JPS6048524B2 - 生物活性物質試薬およびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、非水溶性高分子化合物に生物活性物質を結合
させた生物活性物質試薬およびその製造方法に関する。

近年になつて、担体に結合された生物活性物質の選択的
に行なわれるべき反応に対する親和性の利用を主たる特
徴とする新しい技術が生化学的操作の分野でますます用
いられるようになつてきた。本発明の生物活性物質試薬
はこのような生化学的操作の分野に広く利用することが
でき、特にアフイニテイークロマトグラフイーに好適に
利用することができる。

担体に結合された物質と、混合物中に存在する第二物質
との特異的なコンプレックス形成を通して、当該物質を
その混合物から除去でき、次いで所望により脱着により
単離することができる。

担体に結合された酵素を用いれば、物質転化を連続製造
方法として行なうことができ、また反応生成物を酵素不
含に得ることができるという長所がある。生化学的酵素
的分析においては、担体に結合された非水溶性酵素は、
反復使用し得る試薬として利用することがてきる。

基質のみならす特異的阻害物質に対しても親和性を示す
という酵素の性質のために、酵素阻害物質の採取は、担
体に結合された酵素でのアフイニテイークロマトグラフ
イーにより行なうのが特に適切である。

一方、阻害物質を非水溶性マトリックスに結合すれば、
相当する酵素を調製採取できる。 ・，いわゆる免疫吸
着剤としては抗原または抗体を非水溶性マトリックスに
結合するが、それによつて相当する抗体または抗原を単
離することが可能となる。

生物活性物質としては、前述の記載に従つて生体内（Ｉ
ｎｖｉｖＯ）および試験管内（ＩｎｖｉｔｒＯ）で活性
な天然および合成物質が挙げられるが、それらは最も広
義な意味において酵素、活性化物質、阻害物質、抗原ま
たは抗体、ビタミンおよびホルモンと呼ぶことができる
。

これらの生物活性物質は非水溶性系の作用原理を描出し
ていることから、これらに対して「エフェクター（また
は発現物質月なる呼称が導入されている。これまでに報
告されている担体に結合されたエフェクターの大部分は
溶解状態の相当する生物活性物質よりも本質的に安定て
ある。

担体材料、いわゆるマトリックスとしては、水性系に不
溶であるほかに非特異的吸着が可及的に低いような物質
を用いるのが有利である。

それにはマトリックスとエフェクターの反応相手との間
の疎水性、親水性およびイオン性相互作用を充分防止せ
ねばならない。エフェクターに結合するのが望ましくな
い物質、例えばエフェクターの特異的反応相手ではない
ような物質に対しては、結合を生じさせるべきではない
。生物活性物質に対する担体として従来用いられている
マトリックスはエフェクターを物理吸着により結合する
もの（これには例えばポリスチレ・ン、活性炭およびガ
ラス球が属する）と、共有結合を介してエフェクターと
相互に結合するものとに大別される。

後者のマトリックスとしては例えばビニル重合体（例え
ば単独および共重合体）例えばポリアクリル酸、ポリア
クリル酸アミドおよフびアミノー、カルボキシーまたは
スルホニルー置換ポリスチレン、およびセルロースおよ
びその誘導体、および更に天然および合成ポリペプチド
および蛋白などが挙げられる。炭水化物、特にセルロー
ス、デキストラン、殿粉、寒天またはそれら５の誘導体
は、これら天然物中にしばしば含まれるカルボキシル基
が非特異的親和性を示すために障害があるように思われ
るにもかかわらす、マトリックスとエフェクターとの間
の相互作用が平均しているために最もよく用いられる。
更にまたこれｏらの物質は熱的および化学的安定性が比
較的低い。これらの欠点の多くは、ポリビニレングリコ
ールなる合成重合体をマトリックスとして用いることに
より充分解消することができた。

ポリヒドロキシメチレンとも呼ばれるポリビニレングリ
コールはポリビニレンカーボネートを酸性または塩基性
加水分解することにより製造される。各々の炭素原子は
ヒドロキシル基１個および水素原子１個を有している。
貫通する−Ｃ−Ｃ−結合は当該担体に特に高い安定性を
付与する。本発明によれば、ポリビニレングリコールに
代えてビニレングリコール共重合体を担体マトリックス
として有利に使用できることが見出された。

適当な共単量体をポリビニレンカーボネートに重合によ
り組込むことにより、それより製造されるポリビニレン
グリコールの物理的および化学的性質を広く変えること
ができる。すなわち、例えばポリビニレングリコールの
「親水性」または「膨潤性」は、疎水性単量体、例えば
エチレン、塩化ビニルまたはスチレンなどをポリビニレ
ンカーボネートに重合により組込むことにより変えるこ
とができる。酢酸ビニルの共重合により、けん化された
目的生成物においてビニレングリコール基はビニルアル
コール基により置換され、その結果水性媒質中での膨潤
性が高まる。共単量体例えばジエチレングリコールジビ
ニルエーテルおよびベンゼンなどを用いることにより架
橋することも可能であり、またそれ故に当該担体の機械
的性質を改善することができる。

親電子；官能部例えばビニルグリシジルエーテル共単量
体からのオキシラン基（エポキシ基）を重合により組込
むことにより、マトリックスを直接親核官能部（−ＮＨ
２、−０Ｈなど）と反応させることができる。カルボキ
シル基はアクリル酸エステル共単３量体を通して導入す
ることができる。共重合完了後にそのエステル基はカル
ボキシル基にけん化される。−ＮＨ。基または−ＣＯＯ
Ｈ基の導入により、カルボジイミド、イソオキサゾリウ
ム塩、グルタールアルデヒドなどによる活性化が可能と
なる。３．ビニレングリコール／ビニルアルコール共重
合体は比較的大きな比表面積を有するため、例えば蛋＊
＊白の重合体粉末表面への結合能はビニレングリコール
単独重合体よりも大きい。

従つて本発明の対象は、ポリビニレングリコールの好ま
しくは非水溶性の共重合体と、生物活性を維持しつつ該
共重合体に結合した生物活性物質とより成る生物活性化
合物である。

これらの化合物において、担体マトリックスは、４５％
まで、好ましくは５ 〜２０％の共単量体を含有するポ
リビニレングリコール共重合体である。生物活性物質は
フ例えば、酵素、活性化物質、阻害物質、抗原または抗
体、その他の血漿蛋白、血液型物質、植物性血球凝集素
、抗生物質、ビタミンまたはホルモン、ペプチドまたは
アミノ酸、あるいは合成により製造したエフェクターな
どの物質である。前記・重合体担体および生物活性物質
は直接または側鎖（スペーサー）を介して共有結合によ
り相互に結合される。生物活性化合物を側鎖（スペーサ
ー）を介して結合することは、それらに親和性を有する
相手の分子量が極めて異なる場合、あるいは生物特異性
を示すプロセスに用いる際に極めて高分子量を有する蛋
白またはいくつかのサブユニットから成る蛋白が関係し
てくる楊合に有利である。

スペーサーは重合体マトリックスに係留されたある長さ
をもつた側鎖であり、重合により、付加または組込み（
二官能性または多官能性化合物例えばトリペプチドをマ
トリックスに結合させる）により、または官能基の組込
みおよび該基における逐次的鎖延長により得ることがで
きる。本発明の対象は更に、前記生物活性物質と担体と
の共有結合による結合方法である。

これには、一連の一般に知られた反応を用いることがで
きる。

本発明方法はまず前記ポリビニレングリコール共重合体
の製造方法に関する。

該方法は、ビニレンカーボネートを一般式（式中Ｒ，は
水素、メチル、エチルを意味し、Ｒ。

はメチル、エチル、プロピルを意味し、またｎは１〜４
の整数を意味する）て表オ）される共単量体と重合させ
ることを特徴と２する。

ポリビニレンカーボネートの重合は４５％まての共単量
体、好ましくは５ 〜２０％の共単量体を用いて行なわ
れる。生物活性化合物は例えは、親電子性基を生物活性
物質またはポリビＰレングリコール共重合体に２導入し
、そして該基を介して前記生物活性物質をポリビニレン
グリコール共重合体と反応させることにより製造するこ
とができる。

担体マトリックスへの親電子性基の導入は、ビニレンカ
ーボネートを親電子性基含有共単量体と共重合させるか
、．または担体マトリックスを活性化親電子性基を有す
る低分子化合物と反応させることにより行なわれる。一
般に、担体マトリックスにある反応相手を化学的に結合
することは、一方に親核性の、そして他方に親電子性の
官能部が存在する場合には簡単である。

反応性親核性官能部としては就中アミノ基、スルフヒド
リル基およびヒドロキシル基が挙げられ、これらは通常
、マトリックスまたは反応相手にすてに含まれている。
親電子性官能部は導 フ入されねばならない。更に、カ
ルボキシル基を酸ハロゲニド、酸アジド、酸無水物、イ
ミグゾリドに導くことができ、あるいは直接カルボジイ
ミドで活性化することができる。反応性親電子性基Ｃし
てはイソシアネート基、イソチオシアネート基、ジアゾ
ニウム基または環状イミドカーボネートエステルなどを
用いることもできる。共重合により反応性基を導入する
のが特に適している。エポキシ基を有する単量体例えば
エポキシアルキルビニルエーテルをポリビニレンカーボ
ネートに共重合により導入することにより、また環状カ
ーボネート基とエポキシ基との間のけん化速度差が極め
て大である。親核性官能部と反応させることのできる反
応性エポキシ基を有するポリビニレングリコールマトリ
ツクスを容易に得ることができる。すなわち、生物活性
物質を直接結合することおよび／または側鎖（スペーサ
ー）を導入（延長）することが可能てある。従つて、共
重合体を用いることのもう一つの利点は、親電子性官能
部を直接導入すること（重合により組込むこと）ができ
ることであり、それによつて反応を既知の方法により行
なうことができる。ビニレンカーボネートをアクリル酸
エチルと共重合させ、次いでその重合体をけん化するこ
とにより、−０Ｈおよび−ＣＯＯＨ官能基を有するマト
リックスが得られる。

そのカルボキシル基はカルボジイミドにより活性化する
ことができ、その場；合、エフェクターのアミノ基に対
してアミド結合が生じる。更にまたカルボキシル基は、
ウッドワード（ＷＯＯｄｗａｒｄ）氏により提案された
イソオキサゾリウム塩によるアミド結合の形成を可能に
する。カルボキシル基含有重合体へ生物活性化合物ィ結
合するための他の方法は、Ｎ−エトキシカル・」キシル
ー２−エトキシ１・２−ジヒドロキノリー（ＥＥＤＱ）
を用いて行なわれる。

前記カルボキシル基は既知の方法によりエスッル化し、
次いでそのエステルをヒドラジドにイき、そして最後に
、結果的に得られるアジドを一エフェクター蛋白のアミ
ノ基を介してポリビニレングリコールマトリツクスと結
合することがでさる。

マトリックスに重合により導入された共単量体が爾後の
反応により遊離させることのできるアミノ基を有する場
合には、アリールアミノ基を含有するビニルスルホン誘
導体またはβ−ヒドロキシ５ エチルスルホンの硫酸エ
ステルによりアリールアミノ基を導入することができる
。

その際アリールアミノ基は次の既知の方法によりジアゾ
化し、次いでエフェクターの相当する反応性基と結合さ
せることができる。次にその一例を示す。この方法によ
り、スペーサーの「延長」を行なうこともできる。

蛋白をそのアミノ基を介して結合させる他の方法はグル
タールジアルデヒドを用いて行なわれる。

マトリックスへのエフェクターの結合は、ポリビニレン
グリコール共重合体のヒドロキシル基またはアミノ基を
シアンハロゲニド好ましくはブロモシアンを用いて活性
化し、次いでこの活性化された基を通してアミノ基含有
生物活性エフェクターを反応させることにより行なうの
が簡単である。

ポリビニレングリコールまたはポリビニレングリコール
共重合体マトリックスへのエフェクターの結合はまた、
そのヒドロキシル基をプロムアセーチルブ七ミドでアシ
ル化し次いでエフェクターのアミノ基をアルキル化する
ことによつて行なうこともできる。

例えば担体のヒドロキシル基を反応性トリアジンと反応
させることによつても同様に反応を行な４わしめること
ができる。

その場合、トリアジンの反応性基の一部はポリビニレン
グリコール化合物と反応し、他の一部はエフェクターの
アミノ基と反応する。一方において他の反応性基を介し
て担体のヒドロキシル基と結合し得るジアゾ化可能な芳
香族アミンは、他方において、カップリング能のある活
性化されたアミノ酸、例えば蛋白エフェクターの・チロ
シン残基またはヒスチジン残基とのカップリングを可能
にする。

アリールアミノ基を含有するビニールスルホン誘導体お
よびβ−ヒドロキシエチルスルホンの硫酸半エステルは
担体のヒドロキシ基と結合させることができる。

それらは前述のジアゾ化反応によるエフェクターの結合
を可能にする。ポリビニレングリコール共重合体のヒド
ロキシル基を、少なくとも２個の反応性基を含む非イオ
ン形成性エポキシド、例えばエピハロヒドリンまたはポ
リエポキシド、例．えばエピクロルヒドリンまたはビス
エポキシドなどと反応させた場合には特に安定なエーテ
ル結合が生じる。

他の変形例においては、共単量体（例えばビニルピロリ
ドン）をポリビニレンカーボネート鎖に重合により導入
し、次いでそのポリビニレンカーボネートのシクロカー
ボネート環をアミン例えばヘキサメチレンジアミンと部
分的に反応させて、ウレタン結合を介してスペーサーま
たはエフェクターにより置換されたポリビニレンカーボ
ネート共重合体とする。

次に残りのシクロカーボネートをヒドロキシル基にけん
化する。すなわちホリビニレンカーボネート 担体マトリックスと蛋白エフェクターまたは他のエフェ
クターとの間に共有結合をつくるための方法としては、
既に例示したものの他にも共重合２体のヒドロキシル基
または特定の基をエフェクターと反応させることにより
両者の間に共有結合をつくる別法も存在する。

例えは、錯体形成金属化合物、例えはチタン化合物を用
いる既知の反応はその一例てある。これらの方法はすべ
て当業者の２知るところてある。低分子の生物活性化合
物を結合する場合には、担体てはなくエフェクターの方
を活性化するのが有利なこともある。

原則的には、高分子化学において、合成または．天然高
分子化合物の変性に関して知られるあらゆる方法を用い
ることができる。

ポリビニレングリコール共重合体は化学的および熱的安
定性の点で優れているのみならず、操作技術的に有利な
性質を有するという点でも優れており、従つてこれまで
最適とされている天然炭水化物系の担体マトリックスよ
りもはるかに優れている。

それらは例えば繊維、糸、箔または球状粒子の形で製造
することができ、そのため結合されるべきエフェクター
の使用目的に応じて適当な形 ）を選択することができ
る。好ましくは、これらの共重合体は大きな比表面積を
有する微粉砕粉末の形で用いられる。エフェクターまた
はスペーサーの結合のために利用し得る表面の大きさを
工業的規模て調整できる点でも、ポリビニレングリコー
ル共重合体は既知の担体材料よりも優れている。

本発明による生物活性化合物は、親水性非水溶性の担体
に結合した他のエフェクターについてこれまて知られて
いる大部分の方法に使用できる。

従つて酵素を非水溶性にすることができる。この不溶性
酵素は自動分析による基質測定に、またいわゆる酵素電
極としてますます用いられつつある。担体に結合された
酵素の多くは安定性が高いため、工業規模での酵素反応
の実施に適している。担体に結合した生物活性物質は特
異的吸着剤としての性質を有しているために、アフイニ
テイークロマトグラフイーに広く利用されている。担体
に結合した天然または合成の酵素阻害物質を用いれば高
度の酵素精製が可能であり、一方エフェクターとしての
酵素は天然の酵素阻害物質を粗製抽出液から採取するの
に特に適していることが見出された。担体に結合した非
水溶性抗原はそれに対する抗体の単離に用いられるが、
このようにして得られる抗体は他の血清成分および他の
抗原を含；有しない。アフイニテイークロマトグラフイ
ーにおいては、沈殿し得ない抗体や、血清内濃度が低い
ために沈殿し得ない抗体も単離でき、また定量測定する
ことができる。実施例 ビニレンカーボネート共重合体の製造 共重合体（ＣＰ）の製造に用いるビニレンカーボネート
は使用前に硼水素化ナトリウム（ＮａＢＨ．踵量部に対
しビニレンカーボネートを１０腫量部使用）上で３３ｗ
ｒＩｎの圧力下に１時間還流 夕加熱し、次いで７５℃
／３３７−Ｉｒｍの圧力で長さ５０ｃｍのラシッヒ（Ｒ
ａｓｃｈｉｇ）−ガラスリングを充てんした銀筒カラム
を通して蒸留し、そしてなるべく速かに共重合に用いた
。

同様に、使用共単量体も予め蒸留により精製した。 （
実施例１ けん化されたビニレンカーボネート／酢酸ビニルー共重
合体からのポリビニレングリコール／ビニルアルコール
共重合体（ａ）９重量部のビニレンカーボネートおよび
１重量部の酢酸ビニルに、０．０５重量部のアゾビスイ
ソブチロニトリルを窒素下に溶解する。

その単量体混合物を窒素下に平坦にされた螺子栓付アル
ミニウム管（厚さ４ｗ０ｎ）幅６０Ｔｗｔ）長さ１５０
ＷｒＩｒＬ）に充てんし（充てん総量は約３５ｍ１）、
窒素（Ｎ２）下に密封し、そして４８時間５０゜Ｃの温
水浴中に吊す。得られる硬質で脆い合成樹脂プレートを
粉砕ミルて予め粉砕する。次いでその顆粒状物を圧力１
〜２ｒｍで５時間１２０℃に加熱して未重合残留単量体
を分離する。その単量体除去−した顆粒状物をミル内で
更に粒径＜０．１ＴｎＩｆｔとなるまで粉砕し、５叩重
量部の０．５Ｎ苛性ソーダに添加し、２０゜Ｃで高速攪
拌器を用いて１時間混合するとその際カーボネート基お
よびアセチル基がけん化される。非水溶性ビニレングリ
コーこル／ビニルアルコールーＣＰを枦取し、無機塩不
含に水洗しそして凍結乾燥する。３４イ／ｙの比表面積
（ＢＥＴ法により測定）を有するビニレングリコール／
ビニルアルコールーＣＰ４．７重量部が得られる。

３ （ｂ）実施例１（ａ）と同様であるが、ただし７重量部
のビニレンカーボネートに対し３重量部の酢酸ビニルを
用いる。

凍結乾燥した重合体粉末の比表面積が６２．５イ１ｙで
あるビニレングリコール／ビニルアル４ｔコールＣＰ４
．ｌ重量部が得られた。

（ｃ）比較実験の目的で、実施例１（ａ）と同様である
がただしｍ重量部のビニレンカーボネートを用い、共単
量体は全く用いない。

凍結乾燥した重合体粉末の比表面積が２０．５イＩダで
あるビニレングリコール単独重合体４．７重量部が得ら
れた。

実施例２ 丁 ビニレングリコール／ビニルグリシジルエーテル共
重合体７重量部のビニレンカーボネート、３重量部のビ
ニルグリシジルエーテルおよび０．１重量部のアゾビス
イソブチルニトリルから成る混合物を、実ｏ施例１（ａ
）と同様にして、平坦なアルミニウム管中、窒素（Ｎ２
）下に５０℃に加温する。

得られる合成樹脂プレートを実施例１（ａ）と同様に粉
砕し、単量体を除去し、粒径＜０．１Ｔｍとなるまで粉
砕し、５卯重量部の氷冷０．５ＮＮａ０Ｈ中に高速攪拌
器を用７いて３紛間懸濁し、次いでけん化された重合体
を直ちに遠心分離により採取し、氷水に懸濁し、氷冷下
に２ＮＨ２Ｓ０，を用いてＰＨ７に中和し、吸引ろ過し
、氷水洗浄しそして凍結乾燥する。１ｇあたり１．３ミ
リ当量のオキシラン基を含有）する〔Ｄ．Ｂｒａｕｎ氏
等著「ＰｒａｋｔｉｋｕｍｄｅｒｍａｋｒＯｍＯｌｅｋ
ｕｌａｒｅｎＯｒｇａｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ」第
２２１頁（１９６師発行）に従つて測定〕ビニレングリ
コール／ビニルグリシジルエーテルーＣＰ３．腫量部が
得られた。実施例３ アミノ置換共重合体担体物質 ３．鍾量部のビニレングリコール／ビニルグリシジルエ
ーテル（実施例２より）をウルトラーツラツクス（Ｕｌ
ｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）攪拌器を用いて１００重量部の
Ｈ２Ｏに懸濁し、そして１０ｍ１の３０％アンモニアと
混合する。

次いで小さな磁気攪拌器を用いて更に１時間５０゜Ｃに
て攪拌し、最後に吸引ろ過し、十分水洗しそして凍結乾
燥する。１ｆ１あたり０．９ミリ当量アミノ基を３−ア
ミノー２−ヒドロキシープロピル基（これはアンモニア
とグリシジル基との反応により生じる）を含有する共重
合担体物質３．５重量部が得られた。

実施例４ビニレングリコール／アクリル酸−ＣＰ ９重量部のビニレンカーボネート、１重量部のアクリル
酸エチルエステルおよび０．０５重量部のアゾビスイソ
ブチロニトリルを窒素下で実施例１（ａ）と同様に重合
させ、粉砕し、単量体を除去し、粒平＜０．１Ｔｒｆ１
７＄となるまで粉砕し、けん化し、吸引戸過し、洗浄し
そして凍結乾燥する。

担体１ｙあたり１．１ミリ当量のカルボキシル基を含有
し、ＢＥＴ法による比表面積が２７．２イ１ｙである親
水性重合体粉末５．腫量部が得られた。

実施例５５ω−アミノヘキシル基置換ポリビニレングリ
コーノレ５重量部のビニレングリコール／アクリル酸−
ＣＰ（実施例４より）をウルトラーツラツクス攪拌器を
用いて１００ｎｌιのＨ２Ｏに懸濁し、５゜Ｃに冷却１
（し、２．５ｙ（７）Ｎ−シクロヘキシルーＮ’− （
Ｎ−メチルモルホリノ）一エチルーカルボジイミドーｐ
−トルエンースルホネートと混合し、ＰＨ５および５゜
Ｃて３紛攪拌し、枦過し、そして迅速に氷水洗浄する。

次いでその活性化された担体を直ちに、１２ＮＨＣＩで
ＰＨ７．５に調整され５゜Ｃに冷却されたヘキサメチレ
ンジアミン（５ｙ）の水（１００ｍι）溶液に懸濁し、
そして更に２４時間これらの条件下に磁気攪拌器を用い
て攪拌し、吸引洒過し、充分水洗しそして凍結乾燥する
。２ 担体１ｙあたり０．７ミリ当量のアミノ基を有するω−
アミノヘキシル基置換ポリビニレングリコール４．５重
量部が得られた。

実施例６ 実施例１（ａ）により得られるＢＥＴ法による比表２面
積が３４イＩｙのビニレングリコール／ビニルアルコー
ルーＣＰの反応（ａ）エピクロルヒドリンとの反応 実施例１（ａ）により製造されるビニレングリコール／
ビニルアルコールーＣＰ５Ｏダを１１（７）２Ｎ二Ｎａ
ＯＨに懸濁し、２５０ｍιのエピクロルヒドリンと混合
し、そして２時間５５〜６０’Ｃにて攪拌する。

その懸濁液のＰＨ値はしばらくの後１０〜１１に低下す
る。ＮａＯＨ添加により更に１時間このＰＨ値に保つ。
２時間の反応時間後、固体物質を吸．引沖過し、水、ア
セトンおよび最後に再び水を用いて洗浄する。

（ｂ）ヘキサメチレンジアミンとの反応 ５０ｙのヘキサメチレンジアミンを１．５１の水に溶解
しそしてＰＨｌＯとなるまでＨＣＩを添加する。

その溶液に、実施例Ｅにより活性化されたビニレングリ
コール／ビニルアルコールーＣＰを添加し、そして５０
〜５５゜Ｃにて６時間攪拌する。次いてその生成物を吸
引濾過し、そしてヘキサメチレンジアミン不含となるよ
う水洗する。ｃ）１−アミノベンゼンー４−β−ヒドロ
キシエチルスルホン硫酸エステルとの反応実施例６（ｂ
）により得られる生成物を５０ｙの１−アミノベンゼン
ー４−β−ヒドロキシエチルスルホン酸エステルと共に
５５℃およびＰＨｌＯにて１時間攪拌する。

次いて固体物質を胛別し、水、アセトンおよび再び水を
用いて洗浄する。ｄ） ジアゾ化実施例６（ｃ）により
得られる生成物１０ｙをヌツチエ上で２００７７１１の
０．ＩＮＨＣＩを用いて洗浄し次いで３００Ｔｎιの０
．５ＮＨＣＩに懸濁する。

この懸濁液に攪拌しながら０〜４℃で０．ＩＮＮａＮ０
２溶液をジアゾ化において、ＫＩ−殿粉紙により亜硝酸
塩がわずかに過剰となるのが確認されるまで添加する。
１吟後、ヌツチエ上で濾別し、そして残留物を氷水、次
いて０．４゜Ｃの０．１５Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（
ＰＨ７．５）を用いて洗浄する。

（ｅ）蛋由との共有結合０．８ｇのアルブミンを３５０
ｗＬ１のホスフェート緩衝液（ＰＨ７．５）に溶解し、
４℃に冷却し、そして実施例６（ｄ）により製造される
生成物を添加する。

その懸濁液を２時間４゜Ｃにて攪拌し、次いで枦別しそ
して固体物質をＩＭＮａＣｌおよびホスフェート緩衝化
食塩溶液（略してＰＢＳ）（ＰＨ７．２の１１１５ＭＮ
ａ。ＨＰ０，−ＫＨ。ＰＯ。一緩衝液を含有する０．９
％ＮａＣｌ水溶液を用いて洗浄する。泪液および洗液に
ついて放射状免疫拡散方法によりアルブミンの検査を行
なう。そのようにして製造された担体１ｙに６０ｍ９の
アルブミンが結合している。実施例７ 実施例１（ｂ）により得られるＢＥＴ法による比表面積
が６２．５イｌダのビニレングリコール／ビニルアルコ
ールーＣＰの反応実施例６（ａ）〜（ｅ）に記載の反応
と同様にして１ｆ１の活性化された担体に８０ｍｇのア
ルブミンを定量的に結合することができる。

実施例８ 実施例６（ａ）〜（ｅ）に記載の反応と同様にして１ｇ
の活性化された担体に４５ｍ９のアルブミンを定量的に
結合することができる。

実施例９ ω−アミノヘキシル基置換されたビニレングリコール／
ビニルピロリドン共重合体９重量部のビニレンカーボネ
ートと１重量部のビニルピロリドンとに０．０５重量部
のアゾビスイソブチロニトリルを窒素下に溶解し、そし
て実施例１（ａ）と同様に重合させそして後処理する。

単量体の除去後、顆粒状物を溶解して１鍾量％ジメチル
ホルムアミド溶液とし、そしてこの溶液を１５ａｔｍｇ
の圧力でメタノール沈殿浴中に噴射する。得られる微細
繊維状沈殿ビニレンカーボネート／ビニルピロリドン共
重合体を吸引沖過し、更にメタノールで洗浄し、そして
２００重量部のメタノールに再懸濁する。（４）重量部
のメタノールに溶解した６重量部のヘキサメチレンジア
ミンを添加し、その懸濁液を２日間室温で攪拌し、吸引
沖過し、そしてメタノールで洗浄する。その洗浄したフ
ィルター残留物を次いで、ナトリウムメチラートｗ重量
部の９６％メタノール３０鍾量部中の溶液中で４日間室
温にて懸濁させ、メタノールで洗浄後極めて充分に水洗
しそして凍結乾燥する。担体１ｙあたり１．６ミリ当量
のＮＨ２基を含有する、ウレタン結合を通してω−アミ
ノヘキシル基により置換されたビニレングリコール／ビ
ニルピロリドン共重合体５．呼量部が得られた。実施例
１０２ コハク酸無水物および水溶性カルボジイミドを用いたω
−アミノヘキシル基置換共重合体（実施例９により製造
）へのＩｇＧの結合実施例９により製造されるω−アミ
ノヘキシル置換担体５重量部を１０゜ＣおよびＰＨ６に
て、水２００３重量部に懸濁された２．５重量部のコハ
ク酸無水物により４時間サクシノイル化する。

そのＰＨ値は２ＮＮａ０Ｈにより調整する。固体物質を
水洗後、生成物を１．２５重量部のＮ−シクロヘキシル
ーＮ″一（Ｎ−メチルモルホリノ）一エチルーカルボジ
イ３ミドーｐ−トルエンースルホネートと共にＰＨ５お
よび５゜Ｃにて３紛攪拌し、沖別しそして迅速に氷水洗
浄する。 ゛０．５重量部のＩｇＧを１（イ）重量
部のホスフェート緩衝液（ＰＨ７．５）に溶解しそして
前述の活性化され４ｆた担体と共に２４時間４℃におい
て攪拌する。

沖過後生成物を１Ｍ食塩およびＰＢＳを用いて洗浄する
。担体１ｇに７５ｍ９のＩｇＧが共有結合により結合さ
れる。

実施例１１ ビニレングリコール／ジエチレングリコールジビニルエ
ーテルー共重合体９重量部のビニレンカーボネートおよ
び１重量部のジエチレングリコールジビニルエーテルに
”０．１重量部のアゾビスイソブチロニトリルを窒素下
に溶解し、そして実施例１（ａ）と同様に、平坦なアル
ミニウム管内て窒素下に３日間５０℃に加温し重合させ
る。

実施例１（ａ）と同様に後処理およびけん化を行なつた
後３．５重量部のビニレングリコール／ジエチレングリ
コールジビニルエーテルが得られる。実施例１２ ビニレングリコール／Ｎ−アクリロイルアミノアセトア
ルデヒドジメチルアセタール（ａ）９重量部のビニレン
カーボネートと１重量部のＮ−アクリロイルアミノアセ
トアルデヒドジメチルアセタールとに０．０５重量部の
アゾビスイソブチロニトリルを窒素下に溶解する。

その単量体混合物を実施例１（ａ）と同様に重合させ、
後処理しそしてけん化して４．１重量部のＮ−アクリロ
イルアミノアセトアルデヒドジメチルアセタール／ビニ
レングリコール共重合体を得る。１呼量部のＮ−アクリ
ロイルアミノアセトアルデヒドジメチルアセタール／ビ
ニレングリコール共重合体を１０喧量部の１ＮＨＣ１中
で４〜５時間攪拌した。その活性化された担体を水およ
びホスフェート緩衝液（ＰＨ７．５）を用いて洗浄した
。（ｂ）０．５ｇのアルブミンを２００ＴＴＬｔ（７）
ＰＢＳに溶解し、そしてて上記（ａ）て製造された生成
物と共に１４時間４℃にて攪拌した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ビニレンカーボネートと一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１は水素、メチル、エチルを意味し、Ｒ＿３
   はメチル、エチル、プロピルを意味し、そしてｎは１〜
   ４の整数を意味する）で表わされる少なくとも１種の単
   量体とのビニレンカーボネート共重合体を加水分解して
   製造されたビニレングリコール共重合体に化学的に結合
   した酵素、活性化物質、阻害物質、抗原または抗体、血
   漿蛋白、血液型物質、植物性血球凝集素、抗生物質、ビ
   タミンまたはホルモン、ペプチドまたはアミノ酸、天然
   のまたは合成により製造されたエフェクターから選択さ
   れた生物活性物質からなる生物活性物質試薬。 ２（Ａ）ビニレンカーボネートと一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１は水素、メチル、エチルを意味し、Ｒ＿３
   はメチル、エチル、プロピルを意味し、そしてｎは１〜
   ４の整数を意味する）で表わされる少なくとも１種の単
   量体とのビニレンカーボネート共重合体を酵素、活性化
   物質、阻害物質、抗原または抗体、血漿蛋白、血液型物
   質、植物性血球凝集素、抗生物質、ビタミンまたはホル
   モン、ペプチドまたはアミノ酸、天然のまたは合成によ
   り製造されたエフェクターから選択された生物活性物質
   と反応させ、そして次いでなお存在するシクロカーボネ
   ート基をヒドロキシ基に導くか、または（Ｂ）ビニレン
   カーボネートの共重合体のシクロカーボネート基をヒド
   ロキシ基に導き、そして（ａ）前記共重合体中に存在す
   るかまたはこの共重合体に導入された親電子性基を生物
   活性物質と反応させるか、または（ｂ）そのヒドロキシ
   基を （１）まず親電子性基含有化合物そして次に生物活性物
   質と反応させるか、または（２）親電子性基含有生物活
   性物質と直接反応させることを特徴とする、ビニレング
   リコールの共重合体に化学的に結合した生物活性物質試
   薬の製造方法。