JPS61181380A - 新規ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
新規ｄｎａおよびその用途Info
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- JPS61181380A JPS61181380A JP60075910A JP7591085A JPS61181380A JP S61181380 A JPS61181380 A JP S61181380A JP 60075910 A JP60075910 A JP 60075910A JP 7591085 A JP7591085 A JP 7591085A JP S61181380 A JPS61181380 A JP S61181380A
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- dna
- peptide
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- human
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構
造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒトインターロイキン２
のペプチドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡを連
結してなるＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれたプラスミド
、該プラスミドで形質転換された形質転換体、抗体認識
部位を含むペプチドとヒトインターロイキン２のペプチ
ドとを結合したポリペプチドおよび該形質転換体を用い
る該ポリペプチドの製造法に関する。
造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒトインターロイキン２
のペプチドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡを連
結してなるＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれたプラスミド
、該プラスミドで形質転換された形質転換体、抗体認識
部位を含むペプチドとヒトインターロイキン２のペプチ
ドとを結合したポリペプチドおよび該形質転換体を用い
る該ポリペプチドの製造法に関する。
従来の技術
抗体認識部位を含むペプチド、例えば免疫グロブリンＥ
（以下、ＩｇＥと略称することもある）は、アレルギー
反応などの重要な生体反応を担っている。すなわち、ア
レルギー反応は特異抗原と結合したＩｇＥの感作された
肥満細胞や好塩基球への結合によって誘起されることが
知られている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗ ４１．１０９ （１９７８） ）。
（以下、ＩｇＥと略称することもある）は、アレルギー
反応などの重要な生体反応を担っている。すなわち、ア
レルギー反応は特異抗原と結合したＩｇＥの感作された
肥満細胞や好塩基球への結合によって誘起されることが
知られている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗ ４１．１０９ （１９７８） ）。
従って、アレルギー反応をおさえるために抗原結合部位
を除いたＩｇＥ分子を用いることも考えられている。し
かし生体内でのＩｇＥに起因する種々の反応については
、まだ未解決な点が多い。十分な量のヒトＩｇＥを供給
できないことが、この理由の一つとなっている。
を除いたＩｇＥ分子を用いることも考えられている。し
かし生体内でのＩｇＥに起因する種々の反応については
、まだ未解決な点が多い。十分な量のヒトＩｇＥを供給
できないことが、この理由の一つとなっている。
ＩｇＥの生産方法としては、ヒトＩｇＥ産生能を有する
株化ヒト骨髄腫細胞の培養上清より分取精製する方法が
提唱されているが、細胞培養であること、細胞の増殖能
が低いことなどから、安価に大量のＩｇＥを得るのは難
しい。そこで、遺伝子操作技術を利用して、ＩｇＥ構造
遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体を培養することにより、ＩｇＥを大量に得られる
技術が開発された［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１１．７１９ （１９８３）； Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ旦、３
０７７ （１９８３）］。
株化ヒト骨髄腫細胞の培養上清より分取精製する方法が
提唱されているが、細胞培養であること、細胞の増殖能
が低いことなどから、安価に大量のＩｇＥを得るのは難
しい。そこで、遺伝子操作技術を利用して、ＩｇＥ構造
遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体を培養することにより、ＩｇＥを大量に得られる
技術が開発された［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１１．７１９ （１９８３）； Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ旦、３
０７７ （１９８３）］。
一方、インターロイキン２［以下、ＩＬ−２と略称する
こともある。以前はＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）と呼ば
れた。］は、レクチンやアロ抗原等で刺激されたＴ細胞
によって産生されるリンホカインである［５ｃｉｅｎｓ
ｅ １９３．１００７ （１９７６）：Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗ ５１．２５７ （１９
８０）］。Ｉｎ。
こともある。以前はＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）と呼ば
れた。］は、レクチンやアロ抗原等で刺激されたＴ細胞
によって産生されるリンホカインである［５ｃｉｅｎｓ
ｅ １９３．１００７ （１９７６）：Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗ ５１．２５７ （１９
８０）］。Ｉｎ。
−２は、Ｔ細胞をインビトロでその機能を保持したまま
増殖させ長期間の継代維持を可能にするはかに、今まで
に胸腺細胞のマイト−ジエン反応を促進したり（コステ
ィミュレーター）、ヌードマウス婢細胞のＴ細胞依存性
抗原に対する抗体産生能を回復させたり（Ｔ細胞リブレ
ーシングファクター）、キラー細胞の分化増殖を促進す
る（キラーヘルパーファクター）活性を有すると報告さ
れている［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２３゜２９２８ （１９７９
） ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
５１．２５７（１９８０）］。
増殖させ長期間の継代維持を可能にするはかに、今まで
に胸腺細胞のマイト−ジエン反応を促進したり（コステ
ィミュレーター）、ヌードマウス婢細胞のＴ細胞依存性
抗原に対する抗体産生能を回復させたり（Ｔ細胞リブレ
ーシングファクター）、キラー細胞の分化増殖を促進す
る（キラーヘルパーファクター）活性を有すると報告さ
れている［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２３゜２９２８ （１９７９
） ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
５１．２５７（１９８０）］。
しかしながら、ヒトｒＬ−２は、天然のものを用いての
量産は困難であるため、遺伝子操作技術を利用して、ヒ
トＩＬ−２構造遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質
転換された形質転換体を培養することにより、ヒトＩＬ
−２を大量に得られるようになった［Ｎａｔｕｒｅ
３０２．３０５（１９８３）；Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ａｎｄ Ｂ １ｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌ、
１０９． ＮＯ，２，ｐ、３６３（１９８３）： Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
１１゜４３０７ （１９８３）］。
量産は困難であるため、遺伝子操作技術を利用して、ヒ
トＩＬ−２構造遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質
転換された形質転換体を培養することにより、ヒトＩＬ
−２を大量に得られるようになった［Ｎａｔｕｒｅ
３０２．３０５（１９８３）；Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ａｎｄ Ｂ １ｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌ、
１０９． ＮＯ，２，ｐ、３６３（１９８３）： Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
１１゜４３０７ （１９８３）］。
発明が解決しようとする問題点
前記のとおり、ヒトＩｇＥのペプチドあるいはヒトＩＬ
−２のペプチドをそれぞれ単独でコードする構造遺伝子
によるこれらの発現がそれぞれ単独で試みられてきたが
、本発明はこれら２種の異なる免疫学的あるいは生物学
的活性を持つ異種蛋白の新規複合体を製造することにあ
る。
−２のペプチドをそれぞれ単独でコードする構造遺伝子
によるこれらの発現がそれぞれ単独で試みられてきたが
、本発明はこれら２種の異なる免疫学的あるいは生物学
的活性を持つ異種蛋白の新規複合体を製造することにあ
る。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、ヒトＩｇＥとヒトＩＬ〜２との異種蛋白
の複合体を遺伝子工学の手法を用い製造したところ、該
複合体はヒトＩｇＥのもつ抗原性とヒトＩＬ−２のもつ
抗原性の両方の性質を有していることを見いだし、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。
の複合体を遺伝子工学の手法を用い製造したところ、該
複合体はヒトＩｇＥのもつ抗原性とヒトＩＬ−２のもつ
抗原性の両方の性質を有していることを見いだし、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、（１）、抗体認識部位を含むペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒト
ＩＬ−２のペプチドをコードする構造遺伝子を有するＤ
ＮＡを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
ＤＮＡ、（２）、抗体認識部位を含むペプチドをコード
する構造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒトＩＬ−２のペ
プチドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡを、それ
ぞれの読み取り枠をそろえて連結してなるＤＮＡが組み
込まれたプラスミド、（３）、抗体認識部位を含むペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒト
ＩＬ−２のペプチドをコードする構造遺伝子を有するＤ
ＮＡを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
ＤＮＡが組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体、（４）、抗体認識部位を含むペプチドとヒトＩ
Ｌ−２のペプチドとを結合したポリペプチド、および（
５）、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺
伝子を有するＤＮＡおよびヒトＩＬ−２のペプチドをコ
ードする構造遺伝子を有するＤＮＡを、それぞれ読み取
り枠をそろえて連結してなるＤＮＡが組み込まれたプラ
スミドで形質転換された形質転換体を培地に培養し、培
養物中に抗体認識部位を含むペプチドとヒトＩＬ−２の
ペプチドとを結合したポリペプチドを生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造
法である。
チドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒト
ＩＬ−２のペプチドをコードする構造遺伝子を有するＤ
ＮＡを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
ＤＮＡ、（２）、抗体認識部位を含むペプチドをコード
する構造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒトＩＬ−２のペ
プチドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡを、それ
ぞれの読み取り枠をそろえて連結してなるＤＮＡが組み
込まれたプラスミド、（３）、抗体認識部位を含むペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒト
ＩＬ−２のペプチドをコードする構造遺伝子を有するＤ
ＮＡを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
ＤＮＡが組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体、（４）、抗体認識部位を含むペプチドとヒトＩ
Ｌ−２のペプチドとを結合したポリペプチド、および（
５）、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺
伝子を有するＤＮＡおよびヒトＩＬ−２のペプチドをコ
ードする構造遺伝子を有するＤＮＡを、それぞれ読み取
り枠をそろえて連結してなるＤＮＡが組み込まれたプラ
スミドで形質転換された形質転換体を培地に培養し、培
養物中に抗体認識部位を含むペプチドとヒトＩＬ−２の
ペプチドとを結合したポリペプチドを生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造
法である。
本明細書においては、抗体認識部位を含むペプチドがヒ
トＩｇＥであり、これとヒトＩＬ−２のペプチドとを結
合したポリペプチドをイムノブロイキン（Ｉ ｍｍｕｎ
ｏｇｌｅｕｋｉｎ）Ｅ Ｃ２２と称し、あるいは単にＩ
ＧＬ−ＥＣ２２と略称することもある。
トＩｇＥであり、これとヒトＩＬ−２のペプチドとを結
合したポリペプチドをイムノブロイキン（Ｉ ｍｍｕｎ
ｏｇｌｅｕｋｉｎ）Ｅ Ｃ２２と称し、あるいは単にＩ
ＧＬ−ＥＣ２２と略称することもある。
本発明における抗体認識部位を含むペプチドとしては、
たとえば抗ヒト免疫グロブリンＥ抗体認識部位を含むペ
プチドが挙げられる。
たとえば抗ヒト免疫グロブリンＥ抗体認識部位を含むペ
プチドが挙げられる。
抗ヒトＩｇＥ抗体認識部位を含むペプチドとしては、ヒ
トＩｇＥＨ鎖の全部または部分を含むペプチドが挙げら
れる。該ヒトＩｇＥＨ鎖の部分とは、ヒトＩｇＥ分子を
構成するペプチド鎖の１つで、該分子は１対のＨ鎖と１
対のし鎖から構成されていることが知られている。した
がって、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造
遺伝子の例としては、ヒトＩｇＥＨ鎖の全部または部分
を含むペプチドをコードする構造遺伝子が挙げられる。
トＩｇＥＨ鎖の全部または部分を含むペプチドが挙げら
れる。該ヒトＩｇＥＨ鎖の部分とは、ヒトＩｇＥ分子を
構成するペプチド鎖の１つで、該分子は１対のＨ鎖と１
対のし鎖から構成されていることが知られている。した
がって、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造
遺伝子の例としては、ヒトＩｇＥＨ鎖の全部または部分
を含むペプチドをコードする構造遺伝子が挙げられる。
該ＩｇＥ Ｈ鎖の全部または部分を含むペプチドをコ
ードする構造遺伝子としては、たとえば、日本特開昭５
９−４４３９９号公報、Ｃｅ１ｌ ｖｏｌ、 ２９
゜６９１ （１９８２）、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １１゜７１９ （１９８
３）、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ １１゜３０７７（１９８３）、 ＥＭＢＯ（
Ｔｈｅ ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）Ｊｏｕｒ
ｎａｌ上、 ６５５ （１９８２）などに記載されたＤ
ＮＡが挙げられる。
ードする構造遺伝子としては、たとえば、日本特開昭５
９−４４３９９号公報、Ｃｅ１ｌ ｖｏｌ、 ２９
゜６９１ （１９８２）、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １１゜７１９ （１９８
３）、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ １１゜３０７７（１９８３）、 ＥＭＢＯ（
Ｔｈｅ ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）Ｊｏｕｒ
ｎａｌ上、 ６５５ （１９８２）などに記載されたＤ
ＮＡが挙げられる。
本発明のヒトＩＬ−２のペプチドとは、ヒトＩＬ−２活
性を有するペプチドであればいずれでもよい。たとえば
活性を有する限り、ヒトＩＬ−２より短いペプチドであ
っても長いペプチドであってもよい。
性を有するペプチドであればいずれでもよい。たとえば
活性を有する限り、ヒトＩＬ−２より短いペプチドであ
っても長いペプチドであってもよい。
該ヒトＩＬ−２のペプチドをコードする構造遺伝子とし
ては、たとえば、日本特許出願昭和５８年第２２５０７
９号（昭和５８年（西暦１９８３年）１１月２８日付出
願）１日本特許出願昭和５８年第２：（５６３８号（昭
和５８年（西暦１９８３年）１２月１３日付出願）、
Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ。
ては、たとえば、日本特許出願昭和５８年第２２５０７
９号（昭和５８年（西暦１９８３年）１１月２８日付出
願）１日本特許出願昭和５８年第２：（５６３８号（昭
和５８年（西暦１９８３年）１２月１３日付出願）、
Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ。
３０２、 ｐ、３０５ （１９８３）、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｖｏｌ
、 １０９． ＮＯ，２，ｐ、３６３ （１９８２）、
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
旦、 ４３０７ （１９８３）などに記載されたＤＮＡ
が挙げられる。
ｍｉｃａｌ ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｖｏｌ
、 １０９． ＮＯ，２，ｐ、３６３ （１９８２）、
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
旦、 ４３０７ （１９８３）などに記載されたＤＮＡ
が挙げられる。
上記、特許出願昭和５８年第２２５０７９号に記載され
たヒトＩＬ−２のペプチドをコードするＤＮＡは、式 ％式％ 中、コドン１−１３３で示される塩基配列のＤＮＡ（Ｖ
）が挙げられる。このＤＮＡ（Ｖ）は、その５′末端に
ＡＴＧまたは上記式中コドンＳ１〜Ｓ２゜で示されるシ
グナルコドンを有していてもよく、３′末端にＴＡＡ、
ＴＧＡまたはＴＡＧを育することが好ましく、とりわけ
ＴＧＡが好ましい。
たヒトＩＬ−２のペプチドをコードするＤＮＡは、式 ％式％ 中、コドン１−１３３で示される塩基配列のＤＮＡ（Ｖ
）が挙げられる。このＤＮＡ（Ｖ）は、その５′末端に
ＡＴＧまたは上記式中コドンＳ１〜Ｓ２゜で示されるシ
グナルコドンを有していてもよく、３′末端にＴＡＡ、
ＴＧＡまたはＴＡＧを育することが好ましく、とりわけ
ＴＧＡが好ましい。
上記ＤＮＡ（Ｖ）は、式
％式％
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ
Ｌｅ＋ｕ ＴｈｒＰｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔ
ｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ ＬｙｓＬｙｓ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ ＧｌｕＬｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ ＶａｌＬｅｕ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ ＬｙｓＡ
ｓｎ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ ＡｒｇＡｓｐ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ｓｅｒ
Ａｓｎ ｌｉｅ ＡｓｎＶａｔ ｌｉｅ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ ＬｙｓＣｙ
ｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌ
ｕ ＴｈｒＡｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｐｈｅ ＬｅｕＡｓｎ Ａｒｇ
Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ ＣｙｓＧ
ｉｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ｌｉｅ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ（上記式中、ＸはＭｅｔ または水
素を示す。）で表わされるペプチドをコードする。また
、上記日本特許出願昭和５８年第２３５６３８号に記載
されたヒトＩＬ−２のペプチドをコードするＤＮＡは、
式２式％ ［式中、ＸはＡＧＣ，ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ。
Ｌｅ＋ｕ ＴｈｒＰｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔ
ｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ ＬｙｓＬｙｓ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ ＧｌｕＬｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ ＶａｌＬｅｕ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ ＬｙｓＡ
ｓｎ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ ＡｒｇＡｓｐ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ｓｅｒ
Ａｓｎ ｌｉｅ ＡｓｎＶａｔ ｌｉｅ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ ＬｙｓＣｙ
ｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌ
ｕ ＴｈｒＡｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｐｈｅ ＬｅｕＡｓｎ Ａｒｇ
Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ ＣｙｓＧ
ｉｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ｌｉｅ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ（上記式中、ＸはＭｅｔ または水
素を示す。）で表わされるペプチドをコードする。また
、上記日本特許出願昭和５８年第２３５６３８号に記載
されたヒトＩＬ−２のペプチドをコードするＤＮＡは、
式２式％ ［式中、ＸはＡＧＣ，ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ。
ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ以外のコ
ドンまたは水素を示し、Ｙはコドンまたは水酸基を示す
コで表わされる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、上
記ＤＮＡ（■）は、式２式％ ［式中、ＺはＳｅｔ以外のアミノ酸残基または水素を示
す］の配列を有するポリペプチドをコードする。
ドンまたは水素を示し、Ｙはコドンまたは水酸基を示す
コで表わされる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、上
記ＤＮＡ（■）は、式２式％ ［式中、ＺはＳｅｔ以外のアミノ酸残基または水素を示
す］の配列を有するポリペプチドをコードする。
ＤＮＡ（Ｖｌ）に関し、Ｘで示されるコドンは、ヒ）［
Ｌ−２と実質的に同様の活性を有するポリペプチド（■
）の一部を構成するアミノ酸をコードするコドン（但し
、ＸはＳｅｔをコードするコドンおよび翻訳終止コドン
ではない）であればいずれでもよく、更にその５′末端
側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有していて
もよい。ＸはとりわけＡＴＧであることが好ましい。
Ｌ−２と実質的に同様の活性を有するポリペプチド（■
）の一部を構成するアミノ酸をコードするコドン（但し
、ＸはＳｅｔをコードするコドンおよび翻訳終止コドン
ではない）であればいずれでもよく、更にその５′末端
側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有していて
もよい。ＸはとりわけＡＴＧであることが好ましい。
Ｙで示されるコドンは、翻訳終止コドンまたはヒトＩＬ
−２と実質的に同様の活性を有するポリペプチド（■）
の一部を構成するアミノ酸をコードするコドンであれば
いずれでもよく、更にその３′末端側にアミノ酸をコー
ドするコドンを１個以上有していてもよい。Ｙで示され
るコドンが翻訳終止コドン以外のコドンの場合（更にそ
の３′末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上
有する場合を含む）は、３′末端に翻訳終止コドンを有
することが好ましい。なおＹで示されるコドンはＴＡＡ
、ＴＡＧまたはＴＧＡであることがより好ましく、とり
わけＴＧＡであることが好ましい。
−２と実質的に同様の活性を有するポリペプチド（■）
の一部を構成するアミノ酸をコードするコドンであれば
いずれでもよく、更にその３′末端側にアミノ酸をコー
ドするコドンを１個以上有していてもよい。Ｙで示され
るコドンが翻訳終止コドン以外のコドンの場合（更にそ
の３′末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上
有する場合を含む）は、３′末端に翻訳終止コドンを有
することが好ましい。なおＹで示されるコドンはＴＡＡ
、ＴＡＧまたはＴＧＡであることがより好ましく、とり
わけＴＧＡであることが好ましい。
ポリペプチド（■）に関し、Ｚで示されるＳｅｔ以外の
アミノ酸残基としてはヒトＩＬ−２と実質的に同様の活
性を有するポリペプチドの一部を構成するアミノ酸残基
であればいずれでもよく、例えば第１表に示されるアミ
ノ酸残基（但し、Ｓｅｒを除く）が挙げられ、更にその
Ｎ末端側に、例えば、第１表に示されるアミノ酸残基ま
たはこれらアミノ酸残基の複数個で構成されるペプチド
を有していてもよい。とりわけＺとしてはＭｅｔ ま
たは水素が好ましい。
アミノ酸残基としてはヒトＩＬ−２と実質的に同様の活
性を有するポリペプチドの一部を構成するアミノ酸残基
であればいずれでもよく、例えば第１表に示されるアミ
ノ酸残基（但し、Ｓｅｒを除く）が挙げられ、更にその
Ｎ末端側に、例えば、第１表に示されるアミノ酸残基ま
たはこれらアミノ酸残基の複数個で構成されるペプチド
を有していてもよい。とりわけＺとしてはＭｅｔ ま
たは水素が好ましい。
抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝子を
有するＤＮＡ、およびヒトＩＬ−２のペプチドをコード
する構造遺伝子を有するＤＮＡを、それぞれの読み取り
枠をそろえて連結する。連結する方法は、公知の方法に
従って行えばよく、たとえば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いてひとつのＤＮＡの３’−ＯＨ末端と他方のＤＮＡの
５′−Ｐ末端をＡＴＰ存在下で連結させる。
有するＤＮＡ、およびヒトＩＬ−２のペプチドをコード
する構造遺伝子を有するＤＮＡを、それぞれの読み取り
枠をそろえて連結する。連結する方法は、公知の方法に
従って行えばよく、たとえば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いてひとつのＤＮＡの３’−ＯＨ末端と他方のＤＮＡの
５′−Ｐ末端をＡＴＰ存在下で連結させる。
また、両遺伝子の間にリンカ−を介するのが好ましい。
該リンカ−としては、たとえば、ＥＣ０ＲＩリンカーり
（ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧ）などがあり、さらにＮｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（米国）のも
の、その他の市販されているものを用いることができる
。
（ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧ）などがあり、さらにＮｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（米国）のも
の、その他の市販されているものを用いることができる
。
リンカ−を連結する方法は、たとえば、遺伝子の末端を
大腸菌ポリメラーゼ■（ラージフラグメント）やＳｌヌ
クレアーゼなどで平滑末端にして、該末端とリンカ−の
末端をＴ４ ＤＮＡリガーゼによって連結する。この際
、リンカ−同志の重複連結などを除去するために、制限
酵素で消化して粘着末端とする必要がある。制限酵素の
種類はリンカ−の種類により異なるが、たとえば、Ｅｃ
ｏＲ１リンカ−を使用した際の制限酵素はＥｃｏＲＩで
ある。生じた粘着末端を利用して両遺伝子同志をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結すればリンカ−を介したひとつのＤ
ＮＡを得ることができる。
大腸菌ポリメラーゼ■（ラージフラグメント）やＳｌヌ
クレアーゼなどで平滑末端にして、該末端とリンカ−の
末端をＴ４ ＤＮＡリガーゼによって連結する。この際
、リンカ−同志の重複連結などを除去するために、制限
酵素で消化して粘着末端とする必要がある。制限酵素の
種類はリンカ−の種類により異なるが、たとえば、Ｅｃ
ｏＲ１リンカ−を使用した際の制限酵素はＥｃｏＲＩで
ある。生じた粘着末端を利用して両遺伝子同志をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結すればリンカ−を介したひとつのＤ
ＮＡを得ることができる。
上記両構造遺伝子が連結してなるＤＮＡの上流に、プロ
モーターを連結するのが好ましい。
モーターを連結するのが好ましい。
ｊお、プロモーターの下流に連結されることとなる禰構
造遺伝子の順序は、プロモーターの下流に抗体認識部位
を含むペプチドをコードする構造遺伝子次いでヒトＩＬ
−２の構造遺伝子となるように、あるいは、プロモータ
ーの下流にヒトＩＬ−２の構造遺伝子次いで抗体認識部
位を含むペプチドをコードする構造遺伝子となるように
連結される。上記プロモーター以外の三者の連結の順序
は、特にとわれないが、プロモーターは最上流に連結す
ることが必須である。該プロモーターとしては、たとえ
ば、トリプトファン合成（ｔｒｐ）プロモーター、 ｒ
ｅｃ Ａプロモーター、ラクトースプロモーター等があ
げられ、とりわけｔｒｐプロモーターが好適である。
造遺伝子の順序は、プロモーターの下流に抗体認識部位
を含むペプチドをコードする構造遺伝子次いでヒトＩＬ
−２の構造遺伝子となるように、あるいは、プロモータ
ーの下流にヒトＩＬ−２の構造遺伝子次いで抗体認識部
位を含むペプチドをコードする構造遺伝子となるように
連結される。上記プロモーター以外の三者の連結の順序
は、特にとわれないが、プロモーターは最上流に連結す
ることが必須である。該プロモーターとしては、たとえ
ば、トリプトファン合成（ｔｒｐ）プロモーター、 ｒ
ｅｃ Ａプロモーター、ラクトースプロモーター等があ
げられ、とりわけｔｒｐプロモーターが好適である。
プロモーターを連結する方法としては、たとえば、発現
させようとする遺伝子の５′末端に適当なリンカ−を用
いて、翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、これをプロモー
ターの３′末端に連結する。
させようとする遺伝子の５′末端に適当なリンカ−を用
いて、翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、これをプロモー
ターの３′末端に連結する。
このとき用いる酵素としてはＴ４ＤＮＡリガーゼが一般
的であり、その処理方法は前述に準する。
的であり、その処理方法は前述に準する。
また、プロモーターの下流には適当な制限酵素の認識部
位が設けられていることが望ましい。
位が設けられていることが望ましい。
両遺伝子を連結してなるＤＮＡを宿主微生物で発現させ
るために、ベクターとしてプラスミドを用い、これに該
ＤＮＡを組み込む。該ベクターとしてのプラスミドとし
ては、たとえば、Ｃｏ１Ｅ Ｉ由来のｐＢ Ｒ３２２［
Ｇｅｎｅ ２．９５ （１９７７）］が最もよく利用
されるが、その他のプラスミドであっても、効率良く発
現させ得るものはいずれも用いることができる。その例
としては、たとえば、トリプトファン合成プロモーター
を組み込んだｐｔｒｐ・７８１、 ｐｔｒｐ ７７１
などが挙げられる。このようにして得られたＤＮＡをプ
ラスミドに組み込むには、まず、プラスミドのＤＮＡを
適当な制限酵素で処理して、線状にする。これと、前述
のようにして得られたＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼで連
結する。
るために、ベクターとしてプラスミドを用い、これに該
ＤＮＡを組み込む。該ベクターとしてのプラスミドとし
ては、たとえば、Ｃｏ１Ｅ Ｉ由来のｐＢ Ｒ３２２［
Ｇｅｎｅ ２．９５ （１９７７）］が最もよく利用
されるが、その他のプラスミドであっても、効率良く発
現させ得るものはいずれも用いることができる。その例
としては、たとえば、トリプトファン合成プロモーター
を組み込んだｐｔｒｐ・７８１、 ｐｔｒｐ ７７１
などが挙げられる。このようにして得られたＤＮＡをプ
ラスミドに組み込むには、まず、プラスミドのＤＮＡを
適当な制限酵素で処理して、線状にする。これと、前述
のようにして得られたＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼで連
結する。
このようにして得られた両遺伝子が連結されたＤＮＡが
組み込まれたプラスミドで宿主菌を形質転換し、形質転
換体を製造する。
組み込まれたプラスミドで宿主菌を形質転換し、形質転
換体を製造する。
該宿主菌としては、たとえばエシェリヒア属菌。
枯草菌、酵母などが挙げられ、特にエシェリヒア属菌が
好ましい。該エシェリヒア属菌としては、たとえば大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨＩ株［
Ｎ ａｔｕｒｅ 幻、７．１１１０−１１１４ （１
９６８）、Ｊｏｕｒｎａｌｏｒ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６６、 ５５７−５８０
（１９８３）コなどが挙げられる。
好ましい。該エシェリヒア属菌としては、たとえば大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨＩ株［
Ｎ ａｔｕｒｅ 幻、７．１１１０−１１１４ （１
９６８）、Ｊｏｕｒｎａｌｏｒ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６６、 ５５７−５８０
（１９８３）コなどが挙げられる。
該プラスミドで宿主菌を形質転換する方法としては、カ
ルシウム法やプロトプラスト法などが挙げられ、特にカ
ルシウム法が好ましい。
ルシウム法やプロトプラスト法などが挙げられ、特にカ
ルシウム法が好ましい。
上記方法によって得られた形質転換体の一例として、後
述の実施例１で製造されたＥＳＣｈｅｒｉＣｈｉａｃｏ
ｌｉ ＤＨＩ／ｐＧＥＬ １０２８が挙げられる。該微
生物は、財団法人発酵研究所（ＩＦｏ、５３２日本国大
阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）に昭和
５９年（西暦１９８４年）３月２７日に受託番号Ｉ Ｐ
Ｏ１４３３２として寄託され、また、本微生物は、日
本国通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ
ＲＩ 、３０５日本国茨城県筑波郡谷田部町東Ｉ丁目１
番３号）に昭和５９年（西暦１９８４年）３月２９日に
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−７５６８として寄託されてい
る。
述の実施例１で製造されたＥＳＣｈｅｒｉＣｈｉａｃｏ
ｌｉ ＤＨＩ／ｐＧＥＬ １０２８が挙げられる。該微
生物は、財団法人発酵研究所（ＩＦｏ、５３２日本国大
阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）に昭和
５９年（西暦１９８４年）３月２７日に受託番号Ｉ Ｐ
Ｏ１４３３２として寄託され、また、本微生物は、日
本国通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ
ＲＩ 、３０５日本国茨城県筑波郡谷田部町東Ｉ丁目１
番３号）に昭和５９年（西暦１９８４年）３月２９日に
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−７５６８として寄託されてい
る。
このようにして得られた形質転換体の培養に使用される
培地としては、液体培地が適当であり、その中には該形
質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他
が含有せしめられれる。炭素源としては、たとえばグル
コース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素
源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コ
ーンスターチ、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕
、バレインヨ抽出液などの無機または有機物質、無機物
としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリ
ウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また酵母エ
キス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい
。とりわけ塩化カルシウム・２水和物を約０．１％およ
びリン酸二水素ナトリウム・２水和物を約２％含有する
培地が目的物の生産に有利である。また、培養するため
の温度、ｐＨ１時間などの条件は、目的物の生産および
その活性が最高となるように適宜に定められるが、一般
に培養温度は約２０〜４０℃付近、培１ｐＨは微酸性か
ら微アルカリ性で、ことに中性付近が好ましく、培養時
間は約６〜１０時間程度である。
培地としては、液体培地が適当であり、その中には該形
質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他
が含有せしめられれる。炭素源としては、たとえばグル
コース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素
源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コ
ーンスターチ、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕
、バレインヨ抽出液などの無機または有機物質、無機物
としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリ
ウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また酵母エ
キス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい
。とりわけ塩化カルシウム・２水和物を約０．１％およ
びリン酸二水素ナトリウム・２水和物を約２％含有する
培地が目的物の生産に有利である。また、培養するため
の温度、ｐＨ１時間などの条件は、目的物の生産および
その活性が最高となるように適宜に定められるが、一般
に培養温度は約２０〜４０℃付近、培１ｐＨは微酸性か
ら微アルカリ性で、ことに中性付近が好ましく、培養時
間は約６〜１０時間程度である。
本発明の発酵に於て目的とするポリペプチドは通常菌体
内に蓄積されるので、培養物中に蓄積された該ポリペプ
チドを採取するには、まず菌体を遠心分離やろ過によっ
て集め、これより該ポリペプチドを抽出することにより
行なわれる。該ポリペプチドを効率よく抽出させるため
には、たとえば超音波処理、リゾチーム処理、界面活性
剤などの化学薬品による処理などが行なわれる。
内に蓄積されるので、培養物中に蓄積された該ポリペプ
チドを採取するには、まず菌体を遠心分離やろ過によっ
て集め、これより該ポリペプチドを抽出することにより
行なわれる。該ポリペプチドを効率よく抽出させるため
には、たとえば超音波処理、リゾチーム処理、界面活性
剤などの化学薬品による処理などが行なわれる。
このようにして抽出された該ポリペプチドの精製は、従
来からの蛋白質あるいはペプトンの精製法、たとえば硫
安塩析、アルコール沈澱、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー、セルロース力ラムグロマトグラフイー、ゲル
ろ適法などの適用により行なわれる。
来からの蛋白質あるいはペプトンの精製法、たとえば硫
安塩析、アルコール沈澱、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー、セルロース力ラムグロマトグラフイー、ゲル
ろ適法などの適用により行なわれる。
後述の実施例１において得られるＤＮＡは、第１図に示
されるヌクレオチドを含有するＤＮＡである。このうち
、第１図においてヌクレオチド配列９−３５６として示
されるポリヌクレオチドは、第２図においてアミノ酸配
列３−１１８で表されるポリペプチド、つまりヒトＩｇ
ＥＨ鎖の０２領域をコードする。
されるヌクレオチドを含有するＤＮＡである。このうち
、第１図においてヌクレオチド配列９−３５６として示
されるポリヌクレオチドは、第２図においてアミノ酸配
列３−１１８で表されるポリペプチド、つまりヒトＩｇ
ＥＨ鎖の０２領域をコードする。
また、第１図においてヌクレオチド配列３６９−７６７
として示されるポリヌクレオチドは、第２図においてア
ミノ酸配列１２３−２５５として表されるポリペプチド
、つまりヒトＩＬ−２をコードする。
として示されるポリヌクレオチドは、第２図においてア
ミノ酸配列１２３−２５５として表されるポリペプチド
、つまりヒトＩＬ−２をコードする。
これらのポリヌクレオチドは、直接発現のために、５′
末端に読み取り枠を一致させるように、ＡＴＧを有して
いてもよい。この場合には、Ｎ末端にＭｅｔを育するポ
リペプチドをコードする。
末端に読み取り枠を一致させるように、ＡＴＧを有して
いてもよい。この場合には、Ｎ末端にＭｅｔを育するポ
リペプチドをコードする。
また、これらのポリヌクレオチドは読み取り枠を一致さ
せるために、任意の介在配列を有していてもよい。第１
図において、この介在配列とはヌクレオチド配列３５７
−３６８として示される。この場合には、第２図におい
てアミノ酸配列１１９−１２２として表されるポリペプ
チドをコードする。
せるために、任意の介在配列を有していてもよい。第１
図において、この介在配列とはヌクレオチド配列３５７
−３６８として示される。この場合には、第２図におい
てアミノ酸配列１１９−１２２として表されるポリペプ
チドをコードする。
前述したように、ヒトＩｇＥおよびヒトＩＬ−２に関し
ては、それぞれ単独で、それをコードするｍＲＮＡが既
に分離同定され、これらの遺伝子の発現も単独で試みら
れているが、本発明のように、２種類あるいは、それ以
上の遺伝子を連結して、２種類あるいは、それ以上の異
なる免疫学的もしくは生物学的活性をもった１つの新た
なポリペプチドを製造するという概念は、今までに無い
ものである。さらに、２種類以上の独立な免疫学的もし
くは生物学的活性を有する１つのポリペプチドは、自然
界にもその例が少なく、本発明は、新規活性蛋白を提供
するという点で、遺伝子工学に追随したペプチド工学の
先駆をなすものである。
ては、それぞれ単独で、それをコードするｍＲＮＡが既
に分離同定され、これらの遺伝子の発現も単独で試みら
れているが、本発明のように、２種類あるいは、それ以
上の遺伝子を連結して、２種類あるいは、それ以上の異
なる免疫学的もしくは生物学的活性をもった１つの新た
なポリペプチドを製造するという概念は、今までに無い
ものである。さらに、２種類以上の独立な免疫学的もし
くは生物学的活性を有する１つのポリペプチドは、自然
界にもその例が少なく、本発明は、新規活性蛋白を提供
するという点で、遺伝子工学に追随したペプチド工学の
先駆をなすものである。
本発明方法により得られた抗体認識部位を含むペプチド
とヒトＩＬ−２のペプチドとを結合したポリペプチドは
、ヒトＩＬ−２抗体を精製する際の試薬として有用であ
る。たとえば、本発明方法により上記のアミノ酸配列で
構成されるＩ ＧＬ−ＥＣ２２は、ヒトＩｇＥのもつ抗
原性とヒトＩＬ−２のもつ抗原性の両方を有しているた
めに、抗ヒトＩｇＥ抗体を用いてｒＧＬ−ＥＣ２２を精
製し、精製したＩＧＬ−ＥＣ２２を用いて抗ヒトＩＬ−
２抗体を作製・精製し、精製した抗ヒトＩＬ−２抗体を
用いて、ヒトＩＬ−２を精製するという一連のヒトＩＬ
−２精製過程の媒体となり得る。この場合、ＩＧＬ−Ｅ
Ｃ２２が、直接関与するのは抗ヒトＩＬ−２抗体を精製
するときであるが、この様な未知の抗体を作製・精製す
る方法は他に例が無く、抗体精製の新技術として大きく
期待される。したがって、本発明のポリペプチドは、゛
ヒトインターロイキン２抗体を精製する際の媒体あるい
は試薬として使用され得る。
とヒトＩＬ−２のペプチドとを結合したポリペプチドは
、ヒトＩＬ−２抗体を精製する際の試薬として有用であ
る。たとえば、本発明方法により上記のアミノ酸配列で
構成されるＩ ＧＬ−ＥＣ２２は、ヒトＩｇＥのもつ抗
原性とヒトＩＬ−２のもつ抗原性の両方を有しているた
めに、抗ヒトＩｇＥ抗体を用いてｒＧＬ−ＥＣ２２を精
製し、精製したＩＧＬ−ＥＣ２２を用いて抗ヒトＩＬ−
２抗体を作製・精製し、精製した抗ヒトＩＬ−２抗体を
用いて、ヒトＩＬ−２を精製するという一連のヒトＩＬ
−２精製過程の媒体となり得る。この場合、ＩＧＬ−Ｅ
Ｃ２２が、直接関与するのは抗ヒトＩＬ−２抗体を精製
するときであるが、この様な未知の抗体を作製・精製す
る方法は他に例が無く、抗体精製の新技術として大きく
期待される。したがって、本発明のポリペプチドは、゛
ヒトインターロイキン２抗体を精製する際の媒体あるい
は試薬として使用され得る。
またＩＧＬ−ＥＣ２２はアレルギー反応に関与するヒト
ＩｇＥと、Ｔ細胞増殖作用を有するヒトＩＬ−２の双方
の免疫学的もしくは生物学的活性を有し、さらに未知の
第三の活性を有することが期待される。
ＩｇＥと、Ｔ細胞増殖作用を有するヒトＩＬ−２の双方
の免疫学的もしくは生物学的活性を有し、さらに未知の
第三の活性を有することが期待される。
ヒトＩＬ−２抗体精製の具体例としては次の様な方法が
行なわれる。
行なわれる。
まず、抗ヒトＩｇＥ抗゛体とアガロースゲルビーズ（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社製ＡＨｉｇｅｌ−１０など）を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、ＩＧＬ−
ＥＣ２２を特異的に結合させる。次に、ヒトＩＬ−２で
免疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清（ヒト
ＩＬ−２抗体が含ま直いる。）を、上述のＩＧＬ−ＢＣ
２２吸着抗ヒトＩｇＥ抗体カラムと反応させる。これを
適当な緩衝液で溶出すると、Ｉ ＧＬ−ＥＣ２２とヒト
ＩＬ−２抗体の混合液が得られる。この混合液をＤＥＡ
Ｅセルロースカラム（Ｗｈａｔｍａｎ社製Ｃｅ１ｌｕｌ
ｏｓｅ５２など）の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃度で
溶出すればヒト！Ｌ−２抗体が精製される。
ｉｏ−Ｒａｄ社製ＡＨｉｇｅｌ−１０など）を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、ＩＧＬ−
ＥＣ２２を特異的に結合させる。次に、ヒトＩＬ−２で
免疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清（ヒト
ＩＬ−２抗体が含ま直いる。）を、上述のＩＧＬ−ＢＣ
２２吸着抗ヒトＩｇＥ抗体カラムと反応させる。これを
適当な緩衝液で溶出すると、Ｉ ＧＬ−ＥＣ２２とヒト
ＩＬ−２抗体の混合液が得られる。この混合液をＤＥＡ
Ｅセルロースカラム（Ｗｈａｔｍａｎ社製Ｃｅ１ｌｕｌ
ｏｓｅ５２など）の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃度で
溶出すればヒト！Ｌ−２抗体が精製される。
抗１８Ｅ抗体はアレルギー疾患の診断に必要欠くべから
ざる物質であり、需要も非常に多いが、その生産には大
量の純化ヒトＩｇＥを非常とする。
ざる物質であり、需要も非常に多いが、その生産には大
量の純化ヒトＩｇＥを非常とする。
そこで本発明のポリペプチドであるＩＧＬ−ＥＣ２２を
用いて抗ヒトＩｇＥ抗体を精製することができる。した
がって、本発明のポリペプチドであるＩＧＬ−ＥＣ２２
は、抗ヒトＩｇＥ抗体を精製する際の媒体あるいは試薬
として使用され得る。
用いて抗ヒトＩｇＥ抗体を精製することができる。した
がって、本発明のポリペプチドであるＩＧＬ−ＥＣ２２
は、抗ヒトＩｇＥ抗体を精製する際の媒体あるいは試薬
として使用され得る。
抗ヒトＩｇＥ抗体精製の具体例としては次の様な方法が
行なわれる。
行なわれる。
まず、抗ヒトｌ−２抗体とアガロースゲルビーズ（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社製Ａｆｆｔｇｅｌ−１０など）を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、ｒＧＬ−
ＥＣ２２を特異的に結合させる。次に、ヒトＩｇＥで免
疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清（抗ヒト
ＩｇＥ抗体が含まれている。）を、上述のＩＧＬ−ＥＣ
２２吸着抗ヒトＩ Ｌ−２抗体カラムと反応させる。こ
れを適当な緩衝液で溶出すると、ＩＧＬ−ＥＣ２２と抗
ヒトＩｇＥ抗体の混合液が得られる。この混合液をＤＥ
ＡＥセルロースカラム（Ｗｈａｔｍａｎ社製Ｃｅｌ １
ｕｌｏｓｅ５２など）の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃
度で溶出すれば抗ヒト■ｇＥ抗体が精製される。
ｏ−Ｒａｄ社製Ａｆｆｔｇｅｌ−１０など）を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、ｒＧＬ−
ＥＣ２２を特異的に結合させる。次に、ヒトＩｇＥで免
疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清（抗ヒト
ＩｇＥ抗体が含まれている。）を、上述のＩＧＬ−ＥＣ
２２吸着抗ヒトＩ Ｌ−２抗体カラムと反応させる。こ
れを適当な緩衝液で溶出すると、ＩＧＬ−ＥＣ２２と抗
ヒトＩｇＥ抗体の混合液が得られる。この混合液をＤＥ
ＡＥセルロースカラム（Ｗｈａｔｍａｎ社製Ｃｅｌ １
ｕｌｏｓｅ５２など）の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃
度で溶出すれば抗ヒト■ｇＥ抗体が精製される。
なお、本明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏ
ｍｍ１ｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を第
１表に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体があり
うる場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとす
る。
どを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏ
ｍｍ１ｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を第
１表に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体があり
うる場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとす
る。
第１表
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ 相補的デオキシリボ核酸ＲＮＡ
リボ核酸 ｍＲＮＡ 伝令リボ核酸 Ａ デオキシアデニル酸 Ｔ チミジル酸 Ｇ デオキシグアニル酸 Ｃデオキシシチジル酸 Ｕ ウリジル酸 ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ
チミジン三リン酸 ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ
デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ アデ
ノシン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ
ドデシル硫酸ナトリウムｃｔｙ グリシン Ａｌａ アラニン Ｖａｌ バリン Ｌｅｕ ロイシン １１ｅ イソロイシン Ｓｅｒ セリン Ｔｈｒ スレオニン Ｃｙｓ システィン Ｍｅｔ メチオニン Ｇｌｕ グルタミン酸 Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｌｙｓ リジン Ａｒｇ アルギニン Ｈｉｓ ヒスチジン Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｔｙｒ チロシン Ｔｒｐ ）リプトファン Ｐｒｏ プロリン Ａｓｎ アスパラギン Ｇｌｎ グルタミン ｂｐ 塩基対 寒嵐鯉 以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。
リボ核酸 ｍＲＮＡ 伝令リボ核酸 Ａ デオキシアデニル酸 Ｔ チミジル酸 Ｇ デオキシグアニル酸 Ｃデオキシシチジル酸 Ｕ ウリジル酸 ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ
チミジン三リン酸 ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ
デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ アデ
ノシン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ
ドデシル硫酸ナトリウムｃｔｙ グリシン Ａｌａ アラニン Ｖａｌ バリン Ｌｅｕ ロイシン １１ｅ イソロイシン Ｓｅｒ セリン Ｔｈｒ スレオニン Ｃｙｓ システィン Ｍｅｔ メチオニン Ｇｌｕ グルタミン酸 Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｌｙｓ リジン Ａｒｇ アルギニン Ｈｉｓ ヒスチジン Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｔｙｒ チロシン Ｔｒｐ ）リプトファン Ｐｒｏ プロリン Ａｓｎ アスパラギン Ｇｌｎ グルタミン ｂｐ 塩基対 寒嵐鯉 以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。
参考例１
ヒトＩｇＥＨ鎖Ｃ２領域のポリペプチドを発現するプラ
スミドｐｃＥ’ｒｔｒｐ ８１８−Ｃの構築二日本特
開昭５９−４４３９９号公報に記載の方法で構築された
プラスミドｐＧ ＥＴ ｔｒｐ ３０２のＤＮＡ１μ
ｇをＣ１ａＩで切断し、Ｓｔヌクレアーゼ消化を行って
両端の粘着末端を削った。このＤＮＡをフェノール抽出
、エタノール沈澱により精製したのち、５′末端をリン
酸化したＥｃｏＲＩリンカ−Ｐ（ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴ
ＡＧ）５０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、
ＥｃｏＲＩリンカ−の重複連結したプラスミドを除くた
め、結合物をＥｃｏＲＩで切断した。このＤＮＡをＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて再結合して大腸菌２９４を形質
転換し、転換株よりｐＧＥＴｔｒｐ ３０２−ａを得
た。
スミドｐｃＥ’ｒｔｒｐ ８１８−Ｃの構築二日本特
開昭５９−４４３９９号公報に記載の方法で構築された
プラスミドｐＧ ＥＴ ｔｒｐ ３０２のＤＮＡ１μ
ｇをＣ１ａＩで切断し、Ｓｔヌクレアーゼ消化を行って
両端の粘着末端を削った。このＤＮＡをフェノール抽出
、エタノール沈澱により精製したのち、５′末端をリン
酸化したＥｃｏＲＩリンカ−Ｐ（ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴ
ＡＧ）５０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、
ＥｃｏＲＩリンカ−の重複連結したプラスミドを除くた
め、結合物をＥｃｏＲＩで切断した。このＤＮＡをＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて再結合して大腸菌２９４を形質
転換し、転換株よりｐＧＥＴｔｒｐ ３０２−ａを得
た。
ｐＧＥＴｔｒｐ３０２−ａをＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで消
化して生ずる１、２ ｋｂ ＤＮＡ断片を、１．２％ア
ガロースゲル電気泳動により分画回収した。このＤＮＡ
断片５０ ｎｇを、ＥｃｏＲＩ 、Ｐｓｔ Ｉ消化した
発現用ベクターｐｔｒｐ７８１［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １１゜ｐ、 ３０７７
−３０８５（１９８３）１２００ｎｇにＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて組み込み、大腸菌２９４を形質転換し、ア
ンピノリン感受性の転換株よりｐＧ Ｅ Ｔ ｔｒｐ
３０２−すを得た。ｐＧＥＴｔｒｐ３０２−ｂを制限酵
素Ｘｂａｌで切断した後、生じたＤＮＡの粘着末端をＳ
ｌヌクレアーゼ消化を行って平滑末端とした。 このＤ
ＮＡを、フェノール抽出、エタノール沈澱により精製し
たのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて再結合し、大腸菌
２９４を形質転換した。転換株よりｐＧＥＴｔｒり ３
０２−ｄを得た。
化して生ずる１、２ ｋｂ ＤＮＡ断片を、１．２％ア
ガロースゲル電気泳動により分画回収した。このＤＮＡ
断片５０ ｎｇを、ＥｃｏＲＩ 、Ｐｓｔ Ｉ消化した
発現用ベクターｐｔｒｐ７８１［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １１゜ｐ、 ３０７７
−３０８５（１９８３）１２００ｎｇにＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて組み込み、大腸菌２９４を形質転換し、ア
ンピノリン感受性の転換株よりｐＧ Ｅ Ｔ ｔｒｐ
３０２−すを得た。ｐＧＥＴｔｒｐ３０２−ｂを制限酵
素Ｘｂａｌで切断した後、生じたＤＮＡの粘着末端をＳ
ｌヌクレアーゼ消化を行って平滑末端とした。 このＤ
ＮＡを、フェノール抽出、エタノール沈澱により精製し
たのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて再結合し、大腸菌
２９４を形質転換した。転換株よりｐＧＥＴｔｒり ３
０２−ｄを得た。
１）Ｇ Ｅ Ｔ ｔｒｐ ３０２−ｄを制限酵素Ｐｖ
ｕＩ［部位で切断した後、制限酵素Ａｖａ１部位で切断
し、Ａｖａ１部位で切断されたＤＮＡ鎖を分取した。こ
のＤＮＡ鎖の両端を８１ヌクレアーゼで削って平滑とし
た後、ＥｃｏＲＩリンカ−１）（ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴ
ＡＧ）を結合し、ＥｃｏＲＩ消化後再結合させて、発現
プラスミドｐＧＥＴｔｒｐ ８１８−ｃを構築した（
第３図参照）。
ｕＩ［部位で切断した後、制限酵素Ａｖａ１部位で切断
し、Ａｖａ１部位で切断されたＤＮＡ鎖を分取した。こ
のＤＮＡ鎖の両端を８１ヌクレアーゼで削って平滑とし
た後、ＥｃｏＲＩリンカ−１）（ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴ
ＡＧ）を結合し、ＥｃｏＲＩ消化後再結合させて、発現
プラスミドｐＧＥＴｔｒｐ ８１８−ｃを構築した（
第３図参照）。
ｐＧＥＴｔｒｌ） ８１８−ｃは、Ｃ２領域の１２１
アミノ酸、およびＣ末端に、リンカ−の結合により生じ
たＬ ｅｕ、 Ｇ ｌｕ、 Ｐ ｈｅを有する分子量１
３，０００のペプチドをコードしている。このプラスミ
ドは、Ｎ末端にＩｇＥＨ鎖に由来しない、アダプターに
コードされたＭ’ｅｔ 、 Ｌ ｅｕを有している。
アミノ酸、およびＣ末端に、リンカ−の結合により生じ
たＬ ｅｕ、 Ｇ ｌｕ、 Ｐ ｈｅを有する分子量１
３，０００のペプチドをコードしている。このプラスミ
ドは、Ｎ末端にＩｇＥＨ鎖に由来しない、アダプターに
コードされたＭ’ｅｔ 、 Ｌ ｅｕを有している。
参考例２
ヒトＩＬ−２のペプチドを発現するプラスミｐＴＦｌの
構築： （１）（ｉ）ヒトＩＬ−２をコードするｍＲＮＡの分離 ヒト末梢血より調製したリンパ球を１２−０−テトラデ
カノイルホルボール−１３−アセテート（Ｔ Ｐ ＡＸ
１５ｎｇ／ｍｌ）とコンカナバリンＡ（４０ｇｇ／ｍｌ
）を含むＲＰＭＩ １６４０ 培地（１０％の牛胎
児血清を含む）中、３７℃で培養し、ＩＬ−２を誘導さ
せた。２４時間後、この誘導したＩ ＸＩＯ”個のヒト
リンパ球を５Ｍグアニジンチオシアネート、５％メルカ
プトエタノール、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ
７，６，１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中でテア０ンホモゲ
ナイザーによって破壊変性した後Ｎ−ラウロイルザルコ
シン酸ナトリウムを４％になるように加え、均質化した
混合物を５．７Ｍ塩化セシウム溶液（５，７Ｍ塩化セシ
ウム、０．１Ｍ ＥＤＴＡ）６ｍｌ上に重層し、ベッ
クマンＳＷ２ｇのローターを用いて１５℃テ２４ＱＯＯ
ｒｐｍ ４８時間遠心処理を行い、ＲＮＡ沈澱を得た
。このＲＮＡ沈澱を０．２５％Ｎ−ラウロイルザルコシ
ン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱さ
せ、１０ｍｇのＲＮＡを得た。このＲＮＡを高塩溶液［
０，５Ｍ ＮａＣ１，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ ＨＣｌ
ｐＨ７，６，１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３％ Ｓ
ＤＳコ中でオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ
、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡを低塩溶液（ｌＱｍＭ
Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，６，１ｍＭ ＥＤＴＡ
、０．３％５ＤＳ）で溶出させることにより、ポリ（Ａ
）を含むｍＲＮＡ ３００ｄｇを分取した。このｍＲＮ
Ａを更にエタノールで沈澱させ、０．２ｍｌの溶液（ｌ
ｏｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６，２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０４％５ＤＳ）に溶かし、６５℃で２分間処理
して１０〜３５％シヨ糖密度勾配遠心処理（ベックマン
５Ｗ２８のローターを用いて２０℃、２５０００ｒｐｍ
で２１時間遠心分離）することにより分画して２２分画
を得た。この各分画につきＲＮＡの一部ずつを、アフリ
カッメガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白中の
ＩＬ−２活性を測定し、分画１１〜１５（沈降逆数８Ｓ
−１５ｓ）にＩＬ−２の活性を検出した。この分画のＩ
Ｌ−２ｍＲＮＡは約２５μｇであった。
構築： （１）（ｉ）ヒトＩＬ−２をコードするｍＲＮＡの分離 ヒト末梢血より調製したリンパ球を１２−０−テトラデ
カノイルホルボール−１３−アセテート（Ｔ Ｐ ＡＸ
１５ｎｇ／ｍｌ）とコンカナバリンＡ（４０ｇｇ／ｍｌ
）を含むＲＰＭＩ １６４０ 培地（１０％の牛胎
児血清を含む）中、３７℃で培養し、ＩＬ−２を誘導さ
せた。２４時間後、この誘導したＩ ＸＩＯ”個のヒト
リンパ球を５Ｍグアニジンチオシアネート、５％メルカ
プトエタノール、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ
７，６，１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中でテア０ンホモゲ
ナイザーによって破壊変性した後Ｎ−ラウロイルザルコ
シン酸ナトリウムを４％になるように加え、均質化した
混合物を５．７Ｍ塩化セシウム溶液（５，７Ｍ塩化セシ
ウム、０．１Ｍ ＥＤＴＡ）６ｍｌ上に重層し、ベッ
クマンＳＷ２ｇのローターを用いて１５℃テ２４ＱＯＯ
ｒｐｍ ４８時間遠心処理を行い、ＲＮＡ沈澱を得た
。このＲＮＡ沈澱を０．２５％Ｎ−ラウロイルザルコシ
ン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱さ
せ、１０ｍｇのＲＮＡを得た。このＲＮＡを高塩溶液［
０，５Ｍ ＮａＣ１，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ ＨＣｌ
ｐＨ７，６，１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３％ Ｓ
ＤＳコ中でオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着させ
、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡを低塩溶液（ｌＱｍＭ
Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，６，１ｍＭ ＥＤＴＡ
、０．３％５ＤＳ）で溶出させることにより、ポリ（Ａ
）を含むｍＲＮＡ ３００ｄｇを分取した。このｍＲＮ
Ａを更にエタノールで沈澱させ、０．２ｍｌの溶液（ｌ
ｏｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６，２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０４％５ＤＳ）に溶かし、６５℃で２分間処理
して１０〜３５％シヨ糖密度勾配遠心処理（ベックマン
５Ｗ２８のローターを用いて２０℃、２５０００ｒｐｍ
で２１時間遠心分離）することにより分画して２２分画
を得た。この各分画につきＲＮＡの一部ずつを、アフリ
カッメガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白中の
ＩＬ−２活性を測定し、分画１１〜１５（沈降逆数８Ｓ
−１５ｓ）にＩＬ−２の活性を検出した。この分画のＩ
Ｌ−２ｍＲＮＡは約２５μｇであった。
（１１）単鎖ＤＮＡの合成：
上記で得たｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用い、１００ｄ
の反応液（５μｇのｍＲＮＡ、５０ｇｇオリゴ（ｄＴ）
、１００ユニツトの逆転写酵素、１ｍＭずつのｄＡＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ Ｔ Ｐ 、 ８ ｍ
ＭＭｇＣｌ、、５０ｍＭ ＫＣＩ、１０ｍＭジチオス
レイトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ８
，３）中で４２°Ｃ，１時間インキュベートした後に、
フェノールで除蛋白し、０．ＩＮのＮａＯＨで７０℃、
２０分処理してＲＮＡを分解除去した。
の反応液（５μｇのｍＲＮＡ、５０ｇｇオリゴ（ｄＴ）
、１００ユニツトの逆転写酵素、１ｍＭずつのｄＡＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ Ｔ Ｐ 、 ８ ｍ
ＭＭｇＣｌ、、５０ｍＭ ＫＣＩ、１０ｍＭジチオス
レイトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ８
，３）中で４２°Ｃ，１時間インキュベートした後に、
フェノールで除蛋白し、０．ＩＮのＮａＯＨで７０℃、
２０分処理してＲＮＡを分解除去した。
（ｉｉｉ）二重鎖ＤＮＡの合成：
ここで合成された単鎖の相補ＤＮＡを５０μ２の反応液
（ｎ＋ＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と同じ
反応液）中で４２℃２時間反応させることにより二重鎖
ＤＮＡを合成した。
（ｎ＋ＲＮＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と同じ
反応液）中で４２℃２時間反応させることにより二重鎖
ＤＮＡを合成した。
（ｉｖ）ｄＣテイルの付加：
この二重１ＩＤＮＡＪこヌクレアーゼＳｔを５０μ２の
反応液（二重鎖Ｄ’ＮＡＯ，１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４
，５，０，２５Ｍ ＮａＣ１，１，５ｍＭ Ｚｎ５
Ｏ，，６０ユニツトの８１ヌクレアーゼ）中で室温３０
分間作用させ、フェノールで除蛋白し、エタノールでＤ
ＮＡを沈澱させた後、これにターミナルトランスフェラ
ーゼを５０μρの反応液（二重鎖ＤＮＡ、０．１４Ｍカ
コジル酸カリウム、 ０．３Ｍ Ｔｒｉｓ（塩基）ｐ
Ｈ７，６，２ｍＭジチオスレイトール、ＩＩＩＩＭ Ｃ
ｏＣ１ｔ。
反応液（二重鎖Ｄ’ＮＡＯ，１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４
，５，０，２５Ｍ ＮａＣ１，１，５ｍＭ Ｚｎ５
Ｏ，，６０ユニツトの８１ヌクレアーゼ）中で室温３０
分間作用させ、フェノールで除蛋白し、エタノールでＤ
ＮＡを沈澱させた後、これにターミナルトランスフェラ
ーゼを５０μρの反応液（二重鎖ＤＮＡ、０．１４Ｍカ
コジル酸カリウム、 ０．３Ｍ Ｔｒｉｓ（塩基）ｐ
Ｈ７，６，２ｍＭジチオスレイトール、ＩＩＩＩＭ Ｃ
ｏＣ１ｔ。
０．１５ ｍＭ ｄＣＴＰ、３０ユ：−ットターミナル
トランス フェラーゼ）中で３分間３７℃で作用させ二
重ｌＤＮＡの３′両端に約１５個のデオキシシチジン鎖
を伸長させた。これらの１連の反応で約３００ｎｇのデ
オキシシチジン鎖をもった二重鎖ＤＮＡを得た。
トランス フェラーゼ）中で３分間３７℃で作用させ二
重ｌＤＮＡの３′両端に約１５個のデオキシシチジン鎖
を伸長させた。これらの１連の反応で約３００ｎｇのデ
オキシシチジン鎖をもった二重鎖ＤＮＡを得た。
（Ｖ）大腸菌プラスミドの開裂ならびにｄＧテイルの付
加ニ 一方、１０Ｍｇの大腸菌プラスミドｐＢ Ｒ３２２Ｄ
ＮＡに制限酵素Ｐｓｔｌを５０Ｍｇの反応液（１０Ｍｇ
ｌ） ＮＡ、５０ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ−ｐＨ７，４゜６ｍＭ ＭｇＣＩｔ、６ｍＭ２−
メルカプトエタノール。
加ニ 一方、１０Ｍｇの大腸菌プラスミドｐＢ Ｒ３２２Ｄ
ＮＡに制限酵素Ｐｓｔｌを５０Ｍｇの反応液（１０Ｍｇ
ｌ） ＮＡ、５０ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ−ｐＨ７，４゜６ｍＭ ＭｇＣＩｔ、６ｍＭ２−
メルカプトエタノール。
１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、２０ユニツトのＰ
ｓｔＩ）中で３時間３７℃で作用させて１）ＢＲ３２２
ＤＮＡ中に１ケ所存在するＰｓｔｌ認識部位を切断し、
フェノールで除蛋白した後、ターミナルトランスフェラ
ーゼを５０μ２の反応液（ＤＮＡ１０Ｍｇ、Ｏ，１４Ｍ
カコジル酸カリ、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ・塩基ｐＨ７，６
，２ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＣａＣ１，，０
，１５ｍＭ ＧＴＰ、：（０ユニツトターミナルトラン
スフエラーゼ）中で３分間３７℃で作用させ上記プラス
ミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの両端に約１７個のデオキシグ
アニン鎖を延長させた。
ｓｔＩ）中で３時間３７℃で作用させて１）ＢＲ３２２
ＤＮＡ中に１ケ所存在するＰｓｔｌ認識部位を切断し、
フェノールで除蛋白した後、ターミナルトランスフェラ
ーゼを５０μ２の反応液（ＤＮＡ１０Ｍｇ、Ｏ，１４Ｍ
カコジル酸カリ、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ・塩基ｐＨ７，６
，２ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＣａＣ１，，０
，１５ｍＭ ＧＴＰ、：（０ユニツトターミナルトラン
スフエラーゼ）中で３分間３７℃で作用させ上記プラス
ミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの両端に約１７個のデオキシグ
アニン鎖を延長させた。
（ｖｉ ）ｃＤ Ｎ Ａの会合ならびに大腸菌の形質転
換：このようにして得られた合成二重鎖ＤＮＡ ０．１
８ｇと上記プラスミドｐＢＲ３２２，０，５μｇを０．
ＩＭＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ
’／、６，１ｍＭＥＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分
間加熱しその後徐冷して会合さＱＥｎｅａらの方法［Ｊ
、Ｍｏｌ。
換：このようにして得られた合成二重鎖ＤＮＡ ０．１
８ｇと上記プラスミドｐＢＲ３２２，０，５μｇを０．
ＩＭＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ
’／、６，１ｍＭＥＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分
間加熱しその後徐冷して会合さＱＥｎｅａらの方法［Ｊ
、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、 、熟、４９５（１９７５）］に従って大腸
菌ＭＭ２９４を形質転換させた。
菌ＭＭ２９４を形質転換させた。
（ｖｉ）ＣＤＮＡ含有プラスミドの単離：このようにし
て約２０，０００個のテトラサイタリン耐性株が単離さ
れ、これら各々のＤＮＡをニトロセルロースフィルター
の上に固定した。次いでＴａｎｉｇｕｃｈｉらの報告［
Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．３０５ （１９８３）］した
ＩＬ−２のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸ＮＯ，７
４〜７８（Ｌ ｙｓ” −Ｈｉｓ −Ｌ ｅｕ −Ｇ
ｌ＋＋ −Ｃｙｓ）およびアミノ酸ＮＯ，１２２〜１２
６ （Ｔｈｒ” −Ｐｈｅ −Ｍｅｔ −Ｃｙｓ −Ｇ
Ｉｕ）に対応する塩基配列（” Ａ Ａ ＡＣＡＴ
ＣＴＴ ＣＡＧ ＴＧＴ”および”ＡＣＡ ＴＴＣ
ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ” ）をトリエステル法［Ｃ
ｒ５ａ、 Ｒ，らＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
て約２０，０００個のテトラサイタリン耐性株が単離さ
れ、これら各々のＤＮＡをニトロセルロースフィルター
の上に固定した。次いでＴａｎｉｇｕｃｈｉらの報告［
Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．３０５ （１９８３）］した
ＩＬ−２のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸ＮＯ，７
４〜７８（Ｌ ｙｓ” −Ｈｉｓ −Ｌ ｅｕ −Ｇ
ｌ＋＋ −Ｃｙｓ）およびアミノ酸ＮＯ，１２２〜１２
６ （Ｔｈｒ” −Ｐｈｅ −Ｍｅｔ −Ｃｙｓ −Ｇ
Ｉｕ）に対応する塩基配列（” Ａ Ａ ＡＣＡＴ
ＣＴＴ ＣＡＧ ＴＧＴ”および”ＡＣＡ ＴＴＣ
ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ” ）をトリエステル法［Ｃ
ｒ５ａ、 Ｒ，らＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、７５．５７６５ （１
９７１１１）］により化学合成した。
９７１１１）］により化学合成した。
このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチド
カイネースを用いて５０μρの反応液（オリゴヌクレオ
チド０．２０Ｍｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈｅ１ｐ
Ｈ８，０，１０ｍＭ ＭｇＣ１ｔ、 ｌＯｎ＋Ｍメル
カプトエタノール、５０μＣｉγ−３″ＰＡＴＰ、３ユ
ニツトＴ４ポリヌクレオチドカイネース）中で１時間３
７℃で反応させ、５′末端を３２Ｐで標識した。この標
識されたオリゴヌクレオチドをプローブとしてＬ ａｗ
ｎらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、 、９゜６１０３（１９８１）］に従って上記のニト
ロセルロースフィルター上に固定したＤＮＡに会合させ
、オートラジオグラフィーによって上記２種類のオリゴ
ヌクレオチドプローブに反応する菌株を４個単離した。
カイネースを用いて５０μρの反応液（オリゴヌクレオ
チド０．２０Ｍｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈｅ１ｐ
Ｈ８，０，１０ｍＭ ＭｇＣ１ｔ、 ｌＯｎ＋Ｍメル
カプトエタノール、５０μＣｉγ−３″ＰＡＴＰ、３ユ
ニツトＴ４ポリヌクレオチドカイネース）中で１時間３
７℃で反応させ、５′末端を３２Ｐで標識した。この標
識されたオリゴヌクレオチドをプローブとしてＬ ａｗ
ｎらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、 、９゜６１０３（１９８１）］に従って上記のニト
ロセルロースフィルター上に固定したＤＮＡに会合させ
、オートラジオグラフィーによって上記２種類のオリゴ
ヌクレオチドプローブに反応する菌株を４個単離した。
これらの菌株の各々の菌体プラスミドＤＮＡをアルカリ
法［Ｂｔｒｎｂｏｉｍ Ｈ，Ｃ，＆ Ｄｏｉｙ、
Ｊ。
法［Ｂｔｒｎｂｏｉｍ Ｈ，Ｃ，＆ Ｄｏｉｙ、
Ｊ。
ＮｕｃＬｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 、７．１
５１ａ （１９７９）］によって単離した。次にプラス
ミドＤＮＡの挿入部を制限酵素Ｐｓｔｌにより切り出し
、分離したプラスミドのうちでその挿入部の長さの最も
長い断片を含むものをえらび、このプラスミドをｐＩ
ＬＯＴ １３５−８と名づけた。
５１ａ （１９７９）］によって単離した。次にプラス
ミドＤＮＡの挿入部を制限酵素Ｐｓｔｌにより切り出し
、分離したプラスミドのうちでその挿入部の長さの最も
長い断片を含むものをえらび、このプラスミドをｐＩ
ＬＯＴ １３５−８と名づけた。
（２）プラスミドＩ）ＴＦＩの構築：
前記（１）で得られたプラスミドｐＩＬＯＴ１３５−８
を制限酵素Ｈｇ１ＡＩで切断し、１２９４ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
で処理して平滑末端とした後ＥｃｏＲＩリンカ−ｐ（Ｔ
ＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡ）をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合し、ＥｃｏＲＩリンカ−の重複連結
したプラスミドを除く為、結合物をＥｃｏＲＩで消化し
、さらにこの断片を制限酵素ｐｓｔｒで消化して、ヒト
ＩＬ−２遺伝子の読み取り枠にそろえて翻訳開始コドン
“ＡＴＧ”を付加したＤＮＡ断片を作製した。
を制限酵素Ｈｇ１ＡＩで切断し、１２９４ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
で処理して平滑末端とした後ＥｃｏＲＩリンカ−ｐ（Ｔ
ＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡ）をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合し、ＥｃｏＲＩリンカ−の重複連結
したプラスミドを除く為、結合物をＥｃｏＲＩで消化し
、さらにこの断片を制限酵素ｐｓｔｒで消化して、ヒト
ＩＬ−２遺伝子の読み取り枠にそろえて翻訳開始コドン
“ＡＴＧ”を付加したＤＮＡ断片を作製した。
このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化
した発現用プラスミドｐｔｒｐ ７８１ ［Ｎｕｃｌｅ
ｆｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 旦、 ９．３
０７７−３０８５ （１９８３）］にＴ４ＤＮＡリガ〜
ゼにより結合させた。この反応によりｔｒｐプロモータ
ーの下流に翻訳開始コドンを有し。読み取り枠を一致さ
せてヒト！Ｌ−２発現プラスミドｐＴＦｌを構築した（
第４図参照）。
した発現用プラスミドｐｔｒｐ ７８１ ［Ｎｕｃｌｅ
ｆｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 旦、 ９．３
０７７−３０８５ （１９８３）］にＴ４ＤＮＡリガ〜
ゼにより結合させた。この反応によりｔｒｐプロモータ
ーの下流に翻訳開始コドンを有し。読み取り枠を一致さ
せてヒト！Ｌ−２発現プラスミドｐＴＦｌを構築した（
第４図参照）。
このプラスミドを用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換さ仕る
ことにより、求めるプラスミドｐＴＦｌを含む菌株を得
た。
ことにより、求めるプラスミドｐＴＦｌを含む菌株を得
た。
実施例！
ＩＧＬ−ＥＣ２２のポリペプチド発現プラスミドｐＧ
Ｅ Ｌ １０２ｇの構築および形質転換体の製造ニブラ
スミドｐＧＥＴ ｔｒｐ ８１８−Ｃを制限酵素Ｃ１ａ
ｌおよびＥｃｏＲＩで切断して約３ＫｂｐのＤＮＡ断片
を得た。また、プラスミドｐＴＦ１を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＰｓｔ［で切断して約５ＱＱｂｐのＤＮＡ断片
を得た。これらの２つのＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガー
ゼで結合させた。この反応によりｔｒｐプロモーターの
下流に翻訳開始コドンを有し、読み取り枠を一致させて
ＩＧＬ−ＥＣ２２発現プ発現用ラスミドＥ Ｌ １０２
ｇを構築した（第５図参照）。
Ｅ Ｌ １０２ｇの構築および形質転換体の製造ニブラ
スミドｐＧＥＴ ｔｒｐ ８１８−Ｃを制限酵素Ｃ１ａ
ｌおよびＥｃｏＲＩで切断して約３ＫｂｐのＤＮＡ断片
を得た。また、プラスミドｐＴＦ１を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＰｓｔ［で切断して約５ＱＱｂｐのＤＮＡ断片
を得た。これらの２つのＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガー
ゼで結合させた。この反応によりｔｒｐプロモーターの
下流に翻訳開始コドンを有し、読み取り枠を一致させて
ＩＧＬ−ＥＣ２２発現プ発現用ラスミドＥ Ｌ １０２
ｇを構築した（第５図参照）。
このプラスミドを用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換させ、
プラスミドｐＧ Ｅ Ｌ １０２ｇを含む形質転換体Ｅ
、 ｃｏｌｉ ＤＨＩ／ｐＧＥＬ１０２８（Ｉ ＦＯ
１４３３２゜ＦＥＲＭ Ｐ−７５６８）を得た。
プラスミドｐＧ Ｅ Ｌ １０２ｇを含む形質転換体Ｅ
、 ｃｏｌｉ ＤＨＩ／ｐＧＥＬ１０２８（Ｉ ＦＯ
１４３３２゜ＦＥＲＭ Ｐ−７５６８）を得た。
実施例２
（１） Ｉ ＧＬ−ＥＣ２２を含む菌体抽出液の調製
：ＩＧＬ−ＥＣ２２発現プラスミドｐＧＥＬ １０２８
を含む大腸菌Ｅ、 ｃｏｌｔ ＤＨ１／ｐＧＥＬ １０
２８（ＩＦｏ １４３３２． ＦＥＲＭ Ｐ−７５
６８）を２０ｍ１のｌ°％グルコース、０．４％カザミ
ノ酸を含むＭ９培地で３７℃４時間培養した後、インド
ールアクリル酸を３０μｇ／口ｌに加え、さらに３７℃
３時間培養した。
：ＩＧＬ−ＥＣ２２発現プラスミドｐＧＥＬ １０２８
を含む大腸菌Ｅ、 ｃｏｌｔ ＤＨ１／ｐＧＥＬ １０
２８（ＩＦｏ １４３３２． ＦＥＲＭ Ｐ−７５
６８）を２０ｍ１のｌ°％グルコース、０．４％カザミ
ノ酸を含むＭ９培地で３７℃４時間培養した後、インド
ールアクリル酸を３０μｇ／口ｌに加え、さらに３７℃
３時間培養した。
菌体を集め、食塩水で洗ったのち、０．５ｍｌの溶菌液
（ｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ８，０，１
０ａ＋ＭＥＤＴＡ ０．２Ｍ ＮａＣ１，１ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、０．０２％トリト
ンＸｌ００゜０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁し、
０℃にて４５分。
（ｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ８，０，１
０ａ＋ＭＥＤＴＡ ０．２Ｍ ＮａＣ１，１ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、０．０２％トリト
ンＸｌ００゜０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁し、
０℃にて４５分。
３７℃にて２分放置して溶菌させた。これをさらに軽＜
（３０秒）超音波処理を行って、溶出した菌体のＤＮＡ
を切断した後、４℃で１５００Ｏｒｐｍ（サーバル５Ｓ
３４０−ター、デュポン社製）、３０分間の遠心分離操
作によって上澄み液を得た。この上澄み液を菌体抽出液
とした。
（３０秒）超音波処理を行って、溶出した菌体のＤＮＡ
を切断した後、４℃で１５００Ｏｒｐｍ（サーバル５Ｓ
３４０−ター、デュポン社製）、３０分間の遠心分離操
作によって上澄み液を得た。この上澄み液を菌体抽出液
とした。
（２）菌体抽出液のＩｇＥ活性の測定：菌体抽出液のＩ
ｇＥ活性をＩｇＢ測定キット（ＩｇＥテスト・ジオツギ
、塩野義製薬製１日本）を用いたＲｕ５Ｔ法［Ｒａｄｉ
ｏ ｉｍｍｕｎｏ ５ｏｒｂｅｎｔｔｅｓｔ、 Ｉ
ＩＩｌｍｕｎｏｌｏｇｙ、 １４．２６５ （１９６
８）］により定量した。
ｇＥ活性をＩｇＢ測定キット（ＩｇＥテスト・ジオツギ
、塩野義製薬製１日本）を用いたＲｕ５Ｔ法［Ｒａｄｉ
ｏ ｉｍｍｕｎｏ ５ｏｒｂｅｎｔｔｅｓｔ、 Ｉ
ＩＩｌｍｕｎｏｌｏｇｙ、 １４．２６５ （１９６
８）］により定量した。
ＩＧＬ−ＥＣ２２のＩｇＥ活性は４２ＸＩＯ’単位／Ｑ
培養液であった。
培養液であった。
（３）菌体抽出液の！Ｌ−２活性：
ヒトＩＬ−２活性の測定は、マウスのＴＣＧＦ依存性細
胞株ＮＫＣ３［日本免疫学会総会記録、第１１巻２７７
頁（１９８１年）コを用いて行った。即ち、まず２段階
希釈により希釈された種々の濃度のサンプル５０μ党を
とり、平底マイクロプレート（ファルコン社製）に入れ
た。次いで３Ｘ１０’のＮＫＣ３細胞を含む、１０％牛
脂児血清（１０％ＦＣ９）含有ＲＰＭＩ−１６４０液５
０μｇを加え、炭酸ガスふ卵器内で３７℃、２０時間培
養した。さらに３Ｈ−チミジン１μＣｉを加えて、４時
間培養したのち、セルハーベスタ−（和研薬工業社製１
日本）を用いて、細胞をガラスフィルターにトラップし
、洗浄、ろ過。
胞株ＮＫＣ３［日本免疫学会総会記録、第１１巻２７７
頁（１９８１年）コを用いて行った。即ち、まず２段階
希釈により希釈された種々の濃度のサンプル５０μ党を
とり、平底マイクロプレート（ファルコン社製）に入れ
た。次いで３Ｘ１０’のＮＫＣ３細胞を含む、１０％牛
脂児血清（１０％ＦＣ９）含有ＲＰＭＩ−１６４０液５
０μｇを加え、炭酸ガスふ卵器内で３７℃、２０時間培
養した。さらに３Ｈ−チミジン１μＣｉを加えて、４時
間培養したのち、セルハーベスタ−（和研薬工業社製１
日本）を用いて、細胞をガラスフィルターにトラップし
、洗浄、ろ過。
乾燥の後、シンチレーションカウンターにより放射活性
を測定した。サンプル中のＩＧＬ−ＥＣ２２のＩＬ−２
活性は、１６Ｘ １０’単位／Ｑ培養液であった。
を測定した。サンプル中のＩＧＬ−ＥＣ２２のＩＬ−２
活性は、１６Ｘ １０’単位／Ｑ培養液であった。
なお、上記活性は、日本特開昭５８−１１６４９８号公
報に記載された算出方法を基準として測定された。
報に記載された算出方法を基準として測定された。
（４） ＩＧＬ−ＥＣ２２の精製：
日本特開昭５８−９６０２８号公報に記載されている方
°法により抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を水不溶性
担体アフィゲル１０（Ｂ ｉｏ −Ｒａｄ社製）に結合
させた。抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体−アフィゲル
１０カラム１ｍｌに前項（３）で得られたＥ。
°法により抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を水不溶性
担体アフィゲル１０（Ｂ ｉｏ −Ｒａｄ社製）に結合
させた。抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体−アフィゲル
１０カラム１ｍｌに前項（３）で得られたＥ。
ｃｏｌｉ Ｄ Ｈ１／ｐＧ Ｅ Ｌ １０２ｇを含む菌
体抽出液５ｍｌをかけ、２０％デキストロースを含むＰ
Ｂ Ｓ （２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨａ、ｇ、 ０
．１５Ｍ ＮａＣ１）５０ｍｌを用いてカラムを洗浄
したのち、０．２Ｍ酢酸、０．１５ＭＮａＣ１溶液５ｍ
ｌを用いて、カラムに吸着したＩＧＬ−ＥＣ２２をカラ
ムから溶出し、溶出液をただちに中和したのち、ＰＢＳ
Ｈ！に対して５℃で２４時間透析した。この操作によ
り純度８０％以上のＩＧＬ−ＥＣ２２のポリペプチドが
約５０％の回収率で得られた。
体抽出液５ｍｌをかけ、２０％デキストロースを含むＰ
Ｂ Ｓ （２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨａ、ｇ、 ０
．１５Ｍ ＮａＣ１）５０ｍｌを用いてカラムを洗浄
したのち、０．２Ｍ酢酸、０．１５ＭＮａＣ１溶液５ｍ
ｌを用いて、カラムに吸着したＩＧＬ−ＥＣ２２をカラ
ムから溶出し、溶出液をただちに中和したのち、ＰＢＳ
Ｈ！に対して５℃で２４時間透析した。この操作によ
り純度８０％以上のＩＧＬ−ＥＣ２２のポリペプチドが
約５０％の回収率で得られた。
聚吸盆然星
本発明のポリペプチドを用いると、抗ヒトＩＬ−２抗体
を効率良く精製することができる。
を効率良く精製することができる。
第１図はヒトＩｇＥのペプチドをコードする構築１図
−そ 造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒトＩＬ−２のペプチド
をコードする構造遺伝子を有するＤＮＡを連結してなる
ＤＮＡのヌクレオチド配列を、第２図は第１図に示され
るヌクレオチド配列に対するアミノ酸配列を、第３図は
参考例１の構築図を、第４図は参考例２（２）の構築図
をそれぞれ示す。 第５図は実施例１の構築図を示し、＝ｎ工ｕＬ部はヒト
ＩＬ−２のペプチドをコードする部分を示す。 し 第２図−その ）ｉＥ’Ｉ” ＬＥＵ ＡＳＰ ＡＳＮ ＬＹ
Ｓ ＴＨＲＰＨＥ ５ＥＥＰＦ？ＯＰＲＯＴＨＲＶ
ＡＬ ＬＹＳ 工ＬＥ ＬＥＵ ＧＬＮＨ工Ｓ
ＰＨＥ ＰＲＯＰＦ？ＯＴＨＲ工ＬＥ ＧＬＮ
ＬＥ［ＪＴＨＲＰＲＯＧＬＹ ＴＨＲ工ＬＥ
ＡＳＮ 工ＬＥ ＴＨＦＩＭＥＴ ＡＳＰ Ｖ
ＡＬ ＡＳＰ ＬＥＵ ＳＥＲＴＨＲＡＬＡＬＥ
Ｕ ＡＬＡ ＳＥ’ＲＴＨＲＧＬＮ ＳＥＲＧＬ
Ｕ ＬＥＵＬＥＵ ＳＥＲＡＳＰ ＡＲＧ Ｔ
ＨＲＴＹＲＴＨＲＣＹＳＴＨＲＰＨＥ ＧＬＵ Ａ
ＳＰ ＳＥＲＴＨＲＬＹＳ ＬＹＳＰＨＥ ＭＥＴ
ＡＬＡ ＰＲＯＴＨＲＳＥＲ５ＥＴＩ ５ＥＲＬ
ＥＵ ＧＬＵ ＨＩＳ ＬＥＵ ＬＥＵ Ｌ
ＥＵ ＡＳＰ ＬＥＵＶＡＬ ＣＹＳ ＳＥＲＡＲ
Ｇ ＡＳＰ ＰＨＥ ＴＨＲ３ＥＲＳＥＲＣＹＳ ＡＳ
Ｐ ＧＬＹ ＧＬＹ ＧＬＹＬＥＵ ＣＹＳ ＬＥＵ
ＶＡＬ ＳＥＲＧＬＹ ＴＹＲＴＲＰ ＬＥＵ ＧＬＵ
ＡＳＰ ＧＬＹ ＧＬＮ ＶＡＬＳＥＲＴＨＲＴＨＲ
ＧＬＮ ＧＬＵ ＧＬＹ ＧＬＵＴＨＲＬＥＵ ＳＥＦ
？ ＧＬＮ ＬＹＳ ＨＩＳ ＴＲＰＧＬＮ ＶＡ
Ｌ ＴＨＲＴＹＲＧＬＮ ＧＬＹ Ｈ工５ＣＹＳ ＡＬ
Ａ ＡＳＰ ＳＥＲＡＳＮ ＬＥＵ ＧＬＵＴＨＲＬ
ＹＳ ＬＹＳ ＴＨＲＧＬＮ ＬＥＤ ＧＬＮＧＬＮ
ＭＥＴ 工ＬＥ ＬＥＵ ＡＳＮ ＧＬＹ 工ＬＥつ
づきあす 第２図−その２ ＡＳＮ ＡＳＮ ＴＹＲＬＹＳ ＡＳＮ ＰＲ
ＯＬＹＳ ＬＥＵ ＴＨＲＰＨＥ ＴＹＲＭＥＴ
ＰＲＯＬＹＳ ＬＹＳ ＡＬＡ ＴＨＲＧＬＵＬ
ＥＵ ＧＬＵ ＧＬＵ ＧＬＵ ＬＥＵ Ｌ
ＹＳ ＰＲＯＬＥＵ ＧＬＵＧＬＮ ＳＥＲＬＹＳ
ＡＳＮ ＰＨＥ ＨＩＳ ＬＥＵ ＡＲＧ
ＰＲＯ工ＬＥ ＡＳＮ ＶＡＬ 工ＬＥ
ＶＡＬ ＬＥＵ ＧＬＵ ＬＥＵ ＬＹＳｉ’ｉＥ
Ｔ ＣＹＳ ＧＬＵ ＴＹＲＡＬＡ ＡＳＰ
ＧＬＵ ＴＨＲＡＬＡＡＳＮ ＡＦ？Ｇ ＴＲ
Ｐ 工ＬＥ ＴＨＲＰＨＥ ＣＹＳ ＧＬＮ
５ＥＲＡＲＧ ＭＥＴ ＬＥＵ ＴＨＲＰＨＥ Ｌ
ＹＳＬＦ：Ｕ ＬＹＳ ＨＩＳ ＬＥＵ ＧＬＮ ＣＹ
ＳＧＬＵ ＶＡＬ ＬＥＵ ＡＳＮ ＬＥＵ ＡＬＡ
ＡＲＧ ＡＳＰ ＬＥＵ 工ＬＥ ＳＥＲＡＳＮＧＬＹ
ＳＥＲＧＬＵ ＴＨＲＴＨ）Ｉ ＰＨＥＴＨＲ工Ｌ
Ｅ ＶＡＬ ＧＬＵ ＰＨＥ ＬＥＵ工ＬＥ 工ＬＥ
ＳＥＲＴＨＲＬＥＵ ＴＨＲ匡 １
−そ 造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒトＩＬ−２のペプチド
をコードする構造遺伝子を有するＤＮＡを連結してなる
ＤＮＡのヌクレオチド配列を、第２図は第１図に示され
るヌクレオチド配列に対するアミノ酸配列を、第３図は
参考例１の構築図を、第４図は参考例２（２）の構築図
をそれぞれ示す。 第５図は実施例１の構築図を示し、＝ｎ工ｕＬ部はヒト
ＩＬ−２のペプチドをコードする部分を示す。 し 第２図−その ）ｉＥ’Ｉ” ＬＥＵ ＡＳＰ ＡＳＮ ＬＹ
Ｓ ＴＨＲＰＨＥ ５ＥＥＰＦ？ＯＰＲＯＴＨＲＶ
ＡＬ ＬＹＳ 工ＬＥ ＬＥＵ ＧＬＮＨ工Ｓ
ＰＨＥ ＰＲＯＰＦ？ＯＴＨＲ工ＬＥ ＧＬＮ
ＬＥ［ＪＴＨＲＰＲＯＧＬＹ ＴＨＲ工ＬＥ
ＡＳＮ 工ＬＥ ＴＨＦＩＭＥＴ ＡＳＰ Ｖ
ＡＬ ＡＳＰ ＬＥＵ ＳＥＲＴＨＲＡＬＡＬＥ
Ｕ ＡＬＡ ＳＥ’ＲＴＨＲＧＬＮ ＳＥＲＧＬ
Ｕ ＬＥＵＬＥＵ ＳＥＲＡＳＰ ＡＲＧ Ｔ
ＨＲＴＹＲＴＨＲＣＹＳＴＨＲＰＨＥ ＧＬＵ Ａ
ＳＰ ＳＥＲＴＨＲＬＹＳ ＬＹＳＰＨＥ ＭＥＴ
ＡＬＡ ＰＲＯＴＨＲＳＥＲ５ＥＴＩ ５ＥＲＬ
ＥＵ ＧＬＵ ＨＩＳ ＬＥＵ ＬＥＵ Ｌ
ＥＵ ＡＳＰ ＬＥＵＶＡＬ ＣＹＳ ＳＥＲＡＲ
Ｇ ＡＳＰ ＰＨＥ ＴＨＲ３ＥＲＳＥＲＣＹＳ ＡＳ
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ＧＬＮ ＧＬＵ ＧＬＹ ＧＬＵＴＨＲＬＥＵ ＳＥＦ
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Ａ ＡＳＰ ＳＥＲＡＳＮ ＬＥＵ ＧＬＵＴＨＲＬ
ＹＳ ＬＹＳ ＴＨＲＧＬＮ ＬＥＤ ＧＬＮＧＬＮ
ＭＥＴ 工ＬＥ ＬＥＵ ＡＳＮ ＧＬＹ 工ＬＥつ
づきあす 第２図−その２ ＡＳＮ ＡＳＮ ＴＹＲＬＹＳ ＡＳＮ ＰＲ
ＯＬＹＳ ＬＥＵ ＴＨＲＰＨＥ ＴＹＲＭＥＴ
ＰＲＯＬＹＳ ＬＹＳ ＡＬＡ ＴＨＲＧＬＵＬ
ＥＵ ＧＬＵ ＧＬＵ ＧＬＵ ＬＥＵ Ｌ
ＹＳ ＰＲＯＬＥＵ ＧＬＵＧＬＮ ＳＥＲＬＹＳ
ＡＳＮ ＰＨＥ ＨＩＳ ＬＥＵ ＡＲＧ
ＰＲＯ工ＬＥ ＡＳＮ ＶＡＬ 工ＬＥ
ＶＡＬ ＬＥＵ ＧＬＵ ＬＥＵ ＬＹＳｉ’ｉＥ
Ｔ ＣＹＳ ＧＬＵ ＴＹＲＡＬＡ ＡＳＰ
ＧＬＵ ＴＨＲＡＬＡＡＳＮ ＡＦ？Ｇ ＴＲ
Ｐ 工ＬＥ ＴＨＲＰＨＥ ＣＹＳ ＧＬＮ
５ＥＲＡＲＧ ＭＥＴ ＬＥＵ ＴＨＲＰＨＥ Ｌ
ＹＳＬＦ：Ｕ ＬＹＳ ＨＩＳ ＬＥＵ ＧＬＮ ＣＹ
ＳＧＬＵ ＶＡＬ ＬＥＵ ＡＳＮ ＬＥＵ ＡＬＡ
ＡＲＧ ＡＳＰ ＬＥＵ 工ＬＥ ＳＥＲＡＳＮＧＬＹ
ＳＥＲＧＬＵ ＴＨＲＴＨ）Ｉ ＰＨＥＴＨＲ工Ｌ
Ｅ ＶＡＬ ＧＬＵ ＰＨＥ ＬＥＵ工ＬＥ 工ＬＥ
ＳＥＲＴＨＲＬＥＵ ＴＨＲ匡 １
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝
子を有するＤＮＡおよびヒトインターロイキン２のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡをそれぞれ
の読み取り枠をそろえて連結してなるＤＮＡ。 ２、両構造遺伝子の上流にプロモーターを連結してなる
特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 ３、両構造遺伝子の間にリンカーを介してなる特許請求
の範囲第１項記載のＤＮＡ。 ４、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブリ
ンＥ抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範囲
第１項記載のＤＮＡ。 ５、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝
子を有するＤＮＡおよびヒトインターロイキン２のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡをそれぞれ
読み取り枠をそろえて連結してなるＤＮＡが組み込まれ
たプラスミド。 ６、ＤＮＡが構造遺伝子の上流にプロモーターを連結し
てなるＤＮＡである特許請求の範囲第５項記載のプラス
ミド。 ７、ＤＮＡが構造遺伝子の間にリンカーを介してなるＤ
ＮＡである特許請求の範囲第５項記載のプラスミド。 ８、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブリ
ンＥ抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範囲
第５項記載のプラスミド。 ９、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝
子を有するＤＮＡおよびヒトインターロイキン２のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡをそれぞれ
の読み取り枠をそろえて連結してなるＤＮＡが組み込ま
れたプラスミドで形質転換された形質転換体。 １０、形質転換体の宿主がエシェリヒア属菌である特許
請求の範囲第９項記載の形質転換体。 １１、ＤＮＡが構造遺伝子の上流にプロモーターを連結
してなるＤＮＡである特許請求の範囲第９項記載の形質
転換体。 １２、ＤＮＡが構造遺伝子の間にリンカーを介してなる
ＤＮＡである特許請求の範囲第９項記載の形質転換体。 １３、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブ
リンＥ抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範
囲第９項記載の形質転換体。 １４、抗体認識部位を含むペプチドとヒトインターロイ
キン２のペプチドとを結合したポリペプチド。 １５、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブ
リンＥ抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範
囲第１４項記載のポリペプチド。 １６、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺
伝子を有するＤＮＡおよびヒトインターロイキン２のペ
プチドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡをそれぞ
れ読み取り枠をそろえて連結してなるＤＮＡが組み込ま
れたプラスミドで形質転換された形質転換体を培地に培
養し、培養物中に抗体認識部位を含むペプチドとヒトイ
ンターロイキン２のペプチドとを結合したポリペプチド
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該
ポリペプチドの製造法。 １７、形質転換体の宿主がエシェリヒア属菌である特許
請求の範囲第１６項記載のポリペプチドの製造法。 １８、ＤＮＡが構造遺伝子の上流にプロモーターを連結
してなるＤＮＡである特許請求の範囲第１６項記載のポ
リペプチドの製造法。 １９、ＤＮＡが構造遺伝子の間にリンカーを介してなる
ＤＮＡである特許請求の範囲第１６項記載のポリペプチ
ドの製造法。 ２０、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブ
リンＥ抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範
囲第１６項記載のポリペプチドの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| WO84/00181 | 1984-04-10 | ||
| PCT/JP1984/000181 WO1985004673A1 (en) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | Novel dna and its use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61181380A true JPS61181380A (ja) | 1986-08-14 |
Family
ID=13818296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60075910A Pending JPS61181380A (ja) | 1984-04-10 | 1985-04-09 | 新規ｄｎａおよびその用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61181380A (ja) |
| WO (1) | WO1985004673A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3712985A1 (de) * | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
| EP0269455A3 (en) * | 1986-11-28 | 1989-09-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Highly purified fused protein comprising human ige fc fragment and production thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法 |
| JPS5944399A (ja) * | 1982-09-07 | 1984-03-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
-
1984
- 1984-04-10 WO PCT/JP1984/000181 patent/WO1985004673A1/ja unknown
-
1985
- 1985-04-09 JP JP60075910A patent/JPS61181380A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1985004673A1 (en) | 1985-10-24 |
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