JPS6019720A - ヒト内来性癌制御因子およびその製造法 - Google Patents
ヒト内来性癌制御因子およびその製造法Info
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- JPS6019720A JPS6019720A JP58128893A JP12889383A JPS6019720A JP S6019720 A JPS6019720 A JP S6019720A JP 58128893 A JP58128893 A JP 58128893A JP 12889383 A JP12889383 A JP 12889383A JP S6019720 A JPS6019720 A JP S6019720A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なヒト内来性癌制御因子およびその製造法
に関する。
に関する。
従来制癌作用を有する生物活性物質としては種々のもの
が知られており５代表的なものとしてはインターフェロ
ン、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｕｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ
Ｆａｃｔｏｒ ： ＴＮＦ ）が知られている。
が知られており５代表的なものとしてはインターフェロ
ン、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｕｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ
Ｆａｃｔｏｒ ： ＴＮＦ ）が知られている。
特にＴＮＦは咄乳動物の産生ずるポ白性生物活性物質で
あり、インターフェロン等と異なり種を越えて抗腫瘍活
性を有すると言われており、腫瘍細胞への作用が直接お
よび宿主の免疫機構を介した間接作用の両者を通じて発
現するものと考えられている。
あり、インターフェロン等と異なり種を越えて抗腫瘍活
性を有すると言われており、腫瘍細胞への作用が直接お
よび宿主の免疫機構を介した間接作用の両者を通じて発
現するものと考えられている。
ＴＮＦは１９７５年に米国５ｌｏａｎ −Ｋｅｔｔｅｒ
ｉｎｇ癌研究所のＯｌｄらのグループによってマウスに
於て発見され、腫瘍壊死を生じさせる物質としてＣａｒ
ｓｗｅｌｌらによって報告された［ Ｐｒｏｃ 、Ｎａ
ｔ 。
ｉｎｇ癌研究所のＯｌｄらのグループによってマウスに
於て発見され、腫瘍壊死を生じさせる物質としてＣａｒ
ｓｗｅｌｌらによって報告された［ Ｐｒｏｃ 、Ｎａ
ｔ 。
Ａｃ１ｄ 、 Ｓｅｔ 、 ＵＳＡ 、 ７２巻（Ａ９
）３６６６〜３６７０頁（１９７５年）〕。また最近
になって新たなＴＮＦ（具体的にはマウスＴＮＦ及びウ
サギＴＮＦ）の精製法も報告されている（特開昭５７−
１４０７２５号および１４０７２６号９日本臨床、４０
巻（８号）１８６〜１９３頁（１９８２年））。これら
の物質は。
）３６６６〜３６７０頁（１９７５年）〕。また最近
になって新たなＴＮＦ（具体的にはマウスＴＮＦ及びウ
サギＴＮＦ）の精製法も報告されている（特開昭５７−
１４０７２５号および１４０７２６号９日本臨床、４０
巻（８号）１８６〜１９３頁（１９８２年））。これら
の物質は。
咄乳動物（具体的にはマウスまたはウサギ）にホルマリ
ン処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃ
ｎｅｓ等の第１刺激物質次いで大腸菌由来のりポポリサ
ノカライド等の第２刺激物質を投与し、その動物の血液
等の体液より採取精製するか。
ン処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃ
ｎｅｓ等の第１刺激物質次いで大腸菌由来のりポポリサ
ノカライド等の第２刺激物質を投与し、その動物の血液
等の体液より採取精製するか。
あるいは第１刺激物質を作用させた哨乳動物由来の活性
化マクロファージに細胞培養系で第２刺激物質を作用さ
せて誘発させて採取。
化マクロファージに細胞培養系で第２刺激物質を作用さ
せて誘発させて採取。
精製されるものである。
かかる物質は分子量３９，０００±５，０００．等電点
ｐＨ３，９Ｆｏ、３の制癌作用を有する生物活性物質で
あってきわめて優れた制癌作用を有し、その作用は種特
異性が少な（しかも毒性がほとんど認められないことか
らきわめて有用な抗腫瘍剤として期待されている。
ｐＨ３，９Ｆｏ、３の制癌作用を有する生物活性物質で
あってきわめて優れた制癌作用を有し、その作用は種特
異性が少な（しかも毒性がほとんど認められないことか
らきわめて有用な抗腫瘍剤として期待されている。
本発明者等はかかる技術水準下に新たに鋭意研究した結
果、ヒト単球系の癌化細胞を。
果、ヒト単球系の癌化細胞を。
組織培養系で増殖させ１２−０−テトラデカノイルフォ
ルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）ヲ作−３− 用させた後に大腸菌由来のりボボリザノカライドを作用
させるとヒト細胞由来の新規な生物活性物質が得られる
ことを見出した。この新規な生物活性物質は、ｉｎ ｖ
ｉＬｒｏ 、 ｉｎ ｖｉｖｏに於てヒトの腫瘍細胞を
含む多種の腫瘍に対し。
ルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）ヲ作−３− 用させた後に大腸菌由来のりボボリザノカライドを作用
させるとヒト細胞由来の新規な生物活性物質が得られる
ことを見出した。この新規な生物活性物質は、ｉｎ ｖ
ｉＬｒｏ 、 ｉｎ ｖｉｖｏに於てヒトの腫瘍細胞を
含む多種の腫瘍に対し。
マウス、ウサギ由来のＴＮＦより強力な抗腫瘍活性を有
する生物活性物質であり２分子量２等電点。
する生物活性物質であり２分子量２等電点。
安定性等の理化学的性質を従来のＴＮＦ’と著しく異に
する新規な生物活性物質である。
する新規な生物活性物質である。
本生物活性物質は、ヒト細胞由来の抗腫瘍活性物質であ
り、腫瘍壊死効果をも有するところから、癌の自然治癒
等の際に極く微量。
り、腫瘍壊死効果をも有するところから、癌の自然治癒
等の際に極く微量。
生体内に産生される物質の１つと考えられるので９本発
明者等はヒト内来性癌制御因子（Ｋｒｅｂｓ ５ｔａｔ
ｉｋａ ：以下ＫＢＳと略記する）と命名した。
明者等はヒト内来性癌制御因子（Ｋｒｅｂｓ ５ｔａｔ
ｉｋａ ：以下ＫＢＳと略記する）と命名した。
ヒト由来のＴＮＦについては、ヒト由来の却１胞より製
造する方法が報告された（特開昭５８−２］６２］号及
び１０７１９７号）。しかし、このヒ） ＴＮＦについ
ての分子量９等電点等の理化４−− 学的性質につし・では全く言及されていないので、マウ
ス、ウサギ等の動物由来のＴＮＦとの異同は不明である
。むしろ、対応するイギリス公開特許出願２１０６１１
７号には、製造したヒトＴＮＦの理化学的性状は、前記
ＣａｒｓｗｅｌｌらのマウスＴＮＦと良（一致したと記
載されて（・ることがら、物質的には動物由来のＴＮＦ
と同一物質と考えられる。
造する方法が報告された（特開昭５８−２］６２］号及
び１０７１９７号）。しかし、このヒ） ＴＮＦについ
ての分子量９等電点等の理化４−− 学的性質につし・では全く言及されていないので、マウ
ス、ウサギ等の動物由来のＴＮＦとの異同は不明である
。むしろ、対応するイギリス公開特許出願２１０６１１
７号には、製造したヒトＴＮＦの理化学的性状は、前記
ＣａｒｓｗｅｌｌらのマウスＴＮＦと良（一致したと記
載されて（・ることがら、物質的には動物由来のＴＮＦ
と同一物質と考えられる。
従って９本発明のＫＢＳは、ヒ） ＴＮＦとも異なる新
規な生物活性物質である。
規な生物活性物質である。
本発明のＫＢＳは組織培養系で第１刺激物質を作用させ
たヒト由来の単球系細胞の正常細胞またはその癌化細胞
に、第２刺激物質を作用させてＫＢＳを生成させ９次い
で該ＫＢＳを採取することによって製造される。
たヒト由来の単球系細胞の正常細胞またはその癌化細胞
に、第２刺激物質を作用させてＫＢＳを生成させ９次い
で該ＫＢＳを採取することによって製造される。
本発明で使用するヒト由来の単球系細胞の正常細胞また
はその癌化細胞とは、具体的には例えば単球系細胞また
はマクロファージ系細胞、並びにその癌化細胞である。
はその癌化細胞とは、具体的には例えば単球系細胞また
はマクロファージ系細胞、並びにその癌化細胞である。
組織培養系で容易に増殖ｌ〜得るものであれば更によい
。
。
特に好ましいのは単球マクロファージ系の癌化細胞であ
り例えばＨＬ−６０，あるいはモノザイテンロイケミャ
（Ｍｏｎｏｃｖｔｅｎ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ ）由来の
末白 梢血傘血球の臨床分離確立株より選択株化した単球系癌
化細胞であるＹＫＢＳ−７−］］５．ＹＫＢＳ−７−１
６ 、 ＹＫＢＳ−７−１７、更にこれらの細胞より単
細胞クローン化したサプライン（５ｕｂＨｎｅ）が挙げ
られる。
り例えばＨＬ−６０，あるいはモノザイテンロイケミャ
（Ｍｏｎｏｃｖｔｅｎ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ ）由来の
末白 梢血傘血球の臨床分離確立株より選択株化した単球系癌
化細胞であるＹＫＢＳ−７−］］５．ＹＫＢＳ−７−１
６ 、 ＹＫＢＳ−７−１７、更にこれらの細胞より単
細胞クローン化したサプライン（５ｕｂＨｎｅ）が挙げ
られる。
この培養細胞ＹＫＢＳ−７−１５、ＹＫＢＳ−７−１６
。
。
ＹＫＢＳ−７−１７は、東京大学医科学研究所と本発明
者等がヒトモノサイテンロイケミア（ＨｕｍａｎＭｏｎ
ｏｃｙｔｅｎ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ）である急性単球性
白血病患者の末梢血軟層白血球より、常法により（塩化
アンモニウム処理、混入赤血球除去）培養株化した単球
系の癌化細胞であって、東京大学医科学研究所と本発明
者等で継代維持されている。
者等がヒトモノサイテンロイケミア（ＨｕｍａｎＭｏｎ
ｏｃｙｔｅｎ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ）である急性単球性
白血病患者の末梢血軟層白血球より、常法により（塩化
アンモニウム処理、混入赤血球除去）培養株化した単球
系の癌化細胞であって、東京大学医科学研究所と本発明
者等で継代維持されている。
その他、単球マクロファージ系の癌化細胞として、Ｍｏ
ｎｏｌ及びＭｏｎｏ−１２０７（Ｖｉ ｒｃｈｏｗ Ａ
ｒｃｈ 。
ｎｏｌ及びＭｏｎｏ−１２０７（Ｖｉ ｒｃｈｏｗ Ａ
ｒｃｈ 。
Ａ、Ｐａｔｈｏｌ、Ａｎａｔ、Ｈｉｓｔｏ１３７］ １
５（＋９７６）及び３７９２６９ （１９７８） ）が
挙げられる。
５（＋９７６）及び３７９２６９ （１９７８） ）が
挙げられる。
更に、これ等単球系細胞には単球系細胞になり得る細胞
も当然含まれる。そのような細胞は量終的に単球系白血
病像を示すようになる細胞であり５例えば骨髄性悪性細
胞が挙げられる。
も当然含まれる。そのような細胞は量終的に単球系白血
病像を示すようになる細胞であり５例えば骨髄性悪性細
胞が挙げられる。
これらの細胞は２通常は牛脂児血清を含有する人工栄養
培地中で組織培養されるが、血清を含まない無血清人工
栄養培地中に於ても組織培養することが可能であり、更
にヌードマウスや幼若ハムスターの腹腔内、皮下に於て
も充分増殖が可能である。例えば、実施例１で用１．−
たＹＫＢＳ−７−１５は、１０％Ｆ ＣＳ （Ｆｅｔａ
ｌｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ 、牛脂児血清）、１ｍＭヘペ
ス緩衝液、２５μｇ／／ｍｔのペニシリン及びストレプ
トマイシンを含有する人工栄養培地であるＲＰＭＴ培地
（ＧＩＢＣＯ社製）で培養される。
培地中で組織培養されるが、血清を含まない無血清人工
栄養培地中に於ても組織培養することが可能であり、更
にヌードマウスや幼若ハムスターの腹腔内、皮下に於て
も充分増殖が可能である。例えば、実施例１で用１．−
たＹＫＢＳ−７−１５は、１０％Ｆ ＣＳ （Ｆｅｔａ
ｌｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ 、牛脂児血清）、１ｍＭヘペ
ス緩衝液、２５μｇ／／ｍｔのペニシリン及びストレプ
トマイシンを含有する人工栄養培地であるＲＰＭＴ培地
（ＧＩＢＣＯ社製）で培養される。
本発明で使用する第１刺激物質としては。
リンパ球系あるいはリンパ芽球系の条件培養液（Ｃｏｎ
ｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ） 、白血球を分化
誘導する化学物質あるいは自然抽出物やそれ等の組−−
７＝ み合せが用いられる。更にある種の化学物質例えばトリ
コテノセンマイコトキシンを投与した咄乳動物の免疫担
当細胞の培養上清も同様に第１刺激物質として用いられ
る。白血球を分化誘導する化学物質あるいは自然抽出物
としては９例えばフィトヘマグルニチン（ＰＨＡ）が挙
げられるがムラミルジペプチド（ＭＤＰ）。
ｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ） 、白血球を分化
誘導する化学物質あるいは自然抽出物やそれ等の組−−
７＝ み合せが用いられる。更にある種の化学物質例えばトリ
コテノセンマイコトキシンを投与した咄乳動物の免疫担
当細胞の培養上清も同様に第１刺激物質として用いられ
る。白血球を分化誘導する化学物質あるいは自然抽出物
としては９例えばフィトヘマグルニチン（ＰＨＡ）が挙
げられるがムラミルジペプチド（ＭＤＰ）。
１２−０−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセ
テート（ＴＰＡ）、 １２．１３−フォルボールブチレ
ート、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） 、メゼレイ
ン（ｍｅｚｅｒｅｉｎ ）の如くマクロファージの機能
を活性化するいわゆるマクロファージ活性化物質が更に
好ましい。
テート（ＴＰＡ）、 １２．１３−フォルボールブチレ
ート、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） 、メゼレイ
ン（ｍｅｚｅｒｅｉｎ ）の如くマクロファージの機能
を活性化するいわゆるマクロファージ活性化物質が更に
好ましい。
更に網内系賦活化作用を有する物質も本発明におけろ第
１刺激物質と１〜て使用することができる。網内系賦活
化作用を有する物質としては通常ダラム陽性菌、カビ産
生物質、原生動物または酵母が用いられ、生菌状態、死
菌状態（例えば熱処理やホルマリン処理後）または菌体
抽出成分として用いられる。ダラム８− 陽性菌としては例えばＰｒｏｐｉｏｎｉＭｃｔｅｒｉｕ
ｍ ａｃｎｅｓ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐ
ａｒｖｕｍ ） 、 Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｒａｎｕｌｏｃｕｍ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｃｕｍ ）のようなＰｒｏｏ
ｉｏｎｉ Ｂａｃｔｅｒｉａ 、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（Ｂ −Ｃ−Ｇ −）
＋ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉ
ｓ のようなＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ 、 Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｓ 、 Ｎｏｃａｒ
ｄｉａｇａｒｄｎｅｒｌのようなＮｏｃａｒｄｉａが挙
げられる。カビ産生物質としてはＦｕｓａｒｉｕｍ系の
産出する毒素が挙げられる。原生動物としては９例えば
。
１刺激物質と１〜て使用することができる。網内系賦活
化作用を有する物質としては通常ダラム陽性菌、カビ産
生物質、原生動物または酵母が用いられ、生菌状態、死
菌状態（例えば熱処理やホルマリン処理後）または菌体
抽出成分として用いられる。ダラム８− 陽性菌としては例えばＰｒｏｐｉｏｎｉＭｃｔｅｒｉｕ
ｍ ａｃｎｅｓ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐ
ａｒｖｕｍ ） 、 Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｒａｎｕｌｏｃｕｍ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｃｕｍ ）のようなＰｒｏｏ
ｉｏｎｉ Ｂａｃｔｅｒｉａ 、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（Ｂ −Ｃ−Ｇ −）
＋ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉ
ｓ のようなＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ 、 Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｓ 、 Ｎｏｃａｒ
ｄｉａｇａｒｄｎｅｒｌのようなＮｏｃａｒｄｉａが挙
げられる。カビ産生物質としてはＦｕｓａｒｉｕｍ系の
産出する毒素が挙げられる。原生動物としては９例えば
。
マラリア原虫、トキソプラズマが挙げられる。
酵母の場合は２通常、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｓｉａｅなどから抽出したＺｙｍｏｓａｎが
用いられる。また。
ｃｅｒｅｖｓｉａｅなどから抽出したＺｙｍｏｓａｎが
用いられる。また。
ビランコーポリマーのような合成高分子を用いることも
できる。
できる。
本発明で使用する第２刺激物質とはグラム陰性菌または
グラノ陽性菌より得られたエンドトキシンを意味する。
グラノ陽性菌より得られたエンドトキシンを意味する。
かかるエンドトキシンとしては２例えば大腸菌、緑膿菌
、チフス菌由来のりポリサッカライドが挙げられる。
、チフス菌由来のりポリサッカライドが挙げられる。
この他、ダラム陽性菌のポリサッカライドも同様に用い
ることができる。
ることができる。
本発明のＫＢＳは、ヒト由来の半球系細胞の正常細胞ま
たはその癌化細胞を人工栄養培地。
たはその癌化細胞を人工栄養培地。
血清などを用いる通常の組織培養系で培養し。
その培養前、培養中あるいは培養後に第１刺激物質を作
用させ５次いで第２刺激物質を作用させることによって
誘導生成することができるのである。このように該細胞
からＫＢＳを誘導生成させるには１通常は２回の刺激に
よって行われるが、いずれか一方のみでも生成するもの
と考えられる。通常は該細胞を通常の組織培養系で充分
培養した後、その培養系に第１刺激物質例えば１２−Ｏ
−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセテ−）
（ＴＰＡ）の場合は０．１〜！、 ＯＯｎｇ／ｍｌを加
えて第１刺激を行い。
用させ５次いで第２刺激物質を作用させることによって
誘導生成することができるのである。このように該細胞
からＫＢＳを誘導生成させるには１通常は２回の刺激に
よって行われるが、いずれか一方のみでも生成するもの
と考えられる。通常は該細胞を通常の組織培養系で充分
培養した後、その培養系に第１刺激物質例えば１２−Ｏ
−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセテ−）
（ＴＰＡ）の場合は０．１〜！、 ＯＯｎｇ／ｍｌを加
えて第１刺激を行い。
更に培養例えば１２時間〜３日培養後に第２刺激物質例
えば大腸菌由来のりポリサッカライドの場合は０．１〜
１０μｇ／／ＩＴｌｔを加えて第２刺激を行い更に培養
例えば８〜２４時間培養すると培養上清中にＫＢＳが誘
導生成されるのである。
えば大腸菌由来のりポリサッカライドの場合は０．１〜
１０μｇ／／ＩＴｌｔを加えて第２刺激を行い更に培養
例えば８〜２４時間培養すると培養上清中にＫＢＳが誘
導生成されるのである。
このようにして誘導生成したＫＢＳは公知の精製９分離
法９例えば透析、塩析、濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾
燥などを行うことによって分離、精製し採取することが
できる。更に高度の精製を必要とする場合には２例えば
イオン交換体への吸着、溶出、ゲル濾過およびアフィニ
ティークロマトグラフィー、等電点分画 、電気泳動、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの方法を
組合わせることができる。通常は、 ＫＢＳを含有する
培養上清を遠心分離等により採取し、該上清を塩基性陰
イオン交換体を用いて精製する。塩基性陰イオン交換体
としては例えばＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０，Ｄ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ 、 ＤＥＡＥセファ
セル、 ＱＡＥ−セファデックスＡ−５ｏＩＬ上ファル
マシア社製） 、 ＡＴＥＣＤＥ ５２（ワットマン社
製） 、 ５ｅｒｖａｃｅｌ ＡＥ（セルバ社製）。
法９例えば透析、塩析、濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾
燥などを行うことによって分離、精製し採取することが
できる。更に高度の精製を必要とする場合には２例えば
イオン交換体への吸着、溶出、ゲル濾過およびアフィニ
ティークロマトグラフィー、等電点分画 、電気泳動、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの方法を
組合わせることができる。通常は、 ＫＢＳを含有する
培養上清を遠心分離等により採取し、該上清を塩基性陰
イオン交換体を用いて精製する。塩基性陰イオン交換体
としては例えばＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０，Ｄ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ 、 ＤＥＡＥセファ
セル、 ＱＡＥ−セファデックスＡ−５ｏＩＬ上ファル
マシア社製） 、 ＡＴＥＣＤＥ ５２（ワットマン社
製） 、 ５ｅｒｖａｃｅｌ ＡＥ（セルバ社製）。
Ｃｅ１ｌｅｘ ＱＡＥ（パイオーラッド社製）が挙げら
れる。ＫＢＳを含有する該上清を例えばＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−５０カラムに付すとＫＢＳは吸着されず
非吸着画分に含まれ、他の蛋白質の多くはゲルに吸着さ
れる。当該非吸着画分を例えばポリエチレングリコール
６．０００やアミコン濃縮装置を用いて濃縮し、必要に
応じ透析した後、再度ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５
０カラムに付すとＫＢＳは吸着され２次いでこの吸着し
たＫＢＳを旧９Ｍ塩化すｌ−ＩＪウムを含む０．０２Ｍ
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で溶出させることに
よって精製ＫＢＳを得ることが出来る。しかし、 ＤＥ
ＡＥ−セファデックスＡ−５０のゲル量を増加させるこ
とにより非吸着画分を得すに、直接ＤＥＡＥ−セファデ
ックスＡ−５０に吸着させた後、０．１９Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．０２Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８
）で溶出させることによっても精製ＫＢＳを得ることが
できる。更に高度の精製を必要とする場合には高速液体
クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマ
トグラフィー。
れる。ＫＢＳを含有する該上清を例えばＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−５０カラムに付すとＫＢＳは吸着されず
非吸着画分に含まれ、他の蛋白質の多くはゲルに吸着さ
れる。当該非吸着画分を例えばポリエチレングリコール
６．０００やアミコン濃縮装置を用いて濃縮し、必要に
応じ透析した後、再度ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５
０カラムに付すとＫＢＳは吸着され２次いでこの吸着し
たＫＢＳを旧９Ｍ塩化すｌ−ＩＪウムを含む０．０２Ｍ
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で溶出させることに
よって精製ＫＢＳを得ることが出来る。しかし、 ＤＥ
ＡＥ−セファデックスＡ−５０のゲル量を増加させるこ
とにより非吸着画分を得すに、直接ＤＥＡＥ−セファデ
ックスＡ−５０に吸着させた後、０．１９Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．０２Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８
）で溶出させることによっても精製ＫＢＳを得ることが
できる。更に高度の精製を必要とする場合には高速液体
クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマ
トグラフィー。
クロマトフオーカシング、ポリアクリルアミドゲルによ
るスラブ電気泳動が採用される。
るスラブ電気泳動が採用される。
殊に、最近開発された高速液体クロマトグラフィーな用
いたイオン交換法（ＦＰ ＬＣＭｏｎｏ−Ｑ ＋ＭＯｎ
ｏ−Ｐ、ファルマシア社製）は高度の精製には適してい
る。
いたイオン交換法（ＦＰ ＬＣＭｏｎｏ−Ｑ ＋ＭＯｎ
ｏ−Ｐ、ファルマシア社製）は高度の精製には適してい
る。
このようにして製造し、採取、精製した本発明のＫＢＳ
の理化学的性質は以下の如くである。
の理化学的性質は以下の如くである。
（１）分子量
セファデックスｃ−２００（ファルマシア社製）の分子
篩法によると本物質の相対分子量は８２．０００±Ｉ
Ｏ，０００である。
篩法によると本物質の相対分子量は８２．０００±Ｉ
Ｏ，０００である。
（２）等電点
高速液体クロマトグラフィーな用いたイオン交換法（Ｆ
ＰＬＣＭｏｎｏ−Ｐ 、ファルマシア社製）によると本
物質の等電点はｐＨ６，５＋０．５である。
ＰＬＣＭｏｎｏ−Ｐ 、ファルマシア社製）によると本
物質の等電点はｐＨ６，５＋０．５である。
（３） ｐＨ安定性
平衡透析法（室温、１７時間）によると本物質の水溶液
はｐＨ５，０〜１０．０で安定である。
はｐＨ５，０〜１０．０で安定である。
しかし、 ｐＨ４，５以下またはｐＨ１０，５以上では
やや不安定であった。
やや不安定であった。
（４）熱安定性
５６℃で３０分間熱処理しても水溶液中における本物質
は安定である。
は安定である。
参考までに２本発明のＫＢＳは、マウス及びウサギＴＮ
Ｆとは分子量９等電点、安定性等の点で著しく異なる新
規な生物活性物質である。
Ｆとは分子量９等電点、安定性等の点で著しく異なる新
規な生物活性物質である。
更にマウス抗つサギＴＮＦ抗血清は、ウサギＴＮＦとほ
ぼ完全に、またマウスＴＮＦとも一部反応しＴＮＦ活性
が抑制されるが、 ＫＢＳとは殆んど反応せずＴＮＦ活
性は抑制されなかった。
ぼ完全に、またマウスＴＮＦとも一部反応しＴＮＦ活性
が抑制されるが、 ＫＢＳとは殆んど反応せずＴＮＦ活
性は抑制されなかった。
この事実は上記の物理化学的性質の差異と共に、免疫学
的にも本発明のＫＢＳが、 ＴＮＦと異なることを示し
ている。
的にも本発明のＫＢＳが、 ＴＮＦと異なることを示し
ている。
また、 ＴＮＦがマウスやウサギなどの動物由来の物質
であるのに対し２本発明のＫＢＳはヒト由来の生物活性
物質であるため生体にとって異物とされず抗原抗体反応
を起こす可能性が著るしく少ないものと考えられる。
であるのに対し２本発明のＫＢＳはヒト由来の生物活性
物質であるため生体にとって異物とされず抗原抗体反応
を起こす可能性が著るしく少ないものと考えられる。
本発明のＫＢＳのＨｅｐ−２、Ｋａｔｏ −ｍ 、 Ｋ
Ｂ 、 Ｈｅ１ａ 。
Ｂ 、 Ｈｅ１ａ 。
ＨＬ６０，５ＥＫＩ等のヒト腫瘍細胞に対するｉｎ ｖ
ｉｔｒ。
ｉｔｒ。
の抗腫瘍効果は、 ＴＮＦのそれと比較してはるかに強
力であり、 ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍壊死効果及び抗腫瘍
効果も種の異なる系であるＭｅｔｈＡを用いた試験でＴ
ＮＦと同等以上の活性を示す強力な抗腫瘍作用を有する
。
力であり、 ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍壊死効果及び抗腫瘍
効果も種の異なる系であるＭｅｔｈＡを用いた試験でＴ
ＮＦと同等以上の活性を示す強力な抗腫瘍作用を有する
。
以下に９本発明のＫＢＳの抗腫瘍作用を示す。
■、細胞障害効果（ｃｙｔｏｔｏｘｉ ｔｙ 、 ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ）培地（９０％ＭＥＭ＋１０％ＦＣ８）
に懸濁した５Ｘ１０６個／ｍｌの細胞をマイクロプレー
トに２５０ μｌ ／ｗｅ１１でまき、培地（９０％Ｍ
ＥＭ ＋ １０％ＦＣ８） で希釈したＫＢＳを等量添
加した後３７℃で４８時間培養した。その後細胞をマイ
クロプレートより回収し、０５％トリパンブルー溶液を
用いた染色除外法（ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｔｅ
ｓｔ ）により生存細胞数をめた。細胞障害効果はＫＢ
Ｓ処理処理熱処理群に対する殺細胞率（％）によって判
定した。ＫＢＳの殺細胞効果を表Ｉに、対比したマウス
ＴＮＦの殺細胞効果を表Ｈに示す。なお。
ｖｉｔｒｏ ）培地（９０％ＭＥＭ＋１０％ＦＣ８）
に懸濁した５Ｘ１０６個／ｍｌの細胞をマイクロプレー
トに２５０ μｌ ／ｗｅ１１でまき、培地（９０％Ｍ
ＥＭ ＋ １０％ＦＣ８） で希釈したＫＢＳを等量添
加した後３７℃で４８時間培養した。その後細胞をマイ
クロプレートより回収し、０５％トリパンブルー溶液を
用いた染色除外法（ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｔｅ
ｓｔ ）により生存細胞数をめた。細胞障害効果はＫＢ
Ｓ処理処理熱処理群に対する殺細胞率（％）によって判
定した。ＫＢＳの殺細胞効果を表Ｉに、対比したマウス
ＴＮＦの殺細胞効果を表Ｈに示す。なお。
使用した細胞は、ヒト由来癌細胞として Ｈｅｐ’−２
。
。
（
Ｋａｔｏ−■、 ＫＢ 、 Ｈｅｈａ 、 ＨＬ６０及
び５ＥＫＩを、ヒト由来正常細胞としてＣｈａｎｇ Ｌ
ｉｖｅｒを用いた。
び５ＥＫＩを、ヒト由来正常細胞としてＣｈａｎｇ Ｌ
ｉｖｅｒを用いた。
表■ＫＢＳの細胞障害効果
１５−
１７−
１６−
上表から明らかな様に２本発明のＫＢＳはヒト由来癌細
胞に対する細胞障害効果を有するが、その程度はマウス
ＴＮＦに比して著しく強力である。
胞に対する細胞障害効果を有するが、その程度はマウス
ＴＮＦに比して著しく強力である。
また５本発明のＫＢＳはヒト由来正常細胞に対する細胞
障害効果は殆んど認められなかった。
障害効果は殆んど認められなかった。
■、 腫瘍壊死作用（Ｔｕｍｏｕｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ
Ａｃｔｉｖｉｔｙ＋ｉｎ ｖｉｖｏ）Ｂａｌｂ／Ｃマ
ウスで継代維持したマウス由来Ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｒａ
ｎｔｈｒｅｎｅ Ａ誘発肉腫（Ｍｅｔｈ Ａ ）の５×
１０個細胞をＢａ１ｂ／Ｃマウス（♀、７週令）背部皮
肉に移植し、７日後に腫瘍径を測定した。次いで３，２
００〜４００単位に段階希釈したＫＢＳｏ、５ｍｌを静
脈注射し、２４時間後（Ｍｅｔｈ Ａ移植８臼目）に腫
瘍壊死を測定し、４８時間後（Ｍｅｔｈ Ａ移植９臼目
）に腫瘍径を測定した。
Ａｃｔｉｖｉｔｙ＋ｉｎ ｖｉｖｏ）Ｂａｌｂ／Ｃマ
ウスで継代維持したマウス由来Ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｒａ
ｎｔｈｒｅｎｅ Ａ誘発肉腫（Ｍｅｔｈ Ａ ）の５×
１０個細胞をＢａ１ｂ／Ｃマウス（♀、７週令）背部皮
肉に移植し、７日後に腫瘍径を測定した。次いで３，２
００〜４００単位に段階希釈したＫＢＳｏ、５ｍｌを静
脈注射し、２４時間後（Ｍｅｔｈ Ａ移植８臼目）に腫
瘍壊死を測定し、４８時間後（Ｍｅｔｈ Ａ移植９臼目
）に腫瘍径を測定した。
腫瘍壊死の程度は原中等の方法〔日本臨床４０巻（８号
） １８６−１９３頁（１９８２年）〕に従い、腫瘍径
は直径のみを測定した。
） １８６−１９３頁（１９８２年）〕に従い、腫瘍径
は直径のみを測定した。
その結果、 ＫＢＳ ８００単位〜３，２００単位の投
与群では、２４時間後に腫瘍壊死（＋）が出現した。
与群では、２４時間後に腫瘍壊死（＋）が出現した。
４８時間後には＋→廿、−→」−又は廿と腫瘍壊死はゆ
るやかに進行の傾向を示した。そしてＫＢＳ ８００単
位〜３，２００単位の投与群では４８時間後に腫瘍の退
縮が明らかに認められ。
るやかに進行の傾向を示した。そしてＫＢＳ ８００単
位〜３，２００単位の投与群では４８時間後に腫瘍の退
縮が明らかに認められ。
殊にＫＢＳ ３，２００単位投与群では金側完治が認め
られた。腫瘍の退縮が認められた全例で。
られた。腫瘍の退縮が認められた全例で。
その後も腫瘍の退縮化が進行し、 １０日後（Ｍｅｔｈ
Ａ移植１７日用）までには完全な退縮。
Ａ移植１７日用）までには完全な退縮。
即ち、移植したＭｅｔｈＡは完全に脱落し、完治した。
なおＫＢＳを投与しなかった群は、 Ｍｅｔｈ Ａ移植
１７日用には腫瘍の直径は１，５ｃＭＬ以上に増大し、
４０日１以降にはほぼ全例が死亡した。
１７日用には腫瘍の直径は１，５ｃＭＬ以上に増大し、
４０日１以降にはほぼ全例が死亡した。
本実験から明らがな様に２本発明のＫＢＳは。
強い腫瘍壊死作用を有すると共に強力な抗腫瘍効果が認
められた。更に本発明のＫＢＳはＳａｒｃｏｍａ ］
８０ 、 Ｅｈｒｌ ｉｃｈ固型癌、 ｐ３８８固型癌
。
められた。更に本発明のＫＢＳはＳａｒｃｏｍａ ］
８０ 、 Ｅｈｒｌ ｉｃｈ固型癌、 ｐ３８８固型癌
。
Ｌｅｗｉｓ Ｌｕｎｇ Ｃａｒｃｉｎｏｒｎａ等の腫瘍
に対し強力な抗腫瘍作用を有する。
に対し強力な抗腫瘍作用を有する。
また２本発明のＫＢＳのスクリーニングにあたっての生
物活性（ＫＢＳ活性）は、咄乳動物由来の正常または癌
化細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏによる細胞障害試験による評
価によった。
物活性（ＫＢＳ活性）は、咄乳動物由来の正常または癌
化細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏによる細胞障害試験による評
価によった。
Ｃａ ｒｓｗｅｌ １氏らの方法（Ｐｒｏｃ 、 Ｎａ
ｔ 、 Ａｃａｄ 、 Ｓｃｉ 。
ｔ 、 Ａｃａｄ 、 Ｓｃｉ 。
Ｕ Ｓ Ａ 、７２巻（／ｌ６９）３６６６〜３６７０
頁（１９７５年）〕に基づき行う。培養容器としてリノ
ゾロ社製（米国）のプレートを使用ｌ〜、非必須アミノ
酸および１０％の熱不活化牛胎児血清、さらにヘニンジ
ン］ ＯＯ単位／ｍｌ ＋ストレプトマイシン１００μ
ｇ／ｍｌを含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ培地）
とＬｃｅｌｌ（Ｓ）を用いて行う。細胞懸濁液（ＩＸＩ
Ｏ個細胞）および同容量の希釈試料を５％炭酸ガス含有
空気中、３７”Ｃで４８時間培養する。力価は、試料の
希釈度とＩ。
頁（１９７５年）〕に基づき行う。培養容器としてリノ
ゾロ社製（米国）のプレートを使用ｌ〜、非必須アミノ
酸および１０％の熱不活化牛胎児血清、さらにヘニンジ
ン］ ＯＯ単位／ｍｌ ＋ストレプトマイシン１００μ
ｇ／ｍｌを含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ培地）
とＬｃｅｌｌ（Ｓ）を用いて行う。細胞懸濁液（ＩＸＩ
Ｏ個細胞）および同容量の希釈試料を５％炭酸ガス含有
空気中、３７”Ｃで４８時間培養する。力価は、試料の
希釈度とＩ。
ｃｅｌｌの生存細胞数をグラフにプロットし、ｌ７ｃａ
ｌｌの５０％殺細胞能に対応する希釈度から算出する。
ｌｌの５０％殺細胞能に対応する希釈度から算出する。
Ｌ ｃｅｌｌの５０％を殺すために必要な生物活性量を
１単位（Ｕ）とする。
１単位（Ｕ）とする。
本発明によって得られたＫＢＳを医薬として使用するに
は、抗腫瘍効果を発現するのに都合のよい形で投与する
。ＫＢＳはそのままの状態で医薬となり得るが、製薬上
の慣習に従って製薬的に許容し得る希釈剤及び／又は他
の薬理作用物質との混合物として組成された状態でも捺
供され得る。従って本発明のＫＢＳは。
は、抗腫瘍効果を発現するのに都合のよい形で投与する
。ＫＢＳはそのままの状態で医薬となり得るが、製薬上
の慣習に従って製薬的に許容し得る希釈剤及び／又は他
の薬理作用物質との混合物として組成された状態でも捺
供され得る。従って本発明のＫＢＳは。
経口的又は非経口的に投与するための形態を適宜に採り
得る。例えば散剤、顆粒２錠剤。
得る。例えば散剤、顆粒２錠剤。
糖衣錠、カプセル、ピル、半開、懸濁剤、液剤、乳剤、
注射剤、エアゾール剤である。通常はＫＢＳを凍結乾燥
し、使用時は生理食塩水。
注射剤、エアゾール剤である。通常はＫＢＳを凍結乾燥
し、使用時は生理食塩水。
滅菌水、無菌の注射用等張液等により溶解し。
静脈注射、皮下注射、筋注射などによりＫＢＳとして患
者に投与される。この製剤化は、先の凍結乾燥に先きた
ち各種安定化剤例えばマンニトール、ヒト血清アルブミ
ンなどを添加し、溶解補助剤例えばグリシンを添加する
ことも可能である。
者に投与される。この製剤化は、先の凍結乾燥に先きた
ち各種安定化剤例えばマンニトール、ヒト血清アルブミ
ンなどを添加し、溶解補助剤例えばグリシンを添加する
ことも可能である。
本発明のＫＢＳの投薬量は、感受性差９年令。
性別９体重、投与方法、投与の時期２間隔。
病状９体調、医薬製剤の性質、調剤の種類等種々の原因
によって変動する。従って下記に示す投薬量の最小値よ
り少な（′・計で十分であり、又ある場合には下記投薬
量をこえて投与する必要の生ずることもある。成人の患
者に対する投薬量は１日当り１万年位以上である。
によって変動する。従って下記に示す投薬量の最小値よ
り少な（′・計で十分であり、又ある場合には下記投薬
量をこえて投与する必要の生ずることもある。成人の患
者に対する投薬量は１日当り１万年位以上である。
そして９本発明は、遺伝子工学的手法によるＫＢＳを製
造する基幹的技術をも包含するものである。即ち、ヒト
由来の単球系細胞の正常細胞またはその癌化細胞を、前
記の方法で。
造する基幹的技術をも包含するものである。即ち、ヒト
由来の単球系細胞の正常細胞またはその癌化細胞を、前
記の方法で。
組織培養系で培養し、第１次刺激次いで第２次刺激を行
った後更に８〜２４時間培養する間に、遠心分離して細
胞を得る。次いでこの細胞を等張緩衝液にて充分洗浄後
、チオシアン酸グアニジン／メルカプトエタノール法や
Ｔｒｉｔｏｎ Ｎｌ旧などのｄｅｔｅｒｇｅｎｔなどで
細胞を破壊又は溶解し、フェノールを用（・る方法など
でＲＮＡを抽出する。次いで、このＲＮＡよりＯｉｌｇ
ｏ ｄｔ−セルロースカラムなどによりＫＢＳｍＲＮＡ
を抽出し、蔗糖密度勾配遠心法にてＫＢＳｍＲＮＡを分
画後、各分画中に含まれろＫＢＳｍＲＮＡ 、をホルモ
ン処理して得たアフリカツメカエルの卵母細胞（Ｘｅｎ
ｏｐｕｓ Ｉａｅｖｉｓ ｏｏｃｙｔｅｓ ）にマイク
ロインジェクターを用いて注入し、一定時間培養後培地
もしくは卵を破砕し、遠心分離後その上清につ℃・て、
Ｌｃｅｌｌに対する細胞障害活性にてＫＢＳ活性を測定
し、 ＫＢＳ活性のの高い画分を粗ＫＢＳｍＲＮＡとし
て得ることができる。また当該ＫＢＳｒｒ＋ＲＮＡは、
上記と同様に処理した単球マクロファージ系癌化細胞例
えばＹＫＢＳ−７−１５細胞より、抗体アフィニティー
法でＫＢＳ産生ｐｏｌｙｓｏｍｅを特異的に抽出後。
った後更に８〜２４時間培養する間に、遠心分離して細
胞を得る。次いでこの細胞を等張緩衝液にて充分洗浄後
、チオシアン酸グアニジン／メルカプトエタノール法や
Ｔｒｉｔｏｎ Ｎｌ旧などのｄｅｔｅｒｇｅｎｔなどで
細胞を破壊又は溶解し、フェノールを用（・る方法など
でＲＮＡを抽出する。次いで、このＲＮＡよりＯｉｌｇ
ｏ ｄｔ−セルロースカラムなどによりＫＢＳｍＲＮＡ
を抽出し、蔗糖密度勾配遠心法にてＫＢＳｍＲＮＡを分
画後、各分画中に含まれろＫＢＳｍＲＮＡ 、をホルモ
ン処理して得たアフリカツメカエルの卵母細胞（Ｘｅｎ
ｏｐｕｓ Ｉａｅｖｉｓ ｏｏｃｙｔｅｓ ）にマイク
ロインジェクターを用いて注入し、一定時間培養後培地
もしくは卵を破砕し、遠心分離後その上清につ℃・て、
Ｌｃｅｌｌに対する細胞障害活性にてＫＢＳ活性を測定
し、 ＫＢＳ活性のの高い画分を粗ＫＢＳｍＲＮＡとし
て得ることができる。また当該ＫＢＳｒｒ＋ＲＮＡは、
上記と同様に処理した単球マクロファージ系癌化細胞例
えばＹＫＢＳ−７−１５細胞より、抗体アフィニティー
法でＫＢＳ産生ｐｏｌｙｓｏｍｅを特異的に抽出後。
０１ｉｇｏ ｄｔ−セルロースカラムに付すことによっ
て、より特異性の高いＫＢＳｍＲＮＡとして得ることも
できる。更に、これ等ＫＢＳｍＲＮＡは。
て、より特異性の高いＫＢＳｍＲＮＡとして得ることも
できる。更に、これ等ＫＢＳｍＲＮＡは。
これを基に逆転写酵素によりｃ Ｄ Ｎ Ａに変換後。
ｐＢＲ３２２などのクローニングベクターに組み込み、
バクテリアを形質変換し常法であるｐｏｓｉｔｉｖｅま
たはｎｅｇａｔｉ ｖｅススクリーニング法よりＫＢＳ
特異的ｍＲＮＡとし、又そのｃＤＮＡとし精製すること
ができる。このようにＫＢＳを暗号づけするＤＮＡセグ
メントを持つ組換えクローニングベクターを含む宿主細
胞よりＫＢＳを産生ずることがでとるのである。
バクテリアを形質変換し常法であるｐｏｓｉｔｉｖｅま
たはｎｅｇａｔｉ ｖｅススクリーニング法よりＫＢＳ
特異的ｍＲＮＡとし、又そのｃＤＮＡとし精製すること
ができる。このようにＫＢＳを暗号づけするＤＮＡセグ
メントを持つ組換えクローニングベクターを含む宿主細
胞よりＫＢＳを産生ずることがでとるのである。
以下に実施例を示し本発明をより具体的に述べるが９本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
処方例（注射剤）
本発明のＫＢＳ１００万単位を１００ｍ１の生理食塩水
に溶解し、メンブランフィルタ−で無菌的に濾過し、Ｐ
液を滅菌したバイアル１ｍｌずつ充填し、凍結乾燥する
。
に溶解し、メンブランフィルタ−で無菌的に濾過し、Ｐ
液を滅菌したバイアル１ｍｌずつ充填し、凍結乾燥する
。
実施例】
ヒトモノサイテンロイケミア（■（ｕｍａ ｎ Ｍｏｎ
ｃｙｔｅｎＬｅｕｋａｅｍｉａ ）の末梢血駄馬白血球
由来の培養細胞ＹＫＢＳ−７−１５（単球系癌化細胞）
を通常の人工栄養培地である１０％牛脂児血清を含ＱＲ
ＰＭＴ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製） （７００ｍ１
）中で３７°Ｃ２５％炭酸ガス含有空気中充分な期間培
養後（５，０Ｘ１０個細胞／ｍｌ）、１２−０−テトラ
デカノイルフォルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）
を２ｎｇ／／ＩＴｌｔ添加することにより第１刺激を行
い、培養１日後にエンドトキシン（大腸菌０１１１；Ｂ
４由来のりポポリサノカライド）１μｇ／ｍｌを加えて
第２刺激を行い、培養１６時間後遠心分離によりＫＢＳ
を含有する培養上清を採取した。
ｃｙｔｅｎＬｅｕｋａｅｍｉａ ）の末梢血駄馬白血球
由来の培養細胞ＹＫＢＳ−７−１５（単球系癌化細胞）
を通常の人工栄養培地である１０％牛脂児血清を含ＱＲ
ＰＭＴ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製） （７００ｍ１
）中で３７°Ｃ２５％炭酸ガス含有空気中充分な期間培
養後（５，０Ｘ１０個細胞／ｍｌ）、１２−０−テトラ
デカノイルフォルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）
を２ｎｇ／／ＩＴｌｔ添加することにより第１刺激を行
い、培養１日後にエンドトキシン（大腸菌０１１１；Ｂ
４由来のりポポリサノカライド）１μｇ／ｍｌを加えて
第２刺激を行い、培養１６時間後遠心分離によりＫＢＳ
を含有する培養上清を採取した。
該上清をあらかじめ０．０４Ｍの塩化す） ＩＪウムを
含む００２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で平衡
化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラム（φ３
．０Ｘ２５ｆｆｉ）に付した。このイオン交換体を同緩
衝液で充分洗浄（流速２０ｍｌ／ｈｒ ） シて非吸着
画分を得た。当該両分をポリエチレングリコール６．０
００で濃縮した後、同緩衝液で充分に透析した。次いで
該透析上清をあらかじめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−セファデックスＡ−５０カラム（φ３．２ Ｘ １０
．５ｃｎＬ）に再度付した。このイオン交換体を同緩衝
液で充分洗浄後、吸着した両分を０１９Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）
でＫＢＳを溶出（流速２５ｍｔ／ｈｒ）させ、活性画分
を採取した。本ＫＢＳのＬ ｃｅｌｌに対する細胞障害
活性として合計４．６ Ｘ １０４単位であった。更に
。
含む００２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で平衡
化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラム（φ３
．０Ｘ２５ｆｆｉ）に付した。このイオン交換体を同緩
衝液で充分洗浄（流速２０ｍｌ／ｈｒ ） シて非吸着
画分を得た。当該両分をポリエチレングリコール６．０
００で濃縮した後、同緩衝液で充分に透析した。次いで
該透析上清をあらかじめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−セファデックスＡ−５０カラム（φ３．２ Ｘ １０
．５ｃｎＬ）に再度付した。このイオン交換体を同緩衝
液で充分洗浄後、吸着した両分を０１９Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）
でＫＢＳを溶出（流速２５ｍｔ／ｈｒ）させ、活性画分
を採取した。本ＫＢＳのＬ ｃｅｌｌに対する細胞障害
活性として合計４．６ Ｘ １０４単位であった。更に
。
上記活性画分の一部をセファデックスＧ−２００（ファ
ルマシア社製）のカラム（φ２．８ ｘ ９０ｃｍ ）
に付し分子篩法で分析したところ９分子量８２．０００
±１０，０００の両分に各々全ての活性画分が回収され
た。従って本実験結果より本ＫＢＳの相対分子量は８２
，０００±１０，０００であった。セファデックスＧ−
２０００カラムクロマトグラフイーの溶出のパターンを
第１図に示す。標準ポ白質としてウサギＩｇＧ（ＩａＧ
：分子量１６０，０００）。
ルマシア社製）のカラム（φ２．８ ｘ ９０ｃｍ ）
に付し分子篩法で分析したところ９分子量８２．０００
±１０，０００の両分に各々全ての活性画分が回収され
た。従って本実験結果より本ＫＢＳの相対分子量は８２
，０００±１０，０００であった。セファデックスＧ−
２０００カラムクロマトグラフイーの溶出のパターンを
第１図に示す。標準ポ白質としてウサギＩｇＧ（ＩａＧ
：分子量１６０，０００）。
牛血清アルブミン（ＢＳＡ：分子量６７．０（［） 、
卵白アルブミン（ＯＶＡ ：分子量４３，０００）及び
チトクロムＣ（Ｃｙｔ−Ｃ：分子量１３，０００）を用
いた。カラムサイズ；１．５Ｘ８７α、溶出：０７Ｍ塩
化ナトリウムを含む００２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，８）で、流速１４ｍ１／時間で溶出２分取画分：１
ｍｌ。
卵白アルブミン（ＯＶＡ ：分子量４３，０００）及び
チトクロムＣ（Ｃｙｔ−Ｃ：分子量１３，０００）を用
いた。カラムサイズ；１．５Ｘ８７α、溶出：０７Ｍ塩
化ナトリウムを含む００２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，８）で、流速１４ｍ１／時間で溶出２分取画分：１
ｍｌ。
更に、上記活性画分の一部を高速液体クロマトグラフィ
ーを用（・たイオン交換カラム（ＦＰＬＣＭｏｎｏ−Ｐ
カラム ファルマシア社製）に付し、クロマトフオーカ
シング法により溶出を行うと、ｐＨ６，５±０．３に一
本のシャープなビ−クとして活性画分が回収された。従
って。
ーを用（・たイオン交換カラム（ＦＰＬＣＭｏｎｏ−Ｐ
カラム ファルマシア社製）に付し、クロマトフオーカ
シング法により溶出を行うと、ｐＨ６，５±０．３に一
本のシャープなビ−クとして活性画分が回収された。従
って。
本実験結果より本ＫＢＳの等電点けｐＨ６，５＋０．３
であった。高速液体クロマトグラフィーによるクロマト
フオーカシングの溶出パターンを第２図に示す。カラム
； Ｍｏｎｏ −Ｐ （０，５Ｘ ２０（Ｗｎ、） 。
であった。高速液体クロマトグラフィーによるクロマト
フオーカシングの溶出パターンを第２図に示す。カラム
； Ｍｏｎｏ −Ｐ （０，５Ｘ ２０（Ｗｎ、） 。
溶出； Ｐｏ１ｙ ｂｕｆｆｅｒ（ファルマシア社製、
ｐＨ５，０）によるｐＨの直線的濃度勾配法（ｐＨ８
，３−５，０）で、流速０．５ｍＬ／分で溶出９分取画
分： ２ｍＺ。この時点での比活性は、平均ｓ、ｏ ｏ
ｏ単位、４■蛋白質であった。
ｐＨ５，０）によるｐＨの直線的濃度勾配法（ｐＨ８
，３−５，０）で、流速０．５ｍＬ／分で溶出９分取画
分： ２ｍＺ。この時点での比活性は、平均ｓ、ｏ ｏ
ｏ単位、４■蛋白質であった。
更に、上記活性画分のｐＨ安定性は、一定量の試料を、
平衡透析法（ｐＨ２，５からｐＨ］０．５まで、１きざ
みで作製した各々の緩衝液に室温で１７時間透析を行い
、残存する活性を測定）で検討したところ、ｐＨ５，０
〜１０．０の範囲でＫＢＳ活性は１００％残存し安定で
あった。しかし。
平衡透析法（ｐＨ２，５からｐＨ］０．５まで、１きざ
みで作製した各々の緩衝液に室温で１７時間透析を行い
、残存する活性を測定）で検討したところ、ｐＨ５，０
〜１０．０の範囲でＫＢＳ活性は１００％残存し安定で
あった。しかし。
ｐＨ４，５以下またはｐＨ１０，５以上では、やや不安
定であった。この実験結果を表１に示す。
定であった。この実験結果を表１に示す。
表 １
更に、上記活性画分は、５６℃で３０分間加熱処理後も
ＫＢＳ活性が１００％残存し安定であった。
ＫＢＳ活性が１００％残存し安定であった。
実施例２
培養細胞ＹＫＢＳ−７−１５（単球系癌化細胞）を組織
培養用無血清培地ＨＢＩ旧ＴＩｖＩ（Ｈａｎａ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃｓ社製） （２，０００ｍ１）中３７℃で充
分な期間攪拌培養後（５，ＯＸ ］ ０個細胞／ｍｌ）
、１２−０−テトラデカノイルフォルボール−１３−ア
セテ−）（ＴＰＡ）を２ｎｇ／ｍｔ添加することにより
第１次刺激を行い、培養３６時間後にエンドトキシン（
大腸菌０１１１；Ｂ４由来のりポポリサノカライド１μ
ｇ／ｍｌを加えて第２次刺激を行い、培養１６時間後遠
心分離によりＫＢＳを含有する培養上清を採取した。
培養用無血清培地ＨＢＩ旧ＴＩｖＩ（Ｈａｎａ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃｓ社製） （２，０００ｍ１）中３７℃で充
分な期間攪拌培養後（５，ＯＸ ］ ０個細胞／ｍｌ）
、１２−０−テトラデカノイルフォルボール−１３−ア
セテ−）（ＴＰＡ）を２ｎｇ／ｍｔ添加することにより
第１次刺激を行い、培養３６時間後にエンドトキシン（
大腸菌０１１１；Ｂ４由来のりポポリサノカライド１μ
ｇ／ｍｌを加えて第２次刺激を行い、培養１６時間後遠
心分離によりＫＢＳを含有する培養上清を採取した。
該上清を実施例１と同様にしてＤＥＡＥ−セファデック
スＡ−５０カラムクロマトで精製してＫＢＳ活性画分を
採取した。本ＫＢＳのＬ ｃｅｌｌに対する細胞障害活
性として合計１．２ Ｘ １０単位であった。更に、実
施例１と同様にして高速液体クロマトグラフィーを用い
たイオン交換カラム（ＦＰＬＣＭｏｎｏ−Ｐカラム フ
ァルマシア社製）に付し、クロマトフオーカシング法に
より溶出を行ってＫＢＳ活性画分を回収した。この時点
での比活性はｇ ｏ、ｏ ｏ ｏ単位鷹蛋白質であった
。
スＡ−５０カラムクロマトで精製してＫＢＳ活性画分を
採取した。本ＫＢＳのＬ ｃｅｌｌに対する細胞障害活
性として合計１．２ Ｘ １０単位であった。更に、実
施例１と同様にして高速液体クロマトグラフィーを用い
たイオン交換カラム（ＦＰＬＣＭｏｎｏ−Ｐカラム フ
ァルマシア社製）に付し、クロマトフオーカシング法に
より溶出を行ってＫＢＳ活性画分を回収した。この時点
での比活性はｇ ｏ、ｏ ｏ ｏ単位鷹蛋白質であった
。
第１図は、実施例１におけるセファデックスＧ−２００
のカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す。図
中矢印（峠）は標準■白質の溶出位置を、 ＩＧＧはウ
サギＩｇＧ （分子量１６ｏ、ｏｏｏ）を、 ＵＳＡは
牛血清アルブミン（分子量６７．０００）を、 ＤＶＡ
は卵白アルブミン（分子量４３，０００）を、ｃｙｔ−
ｃはチトクロムＣ（分子量１３，０００）を、黒丸（−
一）は蛋白質の吸光度（２８０ｍｍ ） 、白丸（トー
）はＫＢＳのＬｃｅｌｌに対する細胞障害活性（ｕ ／
ｍｌ ）を、横軸は分取画分番号（ｆｒａｃｔｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ ）を示す。 第２図は、実施例１における高速液体クロマトグラフィ
ーによるクロマトフオーカシングの溶出パターンを示す
。図中白丸（−一）は蛋白質の吸光度（２８０ｎｍ）、
黒丸（−一）はＫＢＳのＬ ｃｅｌｌに対する細胞障害
活性（ｕ／ｍｔ）を、白三角（Ｍ）はｐＨを、横軸は分
取画分番号（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ）を示
す。 代理人 弁理士 長 井 省 三 第２図 ５ ［） １５ ２０ ２５２８ 扮取ゑ分番号 手続補正書（自発） 昭和５８年７月ｊ０日 ２ 発明の名称 ヒト内来性癌制御因子およびその製造法３ 補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住 所 東京都中央区日本橋本町２丁目５番地１名 称
（６６７） 山之内製薬株式会社代表者 森 岡 茂
夫 ４代理人 住 所 東京都板橋区小豆沢１丁目１番８号６ 補正の
内容 明細書および図面の浄書 （内容に変更なし） 手続補正書（自発） 昭和５９年１０月１２日 昭和５８年特許願第１２８８９３号 ２ 発明の名称 ヒト内来性癌制御因子およびその製造法３ 補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都中央区日本橋本町２丁目５番地１名称 （
６６７） 山之内製薬株式会社代表者 森 岡 茂 夫 ４ 代 理 人 住所 東京都板橋区小豆沢１丁目１番８号明細書の１発
明の詳細な説明」及び「図面の簡単な説明」の欄 訂正する。 （１） 明細書第６頁３行及び同頁１】行の「Ｍｏｎｏ
ｃｙｔｅｎ Ｊを「Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｊに、また同頁
１３行の １処理、」を「処理で」に訂正する。 （２） 同第６頁下から５行の末尾につづけて次の章句
を挿入する。 ［更に、培養細胞ＹＫＢＳ −７−１５はバスクール研
のＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、 （Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｎａｔ
ｉｏｎａｌｓ ｄｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓｍｉｃｒｏ−ｏ
ｒｇａｎｉｓｍｅｓ ）に寄託されている（寄託番号ｌ
−２５８）。」 （３）同第７頁６〜１６行の１これらの・・・・・・・
・ で培養される。」を次のように訂正する。 ［これらの細胞は２通常は牛脂児血清を含有する人工栄
養培地中で組織培養される。例えば、実施例１で用いた
ＹＫＢＳ−７−１５は、１０％ＦＣ８（Ｆｅｔａｌｃａ
ｌｆ ｓｅｒｕｍ、牛脂児血清）、１ｍＭへペス緩衝液
。 ２５μｇ／ｍ１（ｒ）ヘニシリン及ヒストレプトマイシ
ンを含有する人工栄養培地であるＲＰＭＩ培地（ＧＩＢ
ＣＯ社製）で培養される。また、血清を含まない無血清
人工栄養培地中に於ても組織培養することが可能である
。更に人以外の温血動物９例えばヌードマウスや幼若ハ
ムスターの腹腔内、皮下に於ても充分増殖が可能である
。本発明の組織培養系にはかかるｉｎ ｖｉｖｏの増殖
系も含まれる。」（４） 同第９頁最終行「ポリサッカ
ライド」を１リポポリサツカライド」に訂正する。 （５）同第２４頁１２行［Ｍｏｎｃｙｔｅｎ Ｊを［Ｍ
ｏｎｏｃｙｔｅ Ｊに訂正する。 （６）同第２５頁最終行及び第２９頁１２行の１活性と
して」を１活性としては」に訂正する。 訂正する。 （１）明細書第３０頁５行ＦＤｖＡ」を［０ＶＡＪ Ｋ
、 同頁８行「２８０ｒｒＩｒｒ＋」を［２８０ｎｍ
Ｊに訂正する。 ３−
のカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す。図
中矢印（峠）は標準■白質の溶出位置を、 ＩＧＧはウ
サギＩｇＧ （分子量１６ｏ、ｏｏｏ）を、 ＵＳＡは
牛血清アルブミン（分子量６７．０００）を、 ＤＶＡ
は卵白アルブミン（分子量４３，０００）を、ｃｙｔ−
ｃはチトクロムＣ（分子量１３，０００）を、黒丸（−
一）は蛋白質の吸光度（２８０ｍｍ ） 、白丸（トー
）はＫＢＳのＬｃｅｌｌに対する細胞障害活性（ｕ ／
ｍｌ ）を、横軸は分取画分番号（ｆｒａｃｔｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ ）を示す。 第２図は、実施例１における高速液体クロマトグラフィ
ーによるクロマトフオーカシングの溶出パターンを示す
。図中白丸（−一）は蛋白質の吸光度（２８０ｎｍ）、
黒丸（−一）はＫＢＳのＬ ｃｅｌｌに対する細胞障害
活性（ｕ／ｍｔ）を、白三角（Ｍ）はｐＨを、横軸は分
取画分番号（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ）を示
す。 代理人 弁理士 長 井 省 三 第２図 ５ ［） １５ ２０ ２５２８ 扮取ゑ分番号 手続補正書（自発） 昭和５８年７月ｊ０日 ２ 発明の名称 ヒト内来性癌制御因子およびその製造法３ 補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住 所 東京都中央区日本橋本町２丁目５番地１名 称
（６６７） 山之内製薬株式会社代表者 森 岡 茂
夫 ４代理人 住 所 東京都板橋区小豆沢１丁目１番８号６ 補正の
内容 明細書および図面の浄書 （内容に変更なし） 手続補正書（自発） 昭和５９年１０月１２日 昭和５８年特許願第１２８８９３号 ２ 発明の名称 ヒト内来性癌制御因子およびその製造法３ 補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都中央区日本橋本町２丁目５番地１名称 （
６６７） 山之内製薬株式会社代表者 森 岡 茂 夫 ４ 代 理 人 住所 東京都板橋区小豆沢１丁目１番８号明細書の１発
明の詳細な説明」及び「図面の簡単な説明」の欄 訂正する。 （１） 明細書第６頁３行及び同頁１】行の「Ｍｏｎｏ
ｃｙｔｅｎ Ｊを「Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｊに、また同頁
１３行の １処理、」を「処理で」に訂正する。 （２） 同第６頁下から５行の末尾につづけて次の章句
を挿入する。 ［更に、培養細胞ＹＫＢＳ −７−１５はバスクール研
のＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、 （Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｎａｔ
ｉｏｎａｌｓ ｄｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓｍｉｃｒｏ−ｏ
ｒｇａｎｉｓｍｅｓ ）に寄託されている（寄託番号ｌ
−２５８）。」 （３）同第７頁６〜１６行の１これらの・・・・・・・
・ で培養される。」を次のように訂正する。 ［これらの細胞は２通常は牛脂児血清を含有する人工栄
養培地中で組織培養される。例えば、実施例１で用いた
ＹＫＢＳ−７−１５は、１０％ＦＣ８（Ｆｅｔａｌｃａ
ｌｆ ｓｅｒｕｍ、牛脂児血清）、１ｍＭへペス緩衝液
。 ２５μｇ／ｍ１（ｒ）ヘニシリン及ヒストレプトマイシ
ンを含有する人工栄養培地であるＲＰＭＩ培地（ＧＩＢ
ＣＯ社製）で培養される。また、血清を含まない無血清
人工栄養培地中に於ても組織培養することが可能である
。更に人以外の温血動物９例えばヌードマウスや幼若ハ
ムスターの腹腔内、皮下に於ても充分増殖が可能である
。本発明の組織培養系にはかかるｉｎ ｖｉｖｏの増殖
系も含まれる。」（４） 同第９頁最終行「ポリサッカ
ライド」を１リポポリサツカライド」に訂正する。 （５）同第２４頁１２行［Ｍｏｎｃｙｔｅｎ Ｊを［Ｍ
ｏｎｏｃｙｔｅ Ｊに訂正する。 （６）同第２５頁最終行及び第２９頁１２行の１活性と
して」を１活性としては」に訂正する。 訂正する。 （１）明細書第３０頁５行ＦＤｖＡ」を［０ＶＡＪ Ｋ
、 同頁８行「２８０ｒｒＩｒｒ＋」を［２８０ｎｍ
Ｊに訂正する。 ３−
Claims (3)
- （１） 分子量が８２，０００±１０，０００で等電点
がｐＨ６，５十０．５であるヒト内来性癌制御因子。 - （２）組織培養系で第１刺激物質を作用させたヒト由来
の単球系細胞の正常細胞またはその癌化細胞に、第２刺
激物質を作用させてヒト内来性癌制御因子を生成させ１
次いで該ヒト内来性癌制御因子を採取することを特徴と
する分子量が８２，０００±１０，０００で２等電点が
ｐＨ６，５＋０５であるヒト内来性癌制御因子の製造法
。 - （３） ヒト由来の単球系細胞がヒト由来の単球マクロ
ファージ系の癌化細胞であることを特徴とする特許請求
の範囲第２項記載のヒト内来性癌制御因子の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58128893A JPS6019720A (ja) | 1983-07-14 | 1983-07-14 | ヒト内来性癌制御因子およびその製造法 |
| DK6076/83A DK607683D0 (da) | 1983-07-14 | 1983-12-30 | Human endogen cancer-regulerende faktor og fremgangsmade til fremstilling af en sadan faktor |
| GR73450A GR81438B (ja) | 1983-07-14 | 1984-01-09 | |
| CA000445054A CA1224172A (en) | 1983-07-14 | 1984-01-11 | Human endogenous cancer regulatory factor, process for preparing the same, pharmaceutical composition containing the same and human monocytic leukemia cell lines |
| PH30106A PH22226A (en) | 1983-07-14 | 1984-01-16 | Human endogenous cancer regulatory factor, process for preparing the same and pharmaceutical composition containing the same |
| ES528971A ES8601705A1 (es) | 1983-07-14 | 1984-01-18 | Un procedimiento para la produccion de un factor endogeno humano regulador del cancer |
| EP84107015A EP0134923A3 (en) | 1983-07-14 | 1984-06-19 | Process for preparing a human endogenous cancer regulatory factor, pharmaceutical composition containing the same, and human monocytic leukemia cell lines |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58128893A JPS6019720A (ja) | 1983-07-14 | 1983-07-14 | ヒト内来性癌制御因子およびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6019720A true JPS6019720A (ja) | 1985-01-31 |
Family
ID=14995948
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58128893A Pending JPS6019720A (ja) | 1983-07-14 | 1983-07-14 | ヒト内来性癌制御因子およびその製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0134923A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6019720A (ja) |
| CA (1) | CA1224172A (ja) |
| DK (1) | DK607683D0 (ja) |
| ES (1) | ES8601705A1 (ja) |
| GR (1) | GR81438B (ja) |
| PH (1) | PH22226A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4524026A (en) * | 1983-08-29 | 1985-06-18 | Yoshio Sakagami | Novel proteinous cancer-cell proliferation inhibitory factors |
| US6686455B1 (en) | 1984-07-05 | 2004-02-03 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor |
| US5672347A (en) * | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
| US5198428A (en) * | 1991-04-05 | 1993-03-30 | Board Of Regents, The Univ. Of Texas System | Macrophage cytotoxin compositions and methods of preparation |
| DE4124758A1 (de) * | 1991-07-25 | 1993-01-28 | Max Planck Gesellschaft | Antitumorwirksame substanz aus humanen makrophagen |
| US8253645B2 (en) * | 2006-04-28 | 2012-08-28 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) | Method and device for coupling cancellation of closely spaced antennas |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2513124B1 (fr) * | 1981-07-21 | 1989-11-17 | Hayashibara Biochem Lab | Production et applications du facteur de lyse des cellules-cibles |
-
1983
- 1983-07-14 JP JP58128893A patent/JPS6019720A/ja active Pending
- 1983-12-30 DK DK6076/83A patent/DK607683D0/da not_active Application Discontinuation
-
1984
- 1984-01-09 GR GR73450A patent/GR81438B/el unknown
- 1984-01-11 CA CA000445054A patent/CA1224172A/en not_active Expired
- 1984-01-16 PH PH30106A patent/PH22226A/en unknown
- 1984-01-18 ES ES528971A patent/ES8601705A1/es not_active Expired
- 1984-06-19 EP EP84107015A patent/EP0134923A3/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1224172A (en) | 1987-07-14 |
| EP0134923A2 (en) | 1985-03-27 |
| PH22226A (en) | 1988-07-01 |
| EP0134923A3 (en) | 1986-12-03 |
| ES528971A0 (es) | 1985-07-01 |
| DK607683D0 (da) | 1983-12-30 |
| GR81438B (ja) | 1984-12-11 |
| ES8601705A1 (es) | 1985-07-01 |
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