JPS6117479B2

JPS6117479B2 -

Info

Publication number: JPS6117479B2
Application number: JP51138495A
Authority: JP
Inventors: Hideo Takeda; Ikuo Matsumoto; Minoru Naito
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 1976-11-19
Filing date: 1976-11-19
Publication date: 1986-05-07
Also published as: JPS5366493A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、DL−フエニルグリシンアミド誘導
体の光学的分割法に係わる。従来技術一般に、アミノ酸の不斉加水分解法としては、
エステラーゼによるDL−アミノ酸エステル分解
法、アシラーゼによるＮ−アシル−DL−アミノ
酸分解法、及びアミターゼによるDL−アミノ酸
アミド分解法が知られている。またDL−アミノ酸アミドを酵素によつて選択
的に加水分解する例としては、フエニルアラニン
アミドなどの芳香族アミノ酸アミドが、パパイ
ン、ブロメライン又はフイシンにより可能である
とされている。発明が解決しようとする問題点フエニルグリシンは天然アミノ酸でないため、
酵素による選択的加水分解が容易でなく、フエニ
ルグリシンに限つては従来、アシラーゼによるＮ
−アシル−DL−アミノ酸分解法による光学分割
が散見されるに過ぎない。先に本発明者らが見出
した微生物菌体の生合成反応を利用する分割法、
特公昭45−8634号、特公昭45−8635号、特公昭46
−6414号、特開昭49−50191号及び特開昭49−
80290号は、これに該当する。また、DL−フエニルグリシンアミドに対して
は前例に乏しく、最近になつて初めて動物起源の
酵素による不斉加水分解が認められるようになつ
た許りである。特開昭51−9786号公報には、豚の
腎臓に存在するロイシンアミノペプチターゼを用
いるDL−フエニルグリシンアミドの不斉加水分
解が開示されている。しかるに、本発明の微生物起源のアミターゼに
よるDL−フエニルグリシンアミド誘導体の不斉
加水分解は、文献末記載の新規な光学分割法であ
る。問題を解決するための手段本発明者らは、土壌細菌について種々検索を試
みた結果、アゾトバクター属、チオバチルス属、
又はネクロモナス属に属する菌株を培養して得ら
れる培養物又はその処理物をDL−フエニルグリ
シンアミドに接触させることにより、Ｌ体のアミ
ノのみが不斉加水分解されることを見出した。更
に、この反応を酵素的に作用し難くする、、フエ
ニル核に置換基を有するDL−フエニルグリシン
アミド誘導体に対しても試みたところ、意外にも
アミドの不斉加水分解が起るという知見を得、鋭
意研究の結果本発明を完成した。作用本発明の方法によれば、フエニル核に置換基を
有するか又は有しないフエニルグリシンアミド誘
導体の何れをも基質として使用することができ
る。フエニル核の置換基としては、不斉加水分解
能力を著しく低下させないような基の何れであつ
てもよいが、好ましい例としては、ハロゲン原
子、水酸基、メトキシ基、アセトキシ基、又はア
ルキルスルホニルアミノ基などの単独、もしくは
これらの適当な組合わせが挙げられる。即ち、本発明は、このような微生物起源の広範
な不斉加水分解能の知見に基づいて完成されたも
のであり、アゾトバクター属、チオバチルス属、
又はネクロモナス属に属する培養物又はその処理
物が、DL−フエニルグリシンアミド誘導体を不
斉加水分解してＤ−フエニルグリシンアミド誘導
体とＬ−フエニルグリシン誘導体を生成する作用
のあることを利用し、Ｄ−フエニルグリシンアミ
ド誘導体とＬ−フエニルグリシン誘導体とに光学
分割することを特徴とする。本発明に使用されるアゾトバクター属、チオバ
チルス属及びネクロモナス属に属する微生物の具
体例としては、本発明者らが各地の土壌細菌より
検索し得たアゾトバクターNo.5686、チオバチルス
No.5886及びネクロモナスNo.23709が挙げられ、そ
れぞれの菌学的性質は次に示す通りである。１アゾトバクターNo.5686の形態学的特徴及び生
理学的性状

【表】

【表】以上のような菌学的性状をもとに、バージーの
細菌同定書（Bergey’ｓ Manual of
Determinative Bacteriology）、スカーマンの細
菌同定書（Skerman’ｓ The Genera of
Bacteria）、国際細菌分類学雑誌（International
Journal of Systematic Bacteriology）に照合し
た結果、本菌株は次のように分類学上の属が決定
される。菌株No.5686 若い細飽（15〜20時間）は桿状を呈し鞭毛を有
するが、古い細胞（25〜40時間）は卵形状となり
鞭毛は脱落し易く多形性を示す。窒素を含有しない基礎培地として燐酸水素二カ
リウム0.05％、硫酸マグネシウム0.03％、塩化ナ
トリウム0.02％、塩化カルシウム0.01％、硫酸第
一鉄0.001％、モリブデン酸ソーダ10ppm、グル
コース２％を生育した。この無窒素培地にアンモ
ニア態窒素もしくは硝酸態窒素を添加して培養す
ると、窒素を添加しない無窒素培地に比し急速に
生育した。これらの結合態窒素を消費してからも
エネルギー源さえ残存すれば、空中窒素固定作用
を行つて増強することからアゾトバクター
（Azotobacter）属と同定。工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第1661号として寄託さ
れている。２チオバチルスNo.5886の形態学的特徴及び生理
学的性状

【表】

【表】以上のような菌学的性状をもとに、バージーの
細菌同定書（Bergey’ｓ Manual of
Determinative Bacteriology）、スカーマンの細
菌同定書（Skerman’ｓ The Genera of
Bacteria）、国際細菌分類学雑誌（International
Journal of Systematic Bacteriology）に照合し
た結果、本菌株は次のように分類学上の属が決定
される。菌株No.5886 チオ硫酸塩を酸化、二酸化炭素を資化できる。
チオ硫酸平板寒天上のコロニーは、析出した硫黄
に影響されて黄色ないしは褐色に変化する。液体
培地硫酸アンモニウム0.01％、硫酸マグネシウム
0.01％、塩化カルシウム0.01％、燐酸カリウム0.8
％、塩化第一鉄0.002％、硫酸マンガン0.002％
（PH6.6）を基本培地とし、エネルギー源としてチ
オ硫酸などを加えた培地で生育したことから、チ
オバチルス（Thiobacillus）属と同定。工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第1665号と
して寄託されている。３ネクロモナスNo.23709の形態学的特徴及び生化
学的性状ａ；形態（肉汁寒天斜面、30℃、24時間） (1) 細菌の形：短桿菌大きさ：0.5〜0.6×1.5〜2.0 (2) 細菌の多形性の有無：殆んどが単独 (3) 運動性の有無：運動性あり (4) 胞子の有無：なし (5) 鞭毛の有無：長い（５μ）極毛１本 (6) グラム染色性：陰性 (7) 抗酸性：なし (8) 芙膜：なしｂ：各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天培地（30℃、24時間）：生育良好、表面平滑、淡黄色光沢 (2) 肉汁液体培養（30℃、24時間）：生育良好、沈澱なし、ガス発生なし (3) 肉汁ゼラチン穿刺培養：層状に液化 (4) 馬鈴薯培地（30℃、５日間）：生育良好、淡黄色、半透明光沢 (5) 肉汁寒天斜面培地（30℃、24時間）：生育良好、表面平滑、淡黄色光沢 (6) リトマス・ミルク：アルカリ性、ペプトン化ｃ：生理的性質 (1) 生育の範囲：生育し得るPH5.0〜9.0、最適PH7.0〜8.0、生育し得る温度 10℃〜38℃、最適温度28℃ (2) 酸素に対する態度：好気性 (3) 硝酸塩の還元：（＋） (4) MR試験：（＋） (5) VP試験：（＋） (6) アンモニア生成：（＋） (7) インドール生成：（−） (8) 硫化水素の生成：（＋） (9) クエン酸の利用：（−） (10) 澱粉の加水分解：弱 (11) 無機窒素源の利用：弱 (12) 色素の形成：（−） (13) ウレアーゼ：（−） (14) オキシダーゼ（−） (15) カタラーゼ：（＋） (16) メチレンブルー還元：（＋） (17) ミルクの凝固：（−） (18) 食塩耐性：５％ (19) Ｏ−Ｆ試験：Ｆ型（llngh and Leifson Test） (20) カゼインの液化：（−） (21) 脱窒反応（−） (22) 炭水化物の醗酵性発育ガス生産酸生成Ｌ−アラビノース＋ − ＋Ｄ−キシロース ± − − Ｄ−グルコース〓 − ＋Ｄ−マンノース〓 − ＋Ｄ−フラクトース〓 − ＋Ｄ−ガラクトース〓 − ＋麦芽糖〓 − ＋蔗糖〓 − − 乳糖〓 − − トレハロース〓 − − ラフイノース〓 − − Ｄ−ソルビツト＋ − ＋イノシツト − − − グリセロール＋ − ＋サリシン＋ − − α−メチルグリ〓 − ＋コシドイヌリン＋ − − デキストリン〓 − ＋澱粉〓 − ＋繊維素 − − − エタノール〓 − ＋マロン酸＋ − − 馬尿酸 − − − 酒石酸 − − − 酢酸＋ − − 乳酸 − − − Ｄ−マンニツト − − − 上記の菌学的性質を有する土壌分離細菌につい
て、分類学上の位置をバージーズマニユアル
オブデタミネイテイブ、バクテリオロジイ
（Bergey’ｓ Manual of Determinative
Bacteriology）第７版及びジエネラオブバク
テリア（Genera of Bacteria）ブイビーデイ
スカルマン（V.B.D.Skerman）第２版1967年
発行を参照して検討すれば、単一鞭毛（長い極
毛）を有するグラム陰性の従属栄養細菌で、食塩
耐性がありグルコースに対し醗酵的であることか
らエアロモナス属（Genus Aeromonas）に近縁
するが、炭水化物からガスを生成しない点からエ
アロモナス属とは異なつている。更に、ジエネラ
オブバクテリア（Genera of Bacteria）第２
版を参照すると、エアロモナス属に近縁で炭水化
物からガスを生成しない細菌に対してスミス氏
（I.W.Smith）がザジヤーナルオブジエネ
ラルミクロバイオロジイ（The Journal of
General Microbiology）33巻、263〜274頁（1963
年発行）に提案したネクロモナス属（Genus
Necromonas）を記載している。本発明に用いら
れる土壌分離細菌No.23709をスミス氏の原報に記
載された既知菌種と詳細に検討した結果、No.
23709菌はネクロモナス属に属することを確認し
た。尚、バージーズマニユアルオブデタミ
ネイテイブバクテリオロジイ（Bergey’ｓ
Manual of Determinative Bacteriology）第７版
にはネクロモナス属に関する記載はない。尚、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第2830号として寄託されている。これらの微生物は、Ｘ線、紫外線などによる照
射処理、亜硝酸、アザセリン、２−アミノプリ
ン、エチルエタンスルホン酸、Ｎ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変
異剤処理により、加水分解能の活性を高めて使用
することができる。加水分解能を利用するには、通常それらの培養
物またはその処理物が使用される。微生物の培養
物を得るには、振盪培養法又は通電撹拌を伴う好
気的深部培養法による。培養に用いられる液体培
地の組成は、グルコース、グリセリン、澱粉、ペ
プトン、酵母エキス、コンスチープリカーなどを
任意に配合し、燐酸塩、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウムなどが必要に応じて添加される。培養
温度は好ましくは25〜30℃、培養時間は24〜48時
間である。以上述べた培養条件は使用菌株の特性に応じて
最適条件を選択して適用される。このように培養
して得られたアゾトバクター属、チオバチルス属
又はネクロモナス属に属しDL−フエニルグリシ
ンアミドを不斉加水分解する能力を有する微生物
の培養細胞は、そのまま遠心分離した菌塊として
使用できるし、又得られた培養細胞の処理物を使
用することもできる。例えば菌塊の凍結融解物、
超音波などによる細胞破壊物、表面活性剤による
分解能の細胞外への浸出物もしくは分解能を担体
に固定化した物を用いてもよい。この発明の反応は通常、上記の微生物の培養物
又は処理物を水又は緩衝液に溶解又は懸濁し、こ
れに基質DL−フエニルグリシンアミド誘導体を
添加して行われる。反応液のPHは好ましくはPH８
〜９、基質濃度0.5〜１％、反応温度28℃、反応
時間３〜24時間である。以上述べた反応条件は、使用する基質と微生物
の種類に応じて最適条件を選択して適用される。反応液中に生成したＤ−フエニルグリシンアミ
ド誘導体とＬ−フエニルグリシン誘導体は常法に
従つて分離精製される。具体的には、Ｄ−フエニ
ルグリシンアミド誘導体に対しては弱酸性イオン
交換樹脂、例えばアンバーライトIRC−50、ダイ
ヤイオンCR−10などによる吸着処理、Ｌ−フエ
ニルグリシン誘導体に対しては強酸性イオン交換
樹脂、例えばアンバーライトIR−120などによる
吸着処理が有利である。次に、これらのイオン交換樹脂からアンモニア
水で目的物を溶出し、その溶出液を濃縮すること
により、目的物が固体として得られる。再結晶溶
媒としては、メタノール、エタノール、イソプロ
パノールなどの低級アルコールを用いるのが好ま
しい。次に実施例によつて本発明を具体的に説明する
が、これにより本発明は限定されるものではな
い。実施例１グルコース２％、コンスチープリカー５％の組
成の培養液（PH6.8）１にアゾトバクターNo.
5686菌株を接種し、29℃24時間振盪培養した。得
られた細胞を遠心分離し、休止細胞として凍結保
存した。 DL−フエニルグリシンアミド10ｇを水900mlに
溶解し、PH８〜９に修正した後、懸濁した凍結細
胞100mlを加えた。この波を絶えず撹拌し、29℃
で３時間保持した。次にこの反応液から細胞を除去するため遠心分
離して上澄液を得た。この液をPH10に修正
（3N・NH₄OH）し、IRC−50（Ｈ型）１を充填
したカラムに通液した。続いてカラムを脱イオン
水３で洗浄後Ｎ・NH₄OHで溶出しニンヒドリ
ン陽性分画を減圧濃縮し、冷却後析出物を乾燥し
てＤ−フエニルグリシンアミド1.8ｇ、［α］^２０ _Ｄ−
116゜（EtoH、Ｃ＝0.5）を得た。母液は、濃縮乾固してエタノール抽出し、この
エタノール抽出液から更にＤ−フエニルグリシン
アミド1.5ｇ、［α］^２０ _Ｄ−100゜（EtoH、Ｃ＝0.5）
を得た。第１次結晶１ｇを10％臭化水素酸30mlに溶解
し、３時間湯浴上で加熱後乾固し、水を加え濃ア
ンモニア水で中和して、Ｄ−フエニルグリシン
0.6ｇ、［α］^２０ _Ｄ−157゜（Ｎ・HCl、Ｃ＝１）を得
た。前述のIRC−50カラムの通過液と水洗液は、IR
−120（Ｈ型）300mlを充填したカラムに通液し
た。そのカラムは脱イオン水１で洗浄後3N・
NH₄OHで溶出し、ニンヒドリン陽性分画を減圧
濃縮し、PH4.5に修正し冷却後、析出物を乾燥し
てＬ−フエニルグリシン3.3ｇ、［α］^２０ _Ｄ＋153゜
（Ｎ・HCl、Ｃ＝１）を得た。実施例２ DL−パラヒドロキシフエニルグリシンアミド
10ｇを水1.9に溶解しPH８〜９に修正後、実施
例１と同様に培養して得られたチオバチルスNo.
5886菌株の凍結細胞懸濁液100mlを加えた。この
液を撹拌しながら29℃で５時間保持した。次に、この反応液から細胞を除去するため遠心
分離して上澄液を得た。この液を3N・NH₄OHで
PH10とし、CR−10（Ｈ型）１を充填したカラ
ムに通液した。カラムは脱イオン水３で洗浄後
Ｎ・NH₄OHで溶出し、ニンヒドリン陽性分画を
減圧濃縮し、冷却後析出物を乾燥してＤ−パラヒ
ドロキシフエニルグリシンアミド4.2ｇ、［α］^２０ _Ｄ
−125゜（Ｎ・HCl、Ｃ＝１）を得た。前述の、CR−10カラムの通過液と水洗液は、
IR−120（Ｈ型）300mlを充填したカラムに通液
した。そのカラムを脱イオン水１で洗浄後
3N・NH₄OHで溶出し、ニンヒドリン陽性分画を
減圧濃縮し、PH4.5に修正し冷却後析出物を乾燥
してＬ−パラヒドロキシフエニルグリシン4.2
ｇ、［α］^２０ _Ｄ＋156゜（Ｎ・HCl、Ｃ＝１）を得
た。実施例３ DL−メタメシルアミノフエニルグリシンアミ
ド10ｇを水1.9に溶解しPH９に修正後、実施例
１に準じて培養して得られたネクロモナスNo.
23709菌株の凍結細胞懸濁液100mlを加えた。この
液を撹拌しながら29℃で24時間維持した。続いて
反応液を遠心分離し細胞を除去した。この上澄液
を3N・NH₄OHでPH10に修正し、CR−10（Ｈ
型）１を充填したカラムに通液した。カラムは脱イオン水３で洗浄後Ｎ・NH₄OH
で溶出し、ニンヒドリン陽性分画を減圧濃縮し冷
却後、析出物を水で再結しＤ−メタメシルアミノ
フエニルグリシンアミド3.8ｇ、［α］^２０ _Ｄ−85゜
（Ｎ・HCl、Ｃ＝１）を得た。前述の、CR−10カラムの通過液と水洗液は、
IR−120（Ｈ型）300mlを充填したカラムに通液
し、脱イオン水１で洗浄後、3N・NH₄OHで溶
出しニンヒドリン陽性分画を減圧乾固した。少量
の水を加えPH５に修正しエタノールを加え一夜冷
却し、析出物を乾燥してＬ−メタメシルアミノフ
エニルグリシン２ｇ、［α］^２０ _Ｄ＋98゜（Ｎ・HCl、
Ｃ＝１）を得た。実施例４アゾトバクターNo.5686菌株の培養液１から得
られた凍結休止細胞を実施例３と同様にDL−メ
タメシルアミノフエニルグリシンアミド10ｇに対
し反応させ、得られた反応液を同様に処理してＤ
−メタメシルアミノフエニルグリシンアミド3.5
ｇ、［α］^２０ _Ｄ−85゜（Ｎ・HCl）及びＬ−メタメシ
ルアミノフエニルグリシン2.2ｇ、［α］^２０ _Ｄ＋99゜
（Ｎ・HCl、Ｃ＝１）を得た。実施例５チオバチルスNo.5886菌株の培養液１から得た
凍結休止細胞を、実施例１と同様にDL−フエニ
ルグリシンアミド10ｇに対し反応させ、得られた
反応液を同様に処理してＤ−フエニルグリシンア
ミド1.5ｇ、［α］^２０ _Ｄ−116゜（EtOH、Ｃ＝0.5）及
びＬ−フエニルグリシン3.6ｇ、［α］^２０ _Ｄ＋154゜
（Ｎ・HCl、Ｃ＝１）を得た。実施例６ネクロモナスNo.23709菌株の培養液１から得
られた凍結休止細胞を実施例２と同様に、DL−
パラヒドロキシフエニルグリシンアミド10ｇに対
し反応させ、得られた反応液を同様に処理してＤ
−フエニルグリシンアミド4.0ｇ、［α］^２０ _Ｄ−126゜
（Ｎ・HCl、Ｃ＝１）及びＬ−パラヒドロキシフ
エニルグリシン3.8ｇ、［α］^２０ _Ｄ＋155゜（Ｎ・
HCl、Ｃ＝１）を得た。参考例１〜４ DL−パラメトキシフエニルグリシンアミド、
DL−パラメトキシ・メタクロルフエニルグリシ
ンアミド、DL−パラヒドロキシ・メタメトキシ
フエニルグリシンアミド、DL−パラヒドロキ
シ・メタクロルフエニルグリシンアミド各10ｇを
使用し、実施例１と同様に不斉加水分解反応させ
単離されたフエニル核に置換基を有するＤ−フエ
ニルグリシンアミド誘導体を得た。更に、Ｄ−フ
エニルグリシンアミドを酸分解し、それぞれ対応
するＤ−フエニルグリシン誘導体を次表のように
得た。発明の効果本発明によれば、アンピシリン、アモキシシリ
ン、セフアレキシン等の合成ペニシリン及び合成
セフアロポリン誘導体の合成原料として有用なＤ
−フエニルグリシンアミド誘導体及びＬ−フエニ
ルグリシン誘導体を微生物を用いて光学分割する
ことにより得ることができる。本発明は抗生物質の原料を工業的に有利な製造
方法を提供するものである。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中、R₁は水素原子、ヒドロキシ基、又は
メトキシ基、R₂は水素原子、塩素原子、メトキ
シ基、又はメタンスルホニルアミノ基を示す）で
表わされるフエニル核に置換基を有するフエニル
グリシンアミド化合物をアゾトバクター属、チオ
バチルス属、又はネクロモナス属に属し不斉加水
分解能力を有する微生物の培養物、又はその処理
物の存在下で不斉加水分解し、それぞれ該当する
Ｄ（−）フエニルグリシンアミド化合物及びＬ
（＋）フエニルグリシン化合物を分別採取するこ
とを特徴とするフエニル核に置換基を有するフエ
ニルグリシンアミド化合物の光学分割法。