩｖＳ−２００カヲ
ムにて分子篩を行なった。
活性画分の比活性は８．５Ｕ／キー蛋白、全活性は１．
９８ Ｕ （収率３３％）であっ几。
９８ Ｕ （収率３３％）であっ几。
（発明の効果）
本発明方法によシ得られるＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼは広いｐＨ域で安定で、かつ。
ドラーゼは広いｐＨ域で安定で、かつ。
広いｐＨ域で活性を示し、熱に対して安定であり。
非病原性菌由来の酵素を工り安価に得ることができる。
第１ 図ハＮ−アＳ／）ｖノイラミン酸アルドラーゼの
至適ｐＨを示す図である。５０ｍＭ緩衝液（・−・酢酸
、〇−〇リン酸）中での作用を相対活性にて示す。 第２図は、Ｎ−アシルノイラミン１ｌ１７／ｖドラーゼ
の至適温度を示す図でりる〇 第３図は、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼのｐＨ
安定性を示す図である。（ｐＨ４，０〜６．０酢酸、
ｐＨ６，０〜９．０リン酸、ｐＨ９〜１０．５炭酸、
各緩衝液）。３７℃１時間放置後残仔活性を示す。・ 第４図は、Ｎ−アシｌレノイヲミン酸アルドラーゼの熱
安定性を示す図である。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，
５，３０分間処理後の残存活性を示す。
至適ｐＨを示す図である。５０ｍＭ緩衝液（・−・酢酸
、〇−〇リン酸）中での作用を相対活性にて示す。 第２図は、Ｎ−アシルノイラミン１ｌ１７／ｖドラーゼ
の至適温度を示す図でりる〇 第３図は、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼのｐＨ
安定性を示す図である。（ｐＨ４，０〜６．０酢酸、
ｐＨ６，０〜９．０リン酸、ｐＨ９〜１０．５炭酸、
各緩衝液）。３７℃１時間放置後残仔活性を示す。・ 第４図は、Ｎ−アシｌレノイヲミン酸アルドラーゼの熱
安定性を示す図である。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，
５，３０分間処理後の残存活性を示す。
Claims (1)
- ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラク
トバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はスト
レプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属
し、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有す
る菌株を栄養培地に培養し、培養物中にＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼを生成蓄積せしめ、培養物からＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼを採取することを特
徴とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6279485A JPS61219384A (ja) | 1985-03-27 | 1985-03-27 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6279485A JPS61219384A (ja) | 1985-03-27 | 1985-03-27 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61219384A true JPS61219384A (ja) | 1986-09-29 |
Family
ID=13210608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6279485A Pending JPS61219384A (ja) | 1985-03-27 | 1985-03-27 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61219384A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011086834A1 (ja) * | 2010-01-15 | 2011-07-21 | 味の素株式会社 | Ｎ－アセチル－ｄ－ノイラミン酸の製造方法 |
| US10378034B2 (en) | 2014-05-27 | 2019-08-13 | Universitetet I Tromsø—Norges Arktiske Universitet | Use of a N-acetylneuraminate lyase derived from the bacterium Aliivibrio salmonicida in the production of neuraminic acid and derivatives thereof |
-
1985
- 1985-03-27 JP JP6279485A patent/JPS61219384A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011086834A1 (ja) * | 2010-01-15 | 2011-07-21 | 味の素株式会社 | Ｎ－アセチル－ｄ－ノイラミン酸の製造方法 |
| US10378034B2 (en) | 2014-05-27 | 2019-08-13 | Universitetet I Tromsø—Norges Arktiske Universitet | Use of a N-acetylneuraminate lyase derived from the bacterium Aliivibrio salmonicida in the production of neuraminic acid and derivatives thereof |
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