JPH03259090A - ジフルクトース・ジアンヒドリド３の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ジフルクトース・ジアンヒドリド■（以下、
ｒＤＦＡＩ［［Ｊという）の製造法に関するものである
。

〔従来技術及び発明が解決しようとする問題点〕ＤＦＡ
Ｉはフルクトース２分子が１−２’、２−３′の間で脱
水縮合した構造をもつ２糖類であり、ジャクスンらによ
り１９２９年番こ単離同定されている（Ｂｕｒ、５ｔａ
ｎｄ、Ｊ、Ｒｅｓ、Ｊ、　２７．１９２９）。

Ｄ　Ｆ　Ａ、　ＩＩＩは、動物体内では代謝されず、非
発酵性の糖であるため低カロリー甘味剤として着目され
ており、今後美容食等多方面に利用されることが予想さ
れる。

ジャクソンらは、フルクトースを主構成とする多糖であ
るイヌリンを酸加水分解することによりＤＦＡＩ［ｌを
得ているが、収率はわずか２％弱であり、効率的な方法
とは言えない。

また田中らは１９７２年　アルスロバクタ−・ウレアフ
ァシェンスの産生ずるイヌリン分解酵素を用いてイヌリ
ンからＤ　ＦＡＩＩ［を生成させている（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、２８４，２４８，１９
７２　）。

しかし本酵素は温度に対する安定性が低く、６０°Ｃを
越えると象、激な失活がおき、工業化を行う際に適切な
酵素であるとは言えない。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはこれらの点を解決すべく種に研究をＸねた
結果、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ　ＳＰ、）　　（Ｍ　ＣＩ　２４９６　）微工
研菌寄第１１２８８号（ＦＥＲＭＰ−１１２８８）由来
のイヌリン分解酵素が効率よ（ＤＦＡＩＩＩを生産し、
しかも従来のものに比べて熱に対する安定性が高いので
、工業的にＤＦＡＩ［Ｉの連続生産を行わせる際効率的
に行わせることができることを知得し、本発明を完成す
るに至った。

即ち本発明の要旨は、イヌリン含有溶液中、イヌリンを
アルスロバクター・エスピー（ＭＣＩ２４９６）微工研
菌寄第１１２８８号（ＦＥＲＭＰ−１１２８８）由来の
イヌリン分解酵素と反応させることを特徴とするジフル
クトース・ジアンヒドリド四の製造方法に存する。

以下本発明を説明するに、本発明で使用するイヌリン分
ｇ酵素は、アルスロバクター・エスピー（ＭＣＩ２４９
６）微工研菌寄第１１２８８号（ＦＥＲＭＰ−１１２８
８）由来のものである。

本発明のアルスロバクター・エスピー（ＭＣＩ２４９６
号菌）は、本発明者等により、天然土壌から分離された
細菌であり、その菌学的性状は次の通りである。

１、形態的性状 ○ハートインフュージョン寒天培地上、３０°Ｃ１１週
間のコロニーの特徴 工）外形　　　　・　　　円形 ２）大きさ　　　・　　　２〜３１１Ｉ１１３）表面の
***　：　　　凸状 ４）表面の形状　：　　　平滑 ５）光沢　　　　・　　　鈍光 ６）色調　　　　・　　　黄味灰色 ７）透明度　　　・　　　不透明 ８）周縁　　　　　　　　金縁 Ｏハートインフュージョン寒天培地上、３０’Ｃ１３〜
４８時間培養中の形態的性質 １）細胞形態：培養後６〜１２時間ぐらいまでは、細胞
は不均一に伸長し、長い桿状になる。その後中央部に隔
壁が形成され、細胞は湾曲状に曲がり、漸次分節を繰り
返す。１８時間以降はほとんどの細胞が短稈状の斉一な
形態に変化する。

２）細胞***様式：　　Ｂｅｎｄｉｎｇ　ｔｙｐｅ３）
運動性　　　：　なし ４）胞子形成　　：　なし ５）ダラム染色　：　陽性 陰性 ６）抗酸性　　　・ ２６生理的性質 】）嫌気条件下での生育 ２）空気中での生育 ３）カタラーゼ ４）オキシダーゼ ５）Ｏ−Ｆテスト ロ）ゼラチンの加水分解 ７）リドマス・ミルク ８）硝酸塩の還元 ９）メチルレッドテスト １０）ＶＰテスト １１）インドールの生成 １２）硫化水素の生成 １３）デンプンの加水分解 １４）クエン酸の利用 （クリスランセン　培地上） １５）無機窒素源の利用 １６）ウレアーゼ 陰性 陽性 陽性 陰性 酸生成せず 陽性 変色なし、 ペプトン化あり 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陽性 ：　陽性 ：　陰性 １７） １８） １９） ２０） ２１） ２２） ２３） ２４） ２５） カゼインの加水分解　： ＤＮａ　ｓ　ｅの生産　　： ５％塩化ナトリウム中： での生育 色素の生成 生育温度域 生育ｐＨ ７’ｗｅｅｎ８０の分解： チロシン分解性 各種Ｉｉ類からの酸の生成 陽性 陰性 陰性 陰性 １０〜３７°Ｃ ｐＨ５〜１０ 陽性 陽性 （つづき有） （つづき有） Ｏ培養後１〜３週間観察 Ｏ十：生成能有、±：疑わしい、−：生成能無２６）有
機酸の資化性 ○培養後１〜３週間観察 Ｏ十：資化能有、−：資化能無 ３、化学分類学的性状 １）ＤＮＡ中のＣＣ含量　６７％ ２）細胞壁のアミノ酸組成 モル比 リジン　　　　　　　　１ アラニン　　　　　　　３ スレオニン　　　　　　ｌ グルタミン酸　　　　　１ ３）ペプチドグリカン架橋構造 Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＡＩ または Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａｚ ４）細胞壁の糖組成 ラムノース ガラクトース ５）グリコレート・テスト アセチル型 ６）主要メナキノン ＭＫ　　９　（Ｈｚ　） ４、分類学的考察 ○属しベルの同定 本菌株（ＭＣＩ２４９６号菌）は、 １発生ル・サイクル（ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ）に桿状〜
短棒状（Ｒｏｄｓ−ｃｏｃｃｕｓ）の多形性を有する。

２）絶対好気性菌である。

３）グルコース等のＷ類から酸を生成しない。

４）ＤＮＡ中のＣＣ含量は６７％と高いＧＣを示す。

５）細胞壁のジアミノ−アミノ酸はリジンを有する。

６）主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ，）を有するなどの
特徴を示す。

これらの特徴から、氷量はバージエイズ　マニュアル　
オブ　システマティック　バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ。

１ｏｇｙ）第２巻に記載されている、多形性、芽胞非形
成、ダラム染色陽性桿菌（Ｉｒｒｅｇｕｌａｒ、　Ｎｏ
ｎｓｐｏｒｉｎｇ、Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｒｏ
ｄｓ）群のアルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）属菌に帰属することが判明した。

０種レベルの同定 アルスロバクタ−属菌には、現在約１５種が含まれてい
る。これらの種は、各種の往理学的性質、化学分類学的
性質において識別されているが、特に細胞壁の架橋ペプ
チド構造、糖組成、メナキノン組成の相違が種レベルの
重要な分類基準と見なされている。（Ｋ、Ｈ，５ｃｈｌ
ｅｉｂｅｒ　＆　０．Ｋａｎｄｌｅｒ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、Ｒｅｖ、Ｖｏｌ、３６：４０７−４７７．１９７
２．Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌｏｆ　Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　％１ｏ１２
）本菌株（ＭＣＩ２４９６号菌）は、 ｌ発生要メナキノンとしてＭＫ　　９　ＣＨｚ　）を含
有する。

２）細胞壁の架橋ペプチド構造はＬｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈ
ｒ−ＡｌａまたはＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａｚである。

３）細胞壁の糖としてラムノース、ガラクトースを含有
する。

４）運動性を示さない という特徴を持っている。これらの性状と、Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第２巻及び、Ｍ、Ｔａｋｅ
ｕｃｈｉ　＆　Ａ、Ｙｏｋｏｔａ、Ｊ、Ｇｅｎ、Ａｐｐ
ｌ、旧ｃｒｏｂｉｏ１．ｖｏ１．３５：２３３−２５２
．１９８９に記載されているアルスロバクタ−属の種の
特徴と比較した結果、本菌株はアルスロバクタ−・アラ
レセンス（Ａｒｔｈ−ｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｕｒｅｓｃ
ｅｎｓ）に近縁な種であることが示唆された。しかし、
有機酸の資化性、デンプンの加水分解等の生理的性質に
違いが見られた。正式な種の帰属は、今後アルスロバク
タ−・アラレセンスあるいは類似種と氷量との核酸レベ
ルでの比較をした上で決定することとする。従って現段
階では本菌株（ＭＣＩ２４９６号菌）をアル発生バクタ
−・エスピーと同定した。

さらに、ＤＦＡＩＩ［生産菌として公知であるアルスロ
バクタ−・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒＩｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）及びアルスロバクタ−・ウレ
アファシェンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅａ
ｆａｃｉｅｎｓ）の菌学的性状と本菌株を対比したとこ
ろ、下記表に示すように架橋ペプチドの構造及び細胞壁
の糖組成などの主要な点において明らかに区別された。

本発明においては、前記の菌を通常の微生物が利用しう
る栄養物を含有する培地で培養することにより容易に増
殖させることができる。栄養源としては、グルコース、
水あめ、デキストリン、シュクロース、澱粉、糖蜜、動
・植物油等を使用できる。また窒素源として、大豆粉、
小麦胚芽、コーンステイープリカー、綿実粕、肉エキス
、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソー
ダ、尿素等を使用できる。その他、必要に応し、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト
、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成すること
のできる無機塩類を添加することは有効である。

本発明においては、イヌリン或いはキクイモ、ゴボウ等
のイヌリン含有量の高い植物の抽出液を唯一の炭素源と
し、で含む溶液中で、上記アルスロバクター・エスピー
（ＭＣＩ２４９６）微工研菌寄第１１２８８号（ＦＥＲ
ＭＰ−１１２８８）由来のイヌリン分解酵素を作用させ
る。その際、該細菌そのものを作用させてもよいし、ま
た、該細菌から該酵素を抽出し、それを作用させてもよ
い。

細菌そのものを作用させる場合、炭素源としてのイヌリ
ンを約１〜１０％含有し、その他、例えば窒素源として
、大豆粉、小麦胚芽、コーンステイー７’　ＩＪカー、
綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモ
ニウム、硝酸ソーダ、尿素等、更に必要に応じ、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト
、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成すること
のできる無機塩類等を添加した培地に本国を接種し振と
う培養を行う。この際培養温度は２０〜３７°Ｃが、ま
た培養時間は１２〜４０時間が好適である。得られた培
養液を遠心分離により除菌し、その上清を加熱処理によ
り酵素を失活させる。そして濃縮を行い、例えばこれを
活性炭カラムクロマトグラフィーにより活性炭カラムに
吸着させる。蒸留水でフルクトースを溶出させたあと、
５％エタノール水溶液にて溶出を行う。この分画中にＤ
ＦＡｍが得られるので、それを濃縮乾固すると所期のＤ
ＦＡ［ｒを得ることができる。

また酵素を作用させる場合、まず前記方法により培養を
行った培養液を遠心分離により除菌し、得られたろ液に
硫安（６５％飽和）を加え塩析を行い、析出した沈澱物
を遠心分離により取得し、少量の水に懸濁させたのち透
析を行い、粗酵素液を得る。この粗酵素液を例えばｐＨ
７，０に調整した０、０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液中
でイヌリンに作用させることによっても所期のＤＦＡＩ
ＩＩが得られる。

本粗酵素液は、例えばＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ６５０　Ｍ、　　Ｓ　Ｐ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　
　６５０　Ｍカラム（東ソー製）によるイオン交換クロ
マトグラフィーにて精製を行うことにより、電気泳動的
に単一のバンドを示す酵素標品を得ることができる。本
酵素標品の至適ｐＨは５．０で、また６０゛Ｃで最大活
性を示した。ｐＨは４．５〜１１．０の広範囲で安定で
あり２０分間の熱処理では６０°Ｃまで安定であり高い
温度安定性を示した。

〔実施例〕

以下に実施例をあげて本発明の方法をさらに具体的に説
明するが、その要旨を越えない限りこれらに限定される
ものではない。

実施例１ 市販イヌリン５％、酵母エキス０．０２％、硝酸ナトリ
ウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリ
ウム０．０５％、リン酸−カリウム０．０５％、塩化第
二鉄０．００１％を含んだ培地１５０ｓ＋２をｐＨ１，
０に調整して、１２０°Ｃで２０分間蒸気滅菌した。こ
の滅菌した溶液に、ＭＣＩ２４９６号菌を一白金発撥種
し、１６０ｒ、ｐ、ｖｘ、で３０°Ｃ１３０時間培養し
た。

培養終了後遠心分離により菌体を除去し、培養ろ液を得
た。得られた培養ろ液を１０分間加熱処理することによ
り酵素を失活させ、約１０腸！にまで減圧濃縮した。こ
の液は活性炭カラム（活性炭３０ｇとセライトＮα５３
５　６０ｇの混合物を蒸留水にて充てん）に吸着させ、
蒸留水１２を流したのち、５％エタノール水溶液で溶出
した。

溶出ピークを集めて減圧濃縮にて乾固してＤＦＡｍを得
た。得られたＤＦＡＩＩＩは、原料イヌリンに対して１
０％であった。薄層クロマトグラフィー〔シリカゲルプ
レート（Ｍｅｒｃｋ社）；展開溶媒ｎ−ブタノール：エ
タノール：水＝２　：　１　：　１（Ｖ／Ｖ／Ｖ））に
よると、イヌリンの酸分解にヨリ得うレタ標準（７）Ｄ
ＦＡＩＩ［とＲｆ値（０，６７）が一致した。

実施例２ 実施例１で得られた培養ろ液１　ｒｍｌ！を、５％のイ
ヌリンを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液４　ｍｌに加えて
３０℃で３時間反応させた。

反応液を加熱し酵素を失活させた後、活性炭カラムクロ
マトグラフィーを行い、５％エタノールにて溶出させ、
溶出液を減圧濃縮にて乾固してＤＦＡＩＩＩを得た。

得られたＤＦＡＩＩ［は、原料イヌリンに対して８３．
４％であった。

〔発明の効果］ 本発明のアルスロバクター・エスピー（ＭＣＩ２４９６
）微工研菌寄第１１２８８号（ＦＥＲＭＰ−１１２８８
）由来のイヌリン分解酵素は、良好にイヌリンからＤＦ
ＡＩ［［を生産し、また従来のものに比べて熱に対して
高い安定性を有するので、ＤＦＡＩＩＩの連続生産を行
わせる際に非常に有効であると考えられる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）イヌリン含有溶液中、イヌリンをアルスロバクタ
   ー・エスピー（ＭＣＩ２４９６）微工研菌寄第１１２８
   ８号（ＦＥＲＭＰ−１１２８８）由来のイヌリン分解酵
   素と反応させることを特徴とするジフルクトース・ジア
   ンヒドリドIIIの製造法。