JP2565363B2 - トロンボゲンを形成しない基質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、物理的配合、表面への付着および（また
は）化学的手段により、ペプチド結合形又は遊離形とし
てのトロンボゲン非形成性内皮細胞表面多糖類（HSI）
を合成ポリマーあるいはバイオポリマー（基質）に配合
し、付着させあるいは両者を変性させる等の手段によ
り、医薬の分野で使用することの出来る血液親和性基質
を製造する方法に関するものである。これらのポリマー
は繊維、中空繊維、膜、器官代替部、カニューレ、シリ
ンジ、管、血液容器等の形であって良く、又これらは別
の材料から作ることも出来る。

非生理的ポリマーはこれに何らかの補助的手段を施こ
さない限り多少なりとも即座に血液を凝固させてしまう
ことが知られている。更に又、血液の流動状態（これは
基質の形状、表面状態および弾性に特に影響される）も
又血液の凝固プロセスに影響を与えることも知られてい
る。しかしながら、例えばEP−コポリマー、セルロー
ス、ふっ化ポリエチレン、ポリエーテルウレタン、ポリ
エーテルカーボネートあるいは例えばポリアクリルアミ
ドのヒドロゲルの様な適当なポリマーを選択すれば、該
ポリマーとの接触後も血液の凝固をかなり抑制すること
が出来る。

又血液の凝固をより効果的に抑制する別の方法として
は、疎水性ポリマーをアルブミンで被覆する方法があ
る。血液凝固を抑制する更に又別の可能な方法として
は、スルホン化又は硫酸化物、例えば硫酸化ポリエチレ
ン又はビニルスルホン酸を含有するコポリマーを使用し
ても良い。最良の抗血液凝固効果を得るのには、例えば
ヘパリンやヘパリノイドの様な抗血液凝固性性質をポリ
マー中に導入するかあるいは該物質でポリマー表面を変
性すれば良い。ヘパリンを微孔性プラスチック材料に導
入して（この場合、ヘパリンはそのプラスチック材料か
ら容易に拡散し得る）、抗凝固効果を得ることはすでに
行なわれている。又より良い効果が、例えばスチレンを
表面変成しそしてひき続きヘパリンとの塩様結合を行う
ことにより達成された。しかしながらこれまでに作成さ
れたものはどれも、例えば血液の管腔壁上の内皮細胞表
面自体に相応する様な血液親和性を保有するものではな
かった。

本発明の目的は、血液親和性ポリマー基質の製造方法
を提供することである。

本発明の主題は、生物学的に不活性な内皮細胞表面多
種類を、特にその凝固生理学的見地から、遊離形又はペ
プチド結合形として適当なポリマー中又はその表面に沈
着、吸着又は結合させる方法にある。この沈着、吸着又
は結合ファンデルクールス相互作用、塩架橋、キレート
形成又は共有結合により行なうことが出来る。この様に
変成したポリマーの血液親和性は、これまでに知られた
あらゆるポリマーに比べてより強力に改善されている。

上記の様にして変成したポリマーは人工器官、膜、中
空繊維、酸素添加装置、シリンジ、管、容器あるいは繊
維含有材料等に使用するとが出来、そして下記の様な特
徴を有している。

1.HSIが、酵素の不動化、膜の形成、可塑性処理ならび
にファンデルクールスか、疎水性相互作用、キレート形
成あるいは塩様結合等によるポリマー化学的方法等の公
知の方法に従って合成ポリマー又はバイオポリマーの表
面に付与されあるいは不動化されあるいは一体化されて
いる。

2.HSIがペプチド、たん白、糖およびポリマーにおける
化学的方法により合成ポリマーあるいはバイオポリマー
に共有結合により一体化されている。

ここで「HSI」とは内皮細胞表面たん白多糖類を意味
するものであり、これは約195,000の分子量を有し、そ
してその多糖部は１分子につき３〜４個の多糖鎖から成
って分子量35,000を有していて55,000のペプチド部に相
当する。この分子のサブユニットである多糖部（これは
たん白分解やアルカリ分解により入手可能である）は、
例えば下記の点に関する全ての生物学的凝集ならびに作
用試験において完全に不活性であることが示されてい
る。

・凝固因子との相互作用。

・抗トロンビンIIIとの相互作用。

・例えば血小板由来生長因子やEGF等の様なヘパリン結
合生長因子との相互作用。

・例えばコラーゲンＩ〜VI、ラミニン、フィブロネクチ
ン、ニドゲンおよびエンタクチンの様な結合組織の構成
ポリマーとの相互作用。

・血小板との相互作用。

この物質は、血液親和性基質の製造のためにポリマー
と結合させる際に残りのペプチド部と一緒にあるいはそ
れとは別個に多糖部として使用することが出来る。別の
種由来のHSIを使用する場合に、血漿たん白を残りのペ
プチド部に結合させるかあるいは免疫の付与によりペプ
チド結合HSI多糖類の長期にわたる耐性を抑制すること
が出来る。その様な場合に、ペプチド部は更にたん白分
解することにより短鎖化するか、あるいは所望によって
は0.5M NaOHの作用により完全に除去しても良い。

HSIは、塊状培養した内皮細胞の調整培地から、ある
いは内皮細胞自身から、その分子量、疎水性ならびに電
荷に従って単離される。

例えば、ウシ大動脈内皮細胞又はその他の種や組織
（例えば角膜や液腔等）由来の内皮細胞を、コラゲナー
ゼでの処理、機械的除去、例えばヘパリナーゼおよび
（又は）ヘパリチナーゼの様なその他の処理剤での処
理、トリプシン又はその他のプロテアーゼでの処理、あ
るいはEDTA、EGTA又はその他のキレート剤の作用等によ
り組織から単離し、そしてこれを大量に通常の組織培養
じん、ペトリ皿、中空繊維灌流培養装置、ビーズ、円筒
状じん容器を使用して、あるいはその他の種々の方法に
より培養する（１回の培養につき２×10⁹個の細胞）。
この培養は通常の組織あるいは細胞培養方に従って行な
う。

上記の様にして細胞を採取し、くり返し凍結および解
凍を行うことにより、あるいは超音波処理し、あるいは
陶器内処理したりあるいはその他の種々の方法によりホ
モジナイズし、そして10,000xgで遠心分離し、その上ず
みを洗浄剤、好ましくは２％SDSと一緒に溶解する。

内皮細胞の調整培地はHSIの別の起源としても使用す
ることが出来る。この目的のためには、まず最初に培地
をキレート剤（例えばEDTA）の存在下にコンドロイチナ
ーゼABCと一緒に培養し、回転蒸発器中で蒸発させ、そ
して次いで細胞を起源とするものについて上記したのと
原則的に同様の方法により処理する。

HSI含有物質をセファロースCL-4Bによるクロマトグラ
フ処理する。使用カラムの大きさは、直径と高さとの比
が1:10ないし1:50（例えば、10×200cm）である。溶離
剤としては0.13Mトリス/HCl、0.1％ SDS（pH7.4）なら
びにその他の適当な溶出用化合物を使用出来る。定性段
階でのHSIの検出は、クロマトグラフィー画分から採っ
たアリクオットを、糖の検出法（例えばオルシン反応）
の形で、あるいはウロン酸の検出法（例えばカルバゾー
ル反応）の形で、又あるいはセファロースクロマトグラ
フィーの前に少量の放射性標識したHSIを添加する方法
やあるいはその他の種々の方法の形で反応させることに
より行なうことが出来る。

こうして固定したHSIを含有するクロマトグラフィー
画分を回転蒸発器を使用して1/10に蒸発させ、セファデ
ックスＧ−25でのクロマトグラフィー、透析および限外
ろ過膜による限外ろ過により脱塩し、80％エタノール中
あるいはその他の種々の方法により沈でんさせ、そして
次いで３〜7M尿素中、又は洗浄剤（例えば0.1％トリト
ンＸ−100）中、又は緩衝塩（例えば0.1M NaAc、pH6.
5）中に吸収させる。この溶液を7M尿素、洗浄剤および
緩衝塩の存在下に陰イオン交換カラム（例えばDEAE−セ
ルロース）に供給し、そしてその後に塩傾斜法（例えば
０−1M NaCl）によりカラムから溶出する。

これを更に精製するのに次の様な方法を使用すること
が出来る。

・好ましくは1.4g/mlの媒体濃度でのCsCl傾斜法による
密度超遠心分離。

・ゲル−クロマトグラフィー／イオン交換クロマトグラ
フィーのサイクル反復。

・親油性ゲル（例えばオクチル−セファロース）による
クロマトグラフィー。

・イオン交換カラム、シリカゲルカラム、逆相カラムな
らびにゲルカラムによるHPLC。

HSI組成物の均質性試験には下記の基準を使用する。

（１） 加水分解生成物中にガラクトサミンが検出され
ないことは、硫酸コンドロイチンの汚染のないことを示
す。

（２） 280nmにおいて極大吸収、260nmにおいて極小吸
収を示す場合はRNAまたはDNA汚染のないことを示す。

（３） NV−篩アガロースゲル電気泳動における単一バ
ンドおよびSDSゲル電気泳動における単一バンドを示す
場合はたん白汚染のないことを示す。

（４） 0.5M NaOHで12時間４℃で培養すると高分子多
糖が検出される。

組成物を変成することによっても又、未処理細胞か
ら、あるいは未処理媒地からHSI多糖又はペプチド多糖
をアルカリ分解（例えば0.5M NaOH中、12時間４℃で培
養）により、あるいはたん白分解（例えばパパイン又は
プロナーゼを使用）により、又あるいは各製造工程中の
別の方法により遊離することが出来るようになり、そし
てこれはゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、密度勾配超遠心分離あるいはゲル透過カラ
ム、シリカゲルおよび（又は）逆相カラムを使用したHP
LCにより精製することが出来る。そして上記第（３）項
を除いて、上記の全部の均質性基準はこれらの組成物に
も適用出来る。

ここで「合成ポリマーおよびバイオポリマー」とは、
現在までに知られた全ての天然ポリマーならびに現在ま
でに作られた全ての合成ポリマーを意味するものであっ
て、種々の配列、種々の分子量および統計的なそして
（又は）代替的な配列を有する分子の種々の配列順序の
種々のホモポリマーならびにコポリマー、更には配列長
さが種々の分布状態にあるブロックコポリマー、トリブ
ロックコポリマー、イオノマー、グラフトコポリマー、
種々の架橋結合度のポリマーならびにポリマー類似反応
により変成した変成ポリマー等を包含する。以下に記載
のポリマーは本発明において使用可能なポリマーの具体
例を例示するものである。これらは更に共重合、グラフ
ト反応あるいはポリマー類似反応により変成することが
可能であり、従って本発明において適当に使用可能な合
成ポリマーおよびバイオポリマーの選択範囲は更に拡大
したものとなる。

ポリオレフィン、ポリエチレン（HDPE、LDPE、LLP
E）、ふっ化ポリエチレン、エチレンとブテン−
（１）、ペンテン−（１）又はヘキセン−（１）とのコ
ポリマー、エチレンとプロピレンとのコポリマー、EPR
−ゴム又はEPT−ゴム（ジエン構造を有する第３成分、
例えば、ジシクロペンタジエン、エチリデンノルボネ
ン、メチレンエンドメチルヘキサヒドロナフタレン、シ
ス−シス−シクロオクタジエン−1,5−ヘキサジエン−
1,4）、ヘキシン（１−ヘキセンメチルヘキサジエ
ン）；エチレン−酢酸ビニルコポリマー、エチレン−メ
タクリル酸コポリマー、エチレンＮ−ビニルカルバゾー
ル、エチレントルフルオロ−モノクロロエチレン、ポリ
プロピレン、ポリブテン−（１）、ポリ−４（メチルペ
ンテン−（１））、ポリイソブテンコポリマー、イソブ
テン−スチレンコポリマー、ブチルゴム、ポリスチレン
および変成スチレン、クロロメチル化スチレン、スルホ
ン化スチレン、ポリ（４−アミノスチレン）、スチレン
−アクリロニトルルコポリマー、スチレン−アクリロニ
トリル−ブタジエンコポリマー、アクリロニトリル−ス
チレン−アクリルエステルコポリマー、スチレン−ブタ
ジエンコポリマー、スチレン−ジビニルベンゼンコポリ
マー、シス−トランス、１−２および３−４配置のポリ
ジエン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、精製天然ゴ
ム、クロロプレン、ポリスチレン、ブタジエンコポリマ
ー（SBR）、トリブロックポリマー（SBS）、NBR−アク
リロニトリル−ブタジエンコポリマー、ポリ−（2,3−
ジメチルブタジエン）、脂環式第２アミン又はベンジル
−Ｌ−グルタメート又はポリペプチド又はＮ−カルボベ
ンズオキシリジン末端を有するポリブタジエンのトリブ
ロックコポリマー、ポリ−（アルケナマー）−ポリペン
テナマー、ポリ−（１−ヘキセンメチルヘキサジエ
ン）、ポリフェニレン、ポリ−（ｐ−キシレン）、ポリ
酢酸ビニル、酢酸ビニル−ステアリン酸ビニルコポリマ
ー、酢酸ビニル−ピバリン酸ビニルコポリマー、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルホルマール、ポリビニルブ
チラール、ポリビニルエーテル、ポリ−（Ｎ−ビニルカ
ルバゾール）、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリ−
（４−ビニルピリジン）、ポリ−（２−ビニルピリジン
オキシド、ポリ−（２−メチル−５−ビニルピリジ
ン）、ブタジエン−（２−メチル−５−ビニルピリジ
ン）コポリマー、四ふっ化ポリエチレン、テトラフルオ
ロエチレン−ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、テ
トラフルオロエチレン−パーフルオロプロピルビニルエ
ーテルコポリマー、テトラフルオロエチレン−エチレン
コポリマー、テトラフルオロエチレン−トリフルオロニ
トロソメタンコポリマー、四ふっ化エチレン−パーフル
オロメチルビニルエーテルコポリマー、四ふっ化エチレ
ン−（パーフルオロ−４−シアノブチルビニルエーテ
ル）コポリマー、ポリ−（トリフルオロモノクロロエチ
レン）、トリフルオロモノクロロエチレン−エチレンコ
ポリマー、ふっ化ポリビニリデン、ヘキサフルオロイソ
ブチレン−ふっ化ビニリデンコポリマー、ポリふっ化ビ
ニル、ポリ塩化ビニル、ABS,MBS,NBR、塩化PE、EVAC又
はポリアクリレートを付加した耐衝撃性PVC、軟PVC、後
塩化PVC、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー、塩化ビ
ニル−プロペンコポリマー、ポリ塩化ビニリデン、塩化
ビニル−塩化ビニリデンコポリマー、塩化ビニリデン−
アクリロニトリルコポリマー、ポリアクリル酸、アクリ
ル酸−イタコン酸コポリマー、アクリル酸−メタクリル
酸コポリマー、アクリルエステル−アクリロニトリルコ
ポリマー、アクリルエステル−２−クロロエチルビニル
エーテルコポリマー、ポリ−（1,1−ジヒドロパーフル
オロブチルアクリレート）、ポリ−（３−パーフルオロ
メトキシ−1,1−ジヒドロパーフルオロブチルアクリレ
ート）、ポリスルホン、ポリアクロレインポリアクリル
アミド、アクリル酸−アクリルアミド−コポリマー、ア
クリルアミド−マレイン酸コポリマー、アクリルアミド
−ヒドロキシメチルメタクリレートコポリマー、アクリ
ルアミド−メチルメタクリレートコポリマー、アクリル
アミド−メチルアクリレートコポリマー、アクリルアミ
ド−無水マレイン酸コポリマー、アクリルアミド−無水
メタクリル酸コポリマー、アクリルアミド−アニリノア
クリルアミドコポリマー、アクリルアミド−（Ｎ−アク
リロイル−４−カルボキシメチル−2,2′−ジメチルチ
アゾリン）コポリマー、ポリメタクリルアミド、メタク
リル酸−メタクリロニロリルコポリマー、メタクリル酸
−３−フルオロスチレンコポリマー、メタクリル酸−４
−フルオロスチレンコポリマー、メタクリル酸−３−フ
ルオロアニリドコポリマー、メタクリル酸とメタクリル
酸−３−フルオロアニリド又はフルオロスチレンとのニ
トロ化コポリマー、又はメタクリル酸と3,4−イソチオ
シアナトスチレンとのコポリマー、又はＮ−ビニルピロ
リドンと無水マレイン酸とのコポリマー、又はポリビニ
ルアルコールおよびポリアリルアルコール、ポリアクリ
ロニトリル、アクリロニトリル−２−ビニルピリジンコ
ポリマー、アクリロニトリル−メタリルスルホネートコ
ポリマー、アクリロニトリル−Ｎ−ビニルピロリドンコ
ポリマー、水酸基含有PAN、アクリロニトリル−酢酸ビ
ニルコポリマー、アクリロニトリル−アクリルエステル
コポリマー、ポリアリル化合物、ポリジアリルフタレー
ト、ポリ−トリスアリルシアヌレート、ポリ−α−シア
ノ−アクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリ
レートおよびアクリロニトリルとのコポリマー、メチル
メタクリレート−ラウリルメタクリレートコポリマー、
パラ−アセタミノフェニルエトキシメタクリレート−メ
チルメタクリレートコポリマー、グリコールジメタクリ
レート−メタクリレートコポリマー、ポリ−２−ヒドロ
キシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタ
クリレート−メチルメタクリレートコポリマー、グリコ
ールメタクリレート−グリコールジメチルメタクリレー
トコポリマー、HEMA−スチレンブロックおよびグラフト
コポリマー、ポリ−N,N′−P,P′−オキシジフェニレン
メライトイミド、ポリジフェニレングリコールビスアリ
ルカーボネート、脂肪族ポリエーテル、ポリオキシメチ
レン、ポリオキシエチレン、ポリフルオラール、ポリク
ロラール、ポリエチレンオキシド、ポリテトラヒドロフ
ラン、ポリプロピレンオキシド、エチレンオキシド−プ
ロピレンオキシドコポリマー、プロピレンオキシド−ア
リルグリシジルエーテルコポリマー、ポリエピクロルヒ
ドリン、エチレンオキシド−エピクロルヒドリンコポリ
マー、ポリ−1,2−ジクロロメチル−エチレンオキシ
ド、ポリ−2,2−ビス−クロロメチル−オキサシクロブ
タン、エポキシ樹脂、ビスフェノールＡ−ジグリシジル
エーテル、フェノールホルムアルデヒド樹脂、クレゾー
ルホルムアルデヒド樹脂、炭素無水物との架橋結合体、
ジエチレンジアミン、イソホロンジアミン、4,4′−ジ
アミノフェニルメタンとしてのアミン、芳香族ポリエー
テル、ポリフェニレンオキシド、ポリフェノール、フェ
ノキシ樹脂、脂肪族ポリエステル、ポリラチクド、ポリ
グリコリド、ポリ−β−プロピオン酸、ポリ−β−Ｄ−
ヒドロキシブチレート、ポリピボラクトン、ポリ−ε−
カプロラクトン、ポリエチレングリコールセバケート、
ポリエチレングリコールアジペート、無水マレイン酸、
無水フタール酸、イソフタール酸、テレフタール酸又は
HETとエチレングリコール、1,2−プロピレングリコー
ル、ネオペンチルグリコール、オキシエチル化ビスフェ
ノール又はシクロドデカンジオールとからの不飽和ポリ
エステル、不飽和ポリエステルとスチレン、メタクリレ
ート、ビニルモノマー、酢酸ビニル又はメタクリル酸メ
チルとの共重合による不飽和ポリエステル樹脂又はビニ
ルエステル樹脂の架橋結合体、ビスフェノールＡおよび
その誘導体からのポリカーボネートおよびポリエーテ
ル、ビスフェノールＡおよびその誘導体からのセグメン
ト含有ポリカーボネート、および脂肪族ポリエーテルお
よび脂肪族ポリエステル（上記参照）、表面変成ポリエ
チレングリコールテレフタレート（PET）、アクリル酸
でグラフトしたPET又は表面を部分加水分解したPET、ポ
リブチレングリコールテレフタレート、ポリエチレング
リコールテレフタレート、ポリエチレングリコールテレ
フタレート−アジペート、ポリエーテルブロックおよび
脂肪族ポリエステルブロックおよびポリヒドロフランブ
ロックでセグメント付与したポリエチレングリコールテ
レフタレート、ポリ−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、ヒ
ドロキシ安息香酸−イソフタール酸コポリマー、ヒドロ
キシ安息香酸−ヒドロキノンコポリマー、ヒドロキシ安
息香酸−テレフタール酸コポリマー、ヒドロキシ安息香
酸−P,P′−ジフェニルエーテル−コポリマー、ポリビ
ニルピロリドン、ポリビニルピロリドン−無水マレイン
酸−コポリマー、グリセリン、トリメチルプロパン、ペ
ンタエリスリトール、ソルビトールとフタール酸、こは
く酸、マレイン酸、フマール酸、アジピン酸およびあま
に油、ひまし油、大豆油、やし油の脂肪酸とのアルキド
樹脂、脂肪族ポリスルフィド−（Ｒ−S_x−）（ここでｘ
はいおう化度である）、芳香族ポリスルフィド、ポリチ
オ−1,4−フェニレン、フェノールおよびチオフェンの
芳香族ポリスルフィドエーテル、ポリエーテルスルホ
ン、ポリスルホ−1,4−フェニレン、ポリ−ｐ−フェニ
レンスルホン、ポリイミン、ポリエチレンイミン、分枝
ポリエチレン、イミン、ポリアルキレンイミン、ポリア
ミド、ポリヘキサメチレンアジピンアミド、ポリヘキサ
メレンセバシンアミド、ポリヘキサメチレンドデカンジ
アミド、ポリトリデカンブラシルアミド、植物油とジア
ミンおよびトリアミンとのベルサミド（versamide）、
ω−アミノカルボン酸とα，β，γ，δ−アミノカルボ
ン酸又はラクタムとのポリアミド、テレフタール酸−ｍ
−アミノベンズアミドコポリマー、例えばイソフタール
酸をｍ−アミノベンゾヒドラシドとのポリアミドヒドラ
ジド、例えばフマール酸とジメチルピペラジンとのポリ
ピペラジンアミド、テレフタール酸とテトラミノベンゼ
ン（置換体）、又はジアミノフェニルエーテルとジクロ
ルフェニルスルホン（置換体および環状体）、又はｍ−
フェニレンイソフタールイミドおよびテレフタールアミ
ドとのポリベンズイミダゾール、例えばピロメリット酸
２無水物とメトキシ−ｍ−フェニレンジアミンとのポリ
イミド、例えばピロメリット酸２無水物とジアミノペン
ジジンとのピロン、芳香族ポリアミド、ポリ−ｍ−フェ
ニレンイソフタールアミド、ポリ−ｐ−ベンズアミド、
ポリ−ｐ−フェニレンテレフタラミド、ｍ−アミノ安息
香酸−ｐ−フェニレンジアミン−イソフタール酸コポリ
マー、テレフタール酸およびヘキサメチレンテトラミ
ン、テレフタール酸およびトリメチルヘキサメチレンジ
アミンおよび2,4,4−トリメチルヘキサメチレンアミン
からの、あるいはテレフタール酸、ジアミノメチレンノ
ルボネンおよびカプロラクタムからの、あるいはイソフ
タール酸およびラウリンラクタムからの、あるいはイソ
フタール酸およびジ−４−（シクロヘキシルアミノ−３
−メチル）−メタンからの、あるいは1,12−デカンジア
ミドおよび4,4′−ジアミンジシクロヘキシルメタンか
らのポリ−4,4′−ジフェニルスルホンテレフタラミ
ド、例えばジカルボン酸ジクロリド、テレフタレール酸
およびイソフタール酸の様な複素環や、オキシダゾー
ル、トリアゾール、ビチアゾールおよびベンズイミダゾ
ール構造を有するジアミン複素環との芳香族ポリアミ
ド、３−（ｐ−アミノフェニル）−７−アミノ−2,4−
（1H,3H）−キナゾリドン＋イソフタール酸、ポリアミ
ノ酸、ポリ−Ｌ−メチル−Ｌ−ダルタメート、ポリ−Ｌ
−グルタミン酸糖、例えばグルタミン酸とロイシン、グ
ルタミン酸とフェニルアラニン、グルタミン酸とバリ
ン、グルタミン酸とアラニン、リジンとロイシン、ｐ−
ニトロ−D,L−フェニルアラニンとロイシン等からのコ
ポリペプチド、ジイソシアネートとジアミンおよび尿素
とからのポリ尿素、脂肪族および芳香族ジイソシアナー
トと２官能性および３官能性ヒドロキシル含有ポリエス
テル（上記参照）および脂肪族ポリエーテル（上記参
照）、およびこれらの２官能性アミノ基含有、ヒドロキ
シル基含有ならびにカルボキシル基含有物質（例えばヘ
キサメチレンジイソシアネート、ジフェニルメタンジイ
ソシアネート、トリレンジイソシアネート、2,4−およ
び2,6−トルイジンジイソシアネート、キシリレンジイ
ソシアネート、グリセリン、エチレングリコール、ペン
タエリスライト、３−ジメチルアミノ−1,2−プロパン
ジオールおよび炭水化物、脂肪族および芳香族ジカルボ
ン酸およびその誘導体、ｏ−、ｍ−、ｐ−フェニレンジ
アミン、ベンジジン、メチレン−ビス−ｏ−クロルアニ
リン、p,p′−ジアミノジフェニルメタン、1,2−ジアミ
ノプロパン、エチレンジアミン）による変成体からのポ
リウレタン、尿素および環状尿素、メラミン、チオ尿
素、グアニジン、ウレタン、シアナミド、酸アミドおよ
びホルムアルデヒドならびに長鎖アルデヒドおよびケト
ンからのアミノ樹脂、シリコーン、ポリジアルキルシロ
キサン、ジメチル−、ジエチル−、ジプロピル−、ジフ
ェニル−、フェニルメチルシロキサンとしてのジアリー
ルシロキサンおよびアルキル−アリールシロキサン、例
えばアリル基の様な官能基を含有するシリコーン、例え
ばアミノプロピルトリエトキシシロキサン、２−カルボ
キシルプロピルメチルシロキサンの様なアミノ基および
ビニル基を含有するγ−置換フルオロシロキサン、ジメ
チルシロキサン単位とポリスチレン又はポリカーボネー
トブロックとのブロックコポリマー、スチレン、ブチル
アクリレートとα，ω−ジヒドロキシ−ポリメチルシロ
キサン、3,3,3−トルフルオロプロピルメチルシロキサ
ン、アボカン（90％ポリプロピレングリコールおよび10
％シロキサン）とのトリブロックコポリマー、シリコー
ンとポリカーボネートとのブロックコポリマー、セルロ
ースおよびセルロース誘導体、例えばアセチルセルロー
ス、パーフルオロブチリルエチルセルロース、パーフル
オロアセチルセルロース、セルロースナイトレート、カ
ルボキシメチルセルロース、再生セルロース、ビスコー
スからの再生セルロースおよびその他のセルロース誘導
体、アガロース、カラギーナン、デキストラン、マンナ
ン、フルクトサン、キチン、ペクチン、グリコサミノグ
リカン、でん粉、グリコーゲン、アルギン酸としての多
糖類、および全てのデオキシ多糖類およびハロゲノーデ
オキシ多糖類、アミノ−デオキシ多糖類又はスルフヒド
リル−デオキシ多糖類およびその誘導体、ムレイン（mu
reine）、たん白質、例えばアルブミン、ゼラチン、コ
ラーゲンＩ〜XII、ケラチン、フィブリンおよびフィブ
リノーゲン、カゼイン、血漿たん白、乳たん白、動物お
よび植物組織からの構成たん白、大豆たん白、食品分野
のたん白。

上記のポリマーは、これまでに知られたあらゆるモノ
マーを種々変化させて合成し共重合させて作成したもの
であり、本発明において使用するポリマーはこれらから
広範囲に選択出来る。（モノマーについては「Funcfion
al Monomers」、R.H.YocumおよびE.B.Nyguist編、第Ｉ
〜II巻、Marcel Dekker（New York）社、1974年発行に
記載されている。）更に又、上記ポリマーはグラフト付
加、ポリマー様反応あるいは又更に別のブロックコポリ
マーやグラフトコポリマーの合成等により部分的に又は
完全に変成することが出来る。ポリマー混合物、混和
物、被覆ポリマーならびに複合体としてのポリマー等も
又合成することが出来る。これらのポリマーは更に又、
高エネルギー放射線照射、光照射、酸化、加水分解、光
化学反応、ハロゲン化、スルホクロル化、クロルメチル
化やあるいは有機溶媒中でのラジカル形成体Na、Li又は
Ｋとの反応等により表面変成させても良い。

ポリマー誘導体は又、ペプチド、たん白、多糖類およ
びポリマー化学の分野において反応性ポリマーを製造す
るのに使用するものとして知られている２官能性又は多
官能性の架橋剤の使用により作成することも出来る。以
下にポリマー誘導体を作成するのに使用出来る官能基又
は架橋剤分子を挙げる。本発明においてはこれから選択
使用することが出来る。

ホスゲン、ホルムアルデヒド、グリオキザール、アク
ロレイン、グルタール、ジアルデヒド、アジド、活性エ
ステル、無水物、酸塩化物、エステル、混合無水物、ブ
ロモシアノーゲン、ジフルオロニトロベンゼン、チオイ
ソシアネート、エポキシド、イミド、イソシアネート、
ウレチオン基、ジイソシアネート、トリイソシアネー
ト、マレインイミド、ジシクロヘキシルジイミド、N,
N′−ビス−（トリメチルシリルサルファージイミ
ド）、パーオキシド、ビニルケト基、芳香族ジアゾ化合
物、ビニルスルホン、トリクロロトリアジン、モノクロ
ロトリアジン、ジクロロトリアジン、ブロモクロロトリ
アミド、ブロモアクリルアミド、ジフルオロモノクロロ
ピリミジン、トリクロロピリミジン、ジクロロキノキサ
リン、クロロアセチルアミノ基、クロロアセチル尿素、
β−ハロゲノプロピオンアミド、α，β−ジハロゲノプ
ロピオンアミド、β−４級アンモニウムプロピオンアミ
ド、β−スルファトプロピオンアミド、β−スルホニル
プロピオンアミド、置換アルカンジカルボキサミド、置
換アルカンモノカルボキシレート、置換シクロアルカン
カルボキサミド、アルケンモノカルボキサミド、アリー
ルアミド、クロトンアミド、置換アリールアミド、モノ
−、ジ−およびトリ−ハロゲノアリールアミド、置換ク
ロトンアミド、アルケンジカルボキサミド、環状ハロゲ
ノマレインイミド、アルキンカルボキサミド、置換脂肪
族ケトン、置換脂肪族スルホン酸のアミド、置換メタン
スルホンアミド、置換エタンスルホンアミド、β−スル
ファトエチルスルホンアミド、β−チオスルファトエチ
ルスルホンアミド、四級アンモニウムエタンスルホンア
ミド、ビニルスルホンアミド、β−クロロビニルスルホ
ンアミド、反応性脂肪族スルホン酸のエステル、β−置
換エチルスルホン、β−チオスルファトエチルスルホ
ン、β−ハロゲノビニルスルホン、β−置換エチルアミ
ン誘導体、β−スルファトエチルアミン、β−ハロゲノ
エチルピラゾロン、Ｎ−（β−ハロゲノエチル）−アミ
ド、Ｎ−（β−スルファトエチル）−アミド、β−置換
エチルアンモニウム化合物、β−置換エチルアミド、N,
β−ハロゲノエチルスルホンアミド、スルホン酸のβ，
γ−ジハロゲノプロピオニルアミド、エチレンイミンお
よびエチレンイミン化合物、アリル基、プロパルギル
基、ジアリルフタレート、トリアリルシアヌレート、ベ
ンジル誘導体、２−置換チアゾールカルボン酸、クロロ
スルホニルピリジン、４−置換−3,5−ジシアノ−2,6−
ジクロロピリジン、2,6−ビス−（メチルスルホニル）
−ピリジン−４−カルボニルクロリド、クロロピラジジ
ン、ジクロロピリダゾン、１−アルキル−4,5−ジクロ
ロ−６−ピリダジン、クロロ−およびブロモ−ピリミジ
ン、３−（２′,4′,5′−トリクロロピリミジル−
（６′−アミノ）−アニリン、4,5,6−トリクロロピリ
ミジン−２−カルボニルクロリド、トリフルオロピリミ
ジン、トリフルオロモノクロロピリミジン、２−クロロ
トリアジニル誘導体、２−クロロ−４−アルキル−ｓ−
（トリカジニル−２−アミノカルボン酸）、２−クロロ
ベンゾチアゾールカルボニル、６−アミノ−２−フルオ
ロベンゾチアゾール、２−メチルスルホニル−６−アミ
ノベンゾチアゾール、2,3−ジクロロキノキサリン−６
−カルボニルクロリド、1,4−ジクロロフタラジン−６
−カルボニルクロリド、３−クロロ−1,2,4−ベンゾト
リアジン−１−Ｎ−オキシド−７−カルボニルクロリ
ド、フルオロ−２−ニトロ−４−アジドベンゼン、スル
ホン酸エステル、Ｎ−スルホニル尿素、チオ−スルファ
ト−ｓ−アルキルエステル、Ｎ−メチロール尿素、N,
N′−ジメチロールグリオギザールモノウレイン、テレ
フタールジアルデヒド、メシチレントリアルデヒド、イ
ソチウロニウム基、トリアシルホルマール。

上記の合成ポリマーおよびバイオポリマーならびにこ
れらから作成したポリマー誘導体は本発明に従って使用
して、上記した各架橋剤あるいは架橋剤の官能基と共に
あるいはポリマーの表面変成法に従ってHSIと一体化す
ることが出来る。又これと同様にして本発明に従って、
HSIを上記の各架橋剤分子や架橋剤の官能基と一緒に使
用して、あるいは表面変成法により変成してポリマーと
一体化しても良い。HSIとポリマー基質との共有結合は
「０」の架橋長を有して（すなわち、自己架橋あるいは
ポリマー基質又はHSIの官能基のみが関与している架
橋）、あるいは「０」より大きな架橋長を有して行なわ
れている。種々のスペーサー、例えば0.2〜9nmの親水
性、疎水性、両親媒性、帯電したあるいは非帯電の、可
撓性のあるいは嵩高のスペーサーを使用することも出来
る。

又HSIとポリマー又はポリマー誘導体との一体化は次
の様にして行なわれていても良い。

（１） ポリマーの陽帯電基、例えば四級アンモニウム
基およびホスホニウム基との塩形成架橋。

（２） 巨大分子の官能基と金属との間のキレート結合
を形成する公知方法によるキレート生成。

（３） 公知の官能基を有する、飽和および（又は）不
飽和の長鎖炭化水素（８〜30個のメチレン基から成る長
さを有する）で、あるいは環状の飽和又は不飽和炭化水
素、（その炭素数は６〜50である）でHSIおよび（又
は）ポリマー表面を変成させることによる疎水性相互作
用。

更に又、HSIとポリマーとの一体化は、プラスチック
工業分野での方法に従って、HSIをポリマー網状構造中
へ吸着させるかあるいは導入し、あるいはカプセル化す
るかあるいは又物理的に混合することにより行なうこと
も出来る。

本発明による血液親和性基質は、繊維、中空繊維、
膜、器官代替部、カニュール、シリンジ、管、血液容器
あるいはその他の形態として使用され、そしてここで使
用しあるいは合成するポリマーはそれぞれの必要とされ
る物理的、機械工学的ならびに化学的見地から選択され
る。

実施例 下記の実施例は本発明を説明するためのものである。
最初に本発明によりポリマー基質と一体化するためのHS
Iの製造について記載する。次にそのいくつかの例とし
てポリマー基質との共有結合による一体化について記載
する。尚ここでは容易に理解出来るように専ら同類のポ
リマーを使用した。

実施例１ ポリマー基質と一体化するためのHSIの培養ウシ大動脈
内皮細胞からの作成 屠殺したばかりのウシから大動脈を採取する。これら
を脂肪組織から分離し、そして大動脈肋間をクリップで
くくる。次いで大動脈を50mlの滅菌PBSで３回洗浄す
る。一方の端をクリップでくくりつけて、1mM EDTA/PBS
中の0.1％ウシパンクレアストリプシン（Boehringer Ma
nnheim製）の滅菌溶液を上部から大動脈中に注ぎ、次に
もう一方の端をくくりつける。こうして大動脈を37℃の
水浴中で7.5分間培養する。

最後の大動脈結紮糸の１つをとり除いて液体を滅菌ピ
ペットを使って除去する。溶液中にけん濁した細胞を80
0xg、37℃で遠心分離し、そして10,000Vのペニシリン
と、10,000Vのストレプトマイシンを含有する滅菌ダル
ベッコ変成必須培地（DMEM）＋10％ウシ胎児血清（内皮
細胞培地）中に37℃でけん濁させる。

75cm²の滅菌組織培養フラスコ中に20mlの内皮細胞培
地を入れて37℃で１時間培養する。遠心分離した細胞を
1mlの内皮細胞培地中にけん濁させてこのフラスコ中に
加える。次いでこれを５％CO₂および飽和水蒸気雰囲気
中37℃で培養器中に保持して細胞を培養する。

細胞を形態学的にかつ抗ウシ因子VIIIa抗体（Dianova
社、ハンブルグ）での染色法により特性決定する。

細胞を培養合流し、滅菌PBSで洗浄し、1mlのEDTA/PBS
中の2mlの0.1％トリプシンを使用して37℃で３分間培養
することにより基材から除き、5mlの内皮細胞培地と混
合し、800xgで遠心分離し、9mlの内皮細胞培地中に再け
ん濁し、そしてこのけん濁液3mlを新しい３個の75cm²の
組織培養フラスコ（上記と同じ）に播種する。

大量培養するために、75cm²のフラスコ中で培養する
のに上記したのと同様の方法で細胞を円筒形のびん中に
播種する。１回のHSI組成物を作るのに約10⁹個の細胞を
使用する。HSI組成物を作成するために、PBS中の1mlのE
DTAを使って基材から細胞を分離し、超音波処理を３回
（１回につき30秒間でそれぞれ１分間中断する）０℃で
行なって均質化し、10,000xgで遠心分離し、そして上ず
みを２％SDSに調整する。この溶液（約5ml）をセファロ
ースCL-6Bカラム（５×100cm）にかける。これを0.1％S
DS、0.1Mトリス/HCl、1mM PMSFおよび1mM EDTA（pH7.
5）で溶出する。20mlずつの画分を流速100ml/時で取り
出す。

クロマトグラフィーカラムボイド（画分35〜50）を80
％エタノール中に沈でんさせ,10,000xgで遠心分離し、
真空乾燥し、50mlの7M尿素、0.1％CHAPS（３−（３−ク
ロロアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ）−１−プ
ロパンスルホネート）、0.1Mトリス/HCl、1mM PMSFおよ
び1mM EDTA（pH7.3、緩衝液）中に溶解し、そしてDEAE
−セルロースカラム（2.5×5cm）にかける。このカラム
を前記の緩衝液で平衡化し、そして次いで該緩衝液（25
0＋250ml）を基準として０〜1MのNaClの直線傾斜により
溶出する。0.45〜0.6MのNaClの間に溶出した画分を集
め、80％エタノール中で沈でんさせ、10,000xgで遠心分
離しそして真空中で乾燥する。

この物質を12.8mlの0.1Mトリス/HCl、4M塩酸グアニジ
ニウムおよび1.4g/mlの密度の塩化セシウム中に溶解
し、そしてSW40ローター（Beckmann社）中、35000rpmで
60時間遠心分離する。遠心分離管を地上でパンクさせて
1mlづつの画分を集める。1.4g/mlより大きい密度の画分
を集め、80％エタノール中で沈でんさせ、10,000xgで遠
心分離しそして真空乾燥する。

この物質を2mlの0.1Mトリス/HCl、1mM PMSFおよび1mM
EDTA（pH7.5）中に溶解し、そして1Vコンドロイチナー
ゼABCおよび100V RNAマーゼ（Boehringer Mannbeim社）
を使用して37℃で１時間培養する。次いでこの物質を上
記したのと同じセファロースCL-6Bのクロマトグラフィ
ーに付与する。収量は平均10⁹個の内皮細胞につき約14m
gであった。

実施例２ ヒト臍内皮細胞調整培地からのHSI多糖の抽出 新鮮なヒト臍帯の臍静脈を滅菌PBSで洗浄し、そして
臍帯緩衝液中10,000のコラゲナーゼ（Boehringer Mannb
eim社）の滅菌溶液を使用して37℃で５分間灌流する。
この細胞を37℃、800xgで５分間遠心分離する。

ヒト血液を凝固させ、そして2,000xgで遠心分離して
ヒト血清を抽出する。これらはSMA-12プロフィールにお
いて病理学的数値を示すものであってはならない。

10頭の屠殺したばかりのウシの視床下部をホモジナイ
ズしそしてアセトン／クロロホルム（2/1）に抽出して
精製ウシ生長因子を得る。脱脂剤に不溶の残分を培地１
あたり15〜50mg使用する。

ヒト血漿からヒトフィブロネクチンを抽出する。まず
10gのゼラチン（Sigma社）を65℃で50mlの0.2M NaAcに
溶解する。200mlのセファロースCL-2Bを使用して10.5の
pHで10分間10gのブロモシアノーゲンと反応させる。次
いでこのゲル10lの0.2M NaAcで洗浄し、そしてゼラチン
溶液と４℃で24時間振とうする。5mlのアミノエタノー
ルを加えてから、溶液を再び７時間振とうする。このゲ
ルを4M塩化グアニジウムで次いでPBSで洗浄する（それ
ぞれ１づつ）。１のヒト血漿をこのゲルと一緒に４
℃で24時間振とうする。次いでこれをフィルター上で5l
のPBSで洗浄しそして200mlの1M NaClで溶出する。溶出
物を5lのPBSで３回透析しそして0.2μｍフィルターでろ
過して滅菌する。

ヒト内皮細胞を10,000Vのペニシリンと10,000Vのスト
レプトマイシンと生長因子とを含有する20mlDMEM＋10％
ヒト血清中にけん濁させる。2mlのフィブロネクチン溶
液を75cm²の組織培養フラスコ中に入れて室温で３時間
培養する。この溶液を除去し、フラスコをPBSで洗浄
し、そして細胞を加える。フラスコを細胞培養様培養器
（上記参照）中に入れる。

上記と同様の培地および培養装置ならびに培養技術を
使用して円筒びん中で継代的大量培養を行なう。

採集した調整培地（約25l）を10M NaOHないし0.5M Na
OHで調整して４℃で12時間培養する。次いで倍地を10M
HClを使って４℃でpH1.5に調整しそして10,000xgで遠心
分離する。上ずみを10M NaOHで中和し、そしてアミコン
PM10膜で限外ろ過して100mlとする。この溶液を80％エ
タノールに調整し、12時間４℃に放置し、そして10,000
xgで遠心分離する。沈でんをPBS中に溶解し、10Vのコン
ドロイチナーゼABCと一緒に56℃で１時間培養し、そし
てダウエックス１x²カラム（20mlゲル）にかける。この
カラムを各20mlの1M NaClと4M NaClで洗浄する。4M NaC
lでの溶出液を水で透析し、そして凍結乾燥する。収量
は約1.2mgであった。

実施例３ HSIとシリコーンとの結合 遊離OH基を有するシリコーン1gを18mlの蒸留水および
2mlのγ−アミノプロピルトリエトキシシラン（10％v/
v）を混合し、そして6M HClを使ってそのpH値を３〜４
の間に調整する。こうしてpH調節した後に、この溶液を
75℃に２時間加熱し、洗浄しそして乾燥する。アミノ基
含有シリコーン1gを0.05Mりん酸ナトリウム緩衝液中で
2.5％のグルタールジアルデヒド水溶液と混合しそしてp
H7.9に調整する。反応時間は60分である。こうして活性
化したシリコーンをHSIの１％溶液を２〜４時間攪拌す
ることにより反応させる。洗浄は6M尿素を使用して行な
う。

実施例４ HSIとシリコーンとのイソチオシアネート結合 アミノ基含有シリコーン1gをクロロホルム中の10％
（v/v）チオホスゲン溶液と反応させる。この反応混合
物を少なくとも４時間、好ましくは12〜15時間還流させ
る。これを乾燥クロロホルムで洗浄しそして真空乾燥す
る。１％HSI水溶液をこのイソシアネートシリコーンに
ゆっくりと加える（シリコーン1gあたり50〜100mgのHS
I）。pH値を8.5に調節して反応を２時間行ない、次いで
これを6M尿素溶液で洗浄する。

実施例５ HSIとアミノ基含有シリコーンとのカルボジイミド結合 50mlの0.03Mりん酸（pH4.0）を1gのアミノ基含有シリ
コーンに加える。次いで100〜200mgの水溶性カルボジイ
ミドと50〜100mgのHSIとをこの混合物に加えて24時間反
応させる。これを上記と同様にして洗浄する。

実施例６ 0.2mlのトリエチルアミンを含有するベンゼン10mlと
0.3gの1,3−ジクロロ−５−メトキシトリアジンとを1g
のアミノ基含有シリコーンに加える。反応混合物を２〜
４時間45〜55℃に保持する。HSI（50〜100mg）との結合
反応を４℃、pH8において0.05Mりん酸緩衝液中で一晩行
なう。これを上記と同様にして洗浄する。

実施例７ HSIのグルタールジアルデヒド上への不動化 0.1〜10mlの希ジアルデヒド溶液（0.1〜５％）を、1g
のアミノ基含有ポリマーとこれに分散又は含浸した10mg
のHSIとして加えて、pH7.4で0.5〜２分間反応させる。
次いでこれを速やかに冷水で洗浄する。

実施例８ HSIのポリマー上への熱的および光化学的不動化 1gのフルオロ−２−ニトロ−４−アジドベンゼンを0.
05Mほう酸ナトリウム緩衝液中、最高pH値10.5で50℃で1
6〜64時間暗所で10gのHSIと反応させる。反応生成物と
ろ過し95％エタノールで洗浄する。水銀ガス灯を使用し
て200〜300ワットで数時間ポリマーを光学的に不動化
（固定）させる。次いでこれを上記の様にして洗浄す
る。

実施例９ HSIとヒドロキシルおよびアミノ基含有ポリマーとのオ
キシラン基を介しての一体化 ２％の洗浄アガロースゲル10gを5mlの2.5M NaOH溶液
中にけん濁させる。20gの水素化ほう素ナトリウムを加
え、そして次いで1.4−ブタンジオールジグリドエーテ
ルを激しく攪拌しながら滴下する。反応を室温で６時間
続ける。次いで50mlアセトンをそしてその後で水を加え
る。このオキシランゲルを25mlの0.5M重炭酸ナトリウム
中にけん濁させて、50mgのHSIを加える。反応を５時間
続ける。生成物を上記の様にして洗浄する。

実施例10 HSIとポリマーとのアリールアミン基を介してアゾ結合 1gのアミノ基含有シリコーンを、５％（v/v）のトリ
エチルアミンと1gのｐ−ニトロベンゾイルクロライドを
含有する25〜30mlのクロロホルム中にけん濁させる。反
応混合物を少なくとも４時間還流させる。これを乾燥ク
ロロホルムで洗浄し、そして５％亜ニチオン酸ナトリウ
ム溶液中で還流させる。氷浴中で20mlの2N HClを加える
ことにより、1gのアリールアミンシリコーンとアゾ結合
が起る。100mgの個体亜硝酸ナトリウムを加えて30分間
ジアゾ化する。次いでこれを氷水で洗浄する。100mgのH
SIをpH8.5で0.05Mりん酸ナトリウム中に溶解し、そして
1gのジアゾ化ポリマーを加える。２〜18時間でカップリ
ングを行なわれる。生成物を上記した様にして洗浄す
る。

実施例11 アルキル化およびアシル化モノマーとの共重合によるポ
リマーに結合したHSIの製造 3,4−エポキシブテン、アクリル酸2,3−エポキシプロ
ピルエステル、アクリル酸2,3−チオグリシジルエステ
ル、１−アリルオキシ−３（Ｎ−エチレンイミン）−２
−プロパノール、アクリル酸ｏ−スクシンイミドエステ
ル又はアクリル酸クロライド、無水マレイン酸、無水ク
ロロマレイン酸、マレインアジド又はベロモプロペンを
HSIと等モル割合で反応させ、そして次いで通常の方法
により重合又は共重合体させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バウマン，ハンノ ドイツ連邦共和国、デー‐5100 アーヒ ェン、アウグスチネルヴェーク 23 (56)参考文献 特開 昭58−180162（ＪＰ，Ａ)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】HSIを合成ポリマー、コポリマーもしくは
   これらの誘導体およびバイオポリマーを含めたポリマー
   基質に固定することによる、医学分野で使用する物品を
   製造するためのトロンボゲンを形成しない物質の製造方
   法において、 該製造方法はHSIをバイオポリマー、合成ポリマー及び
   それらのコポリマー若しくは誘導体より成る群から選ば
   れる表面を有するポリマー基質に固定させることによる
   ものであり、HSIは内皮細胞によって生成される、分子
   量が各々35,000の３〜４個の多糖側鎖及び分子量55,000
   の中心部蛋白を有する特異性内皮表面蛋白多糖類であ
   り、該多糖側鎖は血液凝固因子と相互作用がなく、又グ
   リコサミノグリヤン、ヘパリン及びヘパランより成る群
   から選ばれる物質において観察される生物学的活性を示
   さないものであることを特徴とする、前記方法。
2. 【請求項２】１cm³のポリマー表面につき約0.01〜100μ
   ｇのHSIが共有結合しており、そしてHSIとポリマーとの
   間には１〜80個の共有結合部又は架橋結合部が存在す
   る、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 【請求項３】HSIのポリマー基質上又は中への固定を、
   １〜1000μg/cm³の濃度で、塩架橋、疎水相互作用、水
   素結合、ならびにファンデルワールスカ、吸着、マイク
   ロカプセル化あるいは網状内包により行うものである、
   請求の範囲第１項に記載の方法。
4. 【請求項４】HSIのたん白核を利用してHSIをポリマー基
   質に固定し、そして相互に種の相異するものへの生体内
   適用の場合には、HSIをたん白核の長さおよび構造は一
   切の免疫的又はその他の不適合が起こらない様に構成す
   るものである、請求の範囲第１〜３項に記載の方法。
5. 【請求項５】HSIを多糖鎖をポリマー基質に共有結合す
   るものである、請求の範囲第１〜３項に記載の方法。
6. 【請求項６】HSIをポリマー表面に固定するための共有
   結合を形成するあらゆる公知の架橋剤あるいは架橋方
   法、例えば染料のポリマーへの固定、たん白質のポリマ
   ーへの固定、たん白質又は炭水化物のポリマーへの固
   定、たん白質又は炭水化物のポリマーへの固定あるいは
   バイオポリマー相互の固定に使用するものが使用可能で
   ある、請求の範囲第１、２、４および５項に記載の方
   法。
7. 【請求項７】HSIおよび（又は）ポリマーの基質を公知
   のたん白化学法および酵素固定法ならびに多糖化学およ
   びポリマー化学的方法により活性化する、請求の範囲第
   １、２および４〜６項に記載の方法。
8. 【請求項８】HSIのポリマー基質への共有架橋が、架橋
   表「０」（自己架橋又はポリマー基質の官能基とHSIと
   が関与しているだけの架橋）か、あるいは0.2〜5nmの大
   きさの親水性又は疎水性、両親媒性又は帯電した又は非
   帯電のスペーサーを使用しての「０」より長い架橋長さ
   を有して行われているものである、請求の範囲第１、２
   および４〜７項に記載の方法。
9. 【請求項９】HSIのポリマー基質への塩様結合が帯電官
   能基の直接作用か、又は0.15〜200nmの大きさの、例え
   ば双性イオン物質やポリマー、たん白等の、HSIとポリ
   マー基質との間に存在する帯電物質が関与することによ
   り行われているものである、請求の範囲第１および３〜
   ５項に記載の方法。
10. 【請求項１０】帯電基がポリマー基質又はHSIの骨格に
    直接結合しているものであるか、あるいはポリマーの側
    鎖を0.15〜500nmの大きさに拡げることによりそれぞれ
    ポリマー基質およびHSIと該帯電基との間の距離を拡大
    させて結合しているものである、請求の範囲第１、３〜
    ５および９項に記載の方法。
11. 【請求項１１】HSIが最初に疎水性基を有する物質の部
    分である陽帯電基に結合することによりポリマー基質へ
    の疎水結合が形成されるものである、請求の範囲１およ
    び３〜５項に記載の方法。
12. 【請求項１２】HSIを塩様結合、水素結合、疎水相互作
    用ならびにファンデルワールス力によりポリマー基質に
    吸着させ、しかる後に請求の範囲６および８に記載の反
    応剤および方法により架橋結合が形成されるものであ
    る、請求の範囲第１〜５項に記載の方法。
13. 【請求項１３】HSIをまず、尚可溶性である様に作成さ
    れたポリマー基質と予備重合させることにより固定し、
    そしてしかる後にHSIを架橋剤と一緒にあるいはこれを
    使用することなく不溶性ポリマー基質に加えて重合させ
    るものである、請求の範囲第１および３項に記載の方
    法。
14. 【請求項１４】HSIを界面重合法、流体乾燥法、コアセ
    ルベーション法、相化学法ならびにリポリーム形成技術
    によりポリマー基質中にマイクロカプセル化する、請求
    の範囲第１および３項に記載の方法。
15. 【請求項１５】HSIとまずビニルモノマーの反応性側鎖
    と反応させ、そしてしかる後にこれを常法により他のモ
    ノマーと共重合させるものである、請求の範囲第１およ
    び２項に記載の方法。