JPS61181380A - 新規dnaおよびその用途 - Google Patents
新規dnaおよびその用途Info
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- JPS61181380A JPS61181380A JP60075910A JP7591085A JPS61181380A JP S61181380 A JPS61181380 A JP S61181380A JP 60075910 A JP60075910 A JP 60075910A JP 7591085 A JP7591085 A JP 7591085A JP S61181380 A JPS61181380 A JP S61181380A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- peptide
- recognition site
- human
- antibody recognition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構
造遺伝子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2
のペプチドをコードする構造遺伝子を有するDNAを連
結してなるDNA、該DNAが組み込まれたプラスミド
、該プラスミドで形質転換された形質転換体、抗体認識
部位を含むペプチドとヒトインターロイキン2のペプチ
ドとを結合したポリペプチドおよび該形質転換体を用い
る該ポリペプチドの製造法に関する。
造遺伝子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2
のペプチドをコードする構造遺伝子を有するDNAを連
結してなるDNA、該DNAが組み込まれたプラスミド
、該プラスミドで形質転換された形質転換体、抗体認識
部位を含むペプチドとヒトインターロイキン2のペプチ
ドとを結合したポリペプチドおよび該形質転換体を用い
る該ポリペプチドの製造法に関する。
従来の技術
抗体認識部位を含むペプチド、例えば免疫グロブリンE
(以下、IgEと略称することもある)は、アレルギー
反応などの重要な生体反応を担っている。すなわち、ア
レルギー反応は特異抗原と結合したIgEの感作された
肥満細胞や好塩基球への結合によって誘起されることが
知られている(Immunological Rev
iew 41.109 (1978) )。
(以下、IgEと略称することもある)は、アレルギー
反応などの重要な生体反応を担っている。すなわち、ア
レルギー反応は特異抗原と結合したIgEの感作された
肥満細胞や好塩基球への結合によって誘起されることが
知られている(Immunological Rev
iew 41.109 (1978) )。
従って、アレルギー反応をおさえるために抗原結合部位
を除いたIgE分子を用いることも考えられている。し
かし生体内でのIgEに起因する種々の反応については
、まだ未解決な点が多い。十分な量のヒトIgEを供給
できないことが、この理由の一つとなっている。
を除いたIgE分子を用いることも考えられている。し
かし生体内でのIgEに起因する種々の反応については
、まだ未解決な点が多い。十分な量のヒトIgEを供給
できないことが、この理由の一つとなっている。
IgEの生産方法としては、ヒトIgE産生能を有する
株化ヒト骨髄腫細胞の培養上清より分取精製する方法が
提唱されているが、細胞培養であること、細胞の増殖能
が低いことなどから、安価に大量のIgEを得るのは難
しい。そこで、遺伝子操作技術を利用して、IgE構造
遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体を培養することにより、IgEを大量に得られる
技術が開発された[Nucleic Ac1ds
Re5earch11.719 (1983); Nu
cleic Ac1ds Re5earch旦、3
077 (1983)]。
株化ヒト骨髄腫細胞の培養上清より分取精製する方法が
提唱されているが、細胞培養であること、細胞の増殖能
が低いことなどから、安価に大量のIgEを得るのは難
しい。そこで、遺伝子操作技術を利用して、IgE構造
遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体を培養することにより、IgEを大量に得られる
技術が開発された[Nucleic Ac1ds
Re5earch11.719 (1983); Nu
cleic Ac1ds Re5earch旦、3
077 (1983)]。
一方、インターロイキン2[以下、IL−2と略称する
こともある。以前はT細胞増殖因子(TCGF)と呼ば
れた。]は、レクチンやアロ抗原等で刺激されたT細胞
によって産生されるリンホカインである[5ciens
e 193.1007 (1976):Immuno
logicalReview 51.257 (19
80)]。In。
こともある。以前はT細胞増殖因子(TCGF)と呼ば
れた。]は、レクチンやアロ抗原等で刺激されたT細胞
によって産生されるリンホカインである[5ciens
e 193.1007 (1976):Immuno
logicalReview 51.257 (19
80)]。In。
−2は、T細胞をインビトロでその機能を保持したまま
増殖させ長期間の継代維持を可能にするはかに、今まで
に胸腺細胞のマイト−ジエン反応を促進したり(コステ
ィミュレーター)、ヌードマウス婢細胞のT細胞依存性
抗原に対する抗体産生能を回復させたり(T細胞リブレ
ーシングファクター)、キラー細胞の分化増殖を促進す
る(キラーヘルパーファクター)活性を有すると報告さ
れている[The Journal of I
mmunology 123゜2928 (1979
) rmmunological Review
51.257(1980)]。
増殖させ長期間の継代維持を可能にするはかに、今まで
に胸腺細胞のマイト−ジエン反応を促進したり(コステ
ィミュレーター)、ヌードマウス婢細胞のT細胞依存性
抗原に対する抗体産生能を回復させたり(T細胞リブレ
ーシングファクター)、キラー細胞の分化増殖を促進す
る(キラーヘルパーファクター)活性を有すると報告さ
れている[The Journal of I
mmunology 123゜2928 (1979
) rmmunological Review
51.257(1980)]。
しかしながら、ヒトrL−2は、天然のものを用いての
量産は困難であるため、遺伝子操作技術を利用して、ヒ
トIL−2構造遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質
転換された形質転換体を培養することにより、ヒトIL
−2を大量に得られるようになった[Nature
302.305(1983);B iochemica
l and B 1ophysical Res
earchCommunications vol、
109. NO,2,p、363(1983): N
ucleic Ac1ds Re5earch
11゜4307 (1983)]。
量産は困難であるため、遺伝子操作技術を利用して、ヒ
トIL−2構造遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質
転換された形質転換体を培養することにより、ヒトIL
−2を大量に得られるようになった[Nature
302.305(1983);B iochemica
l and B 1ophysical Res
earchCommunications vol、
109. NO,2,p、363(1983): N
ucleic Ac1ds Re5earch
11゜4307 (1983)]。
発明が解決しようとする問題点
前記のとおり、ヒトIgEのペプチドあるいはヒトIL
−2のペプチドをそれぞれ単独でコードする構造遺伝子
によるこれらの発現がそれぞれ単独で試みられてきたが
、本発明はこれら2種の異なる免疫学的あるいは生物学
的活性を持つ異種蛋白の新規複合体を製造することにあ
る。
−2のペプチドをそれぞれ単独でコードする構造遺伝子
によるこれらの発現がそれぞれ単独で試みられてきたが
、本発明はこれら2種の異なる免疫学的あるいは生物学
的活性を持つ異種蛋白の新規複合体を製造することにあ
る。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、ヒトIgEとヒトIL〜2との異種蛋白
の複合体を遺伝子工学の手法を用い製造したところ、該
複合体はヒトIgEのもつ抗原性とヒトIL−2のもつ
抗原性の両方の性質を有していることを見いだし、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。
の複合体を遺伝子工学の手法を用い製造したところ、該
複合体はヒトIgEのもつ抗原性とヒトIL−2のもつ
抗原性の両方の性質を有していることを見いだし、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、(1)、抗体認識部位を含むペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAおよびヒト
IL−2のペプチドをコードする構造遺伝子を有するD
NAを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
DNA、(2)、抗体認識部位を含むペプチドをコード
する構造遺伝子を有するDNAおよびヒトIL−2のペ
プチドをコードする構造遺伝子を有するDNAを、それ
ぞれの読み取り枠をそろえて連結してなるDNAが組み
込まれたプラスミド、(3)、抗体認識部位を含むペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAおよびヒト
IL−2のペプチドをコードする構造遺伝子を有するD
NAを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
DNAが組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体、(4)、抗体認識部位を含むペプチドとヒトI
L−2のペプチドとを結合したポリペプチド、および(
5)、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺
伝子を有するDNAおよびヒトIL−2のペプチドをコ
ードする構造遺伝子を有するDNAを、それぞれ読み取
り枠をそろえて連結してなるDNAが組み込まれたプラ
スミドで形質転換された形質転換体を培地に培養し、培
養物中に抗体認識部位を含むペプチドとヒトIL−2の
ペプチドとを結合したポリペプチドを生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造
法である。
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAおよびヒト
IL−2のペプチドをコードする構造遺伝子を有するD
NAを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
DNA、(2)、抗体認識部位を含むペプチドをコード
する構造遺伝子を有するDNAおよびヒトIL−2のペ
プチドをコードする構造遺伝子を有するDNAを、それ
ぞれの読み取り枠をそろえて連結してなるDNAが組み
込まれたプラスミド、(3)、抗体認識部位を含むペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAおよびヒト
IL−2のペプチドをコードする構造遺伝子を有するD
NAを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
DNAが組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体、(4)、抗体認識部位を含むペプチドとヒトI
L−2のペプチドとを結合したポリペプチド、および(
5)、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺
伝子を有するDNAおよびヒトIL−2のペプチドをコ
ードする構造遺伝子を有するDNAを、それぞれ読み取
り枠をそろえて連結してなるDNAが組み込まれたプラ
スミドで形質転換された形質転換体を培地に培養し、培
養物中に抗体認識部位を含むペプチドとヒトIL−2の
ペプチドとを結合したポリペプチドを生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造
法である。
本明細書においては、抗体認識部位を含むペプチドがヒ
トIgEであり、これとヒトIL−2のペプチドとを結
合したポリペプチドをイムノブロイキン(I mmun
ogleukin)E C22と称し、あるいは単にI
GL−EC22と略称することもある。
トIgEであり、これとヒトIL−2のペプチドとを結
合したポリペプチドをイムノブロイキン(I mmun
ogleukin)E C22と称し、あるいは単にI
GL−EC22と略称することもある。
本発明における抗体認識部位を含むペプチドとしては、
たとえば抗ヒト免疫グロブリンE抗体認識部位を含むペ
プチドが挙げられる。
たとえば抗ヒト免疫グロブリンE抗体認識部位を含むペ
プチドが挙げられる。
抗ヒトIgE抗体認識部位を含むペプチドとしては、ヒ
トIgEH鎖の全部または部分を含むペプチドが挙げら
れる。該ヒトIgEH鎖の部分とは、ヒトIgE分子を
構成するペプチド鎖の1つで、該分子は1対のH鎖と1
対のし鎖から構成されていることが知られている。した
がって、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造
遺伝子の例としては、ヒトIgEH鎖の全部または部分
を含むペプチドをコードする構造遺伝子が挙げられる。
トIgEH鎖の全部または部分を含むペプチドが挙げら
れる。該ヒトIgEH鎖の部分とは、ヒトIgE分子を
構成するペプチド鎖の1つで、該分子は1対のH鎖と1
対のし鎖から構成されていることが知られている。した
がって、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造
遺伝子の例としては、ヒトIgEH鎖の全部または部分
を含むペプチドをコードする構造遺伝子が挙げられる。
該IgE H鎖の全部または部分を含むペプチドをコ
ードする構造遺伝子としては、たとえば、日本特開昭5
9−44399号公報、Ce1l vol、 29
゜691 (1982)、 Nucleic Ac1
ds Re5earch 11゜719 (198
3)、 Nucleic Ac1ds Re5ea
rch 11゜3077(1983)、 EMBO(
The EuropeanMolecular B
iology Organization)Jour
nal上、 655 (1982)などに記載されたD
NAが挙げられる。
ードする構造遺伝子としては、たとえば、日本特開昭5
9−44399号公報、Ce1l vol、 29
゜691 (1982)、 Nucleic Ac1
ds Re5earch 11゜719 (198
3)、 Nucleic Ac1ds Re5ea
rch 11゜3077(1983)、 EMBO(
The EuropeanMolecular B
iology Organization)Jour
nal上、 655 (1982)などに記載されたD
NAが挙げられる。
本発明のヒトIL−2のペプチドとは、ヒトIL−2活
性を有するペプチドであればいずれでもよい。たとえば
活性を有する限り、ヒトIL−2より短いペプチドであ
っても長いペプチドであってもよい。
性を有するペプチドであればいずれでもよい。たとえば
活性を有する限り、ヒトIL−2より短いペプチドであ
っても長いペプチドであってもよい。
該ヒトIL−2のペプチドをコードする構造遺伝子とし
ては、たとえば、日本特許出願昭和58年第22507
9号(昭和58年(西暦1983年)11月28日付出
願)1日本特許出願昭和58年第2:(5638号(昭
和58年(西暦1983年)12月13日付出願)、
Nature vol。
ては、たとえば、日本特許出願昭和58年第22507
9号(昭和58年(西暦1983年)11月28日付出
願)1日本特許出願昭和58年第2:(5638号(昭
和58年(西暦1983年)12月13日付出願)、
Nature vol。
302、 p、305 (1983)、 Bioche
mical andBiophysical Re
5earch Communicationsvol
、 109. NO,2,p、363 (1982)、
NucleicAcids Re5earch
旦、 4307 (1983)などに記載されたDNA
が挙げられる。
mical andBiophysical Re
5earch Communicationsvol
、 109. NO,2,p、363 (1982)、
NucleicAcids Re5earch
旦、 4307 (1983)などに記載されたDNA
が挙げられる。
上記、特許出願昭和58年第225079号に記載され
たヒトIL−2のペプチドをコードするDNAは、式 %式% 中、コドン1−133で示される塩基配列のDNA(V
)が挙げられる。このDNA(V)は、その5′末端に
ATGまたは上記式中コドンS1〜S2゜で示されるシ
グナルコドンを有していてもよく、3′末端にTAA、
TGAまたはTAGを育することが好ましく、とりわけ
TGAが好ましい。
たヒトIL−2のペプチドをコードするDNAは、式 %式% 中、コドン1−133で示される塩基配列のDNA(V
)が挙げられる。このDNA(V)は、その5′末端に
ATGまたは上記式中コドンS1〜S2゜で示されるシ
グナルコドンを有していてもよく、3′末端にTAA、
TGAまたはTAGを育することが好ましく、とりわけ
TGAが好ましい。
上記DNA(V)は、式
%式%
Lys Leu Tyr Arg Met
Le+u ThrPhe Lys Phe T
yr Met Pro LysLys Ala
Thr Glu Leu Lys His
Leu Gln Cys Leu Glu
Glu GluLeu Lys Pro Le
u Glu Glu ValLeu Asn
Leu Ala Gln Ser LysA
sn Phe His Leu Arg P
ro ArgAsp Leu lie Ser
Asn lie AsnVat lie
Val Leu Glu Leu LysCy
s Glu Tyr Ala Asp Gl
u ThrAla Thr Ile Val
Glu Phe LeuAsn Arg
Trp Ile Thr Phe CysG
in Ser Ile lie Ser
Thr Leu(上記式中、XはMet または水
素を示す。)で表わされるペプチドをコードする。また
、上記日本特許出願昭和58年第235638号に記載
されたヒトIL−2のペプチドをコードするDNAは、
式2式% [式中、XはAGC,AGT、TCA、TCC。
Le+u ThrPhe Lys Phe T
yr Met Pro LysLys Ala
Thr Glu Leu Lys His
Leu Gln Cys Leu Glu
Glu GluLeu Lys Pro Le
u Glu Glu ValLeu Asn
Leu Ala Gln Ser LysA
sn Phe His Leu Arg P
ro ArgAsp Leu lie Ser
Asn lie AsnVat lie
Val Leu Glu Leu LysCy
s Glu Tyr Ala Asp Gl
u ThrAla Thr Ile Val
Glu Phe LeuAsn Arg
Trp Ile Thr Phe CysG
in Ser Ile lie Ser
Thr Leu(上記式中、XはMet または水
素を示す。)で表わされるペプチドをコードする。また
、上記日本特許出願昭和58年第235638号に記載
されたヒトIL−2のペプチドをコードするDNAは、
式2式% [式中、XはAGC,AGT、TCA、TCC。
TCG、TCT、TAA、TAGおよびTGA以外のコ
ドンまたは水素を示し、Yはコドンまたは水酸基を示す
コで表わされる塩基配列を有するDNAが挙げられ、上
記DNA(■)は、式2式% [式中、ZはSet以外のアミノ酸残基または水素を示
す]の配列を有するポリペプチドをコードする。
ドンまたは水素を示し、Yはコドンまたは水酸基を示す
コで表わされる塩基配列を有するDNAが挙げられ、上
記DNA(■)は、式2式% [式中、ZはSet以外のアミノ酸残基または水素を示
す]の配列を有するポリペプチドをコードする。
DNA(Vl)に関し、Xで示されるコドンは、ヒ)[
L−2と実質的に同様の活性を有するポリペプチド(■
)の一部を構成するアミノ酸をコードするコドン(但し
、XはSetをコードするコドンおよび翻訳終止コドン
ではない)であればいずれでもよく、更にその5′末端
側にアミノ酸をコードするコドンを1個以上有していて
もよい。XはとりわけATGであることが好ましい。
L−2と実質的に同様の活性を有するポリペプチド(■
)の一部を構成するアミノ酸をコードするコドン(但し
、XはSetをコードするコドンおよび翻訳終止コドン
ではない)であればいずれでもよく、更にその5′末端
側にアミノ酸をコードするコドンを1個以上有していて
もよい。XはとりわけATGであることが好ましい。
Yで示されるコドンは、翻訳終止コドンまたはヒトIL
−2と実質的に同様の活性を有するポリペプチド(■)
の一部を構成するアミノ酸をコードするコドンであれば
いずれでもよく、更にその3′末端側にアミノ酸をコー
ドするコドンを1個以上有していてもよい。Yで示され
るコドンが翻訳終止コドン以外のコドンの場合(更にそ
の3′末端側にアミノ酸をコードするコドンを1個以上
有する場合を含む)は、3′末端に翻訳終止コドンを有
することが好ましい。なおYで示されるコドンはTAA
、TAGまたはTGAであることがより好ましく、とり
わけTGAであることが好ましい。
−2と実質的に同様の活性を有するポリペプチド(■)
の一部を構成するアミノ酸をコードするコドンであれば
いずれでもよく、更にその3′末端側にアミノ酸をコー
ドするコドンを1個以上有していてもよい。Yで示され
るコドンが翻訳終止コドン以外のコドンの場合(更にそ
の3′末端側にアミノ酸をコードするコドンを1個以上
有する場合を含む)は、3′末端に翻訳終止コドンを有
することが好ましい。なおYで示されるコドンはTAA
、TAGまたはTGAであることがより好ましく、とり
わけTGAであることが好ましい。
ポリペプチド(■)に関し、Zで示されるSet以外の
アミノ酸残基としてはヒトIL−2と実質的に同様の活
性を有するポリペプチドの一部を構成するアミノ酸残基
であればいずれでもよく、例えば第1表に示されるアミ
ノ酸残基(但し、Serを除く)が挙げられ、更にその
N末端側に、例えば、第1表に示されるアミノ酸残基ま
たはこれらアミノ酸残基の複数個で構成されるペプチド
を有していてもよい。とりわけZとしてはMet ま
たは水素が好ましい。
アミノ酸残基としてはヒトIL−2と実質的に同様の活
性を有するポリペプチドの一部を構成するアミノ酸残基
であればいずれでもよく、例えば第1表に示されるアミ
ノ酸残基(但し、Serを除く)が挙げられ、更にその
N末端側に、例えば、第1表に示されるアミノ酸残基ま
たはこれらアミノ酸残基の複数個で構成されるペプチド
を有していてもよい。とりわけZとしてはMet ま
たは水素が好ましい。
抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝子を
有するDNA、およびヒトIL−2のペプチドをコード
する構造遺伝子を有するDNAを、それぞれの読み取り
枠をそろえて連結する。連結する方法は、公知の方法に
従って行えばよく、たとえば、T4DNAリガーゼを用
いてひとつのDNAの3’−OH末端と他方のDNAの
5′−P末端をATP存在下で連結させる。
有するDNA、およびヒトIL−2のペプチドをコード
する構造遺伝子を有するDNAを、それぞれの読み取り
枠をそろえて連結する。連結する方法は、公知の方法に
従って行えばよく、たとえば、T4DNAリガーゼを用
いてひとつのDNAの3’−OH末端と他方のDNAの
5′−P末端をATP存在下で連結させる。
また、両遺伝子の間にリンカ−を介するのが好ましい。
該リンカ−としては、たとえば、EC0RIリンカーり
(CTAGAATTCTAG)などがあり、さらにNe
w England Biolabs(米国)のも
の、その他の市販されているものを用いることができる
。
(CTAGAATTCTAG)などがあり、さらにNe
w England Biolabs(米国)のも
の、その他の市販されているものを用いることができる
。
リンカ−を連結する方法は、たとえば、遺伝子の末端を
大腸菌ポリメラーゼ■(ラージフラグメント)やSlヌ
クレアーゼなどで平滑末端にして、該末端とリンカ−の
末端をT4 DNAリガーゼによって連結する。この際
、リンカ−同志の重複連結などを除去するために、制限
酵素で消化して粘着末端とする必要がある。制限酵素の
種類はリンカ−の種類により異なるが、たとえば、Ec
oR1リンカ−を使用した際の制限酵素はEcoRIで
ある。生じた粘着末端を利用して両遺伝子同志をT4D
NAリガーゼで連結すればリンカ−を介したひとつのD
NAを得ることができる。
大腸菌ポリメラーゼ■(ラージフラグメント)やSlヌ
クレアーゼなどで平滑末端にして、該末端とリンカ−の
末端をT4 DNAリガーゼによって連結する。この際
、リンカ−同志の重複連結などを除去するために、制限
酵素で消化して粘着末端とする必要がある。制限酵素の
種類はリンカ−の種類により異なるが、たとえば、Ec
oR1リンカ−を使用した際の制限酵素はEcoRIで
ある。生じた粘着末端を利用して両遺伝子同志をT4D
NAリガーゼで連結すればリンカ−を介したひとつのD
NAを得ることができる。
上記両構造遺伝子が連結してなるDNAの上流に、プロ
モーターを連結するのが好ましい。
モーターを連結するのが好ましい。
jお、プロモーターの下流に連結されることとなる禰構
造遺伝子の順序は、プロモーターの下流に抗体認識部位
を含むペプチドをコードする構造遺伝子次いでヒトIL
−2の構造遺伝子となるように、あるいは、プロモータ
ーの下流にヒトIL−2の構造遺伝子次いで抗体認識部
位を含むペプチドをコードする構造遺伝子となるように
連結される。上記プロモーター以外の三者の連結の順序
は、特にとわれないが、プロモーターは最上流に連結す
ることが必須である。該プロモーターとしては、たとえ
ば、トリプトファン合成(trp)プロモーター、 r
ec Aプロモーター、ラクトースプロモーター等があ
げられ、とりわけtrpプロモーターが好適である。
造遺伝子の順序は、プロモーターの下流に抗体認識部位
を含むペプチドをコードする構造遺伝子次いでヒトIL
−2の構造遺伝子となるように、あるいは、プロモータ
ーの下流にヒトIL−2の構造遺伝子次いで抗体認識部
位を含むペプチドをコードする構造遺伝子となるように
連結される。上記プロモーター以外の三者の連結の順序
は、特にとわれないが、プロモーターは最上流に連結す
ることが必須である。該プロモーターとしては、たとえ
ば、トリプトファン合成(trp)プロモーター、 r
ec Aプロモーター、ラクトースプロモーター等があ
げられ、とりわけtrpプロモーターが好適である。
プロモーターを連結する方法としては、たとえば、発現
させようとする遺伝子の5′末端に適当なリンカ−を用
いて、翻訳開始コドンATGを付加し、これをプロモー
ターの3′末端に連結する。
させようとする遺伝子の5′末端に適当なリンカ−を用
いて、翻訳開始コドンATGを付加し、これをプロモー
ターの3′末端に連結する。
このとき用いる酵素としてはT4DNAリガーゼが一般
的であり、その処理方法は前述に準する。
的であり、その処理方法は前述に準する。
また、プロモーターの下流には適当な制限酵素の認識部
位が設けられていることが望ましい。
位が設けられていることが望ましい。
両遺伝子を連結してなるDNAを宿主微生物で発現させ
るために、ベクターとしてプラスミドを用い、これに該
DNAを組み込む。該ベクターとしてのプラスミドとし
ては、たとえば、Co1E I由来のpB R322[
Gene 2.95 (1977)]が最もよく利用
されるが、その他のプラスミドであっても、効率良く発
現させ得るものはいずれも用いることができる。その例
としては、たとえば、トリプトファン合成プロモーター
を組み込んだptrp・781、 ptrp 771
などが挙げられる。このようにして得られたDNAをプ
ラスミドに組み込むには、まず、プラスミドのDNAを
適当な制限酵素で処理して、線状にする。これと、前述
のようにして得られたDNAをT4DNAリガーゼで連
結する。
るために、ベクターとしてプラスミドを用い、これに該
DNAを組み込む。該ベクターとしてのプラスミドとし
ては、たとえば、Co1E I由来のpB R322[
Gene 2.95 (1977)]が最もよく利用
されるが、その他のプラスミドであっても、効率良く発
現させ得るものはいずれも用いることができる。その例
としては、たとえば、トリプトファン合成プロモーター
を組み込んだptrp・781、 ptrp 771
などが挙げられる。このようにして得られたDNAをプ
ラスミドに組み込むには、まず、プラスミドのDNAを
適当な制限酵素で処理して、線状にする。これと、前述
のようにして得られたDNAをT4DNAリガーゼで連
結する。
このようにして得られた両遺伝子が連結されたDNAが
組み込まれたプラスミドで宿主菌を形質転換し、形質転
換体を製造する。
組み込まれたプラスミドで宿主菌を形質転換し、形質転
換体を製造する。
該宿主菌としては、たとえばエシェリヒア属菌。
枯草菌、酵母などが挙げられ、特にエシェリヒア属菌が
好ましい。該エシェリヒア属菌としては、たとえば大腸
菌(Escherichia coli)DHI株[
N ature 幻、7.1110−1114 (1
968)、Journalor Mo1ecula
r Biology 166、 557−580
(1983)コなどが挙げられる。
好ましい。該エシェリヒア属菌としては、たとえば大腸
菌(Escherichia coli)DHI株[
N ature 幻、7.1110−1114 (1
968)、Journalor Mo1ecula
r Biology 166、 557−580
(1983)コなどが挙げられる。
該プラスミドで宿主菌を形質転換する方法としては、カ
ルシウム法やプロトプラスト法などが挙げられ、特にカ
ルシウム法が好ましい。
ルシウム法やプロトプラスト法などが挙げられ、特にカ
ルシウム法が好ましい。
上記方法によって得られた形質転換体の一例として、後
述の実施例1で製造されたESCheriChiaco
li DHI/pGEL 1028が挙げられる。該微
生物は、財団法人発酵研究所(IFo、532日本国大
阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17番85号)に昭和
59年(西暦1984年)3月27日に受託番号I P
O14332として寄託され、また、本微生物は、日
本国通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(F
RI 、305日本国茨城県筑波郡谷田部町東I丁目1
番3号)に昭和59年(西暦1984年)3月29日に
受託番号FERM P−7568として寄託されてい
る。
述の実施例1で製造されたESCheriChiaco
li DHI/pGEL 1028が挙げられる。該微
生物は、財団法人発酵研究所(IFo、532日本国大
阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17番85号)に昭和
59年(西暦1984年)3月27日に受託番号I P
O14332として寄託され、また、本微生物は、日
本国通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(F
RI 、305日本国茨城県筑波郡谷田部町東I丁目1
番3号)に昭和59年(西暦1984年)3月29日に
受託番号FERM P−7568として寄託されてい
る。
このようにして得られた形質転換体の培養に使用される
培地としては、液体培地が適当であり、その中には該形
質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他
が含有せしめられれる。炭素源としては、たとえばグル
コース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素
源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コ
ーンスターチ、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕
、バレインヨ抽出液などの無機または有機物質、無機物
としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリ
ウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また酵母エ
キス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい
。とりわけ塩化カルシウム・2水和物を約0.1%およ
びリン酸二水素ナトリウム・2水和物を約2%含有する
培地が目的物の生産に有利である。また、培養するため
の温度、pH1時間などの条件は、目的物の生産および
その活性が最高となるように適宜に定められるが、一般
に培養温度は約20〜40℃付近、培1pHは微酸性か
ら微アルカリ性で、ことに中性付近が好ましく、培養時
間は約6〜10時間程度である。
培地としては、液体培地が適当であり、その中には該形
質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他
が含有せしめられれる。炭素源としては、たとえばグル
コース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素
源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コ
ーンスターチ、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕
、バレインヨ抽出液などの無機または有機物質、無機物
としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリ
ウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また酵母エ
キス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい
。とりわけ塩化カルシウム・2水和物を約0.1%およ
びリン酸二水素ナトリウム・2水和物を約2%含有する
培地が目的物の生産に有利である。また、培養するため
の温度、pH1時間などの条件は、目的物の生産および
その活性が最高となるように適宜に定められるが、一般
に培養温度は約20〜40℃付近、培1pHは微酸性か
ら微アルカリ性で、ことに中性付近が好ましく、培養時
間は約6〜10時間程度である。
本発明の発酵に於て目的とするポリペプチドは通常菌体
内に蓄積されるので、培養物中に蓄積された該ポリペプ
チドを採取するには、まず菌体を遠心分離やろ過によっ
て集め、これより該ポリペプチドを抽出することにより
行なわれる。該ポリペプチドを効率よく抽出させるため
には、たとえば超音波処理、リゾチーム処理、界面活性
剤などの化学薬品による処理などが行なわれる。
内に蓄積されるので、培養物中に蓄積された該ポリペプ
チドを採取するには、まず菌体を遠心分離やろ過によっ
て集め、これより該ポリペプチドを抽出することにより
行なわれる。該ポリペプチドを効率よく抽出させるため
には、たとえば超音波処理、リゾチーム処理、界面活性
剤などの化学薬品による処理などが行なわれる。
このようにして抽出された該ポリペプチドの精製は、従
来からの蛋白質あるいはペプトンの精製法、たとえば硫
安塩析、アルコール沈澱、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー、セルロース力ラムグロマトグラフイー、ゲル
ろ適法などの適用により行なわれる。
来からの蛋白質あるいはペプトンの精製法、たとえば硫
安塩析、アルコール沈澱、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー、セルロース力ラムグロマトグラフイー、ゲル
ろ適法などの適用により行なわれる。
後述の実施例1において得られるDNAは、第1図に示
されるヌクレオチドを含有するDNAである。このうち
、第1図においてヌクレオチド配列9−356として示
されるポリヌクレオチドは、第2図においてアミノ酸配
列3−118で表されるポリペプチド、つまりヒトIg
EH鎖の02領域をコードする。
されるヌクレオチドを含有するDNAである。このうち
、第1図においてヌクレオチド配列9−356として示
されるポリヌクレオチドは、第2図においてアミノ酸配
列3−118で表されるポリペプチド、つまりヒトIg
EH鎖の02領域をコードする。
また、第1図においてヌクレオチド配列369−767
として示されるポリヌクレオチドは、第2図においてア
ミノ酸配列123−255として表されるポリペプチド
、つまりヒトIL−2をコードする。
として示されるポリヌクレオチドは、第2図においてア
ミノ酸配列123−255として表されるポリペプチド
、つまりヒトIL−2をコードする。
これらのポリヌクレオチドは、直接発現のために、5′
末端に読み取り枠を一致させるように、ATGを有して
いてもよい。この場合には、N末端にMetを育するポ
リペプチドをコードする。
末端に読み取り枠を一致させるように、ATGを有して
いてもよい。この場合には、N末端にMetを育するポ
リペプチドをコードする。
また、これらのポリヌクレオチドは読み取り枠を一致さ
せるために、任意の介在配列を有していてもよい。第1
図において、この介在配列とはヌクレオチド配列357
−368として示される。この場合には、第2図におい
てアミノ酸配列119−122として表されるポリペプ
チドをコードする。
せるために、任意の介在配列を有していてもよい。第1
図において、この介在配列とはヌクレオチド配列357
−368として示される。この場合には、第2図におい
てアミノ酸配列119−122として表されるポリペプ
チドをコードする。
前述したように、ヒトIgEおよびヒトIL−2に関し
ては、それぞれ単独で、それをコードするmRNAが既
に分離同定され、これらの遺伝子の発現も単独で試みら
れているが、本発明のように、2種類あるいは、それ以
上の遺伝子を連結して、2種類あるいは、それ以上の異
なる免疫学的もしくは生物学的活性をもった1つの新た
なポリペプチドを製造するという概念は、今までに無い
ものである。さらに、2種類以上の独立な免疫学的もし
くは生物学的活性を有する1つのポリペプチドは、自然
界にもその例が少なく、本発明は、新規活性蛋白を提供
するという点で、遺伝子工学に追随したペプチド工学の
先駆をなすものである。
ては、それぞれ単独で、それをコードするmRNAが既
に分離同定され、これらの遺伝子の発現も単独で試みら
れているが、本発明のように、2種類あるいは、それ以
上の遺伝子を連結して、2種類あるいは、それ以上の異
なる免疫学的もしくは生物学的活性をもった1つの新た
なポリペプチドを製造するという概念は、今までに無い
ものである。さらに、2種類以上の独立な免疫学的もし
くは生物学的活性を有する1つのポリペプチドは、自然
界にもその例が少なく、本発明は、新規活性蛋白を提供
するという点で、遺伝子工学に追随したペプチド工学の
先駆をなすものである。
本発明方法により得られた抗体認識部位を含むペプチド
とヒトIL−2のペプチドとを結合したポリペプチドは
、ヒトIL−2抗体を精製する際の試薬として有用であ
る。たとえば、本発明方法により上記のアミノ酸配列で
構成されるI GL−EC22は、ヒトIgEのもつ抗
原性とヒトIL−2のもつ抗原性の両方を有しているた
めに、抗ヒトIgE抗体を用いてrGL−EC22を精
製し、精製したIGL−EC22を用いて抗ヒトIL−
2抗体を作製・精製し、精製した抗ヒトIL−2抗体を
用いて、ヒトIL−2を精製するという一連のヒトIL
−2精製過程の媒体となり得る。この場合、IGL−E
C22が、直接関与するのは抗ヒトIL−2抗体を精製
するときであるが、この様な未知の抗体を作製・精製す
る方法は他に例が無く、抗体精製の新技術として大きく
期待される。したがって、本発明のポリペプチドは、゛
ヒトインターロイキン2抗体を精製する際の媒体あるい
は試薬として使用され得る。
とヒトIL−2のペプチドとを結合したポリペプチドは
、ヒトIL−2抗体を精製する際の試薬として有用であ
る。たとえば、本発明方法により上記のアミノ酸配列で
構成されるI GL−EC22は、ヒトIgEのもつ抗
原性とヒトIL−2のもつ抗原性の両方を有しているた
めに、抗ヒトIgE抗体を用いてrGL−EC22を精
製し、精製したIGL−EC22を用いて抗ヒトIL−
2抗体を作製・精製し、精製した抗ヒトIL−2抗体を
用いて、ヒトIL−2を精製するという一連のヒトIL
−2精製過程の媒体となり得る。この場合、IGL−E
C22が、直接関与するのは抗ヒトIL−2抗体を精製
するときであるが、この様な未知の抗体を作製・精製す
る方法は他に例が無く、抗体精製の新技術として大きく
期待される。したがって、本発明のポリペプチドは、゛
ヒトインターロイキン2抗体を精製する際の媒体あるい
は試薬として使用され得る。
またIGL−EC22はアレルギー反応に関与するヒト
IgEと、T細胞増殖作用を有するヒトIL−2の双方
の免疫学的もしくは生物学的活性を有し、さらに未知の
第三の活性を有することが期待される。
IgEと、T細胞増殖作用を有するヒトIL−2の双方
の免疫学的もしくは生物学的活性を有し、さらに未知の
第三の活性を有することが期待される。
ヒトIL−2抗体精製の具体例としては次の様な方法が
行なわれる。
行なわれる。
まず、抗ヒトIgE抗゛体とアガロースゲルビーズ(B
io−Rad社製AHigel−10など)を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、IGL−
EC22を特異的に結合させる。次に、ヒトIL−2で
免疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清(ヒト
IL−2抗体が含ま直いる。)を、上述のIGL−BC
22吸着抗ヒトIgE抗体カラムと反応させる。これを
適当な緩衝液で溶出すると、I GL−EC22とヒト
IL−2抗体の混合液が得られる。この混合液をDEA
Eセルロースカラム(Whatman社製Ce1lul
ose52など)の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃度で
溶出すればヒト!L−2抗体が精製される。
io−Rad社製AHigel−10など)を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、IGL−
EC22を特異的に結合させる。次に、ヒトIL−2で
免疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清(ヒト
IL−2抗体が含ま直いる。)を、上述のIGL−BC
22吸着抗ヒトIgE抗体カラムと反応させる。これを
適当な緩衝液で溶出すると、I GL−EC22とヒト
IL−2抗体の混合液が得られる。この混合液をDEA
Eセルロースカラム(Whatman社製Ce1lul
ose52など)の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃度で
溶出すればヒト!L−2抗体が精製される。
抗18E抗体はアレルギー疾患の診断に必要欠くべから
ざる物質であり、需要も非常に多いが、その生産には大
量の純化ヒトIgEを非常とする。
ざる物質であり、需要も非常に多いが、その生産には大
量の純化ヒトIgEを非常とする。
そこで本発明のポリペプチドであるIGL−EC22を
用いて抗ヒトIgE抗体を精製することができる。した
がって、本発明のポリペプチドであるIGL−EC22
は、抗ヒトIgE抗体を精製する際の媒体あるいは試薬
として使用され得る。
用いて抗ヒトIgE抗体を精製することができる。した
がって、本発明のポリペプチドであるIGL−EC22
は、抗ヒトIgE抗体を精製する際の媒体あるいは試薬
として使用され得る。
抗ヒトIgE抗体精製の具体例としては次の様な方法が
行なわれる。
行なわれる。
まず、抗ヒトl−2抗体とアガロースゲルビーズ(Bi
o−Rad社製Afftgel−10など)を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、rGL−
EC22を特異的に結合させる。次に、ヒトIgEで免
疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清(抗ヒト
IgE抗体が含まれている。)を、上述のIGL−EC
22吸着抗ヒトI L−2抗体カラムと反応させる。こ
れを適当な緩衝液で溶出すると、IGL−EC22と抗
ヒトIgE抗体の混合液が得られる。この混合液をDE
AEセルロースカラム(Whatman社製Cel 1
ulose52など)の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃
度で溶出すれば抗ヒト■gE抗体が精製される。
o−Rad社製Afftgel−10など)を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、rGL−
EC22を特異的に結合させる。次に、ヒトIgEで免
疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清(抗ヒト
IgE抗体が含まれている。)を、上述のIGL−EC
22吸着抗ヒトI L−2抗体カラムと反応させる。こ
れを適当な緩衝液で溶出すると、IGL−EC22と抗
ヒトIgE抗体の混合液が得られる。この混合液をDE
AEセルロースカラム(Whatman社製Cel 1
ulose52など)の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃
度で溶出すれば抗ヒト■gE抗体が精製される。
なお、本明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Co
mm1ssion on Biochemical
Nomenclature による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を第
1表に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体があり
うる場合は、特に明示しなければL一体を示すものとす
る。
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Co
mm1ssion on Biochemical
Nomenclature による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を第
1表に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体があり
うる場合は、特に明示しなければL一体を示すものとす
る。
第1表
DNA デオキシリボ核酸
cDNA 相補的デオキシリボ核酸RNA
リボ核酸 mRNA 伝令リボ核酸 A デオキシアデニル酸 T チミジル酸 G デオキシグアニル酸 Cデオキシシチジル酸 U ウリジル酸 dATP デオキシアデノシン三リン酸dTTP
チミジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸dCTP
デオキシシチジン三リン酸ATP アデ
ノシン三リン酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸SDS
ドデシル硫酸ナトリウムcty グリシン Ala アラニン Val バリン Leu ロイシン 11e イソロイシン Ser セリン Thr スレオニン Cys システィン Met メチオニン Glu グルタミン酸 Asp アスパラギン酸 Lys リジン Arg アルギニン His ヒスチジン Phe フェニルアラニン Tyr チロシン Trp )リプトファン Pro プロリン Asn アスパラギン Gln グルタミン bp 塩基対 寒嵐鯉 以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。
リボ核酸 mRNA 伝令リボ核酸 A デオキシアデニル酸 T チミジル酸 G デオキシグアニル酸 Cデオキシシチジル酸 U ウリジル酸 dATP デオキシアデノシン三リン酸dTTP
チミジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸dCTP
デオキシシチジン三リン酸ATP アデ
ノシン三リン酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸SDS
ドデシル硫酸ナトリウムcty グリシン Ala アラニン Val バリン Leu ロイシン 11e イソロイシン Ser セリン Thr スレオニン Cys システィン Met メチオニン Glu グルタミン酸 Asp アスパラギン酸 Lys リジン Arg アルギニン His ヒスチジン Phe フェニルアラニン Tyr チロシン Trp )リプトファン Pro プロリン Asn アスパラギン Gln グルタミン bp 塩基対 寒嵐鯉 以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。
参考例1
ヒトIgEH鎖C2領域のポリペプチドを発現するプラ
スミドpcE’rtrp 818−Cの構築二日本特
開昭59−44399号公報に記載の方法で構築された
プラスミドpG ET trp 302のDNA1μ
gをC1aIで切断し、Stヌクレアーゼ消化を行って
両端の粘着末端を削った。このDNAをフェノール抽出
、エタノール沈澱により精製したのち、5′末端をリン
酸化したEcoRIリンカ−P(CTAGAATTCT
AG)50ngをT4DNAリガーゼを用いて結合し、
EcoRIリンカ−の重複連結したプラスミドを除くた
め、結合物をEcoRIで切断した。このDNAをT4
DNAリガーゼを用いて再結合して大腸菌294を形質
転換し、転換株よりpGETtrp 302−aを得
た。
スミドpcE’rtrp 818−Cの構築二日本特
開昭59−44399号公報に記載の方法で構築された
プラスミドpG ET trp 302のDNA1μ
gをC1aIで切断し、Stヌクレアーゼ消化を行って
両端の粘着末端を削った。このDNAをフェノール抽出
、エタノール沈澱により精製したのち、5′末端をリン
酸化したEcoRIリンカ−P(CTAGAATTCT
AG)50ngをT4DNAリガーゼを用いて結合し、
EcoRIリンカ−の重複連結したプラスミドを除くた
め、結合物をEcoRIで切断した。このDNAをT4
DNAリガーゼを用いて再結合して大腸菌294を形質
転換し、転換株よりpGETtrp 302−aを得
た。
pGETtrp302−aをEcoRIとPstlで消
化して生ずる1、2 kb DNA断片を、1.2%ア
ガロースゲル電気泳動により分画回収した。このDNA
断片50 ngを、EcoRI 、Pst I消化した
発現用ベクターptrp781[Nucleic A
c1ds Re5earch 11゜p、 3077
−3085(1983)1200ngにT4DNAリガ
ーゼを用いて組み込み、大腸菌294を形質転換し、ア
ンピノリン感受性の転換株よりpG E T trp
302−すを得た。pGETtrp302−bを制限酵
素Xbalで切断した後、生じたDNAの粘着末端をS
lヌクレアーゼ消化を行って平滑末端とした。 このD
NAを、フェノール抽出、エタノール沈澱により精製し
たのち、T4DNAリガーゼを用いて再結合し、大腸菌
294を形質転換した。転換株よりpGETtrり 3
02−dを得た。
化して生ずる1、2 kb DNA断片を、1.2%ア
ガロースゲル電気泳動により分画回収した。このDNA
断片50 ngを、EcoRI 、Pst I消化した
発現用ベクターptrp781[Nucleic A
c1ds Re5earch 11゜p、 3077
−3085(1983)1200ngにT4DNAリガ
ーゼを用いて組み込み、大腸菌294を形質転換し、ア
ンピノリン感受性の転換株よりpG E T trp
302−すを得た。pGETtrp302−bを制限酵
素Xbalで切断した後、生じたDNAの粘着末端をS
lヌクレアーゼ消化を行って平滑末端とした。 このD
NAを、フェノール抽出、エタノール沈澱により精製し
たのち、T4DNAリガーゼを用いて再結合し、大腸菌
294を形質転換した。転換株よりpGETtrり 3
02−dを得た。
1)G E T trp 302−dを制限酵素Pv
uI[部位で切断した後、制限酵素Ava1部位で切断
し、Ava1部位で切断されたDNA鎖を分取した。こ
のDNA鎖の両端を81ヌクレアーゼで削って平滑とし
た後、EcoRIリンカ−1)(CTAGAATTCT
AG)を結合し、EcoRI消化後再結合させて、発現
プラスミドpGETtrp 818−cを構築した(
第3図参照)。
uI[部位で切断した後、制限酵素Ava1部位で切断
し、Ava1部位で切断されたDNA鎖を分取した。こ
のDNA鎖の両端を81ヌクレアーゼで削って平滑とし
た後、EcoRIリンカ−1)(CTAGAATTCT
AG)を結合し、EcoRI消化後再結合させて、発現
プラスミドpGETtrp 818−cを構築した(
第3図参照)。
pGETtrl) 818−cは、C2領域の121
アミノ酸、およびC末端に、リンカ−の結合により生じ
たL eu、 G lu、 P heを有する分子量1
3,000のペプチドをコードしている。このプラスミ
ドは、N末端にIgEH鎖に由来しない、アダプターに
コードされたM’et 、 L euを有している。
アミノ酸、およびC末端に、リンカ−の結合により生じ
たL eu、 G lu、 P heを有する分子量1
3,000のペプチドをコードしている。このプラスミ
ドは、N末端にIgEH鎖に由来しない、アダプターに
コードされたM’et 、 L euを有している。
参考例2
ヒトIL−2のペプチドを発現するプラスミpTFlの
構築: (1)(i)ヒトIL−2をコードするmRNAの分離 ヒト末梢血より調製したリンパ球を12−0−テトラデ
カノイルホルボール−13−アセテート(T P AX
15ng/ml)とコンカナバリンA(40gg/ml
)を含むRPMI 1640 培地(10%の牛胎
児血清を含む)中、37℃で培養し、IL−2を誘導さ
せた。24時間後、この誘導したI XIO”個のヒト
リンパ球を5Mグアニジンチオシアネート、5%メルカ
プトエタノール、50 mM Tris−HCIpH
7,6,10mM EDTA溶液中でテア0ンホモゲ
ナイザーによって破壊変性した後N−ラウロイルザルコ
シン酸ナトリウムを4%になるように加え、均質化した
混合物を5.7M塩化セシウム溶液(5,7M塩化セシ
ウム、0.1M EDTA)6ml上に重層し、ベッ
クマンSW2gのローターを用いて15℃テ24QOO
rpm 48時間遠心処理を行い、RNA沈澱を得た
。このRNA沈澱を0.25%N−ラウロイルザルコシ
ン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱さ
せ、10mgのRNAを得た。このRNAを高塩溶液[
0,5M NaC1,10mM Tris・ HCl
pH7,6,1mM EDTA、0.3% S
DSコ中でオリゴ(dT)セルロースカラムに吸着させ
、ポリ(A)を含むmRNAを低塩溶液(lQmM
T ris−HCl pH7,6,1mM EDTA
、0.3%5DS)で溶出させることにより、ポリ(A
)を含むmRNA 300dgを分取した。このmRN
Aを更にエタノールで沈澱させ、0.2mlの溶液(l
omMTris−HCI pH7,6,2mM E
DTA、04%5DS)に溶かし、65℃で2分間処理
して10〜35%シヨ糖密度勾配遠心処理(ベックマン
5W28のローターを用いて20℃、25000rpm
で21時間遠心分離)することにより分画して22分画
を得た。この各分画につきRNAの一部ずつを、アフリ
カッメガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白中の
IL−2活性を測定し、分画11〜15(沈降逆数8S
−15s)にIL−2の活性を検出した。この分画のI
L−2mRNAは約25μgであった。
構築: (1)(i)ヒトIL−2をコードするmRNAの分離 ヒト末梢血より調製したリンパ球を12−0−テトラデ
カノイルホルボール−13−アセテート(T P AX
15ng/ml)とコンカナバリンA(40gg/ml
)を含むRPMI 1640 培地(10%の牛胎
児血清を含む)中、37℃で培養し、IL−2を誘導さ
せた。24時間後、この誘導したI XIO”個のヒト
リンパ球を5Mグアニジンチオシアネート、5%メルカ
プトエタノール、50 mM Tris−HCIpH
7,6,10mM EDTA溶液中でテア0ンホモゲ
ナイザーによって破壊変性した後N−ラウロイルザルコ
シン酸ナトリウムを4%になるように加え、均質化した
混合物を5.7M塩化セシウム溶液(5,7M塩化セシ
ウム、0.1M EDTA)6ml上に重層し、ベッ
クマンSW2gのローターを用いて15℃テ24QOO
rpm 48時間遠心処理を行い、RNA沈澱を得た
。このRNA沈澱を0.25%N−ラウロイルザルコシ
ン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱さ
せ、10mgのRNAを得た。このRNAを高塩溶液[
0,5M NaC1,10mM Tris・ HCl
pH7,6,1mM EDTA、0.3% S
DSコ中でオリゴ(dT)セルロースカラムに吸着させ
、ポリ(A)を含むmRNAを低塩溶液(lQmM
T ris−HCl pH7,6,1mM EDTA
、0.3%5DS)で溶出させることにより、ポリ(A
)を含むmRNA 300dgを分取した。このmRN
Aを更にエタノールで沈澱させ、0.2mlの溶液(l
omMTris−HCI pH7,6,2mM E
DTA、04%5DS)に溶かし、65℃で2分間処理
して10〜35%シヨ糖密度勾配遠心処理(ベックマン
5W28のローターを用いて20℃、25000rpm
で21時間遠心分離)することにより分画して22分画
を得た。この各分画につきRNAの一部ずつを、アフリ
カッメガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白中の
IL−2活性を測定し、分画11〜15(沈降逆数8S
−15s)にIL−2の活性を検出した。この分画のI
L−2mRNAは約25μgであった。
(11)単鎖DNAの合成:
上記で得たmRNAおよび逆転写酵素を用い、100d
の反応液(5μgのmRNA、50ggオリゴ(dT)
、100ユニツトの逆転写酵素、1mMずつのdATP
、dCTP、dGTPおよびdT T P 、 8 m
MMgCl、、50mM KCI、10mMジチオス
レイトール、50mM Tris−HCI pH8
,3)中で42°C,1時間インキュベートした後に、
フェノールで除蛋白し、0.INのNaOHで70℃、
20分処理してRNAを分解除去した。
の反応液(5μgのmRNA、50ggオリゴ(dT)
、100ユニツトの逆転写酵素、1mMずつのdATP
、dCTP、dGTPおよびdT T P 、 8 m
MMgCl、、50mM KCI、10mMジチオス
レイトール、50mM Tris−HCI pH8
,3)中で42°C,1時間インキュベートした後に、
フェノールで除蛋白し、0.INのNaOHで70℃、
20分処理してRNAを分解除去した。
(iii)二重鎖DNAの合成:
ここで合成された単鎖の相補DNAを50μ2の反応液
(n+RNAとオリゴdTを含まない以外は上記と同じ
反応液)中で42℃2時間反応させることにより二重鎖
DNAを合成した。
(n+RNAとオリゴdTを含まない以外は上記と同じ
反応液)中で42℃2時間反応させることにより二重鎖
DNAを合成した。
(iv)dCテイルの付加:
この二重1IDNAJこヌクレアーゼStを50μ2の
反応液(二重鎖D’NAO,1M酢酸ナトリウムpH4
,5,0,25M NaC1,1,5mM Zn5
O,,60ユニツトの81ヌクレアーゼ)中で室温30
分間作用させ、フェノールで除蛋白し、エタノールでD
NAを沈澱させた後、これにターミナルトランスフェラ
ーゼを50μρの反応液(二重鎖DNA、0.14Mカ
コジル酸カリウム、 0.3M Tris(塩基)p
H7,6,2mMジチオスレイトール、IIIIM C
oC1t。
反応液(二重鎖D’NAO,1M酢酸ナトリウムpH4
,5,0,25M NaC1,1,5mM Zn5
O,,60ユニツトの81ヌクレアーゼ)中で室温30
分間作用させ、フェノールで除蛋白し、エタノールでD
NAを沈澱させた後、これにターミナルトランスフェラ
ーゼを50μρの反応液(二重鎖DNA、0.14Mカ
コジル酸カリウム、 0.3M Tris(塩基)p
H7,6,2mMジチオスレイトール、IIIIM C
oC1t。
0.15 mM dCTP、30ユ:−ットターミナル
トランス フェラーゼ)中で3分間37℃で作用させ二
重lDNAの3′両端に約15個のデオキシシチジン鎖
を伸長させた。これらの1連の反応で約300ngのデ
オキシシチジン鎖をもった二重鎖DNAを得た。
トランス フェラーゼ)中で3分間37℃で作用させ二
重lDNAの3′両端に約15個のデオキシシチジン鎖
を伸長させた。これらの1連の反応で約300ngのデ
オキシシチジン鎖をもった二重鎖DNAを得た。
(V)大腸菌プラスミドの開裂ならびにdGテイルの付
加ニ 一方、10Mgの大腸菌プラスミドpB R322D
NAに制限酵素Pstlを50Mgの反応液(10Mg
l) NA、50mM NaC1,6mM Tris−
HCI−pH7,4゜6mM MgCIt、6mM2−
メルカプトエタノール。
加ニ 一方、10Mgの大腸菌プラスミドpB R322D
NAに制限酵素Pstlを50Mgの反応液(10Mg
l) NA、50mM NaC1,6mM Tris−
HCI−pH7,4゜6mM MgCIt、6mM2−
メルカプトエタノール。
100μg/ml牛血清アルブミン、20ユニツトのP
stI)中で3時間37℃で作用させて1)BR322
DNA中に1ケ所存在するPstl認識部位を切断し、
フェノールで除蛋白した後、ターミナルトランスフェラ
ーゼを50μ2の反応液(DNA10Mg、O,14M
カコジル酸カリ、0.3M Tris・塩基pH7,6
,2mMジチオスレイトール、1mM CaC1,,0
,15mM GTP、:(0ユニツトターミナルトラン
スフエラーゼ)中で3分間37℃で作用させ上記プラス
ミドpBR322DNAの両端に約17個のデオキシグ
アニン鎖を延長させた。
stI)中で3時間37℃で作用させて1)BR322
DNA中に1ケ所存在するPstl認識部位を切断し、
フェノールで除蛋白した後、ターミナルトランスフェラ
ーゼを50μ2の反応液(DNA10Mg、O,14M
カコジル酸カリ、0.3M Tris・塩基pH7,6
,2mMジチオスレイトール、1mM CaC1,,0
,15mM GTP、:(0ユニツトターミナルトラン
スフエラーゼ)中で3分間37℃で作用させ上記プラス
ミドpBR322DNAの両端に約17個のデオキシグ
アニン鎖を延長させた。
(vi )cD N Aの会合ならびに大腸菌の形質転
換:このようにして得られた合成二重鎖DNA 0.1
8gと上記プラスミドpBR322,0,5μgを0.
IMNaCl、50mM Tris−HCI pH
’/、6,1mMEDTAよりなる溶液中で65℃2分
間加熱しその後徐冷して会合さQEneaらの方法[J
、Mol。
換:このようにして得られた合成二重鎖DNA 0.1
8gと上記プラスミドpBR322,0,5μgを0.
IMNaCl、50mM Tris−HCI pH
’/、6,1mMEDTAよりなる溶液中で65℃2分
間加熱しその後徐冷して会合さQEneaらの方法[J
、Mol。
Biol、 、熟、495(1975)]に従って大腸
菌MM294を形質転換させた。
菌MM294を形質転換させた。
(vi)CDNA含有プラスミドの単離:このようにし
て約20,000個のテトラサイタリン耐性株が単離さ
れ、これら各々のDNAをニトロセルロースフィルター
の上に固定した。次いでTaniguchiらの報告[
Nature、 302.305 (1983)]した
IL−2のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸NO,7
4〜78(L ys” −His −L eu −G
l++ −Cys)およびアミノ酸NO,122〜12
6 (Thr” −Phe −Met −Cys −G
Iu)に対応する塩基配列(” A A ACAT
CTT CAG TGT”および”ACA TTC
ATG TGT GAA” )をトリエステル法[C
r5a、 R,らProc、 Natl。
て約20,000個のテトラサイタリン耐性株が単離さ
れ、これら各々のDNAをニトロセルロースフィルター
の上に固定した。次いでTaniguchiらの報告[
Nature、 302.305 (1983)]した
IL−2のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸NO,7
4〜78(L ys” −His −L eu −G
l++ −Cys)およびアミノ酸NO,122〜12
6 (Thr” −Phe −Met −Cys −G
Iu)に対応する塩基配列(” A A ACAT
CTT CAG TGT”および”ACA TTC
ATG TGT GAA” )をトリエステル法[C
r5a、 R,らProc、 Natl。
Acad、 Sci、 USA、75.5765 (1
97111)]により化学合成した。
97111)]により化学合成した。
このオリゴヌクレオチドに対してT4ポリヌクレオチド
カイネースを用いて50μρの反応液(オリゴヌクレオ
チド0.20Mg、50mM Tris −He1p
H8,0,10mM MgC1t、 lOn+Mメル
カプトエタノール、50μCiγ−3″PATP、3ユ
ニツトT4ポリヌクレオチドカイネース)中で1時間3
7℃で反応させ、5′末端を32Pで標識した。この標
識されたオリゴヌクレオチドをプローブとしてL aw
nらの方法[Nucleic Ac1ds Res
、 、9゜6103(1981)]に従って上記のニト
ロセルロースフィルター上に固定したDNAに会合させ
、オートラジオグラフィーによって上記2種類のオリゴ
ヌクレオチドプローブに反応する菌株を4個単離した。
カイネースを用いて50μρの反応液(オリゴヌクレオ
チド0.20Mg、50mM Tris −He1p
H8,0,10mM MgC1t、 lOn+Mメル
カプトエタノール、50μCiγ−3″PATP、3ユ
ニツトT4ポリヌクレオチドカイネース)中で1時間3
7℃で反応させ、5′末端を32Pで標識した。この標
識されたオリゴヌクレオチドをプローブとしてL aw
nらの方法[Nucleic Ac1ds Res
、 、9゜6103(1981)]に従って上記のニト
ロセルロースフィルター上に固定したDNAに会合させ
、オートラジオグラフィーによって上記2種類のオリゴ
ヌクレオチドプローブに反応する菌株を4個単離した。
これらの菌株の各々の菌体プラスミドDNAをアルカリ
法[Btrnboim H,C,& Doiy、
J。
法[Btrnboim H,C,& Doiy、
J。
NucLeic Ac1ds Res、 、7.1
51a (1979)]によって単離した。次にプラス
ミドDNAの挿入部を制限酵素Pstlにより切り出し
、分離したプラスミドのうちでその挿入部の長さの最も
長い断片を含むものをえらび、このプラスミドをpI
LOT 135−8と名づけた。
51a (1979)]によって単離した。次にプラス
ミドDNAの挿入部を制限酵素Pstlにより切り出し
、分離したプラスミドのうちでその挿入部の長さの最も
長い断片を含むものをえらび、このプラスミドをpI
LOT 135−8と名づけた。
(2)プラスミドI)TFIの構築:
前記(1)で得られたプラスミドpILOT135−8
を制限酵素Hg1AIで切断し、1294bpのDNA
断片を得た。このDNA断片をT4DNAポリメラーゼ
で処理して平滑末端とした後EcoRIリンカ−p(T
GCCATGAATTCATGGCA)をT4DNAリ
ガーゼを用いて結合し、EcoRIリンカ−の重複連結
したプラスミドを除く為、結合物をEcoRIで消化し
、さらにこの断片を制限酵素pstrで消化して、ヒト
IL−2遺伝子の読み取り枠にそろえて翻訳開始コドン
“ATG”を付加したDNA断片を作製した。
を制限酵素Hg1AIで切断し、1294bpのDNA
断片を得た。このDNA断片をT4DNAポリメラーゼ
で処理して平滑末端とした後EcoRIリンカ−p(T
GCCATGAATTCATGGCA)をT4DNAリ
ガーゼを用いて結合し、EcoRIリンカ−の重複連結
したプラスミドを除く為、結合物をEcoRIで消化し
、さらにこの断片を制限酵素pstrで消化して、ヒト
IL−2遺伝子の読み取り枠にそろえて翻訳開始コドン
“ATG”を付加したDNA断片を作製した。
このDNA断片を制限酵素EcoRIとPstIで消化
した発現用プラスミドptrp 781 [Nucle
fcAcids Re5earch 旦、 9.3
077−3085 (1983)]にT4DNAリガ〜
ゼにより結合させた。この反応によりtrpプロモータ
ーの下流に翻訳開始コドンを有し。読み取り枠を一致さ
せてヒト!L−2発現プラスミドpTFlを構築した(
第4図参照)。
した発現用プラスミドptrp 781 [Nucle
fcAcids Re5earch 旦、 9.3
077−3085 (1983)]にT4DNAリガ〜
ゼにより結合させた。この反応によりtrpプロモータ
ーの下流に翻訳開始コドンを有し。読み取り枠を一致さ
せてヒト!L−2発現プラスミドpTFlを構築した(
第4図参照)。
このプラスミドを用いて大腸菌DHIを形質転換さ仕る
ことにより、求めるプラスミドpTFlを含む菌株を得
た。
ことにより、求めるプラスミドpTFlを含む菌株を得
た。
実施例!
IGL−EC22のポリペプチド発現プラスミドpG
E L 102gの構築および形質転換体の製造ニブラ
スミドpGET trp 818−Cを制限酵素C1a
lおよびEcoRIで切断して約3KbpのDNA断片
を得た。また、プラスミドpTF1を制限酵素EcoR
IおよびPst[で切断して約5QQbpのDNA断片
を得た。これらの2つのDNA断片を74DNAリガー
ゼで結合させた。この反応によりtrpプロモーターの
下流に翻訳開始コドンを有し、読み取り枠を一致させて
IGL−EC22発現プ発現用ラスミドE L 102
gを構築した(第5図参照)。
E L 102gの構築および形質転換体の製造ニブラ
スミドpGET trp 818−Cを制限酵素C1a
lおよびEcoRIで切断して約3KbpのDNA断片
を得た。また、プラスミドpTF1を制限酵素EcoR
IおよびPst[で切断して約5QQbpのDNA断片
を得た。これらの2つのDNA断片を74DNAリガー
ゼで結合させた。この反応によりtrpプロモーターの
下流に翻訳開始コドンを有し、読み取り枠を一致させて
IGL−EC22発現プ発現用ラスミドE L 102
gを構築した(第5図参照)。
このプラスミドを用いて大腸菌DHIを形質転換させ、
プラスミドpG E L 102gを含む形質転換体E
、 coli DHI/pGEL1028(I FO
14332゜FERM P−7568)を得た。
プラスミドpG E L 102gを含む形質転換体E
、 coli DHI/pGEL1028(I FO
14332゜FERM P−7568)を得た。
実施例2
(1) I GL−EC22を含む菌体抽出液の調製
:IGL−EC22発現プラスミドpGEL 1028
を含む大腸菌E、 colt DH1/pGEL 10
28(IFo 14332. FERM P−75
68)を20m1のl°%グルコース、0.4%カザミ
ノ酸を含むM9培地で37℃4時間培養した後、インド
ールアクリル酸を30μg/口lに加え、さらに37℃
3時間培養した。
:IGL−EC22発現プラスミドpGEL 1028
を含む大腸菌E、 colt DH1/pGEL 10
28(IFo 14332. FERM P−75
68)を20m1のl°%グルコース、0.4%カザミ
ノ酸を含むM9培地で37℃4時間培養した後、インド
ールアクリル酸を30μg/口lに加え、さらに37℃
3時間培養した。
菌体を集め、食塩水で洗ったのち、0.5mlの溶菌液
(lomM Tris−HCI、 pH8,0,1
0a+MEDTA 0.2M NaC1,1mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、0.02%トリト
ンXl00゜0.1mg/mlリゾチーム)に懸濁し、
0℃にて45分。
(lomM Tris−HCI、 pH8,0,1
0a+MEDTA 0.2M NaC1,1mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、0.02%トリト
ンXl00゜0.1mg/mlリゾチーム)に懸濁し、
0℃にて45分。
37℃にて2分放置して溶菌させた。これをさらに軽<
(30秒)超音波処理を行って、溶出した菌体のDNA
を切断した後、4℃で1500Orpm(サーバル5S
340−ター、デュポン社製)、30分間の遠心分離操
作によって上澄み液を得た。この上澄み液を菌体抽出液
とした。
(30秒)超音波処理を行って、溶出した菌体のDNA
を切断した後、4℃で1500Orpm(サーバル5S
340−ター、デュポン社製)、30分間の遠心分離操
作によって上澄み液を得た。この上澄み液を菌体抽出液
とした。
(2)菌体抽出液のIgE活性の測定:菌体抽出液のI
gE活性をIgB測定キット(IgEテスト・ジオツギ
、塩野義製薬製1日本)を用いたRu5T法[Radi
o immuno 5orbenttest、 I
IIlmunology、 14.265 (196
8)]により定量した。
gE活性をIgB測定キット(IgEテスト・ジオツギ
、塩野義製薬製1日本)を用いたRu5T法[Radi
o immuno 5orbenttest、 I
IIlmunology、 14.265 (196
8)]により定量した。
IGL−EC22のIgE活性は42XIO’単位/Q
培養液であった。
培養液であった。
(3)菌体抽出液の!L−2活性:
ヒトIL−2活性の測定は、マウスのTCGF依存性細
胞株NKC3[日本免疫学会総会記録、第11巻277
頁(1981年)コを用いて行った。即ち、まず2段階
希釈により希釈された種々の濃度のサンプル50μ党を
とり、平底マイクロプレート(ファルコン社製)に入れ
た。次いで3X10’のNKC3細胞を含む、10%牛
脂児血清(10%FC9)含有RPMI−1640液5
0μgを加え、炭酸ガスふ卵器内で37℃、20時間培
養した。さらに3H−チミジン1μCiを加えて、4時
間培養したのち、セルハーベスタ−(和研薬工業社製1
日本)を用いて、細胞をガラスフィルターにトラップし
、洗浄、ろ過。
胞株NKC3[日本免疫学会総会記録、第11巻277
頁(1981年)コを用いて行った。即ち、まず2段階
希釈により希釈された種々の濃度のサンプル50μ党を
とり、平底マイクロプレート(ファルコン社製)に入れ
た。次いで3X10’のNKC3細胞を含む、10%牛
脂児血清(10%FC9)含有RPMI−1640液5
0μgを加え、炭酸ガスふ卵器内で37℃、20時間培
養した。さらに3H−チミジン1μCiを加えて、4時
間培養したのち、セルハーベスタ−(和研薬工業社製1
日本)を用いて、細胞をガラスフィルターにトラップし
、洗浄、ろ過。
乾燥の後、シンチレーションカウンターにより放射活性
を測定した。サンプル中のIGL−EC22のIL−2
活性は、16X 10’単位/Q培養液であった。
を測定した。サンプル中のIGL−EC22のIL−2
活性は、16X 10’単位/Q培養液であった。
なお、上記活性は、日本特開昭58−116498号公
報に記載された算出方法を基準として測定された。
報に記載された算出方法を基準として測定された。
(4) IGL−EC22の精製:
日本特開昭58−96028号公報に記載されている方
°法により抗ヒトIgEモノクローナル抗体を水不溶性
担体アフィゲル10(B io −Rad社製)に結合
させた。抗ヒトIgEモノクローナル抗体−アフィゲル
10カラム1mlに前項(3)で得られたE。
°法により抗ヒトIgEモノクローナル抗体を水不溶性
担体アフィゲル10(B io −Rad社製)に結合
させた。抗ヒトIgEモノクローナル抗体−アフィゲル
10カラム1mlに前項(3)で得られたE。
coli D H1/pG E L 102gを含む菌
体抽出液5mlをかけ、20%デキストロースを含むP
B S (20mMリン酸緩衝液、pHa、g、 0
.15M NaC1)50mlを用いてカラムを洗浄
したのち、0.2M酢酸、0.15MNaC1溶液5m
lを用いて、カラムに吸着したIGL−EC22をカラ
ムから溶出し、溶出液をただちに中和したのち、PBS
H!に対して5℃で24時間透析した。この操作によ
り純度80%以上のIGL−EC22のポリペプチドが
約50%の回収率で得られた。
体抽出液5mlをかけ、20%デキストロースを含むP
B S (20mMリン酸緩衝液、pHa、g、 0
.15M NaC1)50mlを用いてカラムを洗浄
したのち、0.2M酢酸、0.15MNaC1溶液5m
lを用いて、カラムに吸着したIGL−EC22をカラ
ムから溶出し、溶出液をただちに中和したのち、PBS
H!に対して5℃で24時間透析した。この操作によ
り純度80%以上のIGL−EC22のポリペプチドが
約50%の回収率で得られた。
聚吸盆然星
本発明のポリペプチドを用いると、抗ヒトIL−2抗体
を効率良く精製することができる。
を効率良く精製することができる。
第1図はヒトIgEのペプチドをコードする構築1図
−そ 造遺伝子を有するDNAおよびヒトIL−2のペプチド
をコードする構造遺伝子を有するDNAを連結してなる
DNAのヌクレオチド配列を、第2図は第1図に示され
るヌクレオチド配列に対するアミノ酸配列を、第3図は
参考例1の構築図を、第4図は参考例2(2)の構築図
をそれぞれ示す。 第5図は実施例1の構築図を示し、=n工uL部はヒト
IL−2のペプチドをコードする部分を示す。 し 第2図−その )iE’I” LEU ASP ASN LY
S THRPHE 5EEPF?OPROTHRV
AL LYS 工LE LEU GLNH工S
PHE PROPF?OTHR工LE GLN
LE[JTHRPROGLY THR工LE
ASN 工LE THFIMET ASP V
AL ASP LEU SERTHRALALE
U ALA SE’RTHRGLN SERGL
U LEULEU SERASP ARG T
HRTYRTHRCYSTHRPHE GLU A
SP SERTHRLYS LYSPHE MET
ALA PROTHRSER5ETI 5ERL
EU GLU HIS LEU LEU L
EU ASP LEUVAL CYS SERAR
G ASP PHE THR3ERSERCYS AS
P GLY GLY GLYLEU CYS LEU
VAL SERGLY TYRTRP LEU GLU
ASP GLY GLN VALSERTHRTHR
GLN GLU GLY GLUTHRLEU SEF
? GLN LYS HIS TRPGLN VA
L THRTYRGLN GLY H工5CYS AL
A ASP SERASN LEU GLUTHRL
YS LYS THRGLN LED GLNGLN
MET 工LE LEU ASN GLY 工LEつ
づきあす 第2図−その2 ASN ASN TYRLYS ASN PR
OLYS LEU THRPHE TYRMET
PROLYS LYS ALA THRGLUL
EU GLU GLU GLU LEU L
YS PROLEU GLUGLN SERLYS
ASN PHE HIS LEU ARG
PRO工LE ASN VAL 工LE
VAL LEU GLU LEU LYSi’iE
T CYS GLU TYRALA ASP
GLU THRALAASN AF?G TR
P 工LE THRPHE CYS GLN
5ERARG MET LEU THRPHE L
YSLF:U LYS HIS LEU GLN CY
SGLU VAL LEU ASN LEU ALA
ARG ASP LEU 工LE SERASNGLY
SERGLU THRTH)I PHETHR工L
E VAL GLU PHE LEU工LE 工LE
SERTHRLEU THR匡 1
−そ 造遺伝子を有するDNAおよびヒトIL−2のペプチド
をコードする構造遺伝子を有するDNAを連結してなる
DNAのヌクレオチド配列を、第2図は第1図に示され
るヌクレオチド配列に対するアミノ酸配列を、第3図は
参考例1の構築図を、第4図は参考例2(2)の構築図
をそれぞれ示す。 第5図は実施例1の構築図を示し、=n工uL部はヒト
IL−2のペプチドをコードする部分を示す。 し 第2図−その )iE’I” LEU ASP ASN LY
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づきあす 第2図−その2 ASN ASN TYRLYS ASN PR
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E VAL GLU PHE LEU工LE 工LE
SERTHRLEU THR匡 1
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝
子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAをそれぞれ
の読み取り枠をそろえて連結してなるDNA。 2、両構造遺伝子の上流にプロモーターを連結してなる
特許請求の範囲第1項記載のDNA。 3、両構造遺伝子の間にリンカーを介してなる特許請求
の範囲第1項記載のDNA。 4、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブリ
ンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範囲
第1項記載のDNA。 5、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝
子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAをそれぞれ
読み取り枠をそろえて連結してなるDNAが組み込まれ
たプラスミド。 6、DNAが構造遺伝子の上流にプロモーターを連結し
てなるDNAである特許請求の範囲第5項記載のプラス
ミド。 7、DNAが構造遺伝子の間にリンカーを介してなるD
NAである特許請求の範囲第5項記載のプラスミド。 8、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブリ
ンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範囲
第5項記載のプラスミド。 9、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝
子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAをそれぞれ
の読み取り枠をそろえて連結してなるDNAが組み込ま
れたプラスミドで形質転換された形質転換体。 10、形質転換体の宿主がエシェリヒア属菌である特許
請求の範囲第9項記載の形質転換体。 11、DNAが構造遺伝子の上流にプロモーターを連結
してなるDNAである特許請求の範囲第9項記載の形質
転換体。 12、DNAが構造遺伝子の間にリンカーを介してなる
DNAである特許請求の範囲第9項記載の形質転換体。 13、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブ
リンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範
囲第9項記載の形質転換体。 14、抗体認識部位を含むペプチドとヒトインターロイ
キン2のペプチドとを結合したポリペプチド。 15、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブ
リンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範
囲第14項記載のポリペプチド。 16、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺
伝子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2のペ
プチドをコードする構造遺伝子を有するDNAをそれぞ
れ読み取り枠をそろえて連結してなるDNAが組み込ま
れたプラスミドで形質転換された形質転換体を培地に培
養し、培養物中に抗体認識部位を含むペプチドとヒトイ
ンターロイキン2のペプチドとを結合したポリペプチド
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該
ポリペプチドの製造法。 17、形質転換体の宿主がエシェリヒア属菌である特許
請求の範囲第16項記載のポリペプチドの製造法。 18、DNAが構造遺伝子の上流にプロモーターを連結
してなるDNAである特許請求の範囲第16項記載のポ
リペプチドの製造法。 19、DNAが構造遺伝子の間にリンカーを介してなる
DNAである特許請求の範囲第16項記載のポリペプチ
ドの製造法。 20、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブ
リンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範
囲第16項記載のポリペプチドの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
WO84/00181 | 1984-04-10 | ||
PCT/JP1984/000181 WO1985004673A1 (en) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | Novel dna and its use |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61181380A true JPS61181380A (ja) | 1986-08-14 |
Family
ID=13818296
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60075910A Pending JPS61181380A (ja) | 1984-04-10 | 1985-04-09 | 新規dnaおよびその用途 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61181380A (ja) |
WO (1) | WO1985004673A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3712985A1 (de) * | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
EP0269455A3 (en) * | 1986-11-28 | 1989-09-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Highly purified fused protein comprising human ige fc fragment and production thereof |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Il‐2をコードする新規伝令rnaの製造法 |
JPS5944399A (ja) * | 1982-09-07 | 1984-03-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規dna |
-
1984
- 1984-04-10 WO PCT/JP1984/000181 patent/WO1985004673A1/ja unknown
-
1985
- 1985-04-09 JP JP60075910A patent/JPS61181380A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1985004673A1 (en) | 1985-10-24 |
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