JPS6363377A

JPS6363377A - シユウドモナス属ｎｓ３０３菌及びｌ−アミノ酸の製法

Info

Publication number: JPS6363377A
Application number: JP20646586A
Authority: JP
Inventors: Takahiro Ishikawa; 高広石川; Hitoshi Kimura; 均木村
Original assignee: Nippon Soda Co Ltd
Current assignee: Nippon Soda Co Ltd
Priority date: 1986-09-02
Filing date: 1986-09-02
Publication date: 1988-03-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ＤＬ−アミノ酸またはその塩に微生物を作用
させて酵素的にＬ−アミノ酸を製造する方法に関するも
のである。

（従来技術〕従来、ＤＬ−アミノ酸にシュウドモナス属エルギノーサ
を作用させてＬ−アミノ酸を得る方法として、バイオキ
ミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ−Ａｃｔａ）　第７８巻１３６　ページ１９
６３年に記載の方法が知られている。

しかしこの方法は、ＤＬ−アミノ酸に対する酵素の基質
特異性が狭く、またＤ−アミノ酸に対する変換速度が遅
いという問題点を有している。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはＤ−アミノ酸にのみ特異的に作用してケト
酸に変換しかつＬ−アミノ酸には作用しない能力を有す
る微生物について探索したところ優れたＤ−アミノ酸オ
キシダーゼ活性を有し、かつアミノ酸に対する基質特異
性の広い酵素を有する新菌を分離することに成功し、更
に検討を重ねて本発明を完成した。

本発明は上記微生物又はその処理物を、ＤＬ−アミノ酸
又はその塩と接触反応させ、次いで、上記微生物の作用
を受けないＬ−アミノ酸を反応生成物から分離すること
によるＬ−アミノ酸を製造する方法である。

本発明の微生物が特異的に作用するＤ−アミノ酸として
はメチオニン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、
フェニルグリシン、リジン等広範なアミノ酸が挙げられ
る。

本発明に用いる微生物は、シェウドモナスＮＳ３０３菌
（工業技術院微生物工業技術研究所　微工研菌寄第８８
７８号）であり、本発明者らが新たに分離した新菌種で
ある。ＮＳ３０３菌の菌学的諸性質は以下の通りである
。

（ａｌ　　形態１）細胞の形および大きさ：０．６〜０．７　Ｘ　１．
５〜２．θ　μｍ桿菌２）細胞の多形性の有無　：なし３）運動性の有無　　　　：あり鞭毛の着生状態　　　　極鞭毛４）胞子の有無　　　　　：なし５）ダラム染色性　　　　：陰性６）抗酸性　　　　　　　：なしくｂｌ　　各培地における生育状態１）肉汁寒天平板培養　　：良好な生育、円形、凸円状
、金縁、不透明、円滑、白色２）肉汁寒天斜面培養　　：良好な生育、糸状可溶性色
素を生成しない３）肉汁液体培養　　　　：良好な生育、膜状４）肉汁
ゼラチン穿刺培養：液化しない５）リドマス　ミルク　
　：変化しない［Ｃ１生理学的性質１）硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　　＋２）脱窒
反応　　　　　　　　　　　　　　＋３）ＭＲテスト　
　　　　　　　　　　　　　　　−４）　ＶＰテスト　
　　　　　　　　　　　　　　　−５）インドールの生
成　　　　　　　　　　−６）硫化水素の生成　　　　
　　　　　　　−７）デンプンの加水分解　　　　　　
　　　−８）クエン酸の利用；クリステンセン培地：＋
（Ｃｈｒ　ｉｓ　ｔｅｎｓｅｎ）シモンズ培地　　：　＋コーザー培地　　：　＋（Ｘｏｓｅｒ）９）無機窒素源の利用；硝酸塩　　　　：　＋７シ干ニ
ウム塩　　　　　　　：　　　＋１０）色素の生成　　
　　　　　　　　生成しない１１）ウレアーゼ　　　　
　　　　　　　　　　＋１２）オキシダーゼ　　　　　
　　　　　　　＋１３）カタラーゼ　　　　　　　　　
　　　　＋１４）生育の範囲　　　：温度　３８℃で生
育するが４２℃で生育しないｐＨ６〜９１５）酸素に対する態度：　　　　好気性１６）　Ｏ−
Ｆテスト　　　　　　　酸化１７）　Ｗ　ｉｌＩから酸
およびガスの生成の有無酸の生成　ガスの生成ｆｌ）　Ｌ−アラビノース　　十　　　　　−（２）Ｄ
−キシロース　　　＋（微弱）　−（３）Ｄ−グルコー
ス　　　＋　　　　　−（４）Ｄ−マンノース　　　十
　　　　　　−（５）Ｄ−フラクトース　　十　　　　
　−（６）Ｄ−ガラクトース　　十　　　　　−（７）
マルトース　　　　　十　　　　　−（８）シ！ＦｗＭ
　　　　　　　十　　　　　−（９）ラクトース　　　
　　＋＜’ａ弱）　−０１）レバロース　　　　十　　
　　　−（１１）　Ｄ−ソルビット　　　＋（微弱）　
　−（１２）　Ｄ−マンニット　　　＋（微弱）　　＝
（１３）イノンソト　　　　　　十　　　　　　−（１
４）グリセロール　　　　＋（微弱）　−（１５）でん
粉　　　　　　　− １８）グルコン酸の酸化　　　　　　　　　−１９）デ
カルボキシラーゼ反応メラー（Ｍφ１ｌｅｒ）の方法リジン　　　　　　　　　　　− オルニチン　　　　　　　　　− アルギニン　　　　　　　　　＋２０）　Ｄ　Ｎ　Ａの分解性　　　　　　　　　　　−
２１）（！Ｉ−β−ヒＦＩｌｌキシ酪酸の蓄積の有無：
　　あり２２）栄養要求性　　　　　　　　　　　　な
し２３）炭素化合物の資化性（Ｓｔａｎｉｅｒ　ｅｔ　
ａｌの方法）１）　　Ｌ−アラビノース　　　　　　　
　＋２）　　Ｄ−キシロース　　　　　　　　　＋３）
　　Ｄ−グルコース　　　　　　　　　＋４）　　Ｄ−
フルクトース　　　　　　　　　＋５）シｇ塘　　　　
　　　　　　　　　＋６）トレハロース　　　　　　　
　　　　＋７）　Ｄ−リポース　　　　　　　　　　＋
８）　　Ｌ−ラムノース　　　　　　　　　　＋９）ア
トニット　　　　　　　　　　　　＋１０）エリスリト
ール　　　　　　　　　　−１１）ソルビトール　　　
　　　　　　　＋１２）エタノール　　　　　　　　　
　　　＋１３）β−アラニン　　　　　　　　　　＋１
４）Ｌ−アルギニン　　　　　　　　　＋１５）　Ｌ−
バリン　　　　　　　　　　−１６）酪酸　　　　　　
　　　　　　　　−ＩＴ）ＤＬ−乳酸　　　　　　　　
　　　＋１８）プロピオン酸　　　　　　　　　　　十
１９）メソ酒石酸　　　　　　　　　　　−２０）　　
Ｄ　（−）酒石酸　　　　　　　　　　−２１）ｍ−ヒ
ドロキシ安息香酸　　　　　−２２）ｐ−ヒドロキシ安
息香酸　　　　　十２３）グリコール酸　　　　　　　
　　　−２４）マロン酸　　　　　　　　　　　　　＝
２５）ＤＬ−β−ヒドロキシ酪酸　　　　十２６）レブ
リン酸　　　　　　　　　　　　−２７）シトラコン酸
　　　　　　　　　　−２８）メサコン酸　　　　　　
　　　　　　−２９）　　　ト　　リ　　プ　り　　ミ
　　ン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　−３０）プロピレングリコ
ール　　　　　　＋３１）　２．３−ブチレングリコー
ル　　　　＋３２）ｎ−アミルアミン　　　　　　　　
　−３３）ベタイン　　　　　　　　　　　　　十以上
の薗学的性質をバージエイ秋分Ｈ（Ｂｅｒｇｅｙ　’　
ｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　第８版）に基づいて検索
すると、シュウドモナス属に属す、さらに種について検
索すると、既知菌種と本国では、デカルボキシラーゼ反
応の有無、炭素化合物の資化性などの性質において一敗
しないことから新菌種であると判断した。

上記微生物の培養は、通常、振とう培養あるいは通気・
攪拌深部培養などの好気的条件で行なう。

培養１１度は１０〜３５℃、培養ｐＨは６〜９で、１〜
３日間培養する。培地には、使用菌が責化しうる炭素源
、窒素源、無機塩及び微量有機栄養源が含まれる。即ち
、炭素源としては、グルコース、フラクトース、デンプ
ン加水分解液、糖蜜などの炭水化物や、更にエタノール
なども使用できる。窒素源としては、アンモニア、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウムなどの各種の無機およ
び有機のアンモニウム塩類、または肉エキス、酵母エキ
ス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物な
どの天然有機窒素源も使用可能である。無機塩としては
、マグネシウム、鉄、マンガン、カリウム、ナトリウム
などの塩が適宜用いられる。

反応に使用する基質であるＤＬ−アミノ酸の濃度に特に
制限はないが、通常１〜６９（濃度が用いられ、反応温
度は１０〜５０℃好ましくは３０〜４５℃、反応ｐＨは
３〜１０、好ましくは６〜９の範囲で１〜３日間反応す
る。

反応液からＬ−アミノ酸を分離するには、例えば濃縮、
等電点沈澱などによる直接晶析法や、イオン交換樹脂処
理などの公知の方法により行なうことができる。

生成したアミノ酸の定量と定量は薄層クロマトグラフィ
ー（ＴＬＣ）　、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）、パイオアフセイによる方法を用いることができる
。また光学的異性体は、旋光度分析、光学異性体分離プ
レートおよびカラムを用いることにより判別することが
できる。

（実施例〕実施例１グルコース０．５χ、酵母エキス０，５χ、ポリペプト
ン０．５χ９食塩０．５χを含有する栄養培地（ｐＨ７
）１０ｍｌに、シュウドモナス属ＮＳ３０３　ｍを接種
し、３０℃で２４時間振とうにより前培養を行った。前
培養液５ｍｌを、上記の栄養培地５００　ｍｌに加えて
本培養を、３０℃、２４時間振とうにより行った。この
培４！８液を遠心分離し、集苗した。得られた菌体に、
ＩＯＮ力性ソーダでｐＨ８に調整した３％濃度のＤＬ−
メチオニン（ＣＬＳＣＨｚＣＬＣ）！（ＮＨｚ）ＣＯＯ
Ｈ〕１００ｍ１を加えてＱ　ｌｉした後、１分間１６０
回転で旋回振とうしつつ、４２℃で２日間反応を行った
０反応終了後、遠心により除菌し、上清をＨＰＬＣと光
学異性体分離カラム（キラルパフクーＨダイセル化学工
業■製）を用いて分析した。

輔　ＣＨｓＳＣ）ＩｚＣＨｚＣＯＣＯＯＩＩ”　　Ｃｌ
１ｉＳＣＨｚＣｌ（ｚｃＯＯＨ・イオン交換樹脂（アン
バーライト＋Ｒ１２ＯＢ）　　５　ｇを充填したクロス
ト用カラムに、ｐＨ３に調整した上記上清を供給した後
、カラムを水で洗浄することによりケト酸とプロピオン
酸を流過させた。ついで０．４Ｍ？Ｅｉ度のアンモニア
水溶液でメチオニンを）８出させた。しかる後に溶出液
を？７４縮、乾固することにより、Ｌ−メチオニン１，
２ｇを得た。

〔α〕。”−＋２３．６°　（Ｃ−１，０４，５Ｎ　−
ＭＣＩ）実施例２実施例１と同様にして培養したシュウドモナス属ＮＳ３
０３菌の培養液５ｍｌより得られる菌体を、０．１Ｍ濃
度のリン酸緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌに懸濁した後、ＤＬ
−バリン（（ＣＨ３）ＩＣ）ＩｃＨ（ＮＬ）ＣＯＯ）Ｉ
）　０゜０１　　ｇを加えた。４２℃で２日間振とうに
より反応を行った０反応後、遠心除菌して得た上清を、
ＨＰＬＣ、キラルバフクーＨおよび光学異性体分離プレ
ート（キラルプレート：マケレイーナーゲル（Ｍａｃｋ
ｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ−ｄｕｅｎ）社製）により分析し
た結果、残存バリンはＬ一体であり、Ｄ一体はまったく
検出されないことを確認した。このＬ−バリンの残存量
は５■／ｍｌであった。

実施例３実施例１と同様にして培養したシュウドモナスｉ　ＮＳ
３０３菌の培養液５＋ｍｌより得られる菌体を、０．１
Ｍ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ８）　１　ｍｌに懸濁した
後、ＤＬ−フェニルアラニンＣＣ，Ｈ５ＣＨ，Ｃ）Ｉ（
ＮＨｆｆｉ）ＣＯＯＨ）　０．０１ｇを加えた。４２℃
で２日間振とうにより反応を行なった０反応後、遠心除
菌して得た上清を、）ＩＦ’Ｌ１１：　、キラルパソク
ＷＨおよびキラルプレートにより分析した結果、残存フ
ェニルアラニンはＬ一体であり、Ｄ一体はまったく検出
されないことを確認した。このＬ−フェニルアラニンの
残存量は４．６　曙／ｍ＋であった。

〔発明の効果〕

本発明法によればシュウドモナス属ＮＳ３０３菌を使用
することにより種々のＤＬ−アミノ酸からＬ−アミノ酸
を高純度でしかも収率よく取得することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する能力を有するシ
ュウドモナス属ＮＳ３０３菌
（２）Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する能力を有するシ
ュウドモナス属ＮＳ３０３菌またはその菌体処理物を、
ＤＬ−アミノ酸またはその塩と接触反応させ、次いで上
記微生物の作用を受けなかったＬ−アミノ酸を反応生成
物から分離することを特徴とするＬ−アミノ酸の製法。