JP2801694B2 - 新規酵素 - Google Patents
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- JP2801694B2 JP2801694B2 JP1290314A JP29031489A JP2801694B2 JP 2801694 B2 JP2801694 B2 JP 2801694B2 JP 1290314 A JP1290314 A JP 1290314A JP 29031489 A JP29031489 A JP 29031489A JP 2801694 B2 JP2801694 B2 JP 2801694B2
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- enzyme
- phenylbutyric acid
- oxo
- acid
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な酵素、更に詳しくは、次の〜に示
す理化学的性質を有する新規酵素及びその製造方法、並
びにその酵素を用いた光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキ
シ−４−フェニル酪酸の製造方法に関する。
す理化学的性質を有する新規酵素及びその製造方法、並
びにその酵素を用いた光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキ
シ−４−フェニル酪酸の製造方法に関する。
作用及び基質特異性； 還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・
リン酸（以後NADPHと称する）を補酵素とし、２−オキ
ソ−４−フェニル酪酸を不斉還元し（Ｒ）−２−ヒドロ
キシ−４−フェニル酪酸を生成する。
リン酸（以後NADPHと称する）を補酵素とし、２−オキ
ソ−４−フェニル酪酸を不斉還元し（Ｒ）−２−ヒドロ
キシ−４−フェニル酪酸を生成する。
至適pH;6.5〜7.0付近（リン酸緩衝液） 安定pH範囲;6〜７ 至適温度;40℃付近（pH7.0） 熱安定性;30℃以下で安定（pH7.0,10分処理） ２−オキソ−４−フェニル酪酸に対するミハエリス
定数Km値;0.87mM 分子量；約５万（ゲル濾過法） 阻害剤；パラクロロ水銀安息香酸 〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕 従来、２−オキソカルボン酸を不斉還元し対応する光
学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を生成する酵素に関
しては乳酸菌の生産する数種の脱水素酵素が報告されて
いる（特公昭61−11591号、特公平１−27717号、特開昭
62−00286号、特開昭63−32480号各公報）。これらの脱
水素酵素は還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレ
オチド（NADH）を補酵素として各種の２−オキソカルボ
ン酸を不斉的に還元し対応する光学活性な２−ヒドロキ
シカルボン酸を生成することが報告されている。
定数Km値;0.87mM 分子量；約５万（ゲル濾過法） 阻害剤；パラクロロ水銀安息香酸 〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕 従来、２−オキソカルボン酸を不斉還元し対応する光
学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を生成する酵素に関
しては乳酸菌の生産する数種の脱水素酵素が報告されて
いる（特公昭61−11591号、特公平１−27717号、特開昭
62−00286号、特開昭63−32480号各公報）。これらの脱
水素酵素は還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレ
オチド（NADH）を補酵素として各種の２−オキソカルボ
ン酸を不斉的に還元し対応する光学活性な２−ヒドロキ
シカルボン酸を生成することが報告されている。
しかしながら、これらの酵素に関しては２−オキソ−
４−フェニル酪酸を不斉還元し光学活性な（Ｒ）−２−
ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生成する活性は知られ
ていない。（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
は医薬品の合成中間体として有用な化合物である。
４−フェニル酪酸を不斉還元し光学活性な（Ｒ）−２−
ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生成する活性は知られ
ていない。（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
は医薬品の合成中間体として有用な化合物である。
本発明者等は２−オキソ−４−フェニル酪酸を不斉還
元し光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル
酪酸を生成しうる酵素を探索した結果、ロイコノストッ
ク（Leuconostco）属に属する微生物が目的とする酵素
を生産することを発見し、本酵素の理化学的性質を明ら
かにし本発明を完成した。
元し光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル
酪酸を生成しうる酵素を探索した結果、ロイコノストッ
ク（Leuconostco）属に属する微生物が目的とする酵素
を生産することを発見し、本酵素の理化学的性質を明ら
かにし本発明を完成した。
即ち本発明は、次の〜に示す理化学的性質を有す
る新規酵素を提供するものである。
る新規酵素を提供するものである。
作用及び基質特異性； NADPHを補酵素とし、２−オキソ−４−フェニル酪酸
を不斉還元し（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪
酸を生成する。
を不斉還元し（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪
酸を生成する。
至適pH;6.5〜7.0付近（リン酸緩衝液） 安定pH範囲;6〜７ 至適温度;40℃付近（pH7.0） 熱安定性;30℃以下で安定（pH7.0,10分処理） ２−オキソ−４−フェニル酪酸に対するミハエリス
定数Km値;0.87mM 分子量；約５万（ゲル濾過法） 阻害剤；パラクロロ水銀安息香酸 また、本発明は、ロイコノストック（Leuconostoc）
属に属する微生物を培養し、該培養物から酵素を採取す
ることを特徴とする前記〜に示す理化学的性質を有
する新規酵素の製造方法を提供するものである。
定数Km値;0.87mM 分子量；約５万（ゲル濾過法） 阻害剤；パラクロロ水銀安息香酸 また、本発明は、ロイコノストック（Leuconostoc）
属に属する微生物を培養し、該培養物から酵素を採取す
ることを特徴とする前記〜に示す理化学的性質を有
する新規酵素の製造方法を提供するものである。
更に、本発明は、前記〜に示す理化学的性質を有
する新規酵素を用い、NADPHを補酵素として、２−オキ
ソ−４−フェニル酪酸を不斉還元することを特徴とする
光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
の製造方法をも提供するものである。
する新規酵素を用い、NADPHを補酵素として、２−オキ
ソ−４−フェニル酪酸を不斉還元することを特徴とする
光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
の製造方法をも提供するものである。
本発明の新規酵素の起源は特に限定されるものではな
く、本発明の新規酵素を生産しうる生物であれば何でも
良いが、好適な例としては例えば乳酸菌、更に好ましく
はロイコノストック属に属する微生物菌株を用いること
ができる。更に、それらのうち、好ましい菌株は、ロイ
コノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・
デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp.
dextranicum）IFO 3349、ロイコノストック・デキスト
ラニカム（Leuconostoc dextranicum）ATCC17072、ロイ
コノストック・デキストラニカム（Leuconostoc dextra
nicum）ATCC 27310、ロイコノストック・メセンテロイ
デス（Leuconostoc mesenteroides）AHU 1067、等であ
る。
く、本発明の新規酵素を生産しうる生物であれば何でも
良いが、好適な例としては例えば乳酸菌、更に好ましく
はロイコノストック属に属する微生物菌株を用いること
ができる。更に、それらのうち、好ましい菌株は、ロイ
コノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・
デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp.
dextranicum）IFO 3349、ロイコノストック・デキスト
ラニカム（Leuconostoc dextranicum）ATCC17072、ロイ
コノストック・デキストラニカム（Leuconostoc dextra
nicum）ATCC 27310、ロイコノストック・メセンテロイ
デス（Leuconostoc mesenteroides）AHU 1067、等であ
る。
これらの微生物は、野生株、変異株、又は細胞融合も
しくは遺伝子操作法などの遺伝的手法により誘導される
組み替え株等、いずれの株でも好適に用いることができ
る。
しくは遺伝子操作法などの遺伝的手法により誘導される
組み替え株等、いずれの株でも好適に用いることができ
る。
尚、IFO番号の付された微生物は、（財）醗酵研究所
（IFO）発行のList of Cultures,第８版，第１巻（198
8）に記載されており、該IFOから入手することができ
る。AHU番号の付された微生物は、日本微生物株保存連
盟（JFCC）発行のCatalogue of Cultures,第４版（198
7）に記載されており、北海道大学農学部から入手する
ことができる。ATCC番号の付された微生物は、American
Type Culture Collection（ATCC）発行のCatalogue of
Bacteria Phages rDNA Vectors,第16版（1985）に記載
されており、該ATCCから入手することができる。
（IFO）発行のList of Cultures,第８版，第１巻（198
8）に記載されており、該IFOから入手することができ
る。AHU番号の付された微生物は、日本微生物株保存連
盟（JFCC）発行のCatalogue of Cultures,第４版（198
7）に記載されており、北海道大学農学部から入手する
ことができる。ATCC番号の付された微生物は、American
Type Culture Collection（ATCC）発行のCatalogue of
Bacteria Phages rDNA Vectors,第16版（1985）に記載
されており、該ATCCから入手することができる。
本発明に用いる微生物を培養する為の培地はその微生
物が増殖し得るものであれば特に制限はない。例えば、
炭素源としては、上記微生物が利用可能であればいずれ
も使用でき、具体的には、グルコース、フルクトース、
シュクロース、デキストリン等の糖類、ソルビトール、
エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマール
酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類及びそ
の塩類、パラフィン等の炭化水素類等或いはこれらの混
合物を使用することができる。窒素源としては例えば、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウ
ム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム
塩、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、
カゼイン加水分解物、尿素等の無機又は有機含窒素化合
物、あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培養に
用いられる栄養源を適宜、混合して用いることができ
る。また必要に応じて微生物の増殖を促進する因子、本
発明の目的化合物の生成能力を高める因子、或いは培地
のpH保持に有効な物質も添加できる。
物が増殖し得るものであれば特に制限はない。例えば、
炭素源としては、上記微生物が利用可能であればいずれ
も使用でき、具体的には、グルコース、フルクトース、
シュクロース、デキストリン等の糖類、ソルビトール、
エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマール
酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類及びそ
の塩類、パラフィン等の炭化水素類等或いはこれらの混
合物を使用することができる。窒素源としては例えば、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウ
ム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム
塩、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、
カゼイン加水分解物、尿素等の無機又は有機含窒素化合
物、あるいはこれらの混合物を使用することができる。
他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培養に
用いられる栄養源を適宜、混合して用いることができ
る。また必要に応じて微生物の増殖を促進する因子、本
発明の目的化合物の生成能力を高める因子、或いは培地
のpH保持に有効な物質も添加できる。
培養方法としては培地pHは3.0〜9.5、好ましくは４〜
８、培養温度は20〜45℃、好ましくは25〜37℃で、嫌気
的或いは好気的に、その微生物の生育に適した条件下、
５〜120時間、好ましくは12〜72時間程度培養する。
８、培養温度は20〜45℃、好ましくは25〜37℃で、嫌気
的或いは好気的に、その微生物の生育に適した条件下、
５〜120時間、好ましくは12〜72時間程度培養する。
このようにして培養された微生物菌体からの、本発明
の新規酵素の精製は、通常の酵素の精製方法を組み合わ
せることにより可能である。例えば、培養物を遠心分離
にかけ菌体を回収し、超音波破砕などにより無細胞抽出
液を得、ストレプトマイシン硫酸処理、硫酸アンモニウ
ム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ゲル濾過法などにより精製され
る。
の新規酵素の精製は、通常の酵素の精製方法を組み合わ
せることにより可能である。例えば、培養物を遠心分離
にかけ菌体を回収し、超音波破砕などにより無細胞抽出
液を得、ストレプトマイシン硫酸処理、硫酸アンモニウ
ム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ゲル濾過法などにより精製され
る。
尚、本発明の酵素の活性は次のようにして測定した。
＜活性測定法＞ 200mMリン酸緩衝液（pH7.0）2ml,12mM2−オキソ−４
−フェニル酪酸カリウム溶液0.5ml、4.5mM NADPH溶液0.
1ml及び酵素溶液で合計3mlの反応系を構成し、30℃でNA
DPHの340nmに於ける吸光度の減少を分光光度計にて追跡
し、酵素活性を求めた。尚、酵素活性1Uは、上記条件
下、１分間に1mMのNADPHが酸化される酵素量とした。
−フェニル酪酸カリウム溶液0.5ml、4.5mM NADPH溶液0.
1ml及び酵素溶液で合計3mlの反応系を構成し、30℃でNA
DPHの340nmに於ける吸光度の減少を分光光度計にて追跡
し、酵素活性を求めた。尚、酵素活性1Uは、上記条件
下、１分間に1mMのNADPHが酸化される酵素量とした。
また、比活性は蛋白質1mg当たりのＵ数とし、蛋白量
は、バイオラッド社のプロテインアッセイキットを用
い、牛血清アルブミンを標準物質として用い求めた。
は、バイオラッド社のプロテインアッセイキットを用
い、牛血清アルブミンを標準物質として用い求めた。
次に本発明の新規酵素を用い２−オキソ−４−フェニ
ル酪酸から光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フ
ェニル酪酸を製造する方法について述べる。
ル酪酸から光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フ
ェニル酪酸を製造する方法について述べる。
本発明の新規酵素を用い２−オキソ−４−フェニル酪
酸（基質）から（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル
酪酸を製造する場合には、基質と共に補酵素としてNADP
Hが必要である。本反応は、基本的には本発明の新規酵
素の活性が安定的に発現できる条件下、基質、酵素、NA
DPHを適当な比率の元に混合して反応させてやれば良
い。反応はpH5〜９、好ましくはpH6〜８の範囲で温度は
10〜60℃、好ましくは20〜40℃の範囲で、１〜120時間
程度、撹拌下あるいは静置下で行う。基質の使用濃度は
特に制限されないが、0.1〜10％程度が好ましい。
酸（基質）から（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル
酪酸を製造する場合には、基質と共に補酵素としてNADP
Hが必要である。本反応は、基本的には本発明の新規酵
素の活性が安定的に発現できる条件下、基質、酵素、NA
DPHを適当な比率の元に混合して反応させてやれば良
い。反応はpH5〜９、好ましくはpH6〜８の範囲で温度は
10〜60℃、好ましくは20〜40℃の範囲で、１〜120時間
程度、撹拌下あるいは静置下で行う。基質の使用濃度は
特に制限されないが、0.1〜10％程度が好ましい。
また、公知の方法により補酵素のリサイクル系を組み
込むことにより更に効率的に製造することができる。
込むことにより更に効率的に製造することができる。
さらに、本発明の酵素は公知の方法により種々の固定
化担体に固定化することにより固定化酵素として使用す
ることも可能である。
化担体に固定化することにより固定化酵素として使用す
ることも可能である。
上記の如き反応によって生成した光学活性な（Ｒ）−
２−ヒドロキシ−４−フェニル硫酸の採取は反応液から
有機溶媒で抽出し、カラムクロマトグラフィー、再結晶
等の通常の精製方法を用いれば容易に行うことができ
る。
２−ヒドロキシ−４−フェニル硫酸の採取は反応液から
有機溶媒で抽出し、カラムクロマトグラフィー、再結晶
等の通常の精製方法を用いれば容易に行うことができ
る。
以下、本発明を実施例にて更に詳しく説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。
発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（スクリーニング） グルコース８％、酵母エキス１％、硫酸マンガン10pp
m、炭酸カルシウム２％の組成をもつ培地100mlを300ml
容三角フラスコに入れ120℃で15分殺菌した後、表１に
示した菌株を植菌し、30℃で１日間回転振盪培養した。
この培養液を遠心分離にかけ菌体を集菌し、次いで生理
的食塩水にて菌体を洗浄した。この菌体に50mMリン酸緩
衝液（pH7）10mlを加え、冷却下超音波破砕した。この
破砕液を10,000g、10分間遠心分離し、上澄液を得た。
この粗酵素抽出液について、酵素活性を測定した。
m、炭酸カルシウム２％の組成をもつ培地100mlを300ml
容三角フラスコに入れ120℃で15分殺菌した後、表１に
示した菌株を植菌し、30℃で１日間回転振盪培養した。
この培養液を遠心分離にかけ菌体を集菌し、次いで生理
的食塩水にて菌体を洗浄した。この菌体に50mMリン酸緩
衝液（pH7）10mlを加え、冷却下超音波破砕した。この
破砕液を10,000g、10分間遠心分離し、上澄液を得た。
この粗酵素抽出液について、酵素活性を測定した。
得られた結果を表１に示した。
実施例２（酵素の精製） 実施例１と同様な組成の培地18を30容ジャーファ
ーメンターに入れ、加熱殺菌後、同様な培地で前培養し
たロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシ
ーズ・デキストラニカムIFO 3349の培養液500mlを植菌
した。30℃で200rpm、気相通気の条件下、20時間培養し
た。この培養液を遠心分離にかけ集菌した後、生理的食
塩水にて洗浄した。この湿菌体120gに50mMリン酸緩衝液
（pH7）（3mM、２−メルカプトエタノールを含む）150m
lを加え、フレンチプレスにて菌体を破砕した。この破
砕液を10,000g、10分間遠心分離し、上澄液150mlを得
た。
ーメンターに入れ、加熱殺菌後、同様な培地で前培養し
たロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシ
ーズ・デキストラニカムIFO 3349の培養液500mlを植菌
した。30℃で200rpm、気相通気の条件下、20時間培養し
た。この培養液を遠心分離にかけ集菌した後、生理的食
塩水にて洗浄した。この湿菌体120gに50mMリン酸緩衝液
（pH7）（3mM、２−メルカプトエタノールを含む）150m
lを加え、フレンチプレスにて菌体を破砕した。この破
砕液を10,000g、10分間遠心分離し、上澄液150mlを得
た。
この粗酵素抽出液につき冷却下、硫酸アンモニウム0.
8飽和の条件で塩析した。生じた沈澱を遠心分離で集め2
0mMリン酸緩衝液（pH8.0）（3mM、２−メルカプトエタ
ノールを含む）に対し透析した。しかる後、同じ緩衝液
で平衡化したDEAE−トヨパール650Mのカラム（2.5×30c
m）に負荷した。同じ緩衝液500mlでこのカラムを洗浄し
た後、塩化ナトリウムを０から1Mまで直線的に上げるグ
ラジェント溶出法により目的の酵素を溶出した。活性画
分を限外濾過法により濃縮し、次いで50mMリン酸緩衝液
（pH7.5）（3mM、２−メルカプトエタノールを含む）に
て平衡化したトヨパールHW−55Fのカラム（2.5×100c
m）にかけゲル濾過を行った。活性画分を集め部分精製
酵素標品とした。
8飽和の条件で塩析した。生じた沈澱を遠心分離で集め2
0mMリン酸緩衝液（pH8.0）（3mM、２−メルカプトエタ
ノールを含む）に対し透析した。しかる後、同じ緩衝液
で平衡化したDEAE−トヨパール650Mのカラム（2.5×30c
m）に負荷した。同じ緩衝液500mlでこのカラムを洗浄し
た後、塩化ナトリウムを０から1Mまで直線的に上げるグ
ラジェント溶出法により目的の酵素を溶出した。活性画
分を限外濾過法により濃縮し、次いで50mMリン酸緩衝液
（pH7.5）（3mM、２−メルカプトエタノールを含む）に
て平衡化したトヨパールHW−55Fのカラム（2.5×100c
m）にかけゲル濾過を行った。活性画分を集め部分精製
酵素標品とした。
ここまでの精製工程を表２に示す。
実施例３（基質特異性） 実施例２で得られた酵素標品を用い、標準活性測定法
に準拠し、表３に記載した各種の基質について反応速度
を調べた。得られた結果を２−オキソ−４−フェニル酪
酸を基質とした場合の活性を100とした相対活性で表
し、表３に示した。
に準拠し、表３に記載した各種の基質について反応速度
を調べた。得られた結果を２−オキソ−４−フェニル酪
酸を基質とした場合の活性を100とした相対活性で表
し、表３に示した。
なお、この反応の際用いられるNADPHは、還元型ニコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（NADH）では代
替できない。
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（NADH）では代
替できない。
実施例４（至適pH） 実施例２で得られた酵素標品を用い、標準活性測定法
に準拠し、用いる緩衝液の種類及びpHを変化させ活性を
測定した。緩衝液としてはpH6〜８は200mMリン酸緩衝
液、pH8〜９は200mMトリス−塩酸緩衝液を用いた。
に準拠し、用いる緩衝液の種類及びpHを変化させ活性を
測定した。緩衝液としてはpH6〜８は200mMリン酸緩衝
液、pH8〜９は200mMトリス−塩酸緩衝液を用いた。
得られた結果をリン酸緩衝液（pH6.5）で測定した活
性を100とした相対活性で表し、第１図に示した。
性を100とした相対活性で表し、第１図に示した。
実施例５（pH安定性） 実施例２で得られた酵素標品を用い、pH安定性を調べ
た。
た。
種々のpHの緩衝液2mlに酵素標品0.5mlを加え、30℃で
30分処理し、次いでこの処理液から0.1mlをサンプリン
グし、1Mリン酸緩衝液（pH7.0）0.5mlに加えた。この酵
素液0.05mlを用い標準活性測定法により残存活性を測定
した。得られた結果をリン酸緩衝液（pH6）で処理した
場合の活性を100とした相対活性で表し、第２図に示し
た。
30分処理し、次いでこの処理液から0.1mlをサンプリン
グし、1Mリン酸緩衝液（pH7.0）0.5mlに加えた。この酵
素液0.05mlを用い標準活性測定法により残存活性を測定
した。得られた結果をリン酸緩衝液（pH6）で処理した
場合の活性を100とした相対活性で表し、第２図に示し
た。
尚、使用した緩衝液の種類は、pH4〜６が200mM酢酸緩
衝液、pH6〜８が200mMリン酸緩衝液、pH8〜９が200mMト
リス−塩酸緩衝液である。
衝液、pH6〜８が200mMリン酸緩衝液、pH8〜９が200mMト
リス−塩酸緩衝液である。
実施例６（至適温度） 実施例２で得られた酵素標品を用い、至適温度を調べ
た。
た。
標準活性測定法に準拠し、反応時の温度を変化させ、
活性を測定した。
活性を測定した。
得られた結果を40℃の場合の活性を100とした相対活
性で表し、第３図に示した。
性で表し、第３図に示した。
実施例７（熱安定性） 実施例２で得られた酵素標品を用い、熱安定性を調べ
た。
た。
この酵素溶液に200mMリン酸緩衝液（pH7.0）を加えpH
を７とした後、各温度条件下10分間加熱処理し、この処
理サンプルについて標準活性測定法により残存活性を測
定した。
を７とした後、各温度条件下10分間加熱処理し、この処
理サンプルについて標準活性測定法により残存活性を測
定した。
得られた結果を20℃の条件下で処理した場合を100と
した相対活性で表し、第４図に示した。
した相対活性で表し、第４図に示した。
実施例８ （２−オキソ−４−フェニル酪酸に対するKm値） 実施例２で得られた酵素標品を用い、２−オキソ−４
−フェニル酪酸の濃度を変化させ、標準活性測定法によ
り活性を測定し、Km値を求めた。その結果0.87mMという
値が得られた。
−フェニル酪酸の濃度を変化させ、標準活性測定法によ
り活性を測定し、Km値を求めた。その結果0.87mMという
値が得られた。
実施例９（阻害剤） 実施例２で得られた酵素標品を用い、本酵素に対する
各種の阻害剤の影響を調べた。
各種の阻害剤の影響を調べた。
標準活性測定法で用いる反応系に阻害剤を添加し、酵
素とともに30℃で５分間インキュベートした後、NADPH
添加で反応をスタートし活性を測定した。
素とともに30℃で５分間インキュベートした後、NADPH
添加で反応をスタートし活性を測定した。
得られた結果を阻害剤無添加の場合を100とした相対
活性で表し表４に示した。
活性で表し表４に示した。
実施例10（分子量） 実施例２で得られた酵素標品を用いゲル濾過法により
本酵素の分子量を求めた。
本酵素の分子量を求めた。
即ち、50mMリン酸緩衝液（pH7,0.3MNaClを含む）で平
衡化したトヨパールHW−55のカラム（1.5×100cm）に本
酵素を負荷しゲル濾過を行った。また、分子量既知の蛋
白質をマーカーとして用い同様にゲル濾過を行い、それ
らの溶出位置から本酵素の分子量を求めた。その結果本
酵素の分子量は約５万であった。
衡化したトヨパールHW−55のカラム（1.5×100cm）に本
酵素を負荷しゲル濾過を行った。また、分子量既知の蛋
白質をマーカーとして用い同様にゲル濾過を行い、それ
らの溶出位置から本酵素の分子量を求めた。その結果本
酵素の分子量は約５万であった。
実施例11 （２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造） ２−オキソ−４−フェニル酪酸100mgを20mlの水に溶
解し1NNaOHにてpH7とした。この溶液にNADPH 500mgを加
え溶解した後、100mMリン酸緩衝液（pH7）20mlを加え
た。次いで、実施例２と同様にして製造、精製した酵素
の粗酵素溶液5ml（200U）を加え30℃で24時間反応させ
た。
解し1NNaOHにてpH7とした。この溶液にNADPH 500mgを加
え溶解した後、100mMリン酸緩衝液（pH7）20mlを加え
た。次いで、実施例２と同様にして製造、精製した酵素
の粗酵素溶液5ml（200U）を加え30℃で24時間反応させ
た。
しかる後、1N硫酸にてpHを2.5とし、塩化ナトリウム
を飽和になるまで溶解させた。次いでこの反応生成物を
酢酸エチル50mlにて２回抽出した。
を飽和になるまで溶解させた。次いでこの反応生成物を
酢酸エチル50mlにて２回抽出した。
この有機層を合わせ、溶媒を留去し粗結晶85mgを得
た。この粗結晶をトルエンで再結し、結晶73mg（収率73
％）を得た。mp113.5℃、［α］Ｄ＝−8.5（ｃ＝1,エタ
ノール）。
た。この粗結晶をトルエンで再結し、結晶73mg（収率73
％）を得た。mp113.5℃、［α］Ｄ＝−8.5（ｃ＝1,エタ
ノール）。
この結晶を少量の水で溶解し、光学分割カラムを用い
た高速液体クロマトグラフィー（カラム；ダイセル化学
工業製キラルセルOB,溶媒;n−ヘキサン/2−プロパノー
ル＝19:1）にかけ絶対配置及び光学純度を測定した。そ
の結果、生成物は（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニ
ル酪酸とリテンションタイムが完全に一致し光学純度も
100％e.e.であった。
た高速液体クロマトグラフィー（カラム；ダイセル化学
工業製キラルセルOB,溶媒;n−ヘキサン/2−プロパノー
ル＝19:1）にかけ絶対配置及び光学純度を測定した。そ
の結果、生成物は（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニ
ル酪酸とリテンションタイムが完全に一致し光学純度も
100％e.e.であった。
本発明により、新規酵素の製造が可能になり、酵素反
応による光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェ
ニル酪酸の製造が可能になった。
応による光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェ
ニル酪酸の製造が可能になった。
第１図は実施例４で行った至適pHの測定結果を示すグラ
フ、第２図は実施例５で行ったpH安定性の測定結果を示
すグラフ、第３図は実施例６で行った至適温度の測定結
果を示すグラフ、第４図は実施例７で行った熱安定性の
測定結果を示すグラフである。
フ、第２図は実施例５で行ったpH安定性の測定結果を示
すグラフ、第３図は実施例６で行った至適温度の測定結
果を示すグラフ、第４図は実施例７で行った熱安定性の
測定結果を示すグラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】次の〜に示す理化学的性質を有する新
規酵素。 作用及び基質特異性； 還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・リ
ン酸（以後NADPHと称する）を補酵素とし、２−オキソ
−４−フェニル酪酸を不斉還元し（Ｒ）−２−ヒドロキ
シ−４−フェニル酪酸を生成する。 至適pH;6.5〜7.0付近（リン酸緩衝液） 安定pH範囲;6〜７ 至適温度;40℃付近（pH7.0） 熱安定性;30℃以下で安定（pH7.0,10分処理） ２−オキソ−４−フェニル酪酸に対するミハエリス
定数Km値;0.87mM 分子量；約５万（ゲル濾過法） 阻害剤；パラクロロ水銀安息香酸 - 【請求項２】ロイコノストック（Leuconostoc）属に属
する微生物を培養し、該培養物から酵素を採取すること
を特徴とする請求項１記載の新規酵素の製造方法。 - 【請求項３】請求項１記載の新規酵素を用い、NADPHを
補酵素として、２−オキソ−４−フェニル酪酸を不斉還
元することを特徴とする光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロ
キシ−４−フェニル酪酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1290314A JP2801694B2 (ja) | 1989-11-08 | 1989-11-08 | 新規酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1290314A JP2801694B2 (ja) | 1989-11-08 | 1989-11-08 | 新規酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03151872A JPH03151872A (ja) | 1991-06-28 |
| JP2801694B2 true JP2801694B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=17754495
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1290314A Expired - Fee Related JP2801694B2 (ja) | 1989-11-08 | 1989-11-08 | 新規酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2801694B2 (ja) |
-
1989
- 1989-11-08 JP JP1290314A patent/JP2801694B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03151872A (ja) | 1991-06-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |