JPS61181380A - Novel dna and use thereof - Google Patents
Novel dna and use thereofInfo
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- JPS61181380A JPS61181380A JP60075910A JP7591085A JPS61181380A JP S61181380 A JPS61181380 A JP S61181380A JP 60075910 A JP60075910 A JP 60075910A JP 7591085 A JP7591085 A JP 7591085A JP S61181380 A JPS61181380 A JP S61181380A
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- peptide
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構
造遺伝子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2
のペプチドをコードする構造遺伝子を有するDNAを連
結してなるDNA、該DNAが組み込まれたプラスミド
、該プラスミドで形質転換された形質転換体、抗体認識
部位を含むペプチドとヒトインターロイキン2のペプチ
ドとを結合したポリペプチドおよび該形質転換体を用い
る該ポリペプチドの製造法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of Industrial Application The present invention relates to DNA having a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site and human interleukin 2.
A DNA obtained by linking DNAs having a structural gene encoding a peptide, a plasmid into which the DNA is integrated, a transformant transformed with the plasmid, a peptide containing an antibody recognition site, and a peptide of human interleukin 2. The present invention relates to a polypeptide that binds to a polypeptide, and a method for producing the polypeptide using the transformant.
従来の技術
抗体認識部位を含むペプチド、例えば免疫グロブリンE
(以下、IgEと略称することもある)は、アレルギー
反応などの重要な生体反応を担っている。すなわち、ア
レルギー反応は特異抗原と結合したIgEの感作された
肥満細胞や好塩基球への結合によって誘起されることが
知られている(Immunological Rev
iew 41.109 (1978) )。Prior Art Peptides containing antibody recognition sites, such as immunoglobulin E
(hereinafter sometimes abbreviated as IgE) is responsible for important biological reactions such as allergic reactions. That is, it is known that allergic reactions are induced by the binding of IgE bound to specific antigens to sensitized mast cells and basophils (Immunological Rev.
iew 41.109 (1978)).
従って、アレルギー反応をおさえるために抗原結合部位
を除いたIgE分子を用いることも考えられている。し
かし生体内でのIgEに起因する種々の反応については
、まだ未解決な点が多い。十分な量のヒトIgEを供給
できないことが、この理由の一つとなっている。Therefore, it has been considered to use IgE molecules from which the antigen-binding site has been removed in order to suppress allergic reactions. However, there are still many unresolved points regarding the various reactions caused by IgE in vivo. One of the reasons for this is the inability to supply sufficient amounts of human IgE.
IgEの生産方法としては、ヒトIgE産生能を有する
株化ヒト骨髄腫細胞の培養上清より分取精製する方法が
提唱されているが、細胞培養であること、細胞の増殖能
が低いことなどから、安価に大量のIgEを得るのは難
しい。そこで、遺伝子操作技術を利用して、IgE構造
遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体を培養することにより、IgEを大量に得られる
技術が開発された[Nucleic Ac1ds
Re5earch11.719 (1983); Nu
cleic Ac1ds Re5earch旦、3
077 (1983)]。As a method for producing IgE, a method of preparative purification from the culture supernatant of human myeloma cell lines that have the ability to produce human IgE has been proposed, but this method requires cell culture, has low cell proliferation ability, etc. It is difficult to obtain large quantities of IgE at low cost. Therefore, a technology has been developed that allows a large amount of IgE to be obtained by culturing a transformant transformed with a plasmid incorporating an IgE structural gene using genetic engineering technology [Nucleic Ac1ds
Re5arch11.719 (1983); Nu
cleic Ac1ds Re5earch day, 3
077 (1983)].
一方、インターロイキン2[以下、IL−2と略称する
こともある。以前はT細胞増殖因子(TCGF)と呼ば
れた。]は、レクチンやアロ抗原等で刺激されたT細胞
によって産生されるリンホカインである[5ciens
e 193.1007 (1976):Immuno
logicalReview 51.257 (19
80)]。In。On the other hand, interleukin 2 [hereinafter sometimes abbreviated as IL-2]. Formerly called T cell growth factor (TCGF). ] is a lymphokine produced by T cells stimulated with lectins, alloantigens, etc.
e 193.1007 (1976): Immuno
logicalReview 51.257 (19
80)]. In.
−2は、T細胞をインビトロでその機能を保持したまま
増殖させ長期間の継代維持を可能にするはかに、今まで
に胸腺細胞のマイト−ジエン反応を促進したり(コステ
ィミュレーター)、ヌードマウス婢細胞のT細胞依存性
抗原に対する抗体産生能を回復させたり(T細胞リブレ
ーシングファクター)、キラー細胞の分化増殖を促進す
る(キラーヘルパーファクター)活性を有すると報告さ
れている[The Journal of I
mmunology 123゜2928 (1979
) rmmunological Review
51.257(1980)]。-2 can proliferate T cells in vitro while retaining their functions and enable long-term passage maintenance, and has so far been shown to promote the mitogen reaction of thymocytes (costimulator). ), it has been reported to have the activity of restoring the ability of nude mouse parasitic cells to produce antibodies against T cell-dependent antigens (T cell rebreathing factor) and promoting the differentiation and proliferation of killer cells (killer helper factor) [ The Journal of I
mmunology 123°2928 (1979
) rmmunological Review
51.257 (1980)].
しかしながら、ヒトrL−2は、天然のものを用いての
量産は困難であるため、遺伝子操作技術を利用して、ヒ
トIL−2構造遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質
転換された形質転換体を培養することにより、ヒトIL
−2を大量に得られるようになった[Nature
302.305(1983);B iochemica
l and B 1ophysical Res
earchCommunications vol、
109. NO,2,p、363(1983): N
ucleic Ac1ds Re5earch
11゜4307 (1983)]。However, human rL-2 is difficult to mass-produce using natural products, so genetic engineering techniques are used to produce transformants transformed with a plasmid incorporating the human IL-2 structural gene. By culturing, human IL
-2 can now be obtained in large quantities [Nature
302.305 (1983); Biochemica
l and B 1ophysical Res
archCommunications vol.
109. No. 2, p. 363 (1983): N.
ucleic Ac1ds Re5earch
11°4307 (1983)].
発明が解決しようとする問題点
前記のとおり、ヒトIgEのペプチドあるいはヒトIL
−2のペプチドをそれぞれ単独でコードする構造遺伝子
によるこれらの発現がそれぞれ単独で試みられてきたが
、本発明はこれら2種の異なる免疫学的あるいは生物学
的活性を持つ異種蛋白の新規複合体を製造することにあ
る。Problems to be Solved by the Invention As mentioned above, human IgE peptides or human IL
Although attempts have been made to express these two peptides using structural genes singly encoding them, the present invention proposes a novel complex of these two heterologous proteins with different immunological or biological activities. The purpose is to manufacture.
問題点を解決するための手段
本発明者らは、ヒトIgEとヒトIL〜2との異種蛋白
の複合体を遺伝子工学の手法を用い製造したところ、該
複合体はヒトIgEのもつ抗原性とヒトIL−2のもつ
抗原性の両方の性質を有していることを見いだし、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。Means for Solving the Problems The present inventors produced a heterologous protein complex of human IgE and human IL-2 using genetic engineering techniques. It was discovered that IL-2 has both the antigenic properties of human IL-2, and as a result of further research based on this finding, the present invention was completed.
すなわち、本発明は、(1)、抗体認識部位を含むペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAおよびヒト
IL−2のペプチドをコードする構造遺伝子を有するD
NAを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
DNA、(2)、抗体認識部位を含むペプチドをコード
する構造遺伝子を有するDNAおよびヒトIL−2のペ
プチドをコードする構造遺伝子を有するDNAを、それ
ぞれの読み取り枠をそろえて連結してなるDNAが組み
込まれたプラスミド、(3)、抗体認識部位を含むペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAおよびヒト
IL−2のペプチドをコードする構造遺伝子を有するD
NAを、それぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
DNAが組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
転換体、(4)、抗体認識部位を含むペプチドとヒトI
L−2のペプチドとを結合したポリペプチド、および(
5)、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺
伝子を有するDNAおよびヒトIL−2のペプチドをコ
ードする構造遺伝子を有するDNAを、それぞれ読み取
り枠をそろえて連結してなるDNAが組み込まれたプラ
スミドで形質転換された形質転換体を培地に培養し、培
養物中に抗体認識部位を含むペプチドとヒトIL−2の
ペプチドとを結合したポリペプチドを生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造
法である。That is, the present invention provides (1) a DNA having a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site and a DNA having a structural gene encoding a peptide of human IL-2;
(2) DNA that has a structural gene that encodes a peptide that includes an antibody recognition site, and DNA that has a structural gene that encodes a peptide of human IL-2. (3) A plasmid into which DNA is linked with their reading frames aligned; (3) A DNA containing a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site and a structural gene encoding a human IL-2 peptide. have D
(4) A transformant transformed with a plasmid incorporating DNA formed by linking NA with their reading frames aligned, (4) a peptide containing an antibody recognition site and human I
A polypeptide bound to a peptide of L-2, and (
5) A plasmid incorporating DNA obtained by ligating a DNA having a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site and a DNA having a structural gene encoding a peptide of human IL-2 with their respective reading frames aligned. The transformant transformed with is cultured in a medium, producing and accumulating in the culture a polypeptide that combines a peptide containing an antibody recognition site and a peptide of human IL-2,
This is a method for producing the polypeptide, which is characterized by collecting the polypeptide.
本明細書においては、抗体認識部位を含むペプチドがヒ
トIgEであり、これとヒトIL−2のペプチドとを結
合したポリペプチドをイムノブロイキン(I mmun
ogleukin)E C22と称し、あるいは単にI
GL−EC22と略称することもある。In this specification, the peptide containing an antibody recognition site is human IgE, and a polypeptide obtained by binding this and a peptide of human IL-2 is used as an immunoleukin (I mmun).
ogleukin) E C22 or simply I
It is sometimes abbreviated as GL-EC22.
本発明における抗体認識部位を含むペプチドとしては、
たとえば抗ヒト免疫グロブリンE抗体認識部位を含むペ
プチドが挙げられる。The peptide containing an antibody recognition site in the present invention includes:
Examples include peptides containing an anti-human immunoglobulin E antibody recognition site.
抗ヒトIgE抗体認識部位を含むペプチドとしては、ヒ
トIgEH鎖の全部または部分を含むペプチドが挙げら
れる。該ヒトIgEH鎖の部分とは、ヒトIgE分子を
構成するペプチド鎖の1つで、該分子は1対のH鎖と1
対のし鎖から構成されていることが知られている。した
がって、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造
遺伝子の例としては、ヒトIgEH鎖の全部または部分
を含むペプチドをコードする構造遺伝子が挙げられる。Peptides containing an anti-human IgE antibody recognition site include peptides containing all or part of a human IgE heavy chain. The human IgE H chain portion is one of the peptide chains that constitute the human IgE molecule, and the molecule consists of a pair of H chains and a
It is known that it is composed of paired chains. Therefore, examples of structural genes encoding peptides containing antibody recognition sites include structural genes encoding peptides containing all or part of a human IgE heavy chain.
該IgE H鎖の全部または部分を含むペプチドをコ
ードする構造遺伝子としては、たとえば、日本特開昭5
9−44399号公報、Ce1l vol、 29
゜691 (1982)、 Nucleic Ac1
ds Re5earch 11゜719 (198
3)、 Nucleic Ac1ds Re5ea
rch 11゜3077(1983)、 EMBO(
The EuropeanMolecular B
iology Organization)Jour
nal上、 655 (1982)などに記載されたD
NAが挙げられる。Examples of structural genes encoding peptides containing all or part of the IgE H chain include
Publication No. 9-44399, Ce1l vol, 29
゜691 (1982), Nucleic Ac1
ds Research 11゜719 (198
3), Nucleic Ac1ds Re5ea
rch 11°3077 (1983), EMBO (
The European Molecular B
iology Organization)Jour
nal, 655 (1982), etc.
One example is NA.
本発明のヒトIL−2のペプチドとは、ヒトIL−2活
性を有するペプチドであればいずれでもよい。たとえば
活性を有する限り、ヒトIL−2より短いペプチドであ
っても長いペプチドであってもよい。The human IL-2 peptide of the present invention may be any peptide that has human IL-2 activity. For example, the peptide may be shorter or longer than human IL-2 as long as it has activity.
該ヒトIL−2のペプチドをコードする構造遺伝子とし
ては、たとえば、日本特許出願昭和58年第22507
9号(昭和58年(西暦1983年)11月28日付出
願)1日本特許出願昭和58年第2:(5638号(昭
和58年(西暦1983年)12月13日付出願)、
Nature vol。As the structural gene encoding the human IL-2 peptide, for example, Japanese Patent Application No. 22507 of 1982
No. 9 (filed on November 28, 1983) 1 Japanese Patent Application No. 2: (No. 5638 (filed on December 13, 1983))
Nature vol.
302、 p、305 (1983)、 Bioche
mical andBiophysical Re
5earch Communicationsvol
、 109. NO,2,p、363 (1982)、
NucleicAcids Re5earch
旦、 4307 (1983)などに記載されたDNA
が挙げられる。302, p. 305 (1983), Bioche
Mical and Biophysical Re
5earch Communications vol.
, 109. No. 2, p. 363 (1982),
Nucleic Acids Re5earch
DNA described in Dan, 4307 (1983) etc.
can be mentioned.
上記、特許出願昭和58年第225079号に記載され
たヒトIL−2のペプチドをコードするDNAは、式
%式%
中、コドン1−133で示される塩基配列のDNA(V
)が挙げられる。このDNA(V)は、その5′末端に
ATGまたは上記式中コドンS1〜S2゜で示されるシ
グナルコドンを有していてもよく、3′末端にTAA、
TGAまたはTAGを育することが好ましく、とりわけ
TGAが好ましい。The DNA encoding the human IL-2 peptide described in the above patent application No. 225079 of 1980 is a DNA (V
). This DNA (V) may have ATG or a signal codon represented by codons S1 to S2° in the above formula at its 5' end, and TAA,
It is preferred to grow TGA or TAG, especially TGA.
上記DNA(V)は、式
%式%
Lys Leu Tyr Arg Met
Le+u ThrPhe Lys Phe T
yr Met Pro LysLys Ala
Thr Glu Leu Lys His
Leu Gln Cys Leu Glu
Glu GluLeu Lys Pro Le
u Glu Glu ValLeu Asn
Leu Ala Gln Ser LysA
sn Phe His Leu Arg P
ro ArgAsp Leu lie Ser
Asn lie AsnVat lie
Val Leu Glu Leu LysCy
s Glu Tyr Ala Asp Gl
u ThrAla Thr Ile Val
Glu Phe LeuAsn Arg
Trp Ile Thr Phe CysG
in Ser Ile lie Ser
Thr Leu(上記式中、XはMet または水
素を示す。)で表わされるペプチドをコードする。また
、上記日本特許出願昭和58年第235638号に記載
されたヒトIL−2のペプチドをコードするDNAは、
式2式%
[式中、XはAGC,AGT、TCA、TCC。The above DNA (V) has the formula % Lys Leu Tyr Arg Met
Le+u ThrPhe Lys Phe T
yr Met Pro LysLysAla
Thr Glu Leu Lys His
Leu Gln Cys Leu Glu
Glu GluLeu Lys Pro Le
u Glu Glu ValLeu Asn
Leu Ala Gln Ser LysA
sn Phe His Leu Arg P
ro ArgAspLeu lie Ser
Asn lie Asn Vat lie
Val Leu Glu Leu LysCy
s Glu Tyr Ala Asp Gl
u ThrAla Thr Ile Val
Glu Phe LeuAsn Arg
Trp Ile Thr Phe CysG
In Ser Ile lie Ser
It encodes a peptide represented by Thr Leu (in the above formula, X represents Met or hydrogen). In addition, the DNA encoding the peptide of human IL-2 described in the above-mentioned Japanese Patent Application No. 235638 of 1982 is
Formula 2 Formula % [Wherein, X is AGC, AGT, TCA, TCC.
TCG、TCT、TAA、TAGおよびTGA以外のコ
ドンまたは水素を示し、Yはコドンまたは水酸基を示す
コで表わされる塩基配列を有するDNAが挙げられ、上
記DNA(■)は、式2式%
[式中、ZはSet以外のアミノ酸残基または水素を示
す]の配列を有するポリペプチドをコードする。Examples include DNA having a base sequence represented by a codon or hydrogen other than TCG, TCT, TAA, TAG, and TGA, and Y represents a codon or a hydroxyl group, and the DNA (■) has the following formula: Z represents an amino acid residue other than Set or hydrogen].
DNA(Vl)に関し、Xで示されるコドンは、ヒ)[
L−2と実質的に同様の活性を有するポリペプチド(■
)の一部を構成するアミノ酸をコードするコドン(但し
、XはSetをコードするコドンおよび翻訳終止コドン
ではない)であればいずれでもよく、更にその5′末端
側にアミノ酸をコードするコドンを1個以上有していて
もよい。XはとりわけATGであることが好ましい。Regarding DNA (Vl), the codon indicated by X is
A polypeptide having substantially the same activity as L-2 (■
) (However, X is not a codon encoding Set or a translation stop codon), any codon that encodes an amino acid forming a part of You may have more than one. It is particularly preferred that X is ATG.
Yで示されるコドンは、翻訳終止コドンまたはヒトIL
−2と実質的に同様の活性を有するポリペプチド(■)
の一部を構成するアミノ酸をコードするコドンであれば
いずれでもよく、更にその3′末端側にアミノ酸をコー
ドするコドンを1個以上有していてもよい。Yで示され
るコドンが翻訳終止コドン以外のコドンの場合(更にそ
の3′末端側にアミノ酸をコードするコドンを1個以上
有する場合を含む)は、3′末端に翻訳終止コドンを有
することが好ましい。なおYで示されるコドンはTAA
、TAGまたはTGAであることがより好ましく、とり
わけTGAであることが好ましい。The codon designated Y is the translation stop codon or human IL
Polypeptide with substantially similar activity to -2 (■)
Any codon may be used as long as it encodes an amino acid that constitutes a part of the codon, and it may further have one or more codons that encode an amino acid at its 3' end. If the codon represented by Y is a codon other than a translation stop codon (including cases where it has one or more codons encoding amino acids at its 3' end), it is preferable to have a translation stop codon at its 3' end. . The codon indicated by Y is TAA
, TAG or TGA, and particularly TGA.
ポリペプチド(■)に関し、Zで示されるSet以外の
アミノ酸残基としてはヒトIL−2と実質的に同様の活
性を有するポリペプチドの一部を構成するアミノ酸残基
であればいずれでもよく、例えば第1表に示されるアミ
ノ酸残基(但し、Serを除く)が挙げられ、更にその
N末端側に、例えば、第1表に示されるアミノ酸残基ま
たはこれらアミノ酸残基の複数個で構成されるペプチド
を有していてもよい。とりわけZとしてはMet ま
たは水素が好ましい。Regarding the polypeptide (■), any amino acid residue other than Set indicated by Z may be used as long as it forms part of a polypeptide having substantially the same activity as human IL-2, Examples include the amino acid residues shown in Table 1 (excluding Ser), and furthermore, on the N-terminal side, for example, the amino acid residues shown in Table 1 or composed of a plurality of these amino acid residues are included. It may also contain a peptide. In particular, Z is preferably Met or hydrogen.
抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝子を
有するDNA、およびヒトIL−2のペプチドをコード
する構造遺伝子を有するDNAを、それぞれの読み取り
枠をそろえて連結する。連結する方法は、公知の方法に
従って行えばよく、たとえば、T4DNAリガーゼを用
いてひとつのDNAの3’−OH末端と他方のDNAの
5′−P末端をATP存在下で連結させる。A DNA having a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site and a DNA having a structural gene encoding a peptide of human IL-2 are ligated with their reading frames aligned. The ligation may be performed according to a known method, for example, the 3'-OH end of one DNA and the 5'-P end of the other DNA are ligated in the presence of ATP using T4 DNA ligase.
また、両遺伝子の間にリンカ−を介するのが好ましい。Furthermore, it is preferable to use a linker between both genes.
該リンカ−としては、たとえば、EC0RIリンカーり
(CTAGAATTCTAG)などがあり、さらにNe
w England Biolabs(米国)のも
の、その他の市販されているものを用いることができる
。Examples of the linker include EC0RI linker (CTAGAATTCTAG), and Ne
w England Biolabs (USA) and other commercially available products can be used.
リンカ−を連結する方法は、たとえば、遺伝子の末端を
大腸菌ポリメラーゼ■(ラージフラグメント)やSlヌ
クレアーゼなどで平滑末端にして、該末端とリンカ−の
末端をT4 DNAリガーゼによって連結する。この際
、リンカ−同志の重複連結などを除去するために、制限
酵素で消化して粘着末端とする必要がある。制限酵素の
種類はリンカ−の種類により異なるが、たとえば、Ec
oR1リンカ−を使用した際の制限酵素はEcoRIで
ある。生じた粘着末端を利用して両遺伝子同志をT4D
NAリガーゼで連結すればリンカ−を介したひとつのD
NAを得ることができる。A method for ligating a linker is, for example, by making the end of the gene blunt with Escherichia coli polymerase (large fragment) or Sl nuclease, and then ligating the end of the gene with the end of the linker using T4 DNA ligase. At this time, in order to remove redundant connections between linkers, it is necessary to digest with restriction enzymes to create sticky ends. The type of restriction enzyme differs depending on the type of linker, but for example, Ec
The restriction enzyme used when using the oR1 linker is EcoRI. Using the resulting sticky ends, connect both genes to T4D.
When ligated with NA ligase, one D via a linker
NA can be obtained.
上記両構造遺伝子が連結してなるDNAの上流に、プロ
モーターを連結するのが好ましい。It is preferable to link a promoter upstream of the DNA formed by linking both of the above structural genes.
jお、プロモーターの下流に連結されることとなる禰構
造遺伝子の順序は、プロモーターの下流に抗体認識部位
を含むペプチドをコードする構造遺伝子次いでヒトIL
−2の構造遺伝子となるように、あるいは、プロモータ
ーの下流にヒトIL−2の構造遺伝子次いで抗体認識部
位を含むペプチドをコードする構造遺伝子となるように
連結される。上記プロモーター以外の三者の連結の順序
は、特にとわれないが、プロモーターは最上流に連結す
ることが必須である。該プロモーターとしては、たとえ
ば、トリプトファン合成(trp)プロモーター、 r
ec Aプロモーター、ラクトースプロモーター等があ
げられ、とりわけtrpプロモーターが好適である。The order of the structural genes to be linked downstream of the promoter is the structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site downstream of the promoter, followed by the human IL.
-2 structural gene, or the human IL-2 structural gene downstream of the promoter and then a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site. The order of linking the three components other than the promoter is not particularly limited, but it is essential that the promoter is linked at the most upstream position. Examples of the promoter include tryptophan synthesis (trp) promoter, r
Examples include the ecA promoter and the lactose promoter, with the trp promoter being particularly preferred.
プロモーターを連結する方法としては、たとえば、発現
させようとする遺伝子の5′末端に適当なリンカ−を用
いて、翻訳開始コドンATGを付加し、これをプロモー
ターの3′末端に連結する。As a method for linking a promoter, for example, a translation initiation codon ATG is added to the 5' end of the gene to be expressed using an appropriate linker, and this is linked to the 3' end of the promoter.
このとき用いる酵素としてはT4DNAリガーゼが一般
的であり、その処理方法は前述に準する。T4 DNA ligase is commonly used as the enzyme at this time, and the treatment method is the same as described above.
また、プロモーターの下流には適当な制限酵素の認識部
位が設けられていることが望ましい。Furthermore, it is desirable that a recognition site for an appropriate restriction enzyme be provided downstream of the promoter.
両遺伝子を連結してなるDNAを宿主微生物で発現させ
るために、ベクターとしてプラスミドを用い、これに該
DNAを組み込む。該ベクターとしてのプラスミドとし
ては、たとえば、Co1E I由来のpB R322[
Gene 2.95 (1977)]が最もよく利用
されるが、その他のプラスミドであっても、効率良く発
現させ得るものはいずれも用いることができる。その例
としては、たとえば、トリプトファン合成プロモーター
を組み込んだptrp・781、 ptrp 771
などが挙げられる。このようにして得られたDNAをプ
ラスミドに組み込むには、まず、プラスミドのDNAを
適当な制限酵素で処理して、線状にする。これと、前述
のようにして得られたDNAをT4DNAリガーゼで連
結する。In order to express the DNA formed by linking both genes in a host microorganism, a plasmid is used as a vector and the DNA is incorporated into it. Examples of the plasmid used as the vector include pB R322 [derived from Co1E I].
Gene 2.95 (1977)] is most often used, but any other plasmid that can be used for efficient expression can be used. Examples include, for example, ptrp781, ptrp771, which incorporates a tryptophan synthesis promoter.
Examples include. In order to incorporate the DNA thus obtained into a plasmid, the plasmid DNA is first treated with an appropriate restriction enzyme to linearize it. This and the DNA obtained as described above are ligated using T4 DNA ligase.
このようにして得られた両遺伝子が連結されたDNAが
組み込まれたプラスミドで宿主菌を形質転換し、形質転
換体を製造する。A host bacterium is transformed with the thus obtained plasmid into which the DNA in which both genes are linked is integrated, to produce a transformant.
該宿主菌としては、たとえばエシェリヒア属菌。Examples of the host bacteria include Escherichia bacteria.
枯草菌、酵母などが挙げられ、特にエシェリヒア属菌が
好ましい。該エシェリヒア属菌としては、たとえば大腸
菌(Escherichia coli)DHI株[
N ature 幻、7.1110−1114 (1
968)、Journalor Mo1ecula
r Biology 166、 557−580
(1983)コなどが挙げられる。Examples include Bacillus subtilis and yeast, with Escherichia bacteria being particularly preferred. Examples of the Escherichia bacteria include Escherichia coli DHI strain [
Nature illusion, 7.1110-1114 (1
968), Journal Molecula
r Biology 166, 557-580
(1983) and others.
該プラスミドで宿主菌を形質転換する方法としては、カ
ルシウム法やプロトプラスト法などが挙げられ、特にカ
ルシウム法が好ましい。Methods for transforming host bacteria with the plasmid include the calcium method and the protoplast method, with the calcium method being particularly preferred.
上記方法によって得られた形質転換体の一例として、後
述の実施例1で製造されたESCheriChiaco
li DHI/pGEL 1028が挙げられる。該微
生物は、財団法人発酵研究所(IFo、532日本国大
阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17番85号)に昭和
59年(西暦1984年)3月27日に受託番号I P
O14332として寄託され、また、本微生物は、日
本国通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(F
RI 、305日本国茨城県筑波郡谷田部町東I丁目1
番3号)に昭和59年(西暦1984年)3月29日に
受託番号FERM P−7568として寄託されてい
る。As an example of the transformant obtained by the above method, ESCheriChiaco produced in Example 1 described below is
li DHI/pGEL 1028. The microorganism was transferred to the Fermentation Research Institute (IFo, 532 2-17-85 Jusanhonmachi, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka-ken, Japan) on March 27, 1984, with accession number IP.
This microorganism was deposited as No.
RI, 305 Higashi I-chome, Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Ibaraki, Japan
No. 3) on March 29, 1984 (AD 1984) under accession number FERM P-7568.
このようにして得られた形質転換体の培養に使用される
培地としては、液体培地が適当であり、その中には該形
質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他
が含有せしめられれる。炭素源としては、たとえばグル
コース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素
源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コ
ーンスターチ、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕
、バレインヨ抽出液などの無機または有機物質、無機物
としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリ
ウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また酵母エ
キス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい
。とりわけ塩化カルシウム・2水和物を約0.1%およ
びリン酸二水素ナトリウム・2水和物を約2%含有する
培地が目的物の生産に有利である。また、培養するため
の温度、pH1時間などの条件は、目的物の生産および
その活性が最高となるように適宜に定められるが、一般
に培養温度は約20〜40℃付近、培1pHは微酸性か
ら微アルカリ性で、ことに中性付近が好ましく、培養時
間は約6〜10時間程度である。A liquid medium is suitable as the medium used for culturing the transformant obtained in this way, and it contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances, etc. necessary for the growth of the transformant. Being forced to do something. Carbon sources include, for example, glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose; nitrogen sources include inorganic or organic substances, such as ammonium salts, nitrates, corn starch, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and valine extract. Examples of inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. Further, yeast extract, vitamins, growth promoting factors, etc. may be added. In particular, a medium containing about 0.1% calcium chloride dihydrate and about 2% sodium dihydrogen phosphate dihydrate is advantageous for producing the target product. In addition, the conditions for culturing, such as the temperature and pH for 1 hour, are appropriately determined to maximize the production of the target product and its activity, but in general, the culture temperature is around 20 to 40°C, and the pH of the culture is slightly acidic. It is preferably slightly alkaline, particularly near neutral, and the culture time is about 6 to 10 hours.
本発明の発酵に於て目的とするポリペプチドは通常菌体
内に蓄積されるので、培養物中に蓄積された該ポリペプ
チドを採取するには、まず菌体を遠心分離やろ過によっ
て集め、これより該ポリペプチドを抽出することにより
行なわれる。該ポリペプチドを効率よく抽出させるため
には、たとえば超音波処理、リゾチーム処理、界面活性
剤などの化学薬品による処理などが行なわれる。In the fermentation of the present invention, the target polypeptide is usually accumulated within the bacterial cells, so in order to collect the polypeptide accumulated in the culture, the bacterial cells are first collected by centrifugation or filtration. This is carried out by extracting the polypeptide from the polypeptide. In order to efficiently extract the polypeptide, for example, ultrasonication, lysozyme treatment, treatment with chemicals such as surfactants, etc. are performed.
このようにして抽出された該ポリペプチドの精製は、従
来からの蛋白質あるいはペプトンの精製法、たとえば硫
安塩析、アルコール沈澱、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー、セルロース力ラムグロマトグラフイー、ゲル
ろ適法などの適用により行なわれる。The polypeptide extracted in this way can be purified using conventional protein or peptone purification methods, such as ammonium sulfate salting out, alcohol precipitation, ion exchange column chromatography, cellulose column chromatography, and gel filtration. It is done by application.
後述の実施例1において得られるDNAは、第1図に示
されるヌクレオチドを含有するDNAである。このうち
、第1図においてヌクレオチド配列9−356として示
されるポリヌクレオチドは、第2図においてアミノ酸配
列3−118で表されるポリペプチド、つまりヒトIg
EH鎖の02領域をコードする。The DNA obtained in Example 1 described below is DNA containing the nucleotides shown in FIG. Among these, the polynucleotide shown as nucleotide sequence 9-356 in FIG. 1 is the polypeptide shown as amino acid sequence 3-118 in FIG.
Encodes the 02 region of the EH chain.
また、第1図においてヌクレオチド配列369−767
として示されるポリヌクレオチドは、第2図においてア
ミノ酸配列123−255として表されるポリペプチド
、つまりヒトIL−2をコードする。In addition, in FIG. 1, the nucleotide sequence 369-767
The polynucleotide shown as encodes the polypeptide represented in FIG. 2 as amino acid sequence 123-255, human IL-2.
これらのポリヌクレオチドは、直接発現のために、5′
末端に読み取り枠を一致させるように、ATGを有して
いてもよい。この場合には、N末端にMetを育するポ
リペプチドをコードする。These polynucleotides are 5' for direct expression.
It may have an ATG at the end to match the reading frame. In this case, it encodes a polypeptide that grows Met at its N-terminus.
また、これらのポリヌクレオチドは読み取り枠を一致さ
せるために、任意の介在配列を有していてもよい。第1
図において、この介在配列とはヌクレオチド配列357
−368として示される。この場合には、第2図におい
てアミノ酸配列119−122として表されるポリペプ
チドをコードする。Furthermore, these polynucleotides may have arbitrary intervening sequences to match the reading frames. 1st
In the figure, this intervening sequence is nucleotide sequence 357
-368. In this case, it encodes the polypeptide represented in Figure 2 as amino acid sequence 119-122.
前述したように、ヒトIgEおよびヒトIL−2に関し
ては、それぞれ単独で、それをコードするmRNAが既
に分離同定され、これらの遺伝子の発現も単独で試みら
れているが、本発明のように、2種類あるいは、それ以
上の遺伝子を連結して、2種類あるいは、それ以上の異
なる免疫学的もしくは生物学的活性をもった1つの新た
なポリペプチドを製造するという概念は、今までに無い
ものである。さらに、2種類以上の独立な免疫学的もし
くは生物学的活性を有する1つのポリペプチドは、自然
界にもその例が少なく、本発明は、新規活性蛋白を提供
するという点で、遺伝子工学に追随したペプチド工学の
先駆をなすものである。As mentioned above, with regard to human IgE and human IL-2, the mRNAs encoding them have already been isolated and identified, and attempts have also been made to express these genes independently, but as in the present invention, The concept of linking two or more types of genes to produce one new polypeptide with two or more different immunological or biological activities is unprecedented. It is. Furthermore, there are few examples in nature of a single polypeptide having two or more independent immunological or biological activities, and the present invention follows genetic engineering in providing a novel active protein. This is a pioneer in peptide engineering.
本発明方法により得られた抗体認識部位を含むペプチド
とヒトIL−2のペプチドとを結合したポリペプチドは
、ヒトIL−2抗体を精製する際の試薬として有用であ
る。たとえば、本発明方法により上記のアミノ酸配列で
構成されるI GL−EC22は、ヒトIgEのもつ抗
原性とヒトIL−2のもつ抗原性の両方を有しているた
めに、抗ヒトIgE抗体を用いてrGL−EC22を精
製し、精製したIGL−EC22を用いて抗ヒトIL−
2抗体を作製・精製し、精製した抗ヒトIL−2抗体を
用いて、ヒトIL−2を精製するという一連のヒトIL
−2精製過程の媒体となり得る。この場合、IGL−E
C22が、直接関与するのは抗ヒトIL−2抗体を精製
するときであるが、この様な未知の抗体を作製・精製す
る方法は他に例が無く、抗体精製の新技術として大きく
期待される。したがって、本発明のポリペプチドは、゛
ヒトインターロイキン2抗体を精製する際の媒体あるい
は試薬として使用され得る。A polypeptide obtained by binding a peptide containing an antibody recognition site and a human IL-2 peptide obtained by the method of the present invention is useful as a reagent for purifying human IL-2 antibodies. For example, IGL-EC22 composed of the above amino acid sequence produced by the method of the present invention has both the antigenicity of human IgE and the antigenicity of human IL-2. rGL-EC22 was purified using IGL-EC22, and anti-human IL-EC22 was purified using purified IGL-EC22.
A series of human IL-2 antibodies produced and purified, and purified anti-human IL-2 antibodies used to purify human IL-2.
-2 Can be used as a medium for purification process. In this case, IGL-E
C22 is directly involved in the purification of anti-human IL-2 antibodies, and there is no other method for producing and purifying such unknown antibodies, and this method is highly anticipated as a new technology for antibody purification. Ru. Therefore, the polypeptide of the present invention can be used as a medium or reagent for purifying human interleukin-2 antibodies.
またIGL−EC22はアレルギー反応に関与するヒト
IgEと、T細胞増殖作用を有するヒトIL−2の双方
の免疫学的もしくは生物学的活性を有し、さらに未知の
第三の活性を有することが期待される。In addition, IGL-EC22 has the immunological or biological activities of both human IgE, which is involved in allergic reactions, and human IL-2, which has a T cell proliferation effect, and may also have an unknown third activity. Be expected.
ヒトIL−2抗体精製の具体例としては次の様な方法が
行なわれる。As a specific example of human IL-2 antibody purification, the following method is performed.
まず、抗ヒトIgE抗゛体とアガロースゲルビーズ(B
io−Rad社製AHigel−10など)を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、IGL−
EC22を特異的に結合させる。次に、ヒトIL−2で
免疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清(ヒト
IL−2抗体が含ま直いる。)を、上述のIGL−BC
22吸着抗ヒトIgE抗体カラムと反応させる。これを
適当な緩衝液で溶出すると、I GL−EC22とヒト
IL−2抗体の混合液が得られる。この混合液をDEA
Eセルロースカラム(Whatman社製Ce1lul
ose52など)の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃度で
溶出すればヒト!L−2抗体が精製される。First, anti-human IgE antibody and agarose gel beads (B
An antibody column bound with AHigel-10 (manufactured by io-Rad, etc.) is prepared. This antibody column was coated with IGL-
specifically binds EC22. Next, ascites of a rat immunized with human IL-2 or serum of a rabbit (recontaining human IL-2 antibodies) was added to the above-mentioned IGL-BC.
22-adsorbed anti-human IgE antibody column. When this is eluted with an appropriate buffer, a mixture of IGL-EC22 and human IL-2 antibody is obtained. Add this mixture to DEA
E-cellulose column (Whatman Celul
If it is eluted with a salt concentration that adsorbs proteins other than antibodies such as ose52), it is human! L-2 antibody is purified.
抗18E抗体はアレルギー疾患の診断に必要欠くべから
ざる物質であり、需要も非常に多いが、その生産には大
量の純化ヒトIgEを非常とする。Anti-18E antibodies are indispensable substances for the diagnosis of allergic diseases and are in great demand, but their production requires large amounts of purified human IgE.
そこで本発明のポリペプチドであるIGL−EC22を
用いて抗ヒトIgE抗体を精製することができる。した
がって、本発明のポリペプチドであるIGL−EC22
は、抗ヒトIgE抗体を精製する際の媒体あるいは試薬
として使用され得る。Therefore, anti-human IgE antibodies can be purified using IGL-EC22, which is the polypeptide of the present invention. Therefore, the polypeptide of the present invention, IGL-EC22
can be used as a medium or reagent when purifying anti-human IgE antibodies.
抗ヒトIgE抗体精製の具体例としては次の様な方法が
行なわれる。As a specific example of anti-human IgE antibody purification, the following method is performed.
まず、抗ヒトl−2抗体とアガロースゲルビーズ(Bi
o−Rad社製Afftgel−10など)を結合させ
た抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、rGL−
EC22を特異的に結合させる。次に、ヒトIgEで免
疫されたラットの腹水、あるいはウサギの血清(抗ヒト
IgE抗体が含まれている。)を、上述のIGL−EC
22吸着抗ヒトI L−2抗体カラムと反応させる。こ
れを適当な緩衝液で溶出すると、IGL−EC22と抗
ヒトIgE抗体の混合液が得られる。この混合液をDE
AEセルロースカラム(Whatman社製Cel 1
ulose52など)の抗体以外の蛋白を吸着する塩濃
度で溶出すれば抗ヒト■gE抗体が精製される。First, anti-human l-2 antibody and agarose gel beads (Bi
An antibody column bound with Afftgel-10 (manufactured by o-Rad, etc.) is prepared. This antibody column was coated with rGL-
specifically binds EC22. Next, ascites of a rat immunized with human IgE or rabbit serum (containing anti-human IgE antibodies) was added to the above-mentioned IGL-EC.
22-adsorbed anti-human IL-2 antibody column. When this is eluted with an appropriate buffer, a mixture of IGL-EC22 and anti-human IgE antibody is obtained. This mixture is DE
AE cellulose column (Whatman Cel 1
The anti-human gE antibody can be purified by elution at a salt concentration that adsorbs proteins other than antibodies such as ulose52.
なお、本明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Co
mm1ssion on Biochemical
Nomenclature による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を第
1表に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体があり
うる場合は、特に明示しなければL一体を示すものとす
る。In this specification and drawings, when bases, amino acids, etc. are indicated by abbreviations, IUPAC-IUB Co
mm1ssion on Biochemical
These are based on nomenclature abbreviations or common abbreviations in the field, examples of which are listed in Table 1. Furthermore, if an amino acid can have optical isomers, unless otherwise specified, the L-isomer is assumed to be indicated.
第1表
DNA デオキシリボ核酸
cDNA 相補的デオキシリボ核酸RNA
リボ核酸
mRNA 伝令リボ核酸
A デオキシアデニル酸
T チミジル酸
G デオキシグアニル酸
Cデオキシシチジル酸
U ウリジル酸
dATP デオキシアデノシン三リン酸dTTP
チミジン三リン酸
dGTP デオキシグアノシン三リン酸dCTP
デオキシシチジン三リン酸ATP アデ
ノシン三リン酸
EDTA エチレンジアミン四酢酸SDS
ドデシル硫酸ナトリウムcty グリシン
Ala アラニン
Val バリン
Leu ロイシン
11e イソロイシン
Ser セリン
Thr スレオニン
Cys システィン
Met メチオニン
Glu グルタミン酸
Asp アスパラギン酸
Lys リジン
Arg アルギニン
His ヒスチジン
Phe フェニルアラニン
Tyr チロシン
Trp )リプトファン
Pro プロリン
Asn アスパラギン
Gln グルタミン
bp 塩基対
寒嵐鯉
以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。Table 1 DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary deoxyribonucleic acid RNA
Ribonucleic acid mRNA Messenger ribonucleic acid A Deoxyadenylic acid T Thymidylic acid G Deoxyguanylic acid C Deoxycytidylic acid U Uridylic acid dATP Deoxyadenosine triphosphate dTTP
Thymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dCTP
Deoxycytidine triphosphate ATP Adenosine triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid SDS
Sodium dodecyl sulfate cty Glycine Ala Alanine Val Valine Leu Leucine 11e Isoleucine Ser Serine Thr Threonine Cys Cystine Met Methionine Glu Glutamate Asp Aspartate Lys Lysine Arg Arginine His Histidine Phe Phenylalanine Tyr Tyrosine Trp ) Liptophan Pro Proline As n asparagine Gln glutamine bp base pair cold Arashi carp The present invention will be explained in more detail below with reference to reference examples and examples.
参考例1
ヒトIgEH鎖C2領域のポリペプチドを発現するプラ
スミドpcE’rtrp 818−Cの構築二日本特
開昭59−44399号公報に記載の方法で構築された
プラスミドpG ET trp 302のDNA1μ
gをC1aIで切断し、Stヌクレアーゼ消化を行って
両端の粘着末端を削った。このDNAをフェノール抽出
、エタノール沈澱により精製したのち、5′末端をリン
酸化したEcoRIリンカ−P(CTAGAATTCT
AG)50ngをT4DNAリガーゼを用いて結合し、
EcoRIリンカ−の重複連結したプラスミドを除くた
め、結合物をEcoRIで切断した。このDNAをT4
DNAリガーゼを用いて再結合して大腸菌294を形質
転換し、転換株よりpGETtrp 302−aを得
た。Reference Example 1 Construction of plasmid pcE'rtrp 818-C expressing polypeptide of human IgE H chain C2 region 2 1μ DNA of plasmid pG ET trp 302 constructed by the method described in Japanese Patent Application Publication No. 59-44399
g was cut with C1aI and digested with St nuclease to remove sticky ends at both ends. After this DNA was purified by phenol extraction and ethanol precipitation, EcoRI linker-P (CTAGAATTCT
AG) 50 ng were ligated using T4 DNA ligase,
The conjugate was cut with EcoRI to remove the plasmid with overlapping EcoRI linkers. This DNA is T4
E. coli 294 was transformed by religation using DNA ligase, and pGETtrp 302-a was obtained from the transformed strain.
pGETtrp302−aをEcoRIとPstlで消
化して生ずる1、2 kb DNA断片を、1.2%ア
ガロースゲル電気泳動により分画回収した。このDNA
断片50 ngを、EcoRI 、Pst I消化した
発現用ベクターptrp781[Nucleic A
c1ds Re5earch 11゜p、 3077
−3085(1983)1200ngにT4DNAリガ
ーゼを用いて組み込み、大腸菌294を形質転換し、ア
ンピノリン感受性の転換株よりpG E T trp
302−すを得た。pGETtrp302−bを制限酵
素Xbalで切断した後、生じたDNAの粘着末端をS
lヌクレアーゼ消化を行って平滑末端とした。 このD
NAを、フェノール抽出、エタノール沈澱により精製し
たのち、T4DNAリガーゼを用いて再結合し、大腸菌
294を形質転換した。転換株よりpGETtrり 3
02−dを得た。A 1 to 2 kb DNA fragment generated by digesting pGETtrp302-a with EcoRI and Pstl was fractionated and collected by 1.2% agarose gel electrophoresis. this DNA
50 ng of the fragment was digested with EcoRI and PstI into the expression vector ptrp781 [Nucleic A
c1ds Research 11゜p, 3077
-3085 (1983) was integrated into 1200 ng using T4 DNA ligase, transformed into Escherichia coli 294, and transformed into pG E T trp from an ampinoline-sensitive transformed strain.
302-s was obtained. After cutting pGETtrp302-b with the restriction enzyme Xbal, the sticky ends of the resulting DNA were
l nuclease digestion was performed to produce blunt ends. This D
After the NA was purified by phenol extraction and ethanol precipitation, it was religated using T4 DNA ligase, and E. coli 294 was transformed. pGETtr from convertible stock 3
02-d was obtained.
1)G E T trp 302−dを制限酵素Pv
uI[部位で切断した後、制限酵素Ava1部位で切断
し、Ava1部位で切断されたDNA鎖を分取した。こ
のDNA鎖の両端を81ヌクレアーゼで削って平滑とし
た後、EcoRIリンカ−1)(CTAGAATTCT
AG)を結合し、EcoRI消化後再結合させて、発現
プラスミドpGETtrp 818−cを構築した(
第3図参照)。1) G E T trp 302-d with restriction enzyme Pv
After cutting at the uI site, the DNA was cut at the restriction enzyme Ava1 site, and the DNA strand cut at the Ava1 site was fractionated. After smoothing both ends of this DNA strand with 81 nuclease, EcoRI linker-1) (CTAGAATTCT
AG) and religated after EcoRI digestion to construct the expression plasmid pGETtrp 818-c (
(See Figure 3).
pGETtrl) 818−cは、C2領域の121
アミノ酸、およびC末端に、リンカ−の結合により生じ
たL eu、 G lu、 P heを有する分子量1
3,000のペプチドをコードしている。このプラスミ
ドは、N末端にIgEH鎖に由来しない、アダプターに
コードされたM’et 、 L euを有している。pGETtrl) 818-c is 121 in the C2 region
Molecular weight 1 having amino acids and L eu, G lu, and P he generated by bonding a linker at the C-terminus
It encodes 3,000 peptides. This plasmid has M'et and Leu encoded by an adapter that is not derived from the IgE heavy chain at the N-terminus.
参考例2
ヒトIL−2のペプチドを発現するプラスミpTFlの
構築:
(1)(i)ヒトIL−2をコードするmRNAの分離
ヒト末梢血より調製したリンパ球を12−0−テトラデ
カノイルホルボール−13−アセテート(T P AX
15ng/ml)とコンカナバリンA(40gg/ml
)を含むRPMI 1640 培地(10%の牛胎
児血清を含む)中、37℃で培養し、IL−2を誘導さ
せた。24時間後、この誘導したI XIO”個のヒト
リンパ球を5Mグアニジンチオシアネート、5%メルカ
プトエタノール、50 mM Tris−HCIpH
7,6,10mM EDTA溶液中でテア0ンホモゲ
ナイザーによって破壊変性した後N−ラウロイルザルコ
シン酸ナトリウムを4%になるように加え、均質化した
混合物を5.7M塩化セシウム溶液(5,7M塩化セシ
ウム、0.1M EDTA)6ml上に重層し、ベッ
クマンSW2gのローターを用いて15℃テ24QOO
rpm 48時間遠心処理を行い、RNA沈澱を得た
。このRNA沈澱を0.25%N−ラウロイルザルコシ
ン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱さ
せ、10mgのRNAを得た。このRNAを高塩溶液[
0,5M NaC1,10mM Tris・ HCl
pH7,6,1mM EDTA、0.3% S
DSコ中でオリゴ(dT)セルロースカラムに吸着させ
、ポリ(A)を含むmRNAを低塩溶液(lQmM
T ris−HCl pH7,6,1mM EDTA
、0.3%5DS)で溶出させることにより、ポリ(A
)を含むmRNA 300dgを分取した。このmRN
Aを更にエタノールで沈澱させ、0.2mlの溶液(l
omMTris−HCI pH7,6,2mM E
DTA、04%5DS)に溶かし、65℃で2分間処理
して10〜35%シヨ糖密度勾配遠心処理(ベックマン
5W28のローターを用いて20℃、25000rpm
で21時間遠心分離)することにより分画して22分画
を得た。この各分画につきRNAの一部ずつを、アフリ
カッメガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白中の
IL−2活性を測定し、分画11〜15(沈降逆数8S
−15s)にIL−2の活性を検出した。この分画のI
L−2mRNAは約25μgであった。Reference Example 2 Construction of plasmid pTFl expressing human IL-2 peptide: (1) (i) Isolation of mRNA encoding human IL-2 Lymphocytes prepared from human peripheral blood were incubated with 12-0-tetradecanoylform. Ball-13-acetate (T P AX
15ng/ml) and concanavalin A (40gg/ml
) in RPMI 1640 medium (containing 10% fetal bovine serum) at 37°C to induce IL-2. After 24 hours, the induced IXIO'' human lymphocytes were treated with 5M guanidine thiocyanate, 5% mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCI pH.
After disrupting and denaturing the mixture in 7, 6, and 10 mM EDTA solution using a tear-on homogenizer, sodium N-lauroyl sarcosinate was added to give a concentration of 4%, and the homogenized mixture was dissolved in 5.7 M cesium chloride solution (5.7 M chloride). Cesium, 0.1M EDTA) and incubate at 15°C at 24QOO using a Beckman SW 2g rotor.
Centrifugation was performed at rpm for 48 hours to obtain RNA precipitate. This RNA precipitate was dissolved in a 0.25% sodium N-lauroyl sarcosinate solution, and then precipitated with ethanol to obtain 10 mg of RNA. This RNA was added to a high salt solution [
0.5M NaCl, 10mM Tris・HCl
pH7, 6, 1mM EDTA, 0.3% S
The poly(A)-containing mRNA was adsorbed onto an oligo(dT) cellulose column in a DS column, and the mRNA containing poly(A) was dissolved in a low salt solution (lQmM
Tris-HCl pH7,6,1mM EDTA
, 0.3% 5DS).
) was collected. This mRN
A was further precipitated with ethanol and 0.2 ml of solution (l
omMTris-HCI pH7,6,2mM E
DTA, 04% 5DS), treated at 65°C for 2 minutes, and centrifuged with 10-35% sucrose density gradient (20°C, 25,000 rpm using a Beckman 5W28 rotor).
(centrifugation for 21 hours) to obtain 22 fractions. A portion of the RNA from each fraction was injected into African frog oocytes, and the IL-2 activity in the synthesized protein was measured.
-15s), IL-2 activity was detected. I of this fraction
L-2 mRNA was approximately 25 μg.
(11)単鎖DNAの合成:
上記で得たmRNAおよび逆転写酵素を用い、100d
の反応液(5μgのmRNA、50ggオリゴ(dT)
、100ユニツトの逆転写酵素、1mMずつのdATP
、dCTP、dGTPおよびdT T P 、 8 m
MMgCl、、50mM KCI、10mMジチオス
レイトール、50mM Tris−HCI pH8
,3)中で42°C,1時間インキュベートした後に、
フェノールで除蛋白し、0.INのNaOHで70℃、
20分処理してRNAを分解除去した。(11) Synthesis of single-stranded DNA: Using the mRNA and reverse transcriptase obtained above, 100 d
reaction solution (5 μg mRNA, 50 gg oligo (dT)
, 100 units of reverse transcriptase, 1mM each of dATP
, dCTP, dGTP and dT T P , 8 m
MMgCl, 50mM KCI, 10mM dithiothreitol, 50mM Tris-HCI pH 8
, 3) after incubation at 42°C for 1 hour.
Protein was removed with phenol and 0. IN NaOH at 70°C,
RNA was degraded and removed by treatment for 20 minutes.
(iii)二重鎖DNAの合成:
ここで合成された単鎖の相補DNAを50μ2の反応液
(n+RNAとオリゴdTを含まない以外は上記と同じ
反応液)中で42℃2時間反応させることにより二重鎖
DNAを合成した。(iii) Synthesis of double-stranded DNA: The single-stranded complementary DNA synthesized here is reacted for 2 hours at 42°C in a 50μ2 reaction solution (the same reaction solution as above except that it does not contain n+RNA and oligo-dT). Double-stranded DNA was synthesized by
(iv)dCテイルの付加:
この二重1IDNAJこヌクレアーゼStを50μ2の
反応液(二重鎖D’NAO,1M酢酸ナトリウムpH4
,5,0,25M NaC1,1,5mM Zn5
O,,60ユニツトの81ヌクレアーゼ)中で室温30
分間作用させ、フェノールで除蛋白し、エタノールでD
NAを沈澱させた後、これにターミナルトランスフェラ
ーゼを50μρの反応液(二重鎖DNA、0.14Mカ
コジル酸カリウム、 0.3M Tris(塩基)p
H7,6,2mMジチオスレイトール、IIIIM C
oC1t。(iv) Addition of dC tail: Add this duplex 1I DNAJ nuclease St to 50μ2 reaction solution (duplex D'NAO, 1M sodium acetate pH 4
,5,0,25M NaCl,1,5mM Zn5
O,,60 units of 81 nuclease) at room temperature for 30 minutes.
Leave to react for minutes, remove protein with phenol, and remove protein with ethanol.
After precipitating the NA, add terminal transferase to the reaction mixture (double-stranded DNA, 0.14M potassium cacodylate, 0.3M Tris (base)).
H7,6,2mM dithiothreitol, IIIM C
oClt.
0.15 mM dCTP、30ユ:−ットターミナル
トランス フェラーゼ)中で3分間37℃で作用させ二
重lDNAの3′両端に約15個のデオキシシチジン鎖
を伸長させた。これらの1連の反応で約300ngのデ
オキシシチジン鎖をもった二重鎖DNAを得た。Approximately 15 deoxycytidine chains were extended at both 3' ends of the double IDNA by treatment in 0.15 mM dCTP, 30 units (terminal transferase) for 3 minutes at 37°C. A double-stranded DNA having approximately 300 ng of deoxycytidine chains was obtained through one series of these reactions.
(V)大腸菌プラスミドの開裂ならびにdGテイルの付
加ニ
一方、10Mgの大腸菌プラスミドpB R322D
NAに制限酵素Pstlを50Mgの反応液(10Mg
l) NA、50mM NaC1,6mM Tris−
HCI−pH7,4゜6mM MgCIt、6mM2−
メルカプトエタノール。(V) Cleavage of E. coli plasmid and addition of dG tail while 10 Mg of E. coli plasmid pB R322D
Reaction solution containing 50Mg of restriction enzyme Pstl in NA (10Mg
l) NA, 50mM NaCl, 6mM Tris-
HCI-pH7, 4°6mM MgCIt, 6mM2-
Mercaptoethanol.
100μg/ml牛血清アルブミン、20ユニツトのP
stI)中で3時間37℃で作用させて1)BR322
DNA中に1ケ所存在するPstl認識部位を切断し、
フェノールで除蛋白した後、ターミナルトランスフェラ
ーゼを50μ2の反応液(DNA10Mg、O,14M
カコジル酸カリ、0.3M Tris・塩基pH7,6
,2mMジチオスレイトール、1mM CaC1,,0
,15mM GTP、:(0ユニツトターミナルトラン
スフエラーゼ)中で3分間37℃で作用させ上記プラス
ミドpBR322DNAの両端に約17個のデオキシグ
アニン鎖を延長させた。100 μg/ml bovine serum albumin, 20 units of P
1) BR322 by reacting in stI) for 3 hours at 37°C.
Cuts the Pstl recognition site that exists at one location in the DNA,
After deproteinizing with phenol, terminal transferase was added to 50μ2 reaction solution (DNA10Mg, O, 14M
Potassium cacodylate, 0.3M Tris/base pH 7.6
, 2mM dithiothreitol, 1mM CaC1,,0
, 15mM GTP: (0 unit terminal transferase) for 3 minutes at 37°C to extend about 17 deoxyguanine chains at both ends of the plasmid pBR322 DNA.
(vi )cD N Aの会合ならびに大腸菌の形質転
換:このようにして得られた合成二重鎖DNA 0.1
8gと上記プラスミドpBR322,0,5μgを0.
IMNaCl、50mM Tris−HCI pH
’/、6,1mMEDTAよりなる溶液中で65℃2分
間加熱しその後徐冷して会合さQEneaらの方法[J
、Mol。(vi) Association of cDNA and transformation of E. coli: Synthetic double-stranded DNA thus obtained 0.1
8g and 0.5μg of the above plasmid pBR322.
IMNaCl, 50mM Tris-HCI pH
'/, 6,1mM EDTA by heating at 65°C for 2 minutes and then slowly cooling to assemble using the method of QEnea et al. [J
, Mol.
Biol、 、熟、495(1975)]に従って大腸
菌MM294を形質転換させた。E. coli MM294 was transformed according to the method of E. Biol., Juku, 495 (1975)].
(vi)CDNA含有プラスミドの単離:このようにし
て約20,000個のテトラサイタリン耐性株が単離さ
れ、これら各々のDNAをニトロセルロースフィルター
の上に固定した。次いでTaniguchiらの報告[
Nature、 302.305 (1983)]した
IL−2のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸NO,7
4〜78(L ys” −His −L eu −G
l++ −Cys)およびアミノ酸NO,122〜12
6 (Thr” −Phe −Met −Cys −G
Iu)に対応する塩基配列(” A A ACAT
CTT CAG TGT”および”ACA TTC
ATG TGT GAA” )をトリエステル法[C
r5a、 R,らProc、 Natl。(vi) Isolation of CDNA-containing plasmids: Approximately 20,000 tetracytalin-resistant strains were thus isolated and the DNA of each of these was immobilized on a nitrocellulose filter. Next, Taniguchi et al.'s report [
Nature, 302.305 (1983)] Based on the amino acid sequence of IL-2, amino acid NO.
4~78(Lys"-His-Leu-G
l++ -Cys) and amino acids NO, 122-12
6 (Thr"-Phe-Met-Cys-G
Base sequence corresponding to (Iu)
CTT CAG TGT” and “ACA TTC
ATG TGT GAA”) using the triester method [C
r5a, R, et al. Proc, Natl.
Acad、 Sci、 USA、75.5765 (1
97111)]により化学合成した。Acad, Sci, USA, 75.5765 (1
97111)].
このオリゴヌクレオチドに対してT4ポリヌクレオチド
カイネースを用いて50μρの反応液(オリゴヌクレオ
チド0.20Mg、50mM Tris −He1p
H8,0,10mM MgC1t、 lOn+Mメル
カプトエタノール、50μCiγ−3″PATP、3ユ
ニツトT4ポリヌクレオチドカイネース)中で1時間3
7℃で反応させ、5′末端を32Pで標識した。この標
識されたオリゴヌクレオチドをプローブとしてL aw
nらの方法[Nucleic Ac1ds Res
、 、9゜6103(1981)]に従って上記のニト
ロセルロースフィルター上に固定したDNAに会合させ
、オートラジオグラフィーによって上記2種類のオリゴ
ヌクレオチドプローブに反応する菌株を4個単離した。This oligonucleotide was treated with a 50 μρ reaction solution (0.20 Mg oligonucleotide, 50 mM Tris-He1p) using T4 polynucleotide kinase.
H8,0,10mM MgClt, 1On+M mercaptoethanol, 50μCi γ-3″PATP, 3 units T4 polynucleotide kinase) for 1 hour 3
The reaction was carried out at 7°C, and the 5' end was labeled with 32P. Using this labeled oligonucleotide as a probe, L aw
[Nucleic Ac1ds Res
, 9°6103 (1981)], and four bacterial strains that reacted with the above two types of oligonucleotide probes were isolated by autoradiography.
これらの菌株の各々の菌体プラスミドDNAをアルカリ
法[Btrnboim H,C,& Doiy、
J。The bacterial plasmid DNA of each of these strains was extracted using the alkaline method [Btrnboim H, C, & Doiy,
J.
NucLeic Ac1ds Res、 、7.1
51a (1979)]によって単離した。次にプラス
ミドDNAの挿入部を制限酵素Pstlにより切り出し
、分離したプラスミドのうちでその挿入部の長さの最も
長い断片を含むものをえらび、このプラスミドをpI
LOT 135−8と名づけた。NucLeic Ac1ds Res, , 7.1
51a (1979)]. Next, the inserted part of the plasmid DNA was cut out using the restriction enzyme Pstl, and the one containing the longest fragment of the inserted part was selected among the separated plasmids, and this plasmid was transformed into pI.
It was named LOT 135-8.
(2)プラスミドI)TFIの構築:
前記(1)で得られたプラスミドpILOT135−8
を制限酵素Hg1AIで切断し、1294bpのDNA
断片を得た。このDNA断片をT4DNAポリメラーゼ
で処理して平滑末端とした後EcoRIリンカ−p(T
GCCATGAATTCATGGCA)をT4DNAリ
ガーゼを用いて結合し、EcoRIリンカ−の重複連結
したプラスミドを除く為、結合物をEcoRIで消化し
、さらにこの断片を制限酵素pstrで消化して、ヒト
IL−2遺伝子の読み取り枠にそろえて翻訳開始コドン
“ATG”を付加したDNA断片を作製した。(2) Plasmid I) Construction of TFI: Plasmid pILOT135-8 obtained in (1) above
was cut with the restriction enzyme Hg1AI to create a 1294 bp DNA.
Got a piece. This DNA fragment was treated with T4 DNA polymerase to make blunt ends, and then EcoRI linker-p (T
GCCATGAATTCATGGCA) were ligated using T4 DNA ligase, the ligated product was digested with EcoRI to remove the plasmid with overlapping EcoRI linkers, and this fragment was further digested with the restriction enzyme pstr to read the human IL-2 gene. A DNA fragment was prepared in which a translation initiation codon "ATG" was added in alignment with the frame.
このDNA断片を制限酵素EcoRIとPstIで消化
した発現用プラスミドptrp 781 [Nucle
fcAcids Re5earch 旦、 9.3
077−3085 (1983)]にT4DNAリガ〜
ゼにより結合させた。この反応によりtrpプロモータ
ーの下流に翻訳開始コドンを有し。読み取り枠を一致さ
せてヒト!L−2発現プラスミドpTFlを構築した(
第4図参照)。This DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and PstI to create an expression plasmid ptrp781 [Nucle
fcAcids Re5earch, 9.3
077-3085 (1983)] T4DNA Riga~
conjugated by enzyme. This reaction results in a translation initiation codon downstream of the trp promoter. Match the reading frames to humans! L-2 expression plasmid pTFl was constructed (
(See Figure 4).
このプラスミドを用いて大腸菌DHIを形質転換さ仕る
ことにより、求めるプラスミドpTFlを含む菌株を得
た。By transforming Escherichia coli DHI using this plasmid, a strain containing the desired plasmid pTFl was obtained.
実施例!
IGL−EC22のポリペプチド発現プラスミドpG
E L 102gの構築および形質転換体の製造ニブラ
スミドpGET trp 818−Cを制限酵素C1a
lおよびEcoRIで切断して約3KbpのDNA断片
を得た。また、プラスミドpTF1を制限酵素EcoR
IおよびPst[で切断して約5QQbpのDNA断片
を得た。これらの2つのDNA断片を74DNAリガー
ゼで結合させた。この反応によりtrpプロモーターの
下流に翻訳開始コドンを有し、読み取り枠を一致させて
IGL−EC22発現プ発現用ラスミドE L 102
gを構築した(第5図参照)。Example! IGL-EC22 polypeptide expression plasmid pG
Construction of E L 102g and production of transformants Niblasmid pGET trp 818-C was digested with restriction enzyme C1a.
A DNA fragment of about 3 Kbp was obtained by cutting with I and EcoRI. In addition, plasmid pTF1 was transformed with restriction enzyme EcoR.
A DNA fragment of about 5QQbp was obtained by cutting with I and Pst[. These two DNA fragments were ligated using 74 DNA ligase. As a result of this reaction, a translation start codon is present downstream of the trp promoter, the reading frames are matched, and the lasmid E L 102 for expressing IGL-EC22 is produced.
g (see Figure 5).
このプラスミドを用いて大腸菌DHIを形質転換させ、
プラスミドpG E L 102gを含む形質転換体E
、 coli DHI/pGEL1028(I FO
14332゜FERM P−7568)を得た。This plasmid was used to transform E. coli DHI,
Transformant E containing 102g of plasmid pGEL
, coli DHI/pGEL1028 (IFO
14332°FERM P-7568) was obtained.
実施例2
(1) I GL−EC22を含む菌体抽出液の調製
:IGL−EC22発現プラスミドpGEL 1028
を含む大腸菌E、 colt DH1/pGEL 10
28(IFo 14332. FERM P−75
68)を20m1のl°%グルコース、0.4%カザミ
ノ酸を含むM9培地で37℃4時間培養した後、インド
ールアクリル酸を30μg/口lに加え、さらに37℃
3時間培養した。Example 2 (1) Preparation of bacterial cell extract containing IGL-EC22: IGL-EC22 expression plasmid pGEL 1028
E. coli containing colt DH1/pGEL 10
28 (IFo 14332. FERM P-75
68) was cultured in 20 ml of M9 medium containing 1% glucose and 0.4% casamino acids at 37°C for 4 hours, then indole acrylic acid was added at 30 μg/ml, and the culture was further cultured at 37°C.
It was cultured for 3 hours.
菌体を集め、食塩水で洗ったのち、0.5mlの溶菌液
(lomM Tris−HCI、 pH8,0,1
0a+MEDTA 0.2M NaC1,1mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド、0.02%トリト
ンXl00゜0.1mg/mlリゾチーム)に懸濁し、
0℃にて45分。After collecting the bacterial cells and washing with saline, add 0.5 ml of bacteriolytic solution (lomM Tris-HCI, pH 8,0,1
Suspended in 0a+MEDTA 0.2M NaCl, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.02% Triton Xl00°0.1mg/ml lysozyme),
45 minutes at 0°C.
37℃にて2分放置して溶菌させた。これをさらに軽<
(30秒)超音波処理を行って、溶出した菌体のDNA
を切断した後、4℃で1500Orpm(サーバル5S
340−ター、デュポン社製)、30分間の遠心分離操
作によって上澄み液を得た。この上澄み液を菌体抽出液
とした。The cells were allowed to stand at 37°C for 2 minutes to lyse the bacteria. This is even lighter
(30 seconds) Perform ultrasonic treatment and elute the DNA of the bacterial cells.
After cutting, 1500 Orpm (Serval 5S
A supernatant liquid was obtained by centrifugation for 30 minutes. This supernatant liquid was used as a bacterial cell extract.
(2)菌体抽出液のIgE活性の測定:菌体抽出液のI
gE活性をIgB測定キット(IgEテスト・ジオツギ
、塩野義製薬製1日本)を用いたRu5T法[Radi
o immuno 5orbenttest、 I
IIlmunology、 14.265 (196
8)]により定量した。(2) Measurement of IgE activity of bacterial cell extract: I of bacterial cell extract
The gE activity was measured using the Ru5T method [Radi
o immuno5orbenttest, I
IIlmunology, 14.265 (196
8)].
IGL−EC22のIgE活性は42XIO’単位/Q
培養液であった。IgE activity of IGL-EC22 is 42XIO' units/Q
It was a culture solution.
(3)菌体抽出液の!L−2活性:
ヒトIL−2活性の測定は、マウスのTCGF依存性細
胞株NKC3[日本免疫学会総会記録、第11巻277
頁(1981年)コを用いて行った。即ち、まず2段階
希釈により希釈された種々の濃度のサンプル50μ党を
とり、平底マイクロプレート(ファルコン社製)に入れ
た。次いで3X10’のNKC3細胞を含む、10%牛
脂児血清(10%FC9)含有RPMI−1640液5
0μgを加え、炭酸ガスふ卵器内で37℃、20時間培
養した。さらに3H−チミジン1μCiを加えて、4時
間培養したのち、セルハーベスタ−(和研薬工業社製1
日本)を用いて、細胞をガラスフィルターにトラップし
、洗浄、ろ過。(3) Bacterial cell extract! L-2 activity: Human IL-2 activity was measured using the mouse TCGF-dependent cell line NKC3 [Records of the General Meeting of the Japanese Society of Immunology, Vol. 11, 277.
Page (1981). That is, first, 50μ samples of various concentrations diluted by two-step dilution were taken and placed in a flat-bottomed microplate (manufactured by Falcon). Then RPMI-1640 solution 5 containing 10% tallow serum (10% FC9) containing 3×10' NKC3 cells.
0 μg was added and cultured at 37° C. for 20 hours in a carbon dioxide incubator. Furthermore, 1 μCi of 3H-thymidine was added and cultured for 4 hours.
(Japan) to trap cells in a glass filter, wash, and filter.
乾燥の後、シンチレーションカウンターにより放射活性
を測定した。サンプル中のIGL−EC22のIL−2
活性は、16X 10’単位/Q培養液であった。After drying, radioactivity was measured using a scintillation counter. IL-2 of IGL-EC22 in the sample
Activity was 16X 10' units/Q culture.
なお、上記活性は、日本特開昭58−116498号公
報に記載された算出方法を基準として測定された。The above activity was measured based on the calculation method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 116498/1983.
(4) IGL−EC22の精製:
日本特開昭58−96028号公報に記載されている方
°法により抗ヒトIgEモノクローナル抗体を水不溶性
担体アフィゲル10(B io −Rad社製)に結合
させた。抗ヒトIgEモノクローナル抗体−アフィゲル
10カラム1mlに前項(3)で得られたE。(4) Purification of IGL-EC22: Anti-human IgE monoclonal antibody was bound to a water-insoluble carrier Affigel 10 (manufactured by Bio-Rad) by the method described in Japanese Patent Application Publication No. 58-96028. . Add E obtained in the previous section (3) to 1 ml of anti-human IgE monoclonal antibody-Affigel 10 column.
coli D H1/pG E L 102gを含む菌
体抽出液5mlをかけ、20%デキストロースを含むP
B S (20mMリン酸緩衝液、pHa、g、 0
.15M NaC1)50mlを用いてカラムを洗浄
したのち、0.2M酢酸、0.15MNaC1溶液5m
lを用いて、カラムに吸着したIGL−EC22をカラ
ムから溶出し、溶出液をただちに中和したのち、PBS
H!に対して5℃で24時間透析した。この操作によ
り純度80%以上のIGL−EC22のポリペプチドが
約50%の回収率で得られた。Pour 5 ml of bacterial cell extract containing 102 g of E. coli D H1/pG E L into P containing 20% dextrose.
B S (20mM phosphate buffer, pHa, g, 0
.. After washing the column with 50 ml of 15M NaCl), add 5 ml of 0.2M acetic acid and 0.15M NaCl solution.
IGL-EC22 adsorbed on the column was eluted from the column using l, and the eluate was immediately neutralized, followed by PBS.
H! Dialysis was performed at 5° C. for 24 hours. Through this operation, IGL-EC22 polypeptide with a purity of 80% or more was obtained with a recovery rate of about 50%.
聚吸盆然星
本発明のポリペプチドを用いると、抗ヒトIL−2抗体
を効率良く精製することができる。By using the polypeptide of the present invention, anti-human IL-2 antibodies can be efficiently purified.
第1図はヒトIgEのペプチドをコードする構築1図
−そ
造遺伝子を有するDNAおよびヒトIL−2のペプチド
をコードする構造遺伝子を有するDNAを連結してなる
DNAのヌクレオチド配列を、第2図は第1図に示され
るヌクレオチド配列に対するアミノ酸配列を、第3図は
参考例1の構築図を、第4図は参考例2(2)の構築図
をそれぞれ示す。
第5図は実施例1の構築図を示し、=n工uL部はヒト
IL−2のペプチドをコードする部分を示す。
し
第2図−その
)iE’I” LEU ASP ASN LY
S THRPHE 5EEPF?OPROTHRV
AL LYS 工LE LEU GLNH工S
PHE PROPF?OTHR工LE GLN
LE[JTHRPROGLY THR工LE
ASN 工LE THFIMET ASP V
AL ASP LEU SERTHRALALE
U ALA SE’RTHRGLN SERGL
U LEULEU SERASP ARG T
HRTYRTHRCYSTHRPHE GLU A
SP SERTHRLYS LYSPHE MET
ALA PROTHRSER5ETI 5ERL
EU GLU HIS LEU LEU L
EU ASP LEUVAL CYS SERAR
G ASP PHE THR3ERSERCYS AS
P GLY GLY GLYLEU CYS LEU
VAL SERGLY TYRTRP LEU GLU
ASP GLY GLN VALSERTHRTHR
GLN GLU GLY GLUTHRLEU SEF
? GLN LYS HIS TRPGLN VA
L THRTYRGLN GLY H工5CYS AL
A ASP SERASN LEU GLUTHRL
YS LYS THRGLN LED GLNGLN
MET 工LE LEU ASN GLY 工LEつ
づきあす
第2図−その2
ASN ASN TYRLYS ASN PR
OLYS LEU THRPHE TYRMET
PROLYS LYS ALA THRGLUL
EU GLU GLU GLU LEU L
YS PROLEU GLUGLN SERLYS
ASN PHE HIS LEU ARG
PRO工LE ASN VAL 工LE
VAL LEU GLU LEU LYSi’iE
T CYS GLU TYRALA ASP
GLU THRALAASN AF?G TR
P 工LE THRPHE CYS GLN
5ERARG MET LEU THRPHE L
YSLF:U LYS HIS LEU GLN CY
SGLU VAL LEU ASN LEU ALA
ARG ASP LEU 工LE SERASNGLY
SERGLU THRTH)I PHETHR工L
E VAL GLU PHE LEU工LE 工LE
SERTHRLEU THR匡 1Figure 1 is a diagram of a construction encoding a peptide of human IgE.
- The nucleotide sequence of the DNA obtained by linking the DNA with the structural gene and the DNA with the structural gene encoding the human IL-2 peptide; Figure 2 shows the amino acid sequence of the nucleotide sequence shown in Figure 1; FIG. 3 shows a construction diagram of Reference Example 1, and FIG. 4 shows a construction diagram of Reference Example 2 (2). FIG. 5 shows a construction diagram of Example 1, where the =nuL portion represents the portion encoding the peptide of human IL-2. Figure 2 - iE'I" LEU ASP ASN LY
S THRPHE 5EEPF? OPROTHRV
AL LYS Engineering LE LEU GLNH Engineering S
PHE PROPF? OTHR Engineering LE GLN
LE [JTHRPROGLY THR Engineering LE
ASN Engineering LE THFIMET ASP V
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GLN GLU GLY GLUTHRLEU SEF
? GLN LYS HIS TRPGGLN VA
L THRTYRGLN GLY H engineering 5CYS AL
A ASP SERASN LEU GLUTHRL
YS LYS THRGLN LED GLNGLN
MET Engineering LE LEU ASN GLY Engineering LE Continued Tomorrow Figure 2 - Part 2 ASN ASN TYRLYS ASN PR
OLYS LEU THRPHE TYRMET
PROLYS LYS ALA THRGLUL
EU GLU GLU GLU LEU L
YS PROLEU GLUGLN SERLYS
ASN PHE HIS LEU ARG
PRO Engineering LE ASN VAL Engineering LE
VAL LEU GLU LEU LYSi'iE
TCYS GLU TYRALA ASP
GLU THRALAASN AF? G-TR
P ENGLE THRPHE CYS GLN
5ERARG MET LEU THRPHE L
YSLF: U LYS HIS LEU GLN CY
SGLU VAL LEU ASN LEU ALA
ARG ASP LEU ENGLE SERA SNGLY
SERGLU THRTH) I PHETHR Engineering L
E VAL GLU PHE LEU Engineering LE Engineering LE
SERTHRLEU THR 塡 1
Claims (1)
子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAをそれぞれ
の読み取り枠をそろえて連結してなるDNA。 2、両構造遺伝子の上流にプロモーターを連結してなる
特許請求の範囲第1項記載のDNA。 3、両構造遺伝子の間にリンカーを介してなる特許請求
の範囲第1項記載のDNA。 4、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブリ
ンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範囲
第1項記載のDNA。 5、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝
子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAをそれぞれ
読み取り枠をそろえて連結してなるDNAが組み込まれ
たプラスミド。 6、DNAが構造遺伝子の上流にプロモーターを連結し
てなるDNAである特許請求の範囲第5項記載のプラス
ミド。 7、DNAが構造遺伝子の間にリンカーを介してなるD
NAである特許請求の範囲第5項記載のプラスミド。 8、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブリ
ンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範囲
第5項記載のプラスミド。 9、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺伝
子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するDNAをそれぞれ
の読み取り枠をそろえて連結してなるDNAが組み込ま
れたプラスミドで形質転換された形質転換体。 10、形質転換体の宿主がエシェリヒア属菌である特許
請求の範囲第9項記載の形質転換体。 11、DNAが構造遺伝子の上流にプロモーターを連結
してなるDNAである特許請求の範囲第9項記載の形質
転換体。 12、DNAが構造遺伝子の間にリンカーを介してなる
DNAである特許請求の範囲第9項記載の形質転換体。 13、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブ
リンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範
囲第9項記載の形質転換体。 14、抗体認識部位を含むペプチドとヒトインターロイ
キン2のペプチドとを結合したポリペプチド。 15、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブ
リンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範
囲第14項記載のポリペプチド。 16、抗体認識部位を含むペプチドをコードする構造遺
伝子を有するDNAおよびヒトインターロイキン2のペ
プチドをコードする構造遺伝子を有するDNAをそれぞ
れ読み取り枠をそろえて連結してなるDNAが組み込ま
れたプラスミドで形質転換された形質転換体を培地に培
養し、培養物中に抗体認識部位を含むペプチドとヒトイ
ンターロイキン2のペプチドとを結合したポリペプチド
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該
ポリペプチドの製造法。 17、形質転換体の宿主がエシェリヒア属菌である特許
請求の範囲第16項記載のポリペプチドの製造法。 18、DNAが構造遺伝子の上流にプロモーターを連結
してなるDNAである特許請求の範囲第16項記載のポ
リペプチドの製造法。 19、DNAが構造遺伝子の間にリンカーを介してなる
DNAである特許請求の範囲第16項記載のポリペプチ
ドの製造法。 20、抗体認識部位を含むペプチドが抗ヒト免疫グロブ
リンE抗体認識部位を含むペプチドである特許請求の範
囲第16項記載のポリペプチドの製造法。[Claims] 1. A DNA obtained by linking a DNA having a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site and a DNA having a structural gene encoding a peptide of human interleukin 2 with their respective reading frames aligned. . 2. The DNA according to claim 1, in which a promoter is linked upstream of both structural genes. 3. The DNA according to claim 1, which has a linker between both structural genes. 4. The DNA according to claim 1, wherein the peptide containing an antibody recognition site is a peptide containing an anti-human immunoglobulin E antibody recognition site. 5. A plasmid incorporating DNA obtained by ligating a DNA having a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site and a DNA having a structural gene encoding a peptide of human interleukin 2 with their respective reading frames aligned. 6. The plasmid according to claim 5, wherein the DNA is a DNA in which a promoter is linked upstream of a structural gene. 7. D where DNA is formed with a linker between structural genes
The plasmid according to claim 5, which is NA. 8. The plasmid according to claim 5, wherein the peptide containing an antibody recognition site is a peptide containing an anti-human immunoglobulin E antibody recognition site. 9. A plasmid into which a DNA containing a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site and a DNA containing a structural gene encoding a peptide of human interleukin 2 are linked with their reading frames aligned. Transformed transformant. 10. The transformant according to claim 9, wherein the host of the transformant is a bacterium of the genus Escherichia. 11. The transformant according to claim 9, wherein the DNA is a DNA in which a promoter is linked upstream of a structural gene. 12. The transformant according to claim 9, wherein the DNA is a DNA with a linker interposed between the structural genes. 13. The transformant according to claim 9, wherein the peptide containing an antibody recognition site is a peptide containing an anti-human immunoglobulin E antibody recognition site. 14. A polypeptide in which a peptide containing an antibody recognition site and a peptide of human interleukin 2 are combined. 15. The polypeptide according to claim 14, wherein the peptide containing an antibody recognition site is a peptide containing an anti-human immunoglobulin E antibody recognition site. 16. Transformation with a plasmid into which a DNA containing a structural gene encoding a peptide containing an antibody recognition site and a DNA containing a structural gene encoding a peptide of human interleukin 2 are linked with their respective reading frames aligned. The transformed transformant is cultured in a medium, and a polypeptide in which a peptide containing an antibody recognition site and a human interleukin 2 peptide are combined is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide is collected. Method for producing polypeptides. 17. The method for producing a polypeptide according to claim 16, wherein the host of the transformant is a bacterium of the genus Escherichia. 18. The method for producing a polypeptide according to claim 16, wherein the DNA is a DNA in which a promoter is linked upstream of a structural gene. 19. The method for producing a polypeptide according to claim 16, wherein the DNA is a DNA with a linker interposed between the structural genes. 20. The method for producing a polypeptide according to claim 16, wherein the peptide containing an antibody recognition site is a peptide containing an anti-human immunoglobulin E antibody recognition site.
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-
1985
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