JPS6037993A - フラクトシルトランスフェラーゼおよびその使用方法 - Google Patents
フラクトシルトランスフェラーゼおよびその使用方法Info
- Publication number
- JPS6037993A JPS6037993A JP59128395A JP12839584A JPS6037993A JP S6037993 A JPS6037993 A JP S6037993A JP 59128395 A JP59128395 A JP 59128395A JP 12839584 A JP12839584 A JP 12839584A JP S6037993 A JPS6037993 A JP S6037993A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sucrose
- glucose
- fructosyltransferase
- enzyme
- aldose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
- C07H5/02—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to halogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
- C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
- C07D407/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/12—Disaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はフラクトシルジサッカライド、特にノ・ロスク
ロース甘味剤特に4. 1’、6’−)リクロロ−4,
1’−6’−)リゾオキシ−ガラクトスクロース(TG
Sとして知られる)を酵素反応により製造する方法に関
する。
ロース甘味剤特に4. 1’、6’−)リクロロ−4,
1’−6’−)リゾオキシ−ガラクトスクロース(TG
Sとして知られる)を酵素反応により製造する方法に関
する。
4、 1’、6’−トリクロロ−4,1’、6’−)リ
ゾオキ7−がラクトスクロースは英国特許第15461
67号明細書に他のクロロスクロース誘導体と共に1示
されている強力な甘味剤である。6−ヒドロキシ基がエ
ーテル化されているか存在しない類似化合物はE P
0103479 fi−および()B2127806A
に記述されている。その他のハロケゞン置換基を有する
類似化合物はGB2104063Aに記述されている。
ゾオキ7−がラクトスクロースは英国特許第15461
67号明細書に他のクロロスクロース誘導体と共に1示
されている強力な甘味剤である。6−ヒドロキシ基がエ
ーテル化されているか存在しない類似化合物はE P
0103479 fi−および()B2127806A
に記述されている。その他のハロケゞン置換基を有する
類似化合物はGB2104063Aに記述されている。
TGSの一製造法は()B2079749Aおよび米国
特許第4,380,476号明細書に記載されている。
特許第4,380,476号明細書に記載されている。
この方法はスクロースの6−エステル、又はスクロース
の6−エステルを主として含有する混合物を調製し、つ
いでこの6−置換化合物を選択的に塩素化するものであ
る。続いてこの6−位で脱エステル化するとTGSが得
られる。実際、化学的手段を使う場合、特定の方法でス
クロース6−エステルを好収量で得るのは難しい。相当
する6−置換グルコースおよびフラクトシド糖から出発
して酵素反応を行ない、他の位置に置換基を有する他の
スクロースを含まない6−置換スクロースを得、ついで
出発物質とグルコースから容易に分離できる、6−置換
スクロース誘導体からTGSを難なく製造することがで
きる。
の6−エステルを主として含有する混合物を調製し、つ
いでこの6−置換化合物を選択的に塩素化するものであ
る。続いてこの6−位で脱エステル化するとTGSが得
られる。実際、化学的手段を使う場合、特定の方法でス
クロース6−エステルを好収量で得るのは難しい。相当
する6−置換グルコースおよびフラクトシド糖から出発
して酵素反応を行ない、他の位置に置換基を有する他の
スクロースを含まない6−置換スクロースを得、ついで
出発物質とグルコースから容易に分離できる、6−置換
スクロース誘導体からTGSを難なく製造することがで
きる。
問題の酵素はフラクトシルトランフェラーゼ゛である。
これは周知の酵素である。代表的酵素は75JrM’A
レバンスクラーゼであり、スクロース又はラフィノース
を分解してレバン、ボ゛リフラクトース誘導体を製造す
るものである。その通常の作用機作は、レバンスクラー
ゼはスクロース中のグルコーヌーフラクトース結合を分
解し、フラクトースをアクセプター糖例えばスクロース
自体に転換するものである。この方法は反復され、フラ
クトース鎖が完成される。スクロース以外に他の糖例え
ばD−キシロースが存在すると、レバンの生成が抑えら
れるかあるいは少なくとも減少し、その代りフラクトー
スは新規のフラクトシドを製造するためにアクセプター
として作用する他の拮抗糖(compθting su
gar )に転換する。この新規フラクトシドはドナー
としても作用し、実際所望の方向で均衡を増すために、
過量のドナーが使われて来た。
レバンスクラーゼであり、スクロース又はラフィノース
を分解してレバン、ボ゛リフラクトース誘導体を製造す
るものである。その通常の作用機作は、レバンスクラー
ゼはスクロース中のグルコーヌーフラクトース結合を分
解し、フラクトースをアクセプター糖例えばスクロース
自体に転換するものである。この方法は反復され、フラ
クトース鎖が完成される。スクロース以外に他の糖例え
ばD−キシロースが存在すると、レバンの生成が抑えら
れるかあるいは少なくとも減少し、その代りフラクトー
スは新規のフラクトシドを製造するためにアクセプター
として作用する他の拮抗糖(compθting su
gar )に転換する。この新規フラクトシドはドナー
としても作用し、実際所望の方向で均衡を増すために、
過量のドナーが使われて来た。
ある糖が良好なフラクトースーアクセゾターとして作用
し、レバンの生成を抑制する傾向にあることをHe5t
rinとAuigad (Biochem、 J、 6
9(1958)388〜698)は示した。第6番群は
明かに不活性であり、レバンの生成を抑制しなかった。
し、レバンの生成を抑制する傾向にあることをHe5t
rinとAuigad (Biochem、 J、 6
9(1958)388〜698)は示した。第6番群は
明かに不活性であり、レバンの生成を抑制しなかった。
D−グルコース6−リン酸塩は最後のカテゴリーにあっ
た。この論文で言及されている他のすべての糖は誘導化
されていない糖であった。
た。この論文で言及されている他のすべての糖は誘導化
されていない糖であった。
しかし、Bacillus 5ubtilis Mar
burg株168の変異株由来の酵素の存在下でグルコ
ース6−リン酸塩とスクロースとの反応が記述されてい
る( Kunst等、Eur、 J、 Biochem
、 42.611〜620(1974))。これらのお
よび他の著者(例えばDedonder、 Metho
ds in27mo1. 、8.5 Q Q〜505)
は常にフラクトースドナー(例えばシュクロース)/ア
クセプターの高化、例えば5:1〜10:1および工業
規模で実施不可能な低濃度を使用した。類似の反応は英
国特許出願第2046757Aに記述され、各種アルド
ース出発物質をActinomyces uiecos
usとB、 sub、tilis(株ATOO6051
、即ちMarburg株)を含むある微生物由来のレバ
ンスクラーゼの存在下スクロース又はラフィノースと反
応させる方法である。
burg株168の変異株由来の酵素の存在下でグルコ
ース6−リン酸塩とスクロースとの反応が記述されてい
る( Kunst等、Eur、 J、 Biochem
、 42.611〜620(1974))。これらのお
よび他の著者(例えばDedonder、 Metho
ds in27mo1. 、8.5 Q Q〜505)
は常にフラクトースドナー(例えばシュクロース)/ア
クセプターの高化、例えば5:1〜10:1および工業
規模で実施不可能な低濃度を使用した。類似の反応は英
国特許出願第2046757Aに記述され、各種アルド
ース出発物質をActinomyces uiecos
usとB、 sub、tilis(株ATOO6051
、即ちMarburg株)を含むある微生物由来のレバ
ンスクラーゼの存在下スクロース又はラフィノースと反
応させる方法である。
しかし、この特許出願では、アルドース番末常に未誘導
の糖であり、多分鎖形成反応を最小にするプこめに、ド
ナ一対アクセプターのモル比は1:5である。
の糖であり、多分鎖形成反応を最小にするプこめに、ド
ナ一対アクセプターのモル比は1:5である。
6−置換スクロース誘導体は相当する6−置換グルコー
ス又はがラクトースとフラクトシルトランフェラーゼと
スクロース、ラフィノース又に−Lスタキオースの存在
下で反応させて製造できることを本発明者は見出した。
ス又はがラクトースとフラクトシルトランフェラーゼと
スクロース、ラフィノース又に−Lスタキオースの存在
下で反応させて製造できることを本発明者は見出した。
ついでこの生g?+を4゜1′および6′−位置でノ・
ロデン化し、必賛なら6−置換基を除いて、目的のノ・
四糖を得ることカーできる。最初の反応はレバンの生成
なしで良収量で進行する。
ロデン化し、必賛なら6−置換基を除いて、目的のノ・
四糖を得ることカーできる。最初の反応はレバンの生成
なしで良収量で進行する。
本発明によれば、一般式
(式中、Aは水素原子又は基0H2X (但し、又は水
素原子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す)であり
、Yはハロゲン原子である)を有するクロロデオキマス
クロース又はがラクトスクロース誘導体の製造法を供し
、一般式 (式中、Aは水素原子又は基0H2X (但り、Xは水
素原子、アルコキシ基又は保護されたヒドロキシ基を示
す)である)を有するアルドースをフラクトシルジー又
はオリゴサツカライドとフラクトシルトランスフェラー
ゼの存在下反応させて、一般式 (式中、Aは弐…について記載した通りである)を有す
る化合物を得、ついで分離し、ハロゲン化し、そしてA
がan2xでありかつXがヒドロキシ基である式■の化
合物については、保護ヒドロキシ基を脱保護するもので
ある。
素原子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す)であり
、Yはハロゲン原子である)を有するクロロデオキマス
クロース又はがラクトスクロース誘導体の製造法を供し
、一般式 (式中、Aは水素原子又は基0H2X (但り、Xは水
素原子、アルコキシ基又は保護されたヒドロキシ基を示
す)である)を有するアルドースをフラクトシルジー又
はオリゴサツカライドとフラクトシルトランスフェラー
ゼの存在下反応させて、一般式 (式中、Aは弐…について記載した通りである)を有す
る化合物を得、ついで分離し、ハロゲン化し、そしてA
がan2xでありかつXがヒドロキシ基である式■の化
合物については、保護ヒドロキシ基を脱保護するもので
ある。
本発明に係る反応で使用するフラクトシルトランスフェ
ラーゼはB、 5ubtilis又は]lcrwini
a sp。
ラーゼはB、 5ubtilis又は]lcrwini
a sp。
(以前はAerobacter levanicumと
して知られていた)由来のものが望ましい。B、θub
tilisは特に望ましく、ある菌株は常法の発酵で大
規模によ(生育し、工業用酵素(例えばα−アミラーゼ
とβ−ラクタマーゼ)源として十分認容されている。
して知られていた)由来のものが望ましい。B、θub
tilisは特に望ましく、ある菌株は常法の発酵で大
規模によ(生育し、工業用酵素(例えばα−アミラーゼ
とβ−ラクタマーゼ)源として十分認容されている。
更に、フラクトシルトランスフェラーゼは主に更に、フ
ラクトシルトランスフェラーゼは主とじて細胞外酵素で
あるから、一層容易に得かつ精製−することができる。
ラクトシルトランスフェラーゼは主とじて細胞外酵素で
あるから、一層容易に得かつ精製−することができる。
使用酵素はインベルターゼ活性がないことが肝要である
。必要な場合、選択的インベルターゼインヒビター例え
ばp−ヒドロキシマーキュリベンゾエートを使用せねば
ならない。
。必要な場合、選択的インベルターゼインヒビター例え
ばp−ヒドロキシマーキュリベンゾエートを使用せねば
ならない。
B、 5ubtilis酵素は選択的沈澱又はその他の
簡便技術によりに3.5ubtilis液体培養物から
採ることができる。例えば、この培養物を遠心芥離して
細胞や細胞片を除き、硫酸アンモニウムで約65%にし
、再度遠心分離して、インベルターゼその他タン白系不
純物を除いてから、硫酸アンモニウムで約95%にもっ
ていく。ついで粗レバンスクラーゼを沈澱させ、更にこ
れをリン酸塩バッファー中に再溶解し、透析して精製す
ることができる。
簡便技術によりに3.5ubtilis液体培養物から
採ることができる。例えば、この培養物を遠心芥離して
細胞や細胞片を除き、硫酸アンモニウムで約65%にし
、再度遠心分離して、インベルターゼその他タン白系不
純物を除いてから、硫酸アンモニウムで約95%にもっ
ていく。ついで粗レバンスクラーゼを沈澱させ、更にこ
れをリン酸塩バッファー中に再溶解し、透析して精製す
ることができる。
重要な酵素はB、 5ubtilis Noより 11
871から得たフラクトシルトランスフェラーゼである
が、Noより 11872と11873株も興味がある
。
871から得たフラクトシルトランスフェラーゼである
が、Noより 11872と11873株も興味がある
。
これら菌株からの酵素も広い特異性を有するから、6−
置換銹導体に一層容易に使用できる。
置換銹導体に一層容易に使用できる。
本発明の別の特徴によれは、アクセプターアルドースの
不存在下で少なくとも0.1 MのkIn/スクロース
を有し、アクセプターアルドースの不存在下でフラクト
ースドナーから有意量のアルコール沈澱性物質を生成せ
ず、かつ界面活性剤に影響されず、約60℃で最適の活
性を示し、45℃までで少なくとも20分間活性である
、フラクトシルトランスフェラーゼを供する。
不存在下で少なくとも0.1 MのkIn/スクロース
を有し、アクセプターアルドースの不存在下でフラクト
ースドナーから有意量のアルコール沈澱性物質を生成せ
ず、かつ界面活性剤に影響されず、約60℃で最適の活
性を示し、45℃までで少なくとも20分間活性である
、フラクトシルトランスフェラーゼを供する。
これらの酵素に関し℃引用した2つの定数(K)ハ論、
ミカエリス−メントン定数であり、これは酵素反応の最
大率(レバン等を生成)の半分がおきる基質濃度であり
、そしてに1、インヒビタ一定数であり、これは酵素活
性の観察可能な最大阻害(レバン生成せず)の半分を生
成するインヒビター濃度である。
ミカエリス−メントン定数であり、これは酵素反応の最
大率(レバン等を生成)の半分がおきる基質濃度であり
、そしてに1、インヒビタ一定数であり、これは酵素活
性の観察可能な最大阻害(レバン生成せず)の半分を生
成するインヒビター濃度である。
株NOより 11871酵素の艙はアクセプターの不存
在下でスクロースについて約0.2 Mであり、[B、
5ubtilis B S 5 J (B、5ubti
lis var。
在下でスクロースについて約0.2 Mであり、[B、
5ubtilis B S 5 J (B、5ubti
lis var。
nigraからのクローン)からのDedonderの
レバンスクラーゼについて報告された勉はわずか0.0
2 Mであった。
レバンスクラーゼについて報告された勉はわずか0.0
2 Mであった。
B、 5ubtili8yaxB11871とhaxB
l 1872および11873はB、 5ubt’1m
1sの変種株テアル。
l 1872および11873はB、 5ubt’1m
1sの変種株テアル。
すなわち、分類試験(BarkleyとσoOdfel
low 。
low 。
「The Aerobic Endospore −f
orming Bacteria:01aeeific
ation ancl工dentifica、tion
J (1981)、Academic Press、
ロンドン、0ordon、 HaynesとPang
、[The Genus Bacillus J 、A
griculturalHandbook 1i0.4
27 (1976)、米国農務省、ワシントン州)およ
びAPI5 Q OHBとAPI 20にシステム(A
PPaystem S、A、 La Balme 1e
sGro1tes −3839[I Montalie
u Verciew、 FranceおよびLoqan
等、J 、 API91. Bact、 1978.2
8〜29)において、種間の殆んどすべての要件を満た
している。これらの試験では、多くのB。
orming Bacteria:01aeeific
ation ancl工dentifica、tion
J (1981)、Academic Press、
ロンドン、0ordon、 HaynesとPang
、[The Genus Bacillus J 、A
griculturalHandbook 1i0.4
27 (1976)、米国農務省、ワシントン州)およ
びAPI5 Q OHBとAPI 20にシステム(A
PPaystem S、A、 La Balme 1e
sGro1tes −3839[I Montalie
u Verciew、 FranceおよびLoqan
等、J 、 API91. Bact、 1978.2
8〜29)において、種間の殆んどすべての要件を満た
している。これらの試験では、多くのB。
5ubtilie株との主な有怠な差は、11cIB1
1B71株がラクトース陰性株で、キシロースから各種
酸生成を示すことである。Noより11872株はラク
トース陰性で、D−マンノース、メルビオースおよびト
レハロース、および0NPG反応において負の結果を示
す。N0IB 11 B 73株はラフ) −ス陽性で
、D−マンノースやイヌリンで負の結果を与える。
1B71株がラクトース陰性株で、キシロースから各種
酸生成を示すことである。Noより11872株はラク
トース陰性で、D−マンノース、メルビオースおよびト
レハロース、および0NPG反応において負の結果を示
す。N0IB 11 B 73株はラフ) −ス陽性で
、D−マンノースやイヌリンで負の結果を与える。
B、 5ubtt1isやFirWina SFの多く
の菌株から誘導したフラクトシルトランスフェラーゼは
一般にレバンスクラーゼであると見なされている。すな
ワチ、スクロースの存在下で、この酵素はレバン、アル
コール沈澱性であるポリフラクトース物質を生成させる
。フラクトースジサッカライドの生成に使用する場合、
レバン生成拮抗反応は、任意の有用な物質が得られる時
に抑えられねばならないから、高割合のアクセプター分
子を含有する反応混合物にGB2046757A中のこ
れら酵素を限定する。しかし、ここで使用するB、 [
1ut)tililllNolB 11871.118
72および11875酵素は余りレバンな生成しない。
の菌株から誘導したフラクトシルトランスフェラーゼは
一般にレバンスクラーゼであると見なされている。すな
ワチ、スクロースの存在下で、この酵素はレバン、アル
コール沈澱性であるポリフラクトース物質を生成させる
。フラクトースジサッカライドの生成に使用する場合、
レバン生成拮抗反応は、任意の有用な物質が得られる時
に抑えられねばならないから、高割合のアクセプター分
子を含有する反応混合物にGB2046757A中のこ
れら酵素を限定する。しかし、ここで使用するB、 [
1ut)tililllNolB 11871.118
72および11875酵素は余りレバンな生成しない。
「レバン」生成についてスクロースの艙は約0.2Mで
ある。これはDeaoncLer (loc、 cit
、 ) Marburg株酵素の約0.02Mの−と匹
敵する。均等濃度のアクセプターとドナー分子を使用し
かつ田中B、 5ubtiliθ酵素による高分子量レ
バンの合成(すなわち、レバンゾライマーの添加、低イ
オン強度溶液の使用および低温度の反応(J、 Bio
chem 90.921.1981))を促進すること
が分った条件を使用する場合でも、非常にわずか高分子
量レバンが生成されるに過ぎない。ピーク収量のジサッ
カライドに達した後、中間分子量のポリマーが生成しt
も更に、他の真のレバンスクラーゼと違って、B。
ある。これはDeaoncLer (loc、 cit
、 ) Marburg株酵素の約0.02Mの−と匹
敵する。均等濃度のアクセプターとドナー分子を使用し
かつ田中B、 5ubtiliθ酵素による高分子量レ
バンの合成(すなわち、レバンゾライマーの添加、低イ
オン強度溶液の使用および低温度の反応(J、 Bio
chem 90.921.1981))を促進すること
が分った条件を使用する場合でも、非常にわずか高分子
量レバンが生成されるに過ぎない。ピーク収量のジサッ
カライドに達した後、中間分子量のポリマーが生成しt
も更に、他の真のレバンスクラーゼと違って、B。
5ubtilie Noより 11871由来の酵呆は
不均合反応(すなわち、低分子量オリゴサツカライドを
高分子量レバンに転換しない)に触媒反応を示さないよ
うである。例えば、トリサツカライドが検出できるが、
酵素が不均合反応を行なう場合、存在させるべきでない
。Aerobacter levanicum(Sig
ma )から得た標準的レバンは高分子および中間分子
量物質に相当する2つのピークに分画することができる
。Dedonder (:toc、 cit、 )酵素
は67℃で約6.6 X 10−”の平衡定数(レバン
とグルコース/スクロース)を有し、DP4Qのレバン
が生成される。全く反対に、yaxn 11871゜1
1872および11873株はスクロース単独から実質
量のアルコール沈澱性ポリサッカライドを産生じない酵
素を生じ、11871株の生育細胞でもレバンな生成し
ない。したがって、生成したフラクトシルトランスフェ
ラーゼは有効にルパンスクラーゼ」では全(ない。この
8All誉では、フラクトシルトランスフェラーゼと呼
ぶ。
不均合反応(すなわち、低分子量オリゴサツカライドを
高分子量レバンに転換しない)に触媒反応を示さないよ
うである。例えば、トリサツカライドが検出できるが、
酵素が不均合反応を行なう場合、存在させるべきでない
。Aerobacter levanicum(Sig
ma )から得た標準的レバンは高分子および中間分子
量物質に相当する2つのピークに分画することができる
。Dedonder (:toc、 cit、 )酵素
は67℃で約6.6 X 10−”の平衡定数(レバン
とグルコース/スクロース)を有し、DP4Qのレバン
が生成される。全く反対に、yaxn 11871゜1
1872および11873株はスクロース単独から実質
量のアルコール沈澱性ポリサッカライドを産生じない酵
素を生じ、11871株の生育細胞でもレバンな生成し
ない。したがって、生成したフラクトシルトランスフェ
ラーゼは有効にルパンスクラーゼ」では全(ない。この
8All誉では、フラクトシルトランスフェラーゼと呼
ぶ。
反応のフラクトース源はスクロース(β−D−フラクト
フラノシルα−D−グルコピラノシド)、ラフィノース
(0−α−D−がラクトピラノシル−(1→6)−〇−
α−D−グルコぎラフシル−(1→2)β−D−フラク
トフラノシド)又はスタキオースのようにリンク(1→
2)によりアルドースのアノマー炭素に結合する望まし
くは不飽和β−フラクトシル環を含む任意のオリゴ−又
はジ−サツカライドでよい。
フラノシルα−D−グルコピラノシド)、ラフィノース
(0−α−D−がラクトピラノシル−(1→6)−〇−
α−D−グルコぎラフシル−(1→2)β−D−フラク
トフラノシド)又はスタキオースのようにリンク(1→
2)によりアルドースのアノマー炭素に結合する望まし
くは不飽和β−フラクトシル環を含む任意のオリゴ−又
はジ−サツカライドでよい。
式Hの6−置換アルドース出発物質は続く塩素化反応に
耐性でありかつ6−ヒドロキシ基を放出するのに除去で
きる6−位置の任意の置換基を保護ヒドロキシ基として
有してもよい。6−カルボン酸エステル例えば6−アセ
テート又はペンゾエ−トが望ましい。グルコース6−ア
セテートは各種方法(例えばDuff、 ;r、 Oh
em、 soa、 p 4760〜4.1957 ;
Reeve %、J、 Am、 Ohem、 soa、
。
耐性でありかつ6−ヒドロキシ基を放出するのに除去で
きる6−位置の任意の置換基を保護ヒドロキシ基として
有してもよい。6−カルボン酸エステル例えば6−アセ
テート又はペンゾエ−トが望ましい。グルコース6−ア
セテートは各種方法(例えばDuff、 ;r、 Oh
em、 soa、 p 4760〜4.1957 ;
Reeve %、J、 Am、 Ohem、 soa、
。
79.6041〜3 ; Frohwein等Natu
re、p156.1960 ; Duff等、Natu
re、 p 103.1957;同じく、Bioch、
em :r、 515〜520170.19り8)によ
り容易に製造することができる。
re、p156.1960 ; Duff等、Natu
re、 p 103.1957;同じく、Bioch、
em :r、 515〜520170.19り8)によ
り容易に製造することができる。
式■のアルドース出発物質の6−置換基は水素化により
容易に除去できるベンジルエーテルの如きエーテルある
いはGB2127806Aに記載される塩素化6−エー
テルをそのま〜供しうる脂肪族エーテルであってもよい
。この出発物質は例えば4−クロロ置換基を有して、既
に部分的に塩素化した4−クロロ−4−デオキシーガラ
クトース6−アセテートの如きジサッカライドを得るこ
とができる。
容易に除去できるベンジルエーテルの如きエーテルある
いはGB2127806Aに記載される塩素化6−エー
テルをそのま〜供しうる脂肪族エーテルであってもよい
。この出発物質は例えば4−クロロ置換基を有して、既
に部分的に塩素化した4−クロロ−4−デオキシーガラ
クトース6−アセテートの如きジサッカライドを得るこ
とができる。
フラクトースドナーとフラクトースアクセフタ−間の反
応は水性系望ましくは酵素の最適−すなわち約60℃の
最適温度でPH5,4〜6.0で緩衝化させて行なうべ
きである。この2棟の反応体は一般に水溶性で、酵素は
相互の溶液中で分散させることができ、あるいは不溶性
担体に固定化するのがよい。固定化は例えばDIAIセ
ルロースの如きイオン交換樹脂を使い、それに酵素を強
力に成層させることができる。その他多くの固定化担体
として例えば米国特許第4,421.850号明細書に
記載の骨炭を使うことができる。
応は水性系望ましくは酵素の最適−すなわち約60℃の
最適温度でPH5,4〜6.0で緩衝化させて行なうべ
きである。この2棟の反応体は一般に水溶性で、酵素は
相互の溶液中で分散させることができ、あるいは不溶性
担体に固定化するのがよい。固定化は例えばDIAIセ
ルロースの如きイオン交換樹脂を使い、それに酵素を強
力に成層させることができる。その他多くの固定化担体
として例えば米国特許第4,421.850号明細書に
記載の骨炭を使うことができる。
反応混合物中のフラクトースドナ一対フラクトースアク
セプター比は1要である。余り低いと、収量が減少する
。余り高いと、特に筒面形含量の基質を使う場合、可能
なレバン反応か抑制されな(なる。一般に、約2=10
モル比(ドナー−アクセプター)が最適である。この反
応は、溶解性又は粘度に問題はないので、高磯度で行な
うことができる。一般には、約401量%の反応体濃度
がうまくいくが、反応体の溶解性例えはグルコース6−
アセテートでは約75%までにより丈に高濃度も使用で
きる。酵素濃度は当然活性に依るか、溶液a当りB、
5ubtilis Noより 11871培養物33m
6から誘導した酵素を含む水溶液を使う場合、約50m
1/ljの濃度がうまくいく。
セプター比は1要である。余り低いと、収量が減少する
。余り高いと、特に筒面形含量の基質を使う場合、可能
なレバン反応か抑制されな(なる。一般に、約2=10
モル比(ドナー−アクセプター)が最適である。この反
応は、溶解性又は粘度に問題はないので、高磯度で行な
うことができる。一般には、約401量%の反応体濃度
がうまくいくが、反応体の溶解性例えはグルコース6−
アセテートでは約75%までにより丈に高濃度も使用で
きる。酵素濃度は当然活性に依るか、溶液a当りB、
5ubtilis Noより 11871培養物33m
6から誘導した酵素を含む水溶液を使う場合、約50m
1/ljの濃度がうまくいく。
式■の化合物の続(塩素化は、4,1′−および6′−
位置で選択的に塩素でヒドロキシを置換することができ
る試薬を使って行なうことができる。
位置で選択的に塩素でヒドロキシを置換することができ
る試薬を使って行なうことができる。
この試薬はビルスマイヤー試薬で、ジアルキルアミドと
塩素化試薬との反応例えばジメチルホルムアミドと五塩
化燐、ホスゲン又は塩化チオニルと反応させて得られる
。スクロース6−エステルの塩素化の詳細はGB207
9749Aおよび米国特許第4,380,476号明細
1″に記載されている。
塩素化試薬との反応例えばジメチルホルムアミドと五塩
化燐、ホスゲン又は塩化チオニルと反応させて得られる
。スクロース6−エステルの塩素化の詳細はGB207
9749Aおよび米国特許第4,380,476号明細
1″に記載されている。
同様に、6−エステルの脱保睦は同一刊行物に記述され
、例えばメタノール中ナトリウムメトキシドを使う。6
−ベンジルエーテル基は水素化により除くことができる
。
、例えばメタノール中ナトリウムメトキシドを使う。6
−ベンジルエーテル基は水素化により除くことができる
。
史に、フラクトース−アクセプターアルコール(%にア
ルドース)とフラクトシルジー又はオリゴ−サツカライ
ドとを、アクセプターアルドースの不存在下少な(とも
0.1Mの辷/スクロースを有し、アクセプターアルド
ースの不存在下フックドースドナーからアルコール沈澱
性物質の実質県を生成せず、界面活性剤の存在により影
響を受けず、約60℃で最適活性を有しかつ45℃まで
で少なくとも20分間活性であるフラクトシルトランス
フェラーゼの存在下反応させてフラクトシドを製造する
方法が供される。フラクトースアクセゾターは一般に、
ピラノース、フラノース糖又は置換糖でよ(、フラクト
シルジサッカライドに加えるのが望ましい。例には6−
置換グルコース誘導体例えばグルコース6−エステルと
エーテルおよび6−ゾオキシーD−グルコース(TGE
Iおよびその甘味類似物の製造上)、又は英国時計出願
GB2046757A(下記参照)のレバンスクラーゼ
と併用するのに示唆された物質を含む。フラクトシルジ
ー又はオリゴ−サツカライドはスクロース、ラフィノー
ス又はスタキオースを含んでよい。
ルドース)とフラクトシルジー又はオリゴ−サツカライ
ドとを、アクセプターアルドースの不存在下少な(とも
0.1Mの辷/スクロースを有し、アクセプターアルド
ースの不存在下フックドースドナーからアルコール沈澱
性物質の実質県を生成せず、界面活性剤の存在により影
響を受けず、約60℃で最適活性を有しかつ45℃まで
で少なくとも20分間活性であるフラクトシルトランス
フェラーゼの存在下反応させてフラクトシドを製造する
方法が供される。フラクトースアクセゾターは一般に、
ピラノース、フラノース糖又は置換糖でよ(、フラクト
シルジサッカライドに加えるのが望ましい。例には6−
置換グルコース誘導体例えばグルコース6−エステルと
エーテルおよび6−ゾオキシーD−グルコース(TGE
Iおよびその甘味類似物の製造上)、又は英国時計出願
GB2046757A(下記参照)のレバンスクラーゼ
と併用するのに示唆された物質を含む。フラクトシルジ
ー又はオリゴ−サツカライドはスクロース、ラフィノー
ス又はスタキオースを含んでよい。
B、 5ubtilie 11871由来の酵素の基質
特異性を更に詳述する。初期の仙死の示すところでは、
B、 5ubtilis (Marburg )のフラ
クトンルトランスフエラーゼ活性は、リン酸塩又はカル
ボン酸基の如き極性基がa−6の位置で置換されない限
り、アルドースのc−6における変化傾より修復されな
い。%に、アクセプタ〜のc−6位置での次の変化はレ
バンスクラーゼ、還元(L−ガラクトースからL−フコ
ース)、OHのO−グルコシルへの置換(D−グルコー
スからイソマルトース)およびC上のHのヒドロキシア
ルキル(m−が2クトーヌからD−グリセロ−D〜ガラ
クトヘプトース) (He5trin等、195B)を
抑制しない。スクロースのように同じグリコシド結合に
よりアルコシル基に結合した非置換フラクトース基を有
する唯一の分子はドナーとして働くから、スクロース6
−アセテートはスクロース又はラフィノースの代りにフ
ラクトースドナーとして作用しうる。
特異性を更に詳述する。初期の仙死の示すところでは、
B、 5ubtilis (Marburg )のフラ
クトンルトランスフエラーゼ活性は、リン酸塩又はカル
ボン酸基の如き極性基がa−6の位置で置換されない限
り、アルドースのc−6における変化傾より修復されな
い。%に、アクセプタ〜のc−6位置での次の変化はレ
バンスクラーゼ、還元(L−ガラクトースからL−フコ
ース)、OHのO−グルコシルへの置換(D−グルコー
スからイソマルトース)およびC上のHのヒドロキシア
ルキル(m−が2クトーヌからD−グリセロ−D〜ガラ
クトヘプトース) (He5trin等、195B)を
抑制しない。スクロースのように同じグリコシド結合に
よりアルコシル基に結合した非置換フラクトース基を有
する唯一の分子はドナーとして働くから、スクロース6
−アセテートはスクロース又はラフィノースの代りにフ
ラクトースドナーとして作用しうる。
しかし、本発明の新規酵素の場合に、非常に広範囲の糖
類はスクロース又はラフィノースから7ラクトースのア
クセプターとしているいろ働く。
類はスクロース又はラフィノースから7ラクトースのア
クセプターとしているいろ働く。
アクセプターの多くは、ヘキソース又はペントース例え
ばリボース、ソルボース、リキソース、アラビノースお
よびキシロースである。反応しないことが分っている唯
一のペントースはキシロースである。反応性アクセプタ
ーの多くはピラノース環構造を応用しうるか、キシリト
ールとグルコン酸も反応するようである。環構造が存在
する時、酸素又は硫黄を含むに違いないから1.イノシ
トールは反応せず、5−チオグルコースが反応する。
ばリボース、ソルボース、リキソース、アラビノースお
よびキシロースである。反応しないことが分っている唯
一のペントースはキシロースである。反応性アクセプタ
ーの多くはピラノース環構造を応用しうるか、キシリト
ールとグルコン酸も反応するようである。環構造が存在
する時、酸素又は硫黄を含むに違いないから1.イノシ
トールは反応せず、5−チオグルコースが反応する。
炭素3および4の構造上、例えばグルコースの代りにガ
ラクトース、6−0−メチルグルコース、4−クロロガ
ラクトースおよびD−アラビノースのすべての態様は定
性的反応性に影響しない。炭素1例えばメチルα−D−
グルコピラノシド、1−チオグルコースおよびソルボー
スのような置換基は反応する。炭素2で、マンノースの
ように各椎変化に耐えるが、2−ジオキシグルコースや
グルコサミンは非反応性である。炭素6では多くの構造
上の変化は6−リン酸塩、クロライド、アセテート、6
−ジオキシグルコース、6−0−メチルグルコース、6
−0−メチルがラクトースおよびラムノースの6−Hの
ように耐えるが、グルコヘプトースのOH,OH,0H
OH−基は反応性を抑制する。
ラクトース、6−0−メチルグルコース、4−クロロガ
ラクトースおよびD−アラビノースのすべての態様は定
性的反応性に影響しない。炭素1例えばメチルα−D−
グルコピラノシド、1−チオグルコースおよびソルボー
スのような置換基は反応する。炭素2で、マンノースの
ように各椎変化に耐えるが、2−ジオキシグルコースや
グルコサミンは非反応性である。炭素6では多くの構造
上の変化は6−リン酸塩、クロライド、アセテート、6
−ジオキシグルコース、6−0−メチルグルコース、6
−0−メチルがラクトースおよびラムノースの6−Hの
ように耐えるが、グルコヘプトースのOH,OH,0H
OH−基は反応性を抑制する。
メリビオース、ラクトース、インマルトースおよびセロ
ビオースを含むジ−サツカライドの多くは反応性アクセ
プターであるが、2クチユロースやイソマルチュロース
の如きあるジサッカライドは非反応性である。オリゴサ
ツカライドアクセプターを使用する場合、アクセフ0タ
ー油桂は類似のマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース等のように、大きさが増すにつれて減少す
る。
ビオースを含むジ−サツカライドの多くは反応性アクセ
プターであるが、2クチユロースやイソマルチュロース
の如きあるジサッカライドは非反応性である。オリゴサ
ツカライドアクセプターを使用する場合、アクセフ0タ
ー油桂は類似のマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース等のように、大きさが増すにつれて減少す
る。
最後に、多(の場合、1炭素原子以上で構造上の変化(
グルコースの)は反応を抑制しない、例えばがラクトー
ス6−アセテート。反応性アクセプター分子の混合物が
例えば加水分解したホエイに使用されると、フラクトシ
ル化ジサッカライドの混合物が生成される。
グルコースの)は反応を抑制しない、例えばがラクトー
ス6−アセテート。反応性アクセプター分子の混合物が
例えば加水分解したホエイに使用されると、フラクトシ
ル化ジサッカライドの混合物が生成される。
次の糖類はアクセプターとして作用することが分った。
D−アラビノース、フコース、6−ゾオキシグルコーヌ
、6−o−メチルガラクトース、ラクトース、がラクト
ース6−アセテート、マンノース、5−チオーD−グル
コース、マルトース、1−チオ−グルコース、マルトト
リオース、6−〇−メチルα−D−グルコース、マルト
ペンタオース、D(−)アラビノース、マルトトリオー
ス、6−クロロ−6−ジオキシグルコース、メリビオー
ス、ガラクトース、キンロース、イソマルトース、L−
アラビノース、ホエイ透過*<ラクトース)、4−クロ
ロがラクトース、リボース、リキソース、グルコース6
−アセテート、グルコン酸、グルコース6−リン酸塩、
L−ラムノース、6−〇−メチルグルコース、メチル−
〇−グルコシド、キシリトール、グリセロールおよびエ
タノール。
、6−o−メチルガラクトース、ラクトース、がラクト
ース6−アセテート、マンノース、5−チオーD−グル
コース、マルトース、1−チオ−グルコース、マルトト
リオース、6−〇−メチルα−D−グルコース、マルト
ペンタオース、D(−)アラビノース、マルトトリオー
ス、6−クロロ−6−ジオキシグルコース、メリビオー
ス、ガラクトース、キンロース、イソマルトース、L−
アラビノース、ホエイ透過*<ラクトース)、4−クロ
ロがラクトース、リボース、リキソース、グルコース6
−アセテート、グルコン酸、グルコース6−リン酸塩、
L−ラムノース、6−〇−メチルグルコース、メチル−
〇−グルコシド、キシリトール、グリセロールおよびエ
タノール。
キシロースにおいて特に興味あるアクセプターは、キシ
ルスクロースとして知られるβ、D−フラクトフラノン
ラフ2→1)α−D−キンロビラノシラフ産生する。他
の興味あるアクセプターはガラクトースで、β−D−フ
ラクトフラノンラフ2→1)−D−ガラクトビラノンド
(ガラクトヌクロース)を産生する。このタイプの生成
物はフ蝕性低く、過剰の七味が問題となっている分野で
は、スクロースの代替品として興味がある。ガラクトス
クロースは糖蜜や加水分解ホエイ透過液から得ることか
でき、また容易に人手できることから、特に興味かもた
れる。これはほんの僅かの甘味を有するに過ぎない(ス
クロースの約1θ〜15チ)。
ルスクロースとして知られるβ、D−フラクトフラノン
ラフ2→1)α−D−キンロビラノシラフ産生する。他
の興味あるアクセプターはガラクトースで、β−D−フ
ラクトフラノンラフ2→1)−D−ガラクトビラノンド
(ガラクトヌクロース)を産生する。このタイプの生成
物はフ蝕性低く、過剰の七味が問題となっている分野で
は、スクロースの代替品として興味がある。ガラクトス
クロースは糖蜜や加水分解ホエイ透過液から得ることか
でき、また容易に人手できることから、特に興味かもた
れる。これはほんの僅かの甘味を有するに過ぎない(ス
クロースの約1θ〜15チ)。
ドナー%異性について、絶対的要件としてα(1→2)
結合をもったスクロースに基づ(糖は反応性で、活性は
分子の大きさにつれて減少する。
結合をもったスクロースに基づ(糖は反応性で、活性は
分子の大きさにつれて減少する。
酵素作用により生成する新規のジサッカライド例えはキ
フルスクロースはドナーとして作用する。
フルスクロースはドナーとして作用する。
酵素触媒反応の生成物に常法の物理化学的手段例えばク
ロマトグラフィ特に尚圧液体クロマトグラフィ(I(P
LO)およびイオン交換樹脂クロマトグラフィにより副
生物と出発物質から分離できる。
ロマトグラフィ特に尚圧液体クロマトグラフィ(I(P
LO)およびイオン交換樹脂クロマトグラフィにより副
生物と出発物質から分離できる。
特に、アルドース環に6−ヒドロキシ基をもたなイ生成
物、例えばスクロース6−エステルやエーテル、キシロ
ース銹4体および6−デオキシスクロースは驚く程低い
極性を有し7、これがイオン交換樹脂クロマトグラフィ
な容易かつ効果的分離方法ニスる。ジビニルベンゼンで
架橋したポリスチレン樹脂例えはアンバーライ) XA
D樹脂は特に適している。この分離は、スクロース6−
誘導体を化学的方法により製造する時に必要な各柚置換
したスクロース誘導体の分離よりはるかに容易である。
物、例えばスクロース6−エステルやエーテル、キシロ
ース銹4体および6−デオキシスクロースは驚く程低い
極性を有し7、これがイオン交換樹脂クロマトグラフィ
な容易かつ効果的分離方法ニスる。ジビニルベンゼンで
架橋したポリスチレン樹脂例えはアンバーライ) XA
D樹脂は特に適している。この分離は、スクロース6−
誘導体を化学的方法により製造する時に必要な各柚置換
したスクロース誘導体の分離よりはるかに容易である。
スクロースの如きグルコシルフラクンドを使うフラクト
ース転換反応の副生物はグルコース自体である。グルコ
ースは勿論有力なアクセプターであり、望ましいアクセ
プターと拮抗し、出発物質を改質する。したがって、フ
ラクトースに転換することによりグルコースを除くのは
望ましい。これはグルコースイソメラーゼを添加して達
成することができる。
ース転換反応の副生物はグルコース自体である。グルコ
ースは勿論有力なアクセプターであり、望ましいアクセ
プターと拮抗し、出発物質を改質する。したがって、フ
ラクトースに転換することによりグルコースを除くのは
望ましい。これはグルコースイソメラーゼを添加して達
成することができる。
次の例により本発明を説明する。
例 I TGsの製造
a)酵素の調製
β−フラクトンルトランスフエラーゼをBacillu
、s 5ubtilie Noより 11871株から
得た最小スクロース培地(1001ffA/フラスコ)
を含む振盪フラスコ(250In/(容、4個のフラス
コ)に細胞が生育中酵素をスクロースにより誘導した。
、s 5ubtilie Noより 11871株から
得た最小スクロース培地(1001ffA/フラスコ)
を含む振盪フラスコ(250In/(容、4個のフラス
コ)に細胞が生育中酵素をスクロースにより誘導した。
培養物は指数期まで培養し、60℃で振盪し、ついで4
つの振盪フラスコの中味を・−緒にし、生育培地を遠心
分離(5000g15分間)により細胞から分離した。
つの振盪フラスコの中味を・−緒にし、生育培地を遠心
分離(5000g15分間)により細胞から分離した。
全酸素の20〜30%は細胞に結合したま〜であった。
生成した清澄液に固形硫酸アンモニウムを加えて65%
の飽和rtr−シ、o℃で45分間放置した。この操作
により望ましくないインベルターゼと他のタン白不純物
の殆んどが沈澱したか、多くの酵素は溶液中に残った。
の飽和rtr−シ、o℃で45分間放置した。この操作
により望ましくないインベルターゼと他のタン白不純物
の殆んどが沈澱したか、多くの酵素は溶液中に残った。
ついでこの試料を再遠心分PfI(20,0005’/
30分間)し、インベルターゼ活性を含む沈澱物を除い
た。更に硫酸アンモニウムをこの溶液に加え、95%飽
和度にし、0℃で45分間史に放置した。
30分間)し、インベルターゼ活性を含む沈澱物を除い
た。更に硫酸アンモニウムをこの溶液に加え、95%飽
和度にし、0℃で45分間史に放置した。
主としてフラクトシルトランスフェラーゼである2番目
の沈澱物が生成し、遠心分離(40,000&/45分
間)により集取し、50 mM IJン酸塩バッファー
、pH6に再溶解した。2回の沈澱の正味効果と2番目
の沈澱物の再溶解により実質的精製と酵素の濃縮をし、
タン白帯だけがポリアクリルアミド/l’A/電気泳動
により検出できた。最後に、残渣のJa酸アンモニウム
を53 mMリン酸塩バッファーに対し透析(0°C/
4時間)して、醇累調製物から除いた。
の沈澱物が生成し、遠心分離(40,000&/45分
間)により集取し、50 mM IJン酸塩バッファー
、pH6に再溶解した。2回の沈澱の正味効果と2番目
の沈澱物の再溶解により実質的精製と酵素の濃縮をし、
タン白帯だけがポリアクリルアミド/l’A/電気泳動
により検出できた。最後に、残渣のJa酸アンモニウム
を53 mMリン酸塩バッファーに対し透析(0°C/
4時間)して、醇累調製物から除いた。
透析した酵素はp−ヒドロキシマーキュリベンゾエート
(インベルターゼを阻害するが、フラクトシルトランス
フェラーゼ活性に惑影伽を及はさない)の添加前後に試
験した。この方法により、フラクトシルトランスフェラ
ーゼiA!!品は通常インベルターゼを含まないことが
分った。調製品のタン白含量は280 nmの吸収度を
測定して0.45 m9/ mlであった。N製した酵
素磨製品にもしばしば黒い色素が見られたが、調製品の
活性に悪影響はない。
(インベルターゼを阻害するが、フラクトシルトランス
フェラーゼ活性に惑影伽を及はさない)の添加前後に試
験した。この方法により、フラクトシルトランスフェラ
ーゼiA!!品は通常インベルターゼを含まないことが
分った。調製品のタン白含量は280 nmの吸収度を
測定して0.45 m9/ mlであった。N製した酵
素磨製品にもしばしば黒い色素が見られたが、調製品の
活性に悪影響はない。
b)スクロース6−アセテート
グルコース6−アセテート(真空乾燥恒[8051)と
粒化スクロース(160,? )なpi(5,4、マキ
ルベンバッファ−1oomeに室温で浴解し、脱イオン
水600me(40%w/v)で稀釈した。ついでこの
溶液を十分濾過し、酵素溶液28幅を加えた。
粒化スクロース(160,? )なpi(5,4、マキ
ルベンバッファ−1oomeに室温で浴解し、脱イオン
水600me(40%w/v)で稀釈した。ついでこの
溶液を十分濾過し、酵素溶液28幅を加えた。
ついで反応混合物を60℃で培養し、HPLO分析によ
りスクロース6−アセテートがそれ以上生成されなくな
ることが認められるまで、一定間隔でサンプリングし、
スクロース6−アセテートの最大濃度は約12091−
1であった。酵素を吸着するD]LiAEセルロースカ
ラムに通して反応混合物を濾過して酵素を取った。別法
には、65℃/1時間加熱して変性させることもできる
。酵素はスクロース6−アセテートをゆっくり加水分解
してフラクトースを遊離するように作用するので、酵素
を除くことは重要である。
りスクロース6−アセテートがそれ以上生成されなくな
ることが認められるまで、一定間隔でサンプリングし、
スクロース6−アセテートの最大濃度は約12091−
1であった。酵素を吸着するD]LiAEセルロースカ
ラムに通して反応混合物を濾過して酵素を取った。別法
には、65℃/1時間加熱して変性させることもできる
。酵素はスクロース6−アセテートをゆっくり加水分解
してフラクトースを遊離するように作用するので、酵素
を除くことは重要である。
ついで、生成物を分取HPLOにより単離して、少なく
とも85チ純度のスクロース6−アセテートを得、全体
の約50%の収率であった。酵素反応の初期速度は24
4.5111&スクロース6−アセテート/り酵素/時
間を生成することであった。酵素工程の収率はグルコー
ス6−アセテート消費で58%、スクロース6−アセテ
ート生成で48%であった。
とも85チ純度のスクロース6−アセテートを得、全体
の約50%の収率であった。酵素反応の初期速度は24
4.5111&スクロース6−アセテート/り酵素/時
間を生成することであった。酵素工程の収率はグルコー
ス6−アセテート消費で58%、スクロース6−アセテ
ート生成で48%であった。
C)スクロース6−アセテートの塩素化1)ビルスマイ
ヤー試薬の調製 五塩化燐(140g)を激しく攪拌しながらビーカー中
無水ジメチルホルムアミl’(250mlに加え、温度
は70〜80℃に保ち、攪拌しま1時間続け、反応混合
物を冷却、濾過した。結晶生成物をamf(2X20m
l)とジエチルエーテル(40ml )で洗い、デシケ
ータ−中で乾燥し、白色結晶としてビルスマイヤー試薬
(93F)を得た。
ヤー試薬の調製 五塩化燐(140g)を激しく攪拌しながらビーカー中
無水ジメチルホルムアミl’(250mlに加え、温度
は70〜80℃に保ち、攪拌しま1時間続け、反応混合
物を冷却、濾過した。結晶生成物をamf(2X20m
l)とジエチルエーテル(40ml )で洗い、デシケ
ータ−中で乾燥し、白色結晶としてビルスマイヤー試薬
(93F)を得た。
(11) スクロース6−アセテート溶液の調製スクロ
ース6−アセテードシラツデ(41,!i’。
ース6−アセテードシラツデ(41,!i’。
実際のスクロース6−アセテート含量28g1dmfに
溶解し稀釈して861R13とした。この溶液を分子フ
ルイで脱水し濾過した。
溶解し稀釈して861R13とした。この溶液を分子フ
ルイで脱水し濾過した。
(llil 塩素化
ビルスマイヤー試薬(ろ1/)をdmf (80m1)
に加え、混合物を0℃に冷却した。スクロース6−アセ
テート浴液(21mg、スクロース6−アセテ−)71
)をゆっくり加え、温度を20°C以1に維持した。反
応混合物を0℃で15分間攪拌してから、60℃の油浴
に60分移した。この浴を120℃60分加熱し、この
温度で2時間維持した。ついで反応混合物を20℃に冷
却し、メタノール−880アンモニア(2:1.8ON
)を添加して中和し、50℃以下に保持した。混合物を
シラツブ状に濃縮し、ピリジン(1007+11と無水
酢酸(100mlを加えてアセチル化した。
に加え、混合物を0℃に冷却した。スクロース6−アセ
テート浴液(21mg、スクロース6−アセテ−)71
)をゆっくり加え、温度を20°C以1に維持した。反
応混合物を0℃で15分間攪拌してから、60℃の油浴
に60分移した。この浴を120℃60分加熱し、この
温度で2時間維持した。ついで反応混合物を20℃に冷
却し、メタノール−880アンモニア(2:1.8ON
)を添加して中和し、50℃以下に保持した。混合物を
シラツブ状に濃縮し、ピリジン(1007+11と無水
酢酸(100mlを加えてアセチル化した。
50℃/2時間攪拌後、混合物を20℃に冷却し、温度
を60℃以下に保ちながらメタノール(80ml8)を
加えた。ついで混合物をシラツブ状に濃縮し、熱トルエ
ン(4X 10 Q me )で抽出した。トルエン抽
出液をシラツブ状に濃縮し、エチルアセテ−)(100
m#)に溶解した。エチルアセテート溶液を水(5X1
00ml)で洗い、その水はエチルアセテート(2X5
0m/l:)で逆抽出した。−緒にしたこのエチルアセ
テート抽出液を硫酸マグネシウムで脱水し、活性炭で脱
色し、シラツブ状に濃縮し、工業用メチル化スピリット
より結晶化して、4、 1’、6’−)リクロロ−4,
1’、6’−)リゾオキシガラクトスクロースペンタア
セテ−)(4,42,69%)を得た。
を60℃以下に保ちながらメタノール(80ml8)を
加えた。ついで混合物をシラツブ状に濃縮し、熱トルエ
ン(4X 10 Q me )で抽出した。トルエン抽
出液をシラツブ状に濃縮し、エチルアセテ−)(100
m#)に溶解した。エチルアセテート溶液を水(5X1
00ml)で洗い、その水はエチルアセテート(2X5
0m/l:)で逆抽出した。−緒にしたこのエチルアセ
テート抽出液を硫酸マグネシウムで脱水し、活性炭で脱
色し、シラツブ状に濃縮し、工業用メチル化スピリット
より結晶化して、4、 1’、6’−)リクロロ−4,
1’、6’−)リゾオキシガラクトスクロースペンタア
セテ−)(4,42,69%)を得た。
(1v)脱エステル化
ペンタアセテートを無水メタノールに溶解し、室温で5
時間触媒量のす) IJウムメトキシドで処理した。つ
いでこの溶液を脱イオン化し蒸発させて、4. 1’、
6’−)リクロロ−4,1’、6’−)リゾオキシが
ラクトスクロース(90%)を得た。
時間触媒量のす) IJウムメトキシドで処理した。つ
いでこの溶液を脱イオン化し蒸発させて、4. 1’、
6’−)リクロロ−4,1’、6’−)リゾオキシが
ラクトスクロース(90%)を得た。
例 2
4、 1’、6’−トリクロロ−4,6,1’、6’−
テトラデオキシがラクトスクロース(6−ジオキシ−T
GS ) (類似の甘味度を有するTGSの関連体)の
製造。
テトラデオキシがラクトスクロース(6−ジオキシ−T
GS ) (類似の甘味度を有するTGSの関連体)の
製造。
(1)6−ジオキシスクロース
単離、精製および結晶化
6−ゾオキシーD−グルコース(D−キノボース、20
g)とスクロースを、例1と同じ反応条件に供し、6−
ジオキシスクロース、D−キノボース、スクロースおよ
びグルコースの混合物、全容fc 140 mt、を得
た。6−ジオキシスクロースを1、Waters Pr
epak 500 C18(逆相カラム)と水を溶離剤
として使って、分取HPLOにより混合物から分別した
。混合物中の6−ジオキシスクロースと他の成分間に篤
(程保持時間に大きな差異がみられた。D−キノボース
、スクロースおよびD−グルコースを注入後4〜9分間
で溶離され、6−ジオキシスクロースにわずか29分(
極大ピーク)であった。大きな分離は材料の分別を一層
可能にした。、6−ジオキシスクロースを含む溶離剤を
減圧不蒸発乾固(給温度50℃)して、きれいなシラツ
ブ(16,7,?、42%)を得、室温で放置して結晶
化させた。この生成物をエタノールから再結し、融点は
180〜181℃、〔α〕9十57.6°(旦2.5、
水)、マススペクトル、m/θ293(M″−0H3−
H2O)、130−NMRスペクトル(Oppmで内部
DSSについてのD20溶液)炭素原子 化学シフト、
ppm 2’ 106.32 1 94.70 5’ 84.01 3′79.04 5 77.74 4’ 76.73 3 74.93 2 73.95 4 71 、oソ ロ’ 65.[)2 1’ 65.77 6 19.56 (2)6−ジオキシスクロースの選択的塩素化6−ジオ
キシスクロース(2,8,?)をDMF(10mlに溶
解し、その溶液なりMF (ろQmA)中ビルスマイヤ
ー試薬(15,@)のサスヘンジョンに松加し、温度を
10℃以下に保った。混合物を室温で10分間攪拌し、
ついで攪拌しながら120℃で2時間加熱した。混合物
を室温に冷却し、メタタール−水酸化アンモニウム浴液
(1:1.20” )を加えた。混合物を70℃で濃縮
し、トルエン(2X 2 D m/i )を残渣から蒸
発させ、ビリジy(50mjn中無水自゛「酸で600
C/ろ時間アセチル化した。メタノール(50廐)を加
え、混合物を蒸発濃縮して、攪拌と傾潟によりトルエン
(4X50mg)で60℃抽出した。−緒にしたトルエ
ン抽出液を蒸発乾固し、残渣をシリカゲル(石油エーテ
ル−エーテル、2:1、ついで1:1)でクロマトグラ
フにかけ、溶媒蒸発後淡黄色ンラツプとして中間の4.
1’、6’−トリクロロ−4゜6、 1’、6’−テ
トラデオキシガラクトスクローステトラアセテート(ろ
i、?、64%)を得た。
g)とスクロースを、例1と同じ反応条件に供し、6−
ジオキシスクロース、D−キノボース、スクロースおよ
びグルコースの混合物、全容fc 140 mt、を得
た。6−ジオキシスクロースを1、Waters Pr
epak 500 C18(逆相カラム)と水を溶離剤
として使って、分取HPLOにより混合物から分別した
。混合物中の6−ジオキシスクロースと他の成分間に篤
(程保持時間に大きな差異がみられた。D−キノボース
、スクロースおよびD−グルコースを注入後4〜9分間
で溶離され、6−ジオキシスクロースにわずか29分(
極大ピーク)であった。大きな分離は材料の分別を一層
可能にした。、6−ジオキシスクロースを含む溶離剤を
減圧不蒸発乾固(給温度50℃)して、きれいなシラツ
ブ(16,7,?、42%)を得、室温で放置して結晶
化させた。この生成物をエタノールから再結し、融点は
180〜181℃、〔α〕9十57.6°(旦2.5、
水)、マススペクトル、m/θ293(M″−0H3−
H2O)、130−NMRスペクトル(Oppmで内部
DSSについてのD20溶液)炭素原子 化学シフト、
ppm 2’ 106.32 1 94.70 5’ 84.01 3′79.04 5 77.74 4’ 76.73 3 74.93 2 73.95 4 71 、oソ ロ’ 65.[)2 1’ 65.77 6 19.56 (2)6−ジオキシスクロースの選択的塩素化6−ジオ
キシスクロース(2,8,?)をDMF(10mlに溶
解し、その溶液なりMF (ろQmA)中ビルスマイヤ
ー試薬(15,@)のサスヘンジョンに松加し、温度を
10℃以下に保った。混合物を室温で10分間攪拌し、
ついで攪拌しながら120℃で2時間加熱した。混合物
を室温に冷却し、メタタール−水酸化アンモニウム浴液
(1:1.20” )を加えた。混合物を70℃で濃縮
し、トルエン(2X 2 D m/i )を残渣から蒸
発させ、ビリジy(50mjn中無水自゛「酸で600
C/ろ時間アセチル化した。メタノール(50廐)を加
え、混合物を蒸発濃縮して、攪拌と傾潟によりトルエン
(4X50mg)で60℃抽出した。−緒にしたトルエ
ン抽出液を蒸発乾固し、残渣をシリカゲル(石油エーテ
ル−エーテル、2:1、ついで1:1)でクロマトグラ
フにかけ、溶媒蒸発後淡黄色ンラツプとして中間の4.
1’、6’−トリクロロ−4゜6、 1’、6’−テ
トラデオキシガラクトスクローステトラアセテート(ろ
i、?、64%)を得た。
MBXm/e 283.285.287(ソ:6:1、
ジクロロ−ジー〇−アセチルフラクトース残渣)および
継続ロスに相当するビーク6 D (0R3C’02H
)、42 (C!H2=O=0)および36 (Mol
) ; 249.251 (0H20ロスでろ:1、
−モノクロロージデオキシ−ジー〇−アセチルガラクト
ース残渣)および60と42の継続ロスに相当するピー
ク。
ジクロロ−ジー〇−アセチルフラクトース残渣)および
継続ロスに相当するビーク6 D (0R3C’02H
)、42 (C!H2=O=0)および36 (Mol
) ; 249.251 (0H20ロスでろ:1、
−モノクロロージデオキシ−ジー〇−アセチルガラクト
ース残渣)および60と42の継続ロスに相当するピー
ク。
テトラアセテートをメタノール(30mlに溶解し、室
温でナトリウムメトキサイド(i M、 pi−19)
により脱アセチル化した。溶液をABberlyst
15(H+)カチオン交換樹脂で中和し、泗過し、蒸発
乾固した。白色固体の生成物が得られた。
温でナトリウムメトキサイド(i M、 pi−19)
により脱アセチル化した。溶液をABberlyst
15(H+)カチオン交換樹脂で中和し、泗過し、蒸発
乾固した。白色固体の生成物が得られた。
〔α)9+87.1°(、(!1.0、アセトン):
130−NMRスペクトル(Oppmの内部DSSにつ
いてD20溶液) 2’ 106.02 1 95.41 5’ 83.75 3’ 78.89 4’ 78.04 5 7[]、95 4 70、[]3 2 69 、78 3 69.28 1 ’ 47.46 6’ 715.99 6 19.61 4、 1’、6’−)ジクロロ−4,6,1’、6’−
テトラデオキシガラクトスクロースはスクロースの40
0倍の甘味があることが分った(8qb溶液)。
130−NMRスペクトル(Oppmの内部DSSにつ
いてD20溶液) 2’ 106.02 1 95.41 5’ 83.75 3’ 78.89 4’ 78.04 5 7[]、95 4 70、[]3 2 69 、78 3 69.28 1 ’ 47.46 6’ 715.99 6 19.61 4、 1’、6’−)ジクロロ−4,6,1’、6’−
テトラデオキシガラクトスクロースはスクロースの40
0倍の甘味があることが分った(8qb溶液)。
例 6
例1の方法を繰り返えしたが、b)段階で6−アセテー
トの代りにグルコース6−ベンゾエートを用いた。類似
の結果が得られた3、段階C)は前のように行なって、
類似の収率でTGSを得た。
トの代りにグルコース6−ベンゾエートを用いた。類似
の結果が得られた3、段階C)は前のように行なって、
類似の収率でTGSを得た。
例 4
B、5ubtilis Marburg 株 16 B
、N0IB 11872株又はN0IB11873株か
ら誘導した酵素を段階b)で使って、例1の方法を改変
することかできる。反応は同じように進行したが、反応
速度は低かった。
、N0IB 11872株又はN0IB11873株か
ら誘導した酵素を段階b)で使って、例1の方法を改変
することかできる。反応は同じように進行したが、反応
速度は低かった。
例 5
DBAEイオン交換セルロースを使ってB、 5ubt
il土θN0IE 11871由来の7ラクトンルトラ
ンスフエシーゼの固定化と精製おJ−ひキシルスクロー
スの製造。
il土θN0IE 11871由来の7ラクトンルトラ
ンスフエシーゼの固定化と精製おJ−ひキシルスクロー
スの製造。
DEARイオン交換セルロース(DE52)を50mM
マキルベンバッファーpH5,4で完全K Aい、つい
でM 術化した基質(スクロース−キシロース2:1.
40%w/■、全糖)で洗った。ブフナーフィルターで
殆んど乾燥するまで濾過した後、例1のようにB、 5
ubtilis由来の7ラクトンルトランスフエ2−ゼ
標品8uとDEAE−1=ルロ−ス(10,V )を攪
拌下60℃715分出1混合した。DEAFiセルロー
スと酵素の混合物をIQmAジャケット伺きカラム(1
9X1cm)に詰め、チャーチルサーモザーキュL’−
タ−テ30℃ニ保った。DEAEセルロースを落下流出
させ、落下物を果めた。基質を約1.0m1h−”の流
速で、ワトソンーマーロウポンフ0を使いカラムまで送
り、溶離剤を−i+)J隔で集め、フラクトシルトラン
スフェラーゼ活性について試験した。280nmの吸光
m(OD280 )も沖1足した。試料を試験するため
に、Q、im#の液体試料又は0.1 gの固定化酵素
(DE52に)を基質2 ml、!:AK30℃/4時
間培養した。「キシルスクロース」製造用キシロース/
スクロース基質を使って、固定化処理後に残っている清
濁溶液のタン白濃度と活性を最初の酵素調製物りタン白
濃度と活性とを比較した。細胞抽出液に最初に存在する
酵素の68.5 %は最初に存在するタン白質の86襲
と共に固定化されたことが分った。この固定化酵素は遊
離酵素の均等量と比較して80.2%の初期活性を示し
た。2つの調製物の活性は夫々0.38&キシルスクロ
一ス/I固定化酵素/時間および0.865 、?キシ
ルスクロース/縦酵素抽出液/時間であった。
マキルベンバッファーpH5,4で完全K Aい、つい
でM 術化した基質(スクロース−キシロース2:1.
40%w/■、全糖)で洗った。ブフナーフィルターで
殆んど乾燥するまで濾過した後、例1のようにB、 5
ubtilis由来の7ラクトンルトランスフエ2−ゼ
標品8uとDEAE−1=ルロ−ス(10,V )を攪
拌下60℃715分出1混合した。DEAFiセルロー
スと酵素の混合物をIQmAジャケット伺きカラム(1
9X1cm)に詰め、チャーチルサーモザーキュL’−
タ−テ30℃ニ保った。DEAEセルロースを落下流出
させ、落下物を果めた。基質を約1.0m1h−”の流
速で、ワトソンーマーロウポンフ0を使いカラムまで送
り、溶離剤を−i+)J隔で集め、フラクトシルトラン
スフェラーゼ活性について試験した。280nmの吸光
m(OD280 )も沖1足した。試料を試験するため
に、Q、im#の液体試料又は0.1 gの固定化酵素
(DE52に)を基質2 ml、!:AK30℃/4時
間培養した。「キシルスクロース」製造用キシロース/
スクロース基質を使って、固定化処理後に残っている清
濁溶液のタン白濃度と活性を最初の酵素調製物りタン白
濃度と活性とを比較した。細胞抽出液に最初に存在する
酵素の68.5 %は最初に存在するタン白質の86襲
と共に固定化されたことが分った。この固定化酵素は遊
離酵素の均等量と比較して80.2%の初期活性を示し
た。2つの調製物の活性は夫々0.38&キシルスクロ
一ス/I固定化酵素/時間および0.865 、?キシ
ルスクロース/縦酵素抽出液/時間であった。
固定化酵素(10gw/w )をカラムに詰め、30℃
で約2週間連続して作用させ、溶離液のpi(の変化又
は微生物のコンタミの徴候はみられなかった。少しのタ
ン白質と酵素が最初の操作6日で脱着し、最初に吸着し
たクン白質の24%および最初に吸着した酵素活性の2
66%となった。固定化酵素活性は処理半減ル195時
間で駄目になり、基質を生成物に転換する程度とカラム
を通る流速間の通常の逆関係を示した。使用した最低の
流速では、o、o 86qカラム容蓋(ecv )h
”、80T。
で約2週間連続して作用させ、溶離液のpi(の変化又
は微生物のコンタミの徴候はみられなかった。少しのタ
ン白質と酵素が最初の操作6日で脱着し、最初に吸着し
たクン白質の24%および最初に吸着した酵素活性の2
66%となった。固定化酵素活性は処理半減ル195時
間で駄目になり、基質を生成物に転換する程度とカラム
を通る流速間の通常の逆関係を示した。使用した最低の
流速では、o、o 86qカラム容蓋(ecv )h
”、80T。
キシルスクロースへの転換率が達成され、カラム溶離散
には21 & l−’キシルスクロースを含有スる。こ
の収率はバッチ反応で得られたものより尚く、生成物は
)!1続的にカラムがら取り出され、蓄積せずかつ生成
物の阻害を来たさないから、カラムのプラグφフローは
キシルスクロースの生成には有利である。全体にこれら
の操作中、20〜25gのキシルスクロースがそこで生
成され、純粋のキシルスクロースは容易に得られる。
には21 & l−’キシルスクロースを含有スる。こ
の収率はバッチ反応で得られたものより尚く、生成物は
)!1続的にカラムがら取り出され、蓄積せずかつ生成
物の阻害を来たさないから、カラムのプラグφフローは
キシルスクロースの生成には有利である。全体にこれら
の操作中、20〜25gのキシルスクロースがそこで生
成され、純粋のキシルスクロースは容易に得られる。
最初に使用した易溶性酵素と違って、固定化酵素は若干
の副産物を導き、反応中に生成される。
の副産物を導き、反応中に生成される。
フラクトースは少し生成されるか、固定化に使った最初
の酵素抽出液により生成されるより少ない。
の酵素抽出液により生成されるより少ない。
多分抽出液を汚染するインベルターゼ活性がDE52に
ほんの一部吸着されたからであろう。16〜20分の保
持時間でHPLOカラムから非常に遅く溶離された少量
の化合物は固定化酵素から溶離液中に見られるが、可溶
性酵素反応の分析中気が付かなかった。これらは多分酵
素により反応体分子のホールド・アップは酵素との接触
時IBJを増すから、重合化の可能性がおきる。
ほんの一部吸着されたからであろう。16〜20分の保
持時間でHPLOカラムから非常に遅く溶離された少量
の化合物は固定化酵素から溶離液中に見られるが、可溶
性酵素反応の分析中気が付かなかった。これらは多分酵
素により反応体分子のホールド・アップは酵素との接触
時IBJを増すから、重合化の可能性がおきる。
基質のキクローヌ含量は13311!−” であるから
、最大可能キシルスクロース濃度は266111!−’
であった。0.086 ecvh−”で観察された最大
調度はこれの80チ、すなわち210 Ml−’であっ
たか、反応中に消費されたキシロースを基準にして計算
して、69.5%の反応を示した。収率はバッチ反応よ
り高(、本方法の「フロー・スルー」性がコンスタント
に生成物が除かれた原因となりかつ生成物が基質と比較
して非4か性だから、正荷電した固定化担体がら離れて
分配される。両方の効果はキシルスクロースの生成に有
利そあろう。
、最大可能キシルスクロース濃度は266111!−’
であった。0.086 ecvh−”で観察された最大
調度はこれの80チ、すなわち210 Ml−’であっ
たか、反応中に消費されたキシロースを基準にして計算
して、69.5%の反応を示した。収率はバッチ反応よ
り高(、本方法の「フロー・スルー」性がコンスタント
に生成物が除かれた原因となりかつ生成物が基質と比較
して非4か性だから、正荷電した固定化担体がら離れて
分配される。両方の効果はキシルスクロースの生成に有
利そあろう。
グルコース6−アセテートからスクロース6−アセテー
ト、6−o−メチルグルコースから6−〇−メチルスク
ロース、および6−0−ベンジルグルコースかう6−0
−ベンジルスクロースを製造するのに同一方法を使用し
た。
ト、6−o−メチルグルコースから6−〇−メチルスク
ロース、および6−0−ベンジルグルコースかう6−0
−ベンジルスクロースを製造するのに同一方法を使用し
た。
例1にしたがって調製した酵素(0,1mi )をスク
ロースとギンロース(1:1)の4%w/v溶M2 m
ljと混合し、pH5で50℃で緩衝化した。キシルス
クロースなHPLOにより確認した。レバン生成をプ゛
C学的に確認した。谷線酵素による比較結果は次の通り
である。
ロースとギンロース(1:1)の4%w/v溶M2 m
ljと混合し、pH5で50℃で緩衝化した。キシルス
クロースなHPLOにより確認した。レバン生成をプ゛
C学的に確認した。谷線酵素による比較結果は次の通り
である。
Noより 11871 8.6 0
No1B 11872 2.9 検出可能1[3より1
18751.4 + ハービカラー 0.87 廿 したがって、本発明の酵素はMarburg株酵素より
少なくとも10倍のキシルスクロースを生成した。No
より 11871酵素の場合には少なくとも100倍で
ある。レバンの拮抗的産生は少ない。
18751.4 + ハービカラー 0.87 廿 したがって、本発明の酵素はMarburg株酵素より
少なくとも10倍のキシルスクロースを生成した。No
より 11871酵素の場合には少なくとも100倍で
ある。レバンの拮抗的産生は少ない。
例 6 ガラクトスクロースの製造。
リン酸塩、クエン酸塩バッファー(pH5,9)に溶解
した等重量のスクロースとがラクトースを含む基質40
%(w/v ) 15 mlは、酵素を95%硫酸アン
モニウム飽和浴液で沈澱させ、この沈澱物を再溶解しつ
いで不純物を65%硫酸アンモニウム飽和浴液で沈澱さ
せて一部精製した少容量のS。
した等重量のスクロースとがラクトースを含む基質40
%(w/v ) 15 mlは、酵素を95%硫酸アン
モニウム飽和浴液で沈澱させ、この沈澱物を再溶解しつ
いで不純物を65%硫酸アンモニウム飽和浴液で沈澱さ
せて一部精製した少容量のS。
5ubtilis N0IB 11871フラクトンル
トランスフエラーゼと共に60℃で培養した。
トランスフエラーゼと共に60℃で培養した。
約24時間の培養後、生成物は逆相カラム(多孔性黒鉛
炭素、5μ直径、溶離剤5qb水性アセトニトリル)で
HPLOクロマトグラフィにより分離した。がラクトス
クロースの収率では丈に増加は、それ以上培養を続けて
もあるいは新しい酵素を加えても得られなかった。ガラ
クトスクロースの最大収率は約0.35&/9がラクト
ースと約0.45Vjl消費スクロースであった。
炭素、5μ直径、溶離剤5qb水性アセトニトリル)で
HPLOクロマトグラフィにより分離した。がラクトス
クロースの収率では丈に増加は、それ以上培養を続けて
もあるいは新しい酵素を加えても得られなかった。ガラ
クトスクロースの最大収率は約0.35&/9がラクト
ースと約0.45Vjl消費スクロースであった。
例 7
4、I’、6’−トリブロモ−4,1’、6’−トリデ
オキシガラクトスクロース。
オキシガラクトスクロース。
(al ビスマイヤー試系の調製
臭化チオニル(280ml)を激しく憤拌しながら、無
水冷ジメチルホルムアミド<260m1)に加えた。混
合物を70〜b 史に1時間攪拌し、周囲温度に冷却した。混合物をjし
過し、残渣をジメチルホルムアミド(2X50me)と
ジエチルエーテル(100miで洗い、デシケータ−中
で脱水し、32011の試楽を得た。
水冷ジメチルホルムアミド<260m1)に加えた。混
合物を70〜b 史に1時間攪拌し、周囲温度に冷却した。混合物をjし
過し、残渣をジメチルホルムアミド(2X50me)と
ジエチルエーテル(100miで洗い、デシケータ−中
で脱水し、32011の試楽を得た。
(b) スクロースアセテートのブロム化DMF (2
0ml )中スクロース6−アセテート(5y)の溶液
を例1のように調製し、攪拌1温度を20℃以下/ 3
0分間保ちながら、DMF(507111)中ビスマイ
ヤー試薬(251)の冷サスペンションで処理した。つ
いで、攪拌混合物を周囲温度760分間攪拌し、110
℃に加熱しついで更に1.75時間攪拌した。それを2
0℃に冷却し、メタノールと濃アンモニア(0,880
)の2:1混合物を添加して中和し、そして40℃以下
に保った。混合物をシラツブに濃縮し、ピリジン(10
0mA)中無水酢酸(1007d)で50℃/2時間ア
セチル化した。生成物はGB2101989Aと同じト
リブロムガラクトスクロースペンタアセテート(4,2
11)として例1のように回収した。
0ml )中スクロース6−アセテート(5y)の溶液
を例1のように調製し、攪拌1温度を20℃以下/ 3
0分間保ちながら、DMF(507111)中ビスマイ
ヤー試薬(251)の冷サスペンションで処理した。つ
いで、攪拌混合物を周囲温度760分間攪拌し、110
℃に加熱しついで更に1.75時間攪拌した。それを2
0℃に冷却し、メタノールと濃アンモニア(0,880
)の2:1混合物を添加して中和し、そして40℃以下
に保った。混合物をシラツブに濃縮し、ピリジン(10
0mA)中無水酢酸(1007d)で50℃/2時間ア
セチル化した。生成物はGB2101989Aと同じト
リブロムガラクトスクロースペンタアセテート(4,2
11)として例1のように回収した。
これを周囲温度で5時間ナトリウムメトキサイド(メタ
ノール91モル、pH9)で脱アセチル化し、ついでA
mberlyst 15 (H” )イオン交換樹脂で
脱イオン化した。上澄液を蒸発乾固し、GB21019
89Aと同じ純粋のトリブロム糖を得た。
ノール91モル、pH9)で脱アセチル化し、ついでA
mberlyst 15 (H” )イオン交換樹脂で
脱イオン化した。上澄液を蒸発乾固し、GB21019
89Aと同じ純粋のトリブロム糖を得た。
例 8 キシルスクロースの塩素化
キシルスクロース(例5がら)C5fl)を10℃でD
MFに溶解し、攪拌下10℃以下に維持したDMF (
25N)中側1のビルスマイヤー試薬(13&)の冷サ
スペンションに加えた。混合物を室温に60分かけて加
温し、ついで120℃にし、攪拌下3時間保った。混合
物を冷却し、メタノール/濃(0,880)アンモニア
1:1′で中和し、70℃で濃縮した。続いてトルエン
を蒸発させて水分を除き、残渣をピリジン(30mJ)
中無水酢酸(30ml )で60℃/6時間アセチル化
した。混合物をメタノール(507fflで処理し、蒸
発乾固した。残液を熱トルエン(60℃、4X5Q+n
A)で抽出し、傾瀉した抽出液を一緒にして蒸発した。
MFに溶解し、攪拌下10℃以下に維持したDMF (
25N)中側1のビルスマイヤー試薬(13&)の冷サ
スペンションに加えた。混合物を室温に60分かけて加
温し、ついで120℃にし、攪拌下3時間保った。混合
物を冷却し、メタノール/濃(0,880)アンモニア
1:1′で中和し、70℃で濃縮した。続いてトルエン
を蒸発させて水分を除き、残渣をピリジン(30mJ)
中無水酢酸(30ml )で60℃/6時間アセチル化
した。混合物をメタノール(507fflで処理し、蒸
発乾固した。残液を熱トルエン(60℃、4X5Q+n
A)で抽出し、傾瀉した抽出液を一緒にして蒸発した。
残渣をシリカゲル(石油エーテルニジメチルエーテル2
:1、ついで1:1)でクロマトグラフにかけ、ンラツ
デとしてトリクロロアラビノスクローステトラアセテ−
)(2,6,?)を得た。
:1、ついで1:1)でクロマトグラフにかけ、ンラツ
デとしてトリクロロアラビノスクローステトラアセテ−
)(2,6,?)を得た。
MSw/C283,285,287(9:6:1、ジク
ロロ−ジーO−アセチルフラクトース残俄):60 (
OH3002H)、42 (cH2=c=o )および
36 ()101 )の継続ロスに相当するピーク。
ロロ−ジーO−アセチルフラクトース残俄):60 (
OH3002H)、42 (cH2=c=o )および
36 ()101 )の継続ロスに相当するピーク。
265.237(3:1、モノクロロージー〇−アセチ
ルアラビノ残渣)および60と42の継続ロスに相当す
るピーク。
ルアラビノ残渣)および60と42の継続ロスに相当す
るピーク。
テトラアセテートをメタノール(30mg)に溶解し、
周囲温度pH9でメタノール中1モルナトリウムメトキ
サイドで脱アセチル化した。
周囲温度pH9でメタノール中1モルナトリウムメトキ
サイドで脱アセチル化した。
混合物をAmberlyst 15 (、H” )樹脂
で脱イオン化し、濾過、蒸発させた。生成物固形フオー
ムとして単離した。DXlol、9°(90済液、o
ppmで内部DSSについて)。
で脱イオン化し、濾過、蒸発させた。生成物固形フオー
ムとして単離した。DXlol、9°(90済液、o
ppmで内部DSSについて)。
2’ 106.0
1 95.8
5’ 83.9
5’ 78.8
4’77.9
2 70.6
3 70.4
5 66.4
4 63.9
1’ 47.3
6’ 45.9
この化合物は2qb溶液でスクロースめ甘味の25倍で
あることが分った。
あることが分った。
代理人 浅 村 皓
手続補正占(自発)
昭和59年8月//11
特許庁長官殿
1゜事件の表示
昭和59年特ir1願第128395号3、補正をする
者 事1′1との関係 持3′「出願人 住 所 4、代理人 昭和 年 月 口 8、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書(内容に変更なし)
者 事1′1との関係 持3′「出願人 住 所 4、代理人 昭和 年 月 口 8、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書(内容に変更なし)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)一般式 (式中、Aは水素原子又は基0H2X (但しXは水素
原子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基である)であり、
Yはハロゲン原子である)を有するクロロデオキシスク
ロース又はガラクトスクロース銹導体の製造において、
一般式 (式中、Aは水素原子又は基0H2X (但し、Xは水
素原子、アルコキシ基又は保護されたヒドロキシ基であ
る)である)を有するアルドースを、フラクトシルトラ
ンスフェラーゼの存在下、フラクトシルジ−サツカライ
ド又はオリゴサツカライドと反応させて、一般式 (式中、Aは式Hについて記載した通りである)を有す
る化合物を得、式■の化合物を分離し、ついでこの化合
物を塩素化し、式1(Aが0H2Xを示し、Xがヒドロ
キシ基である)の化合物の場合、保護されたヒドロキシ
基を脱保護することを特徴とする、上記製造方法。 (2) フラクトシルトランスフェラーゼがバチルス・
サチルス(B、 eubtiliθ)又はエルウィニア
棟(Jl!rwinia sp、 )由来のものである
、特許請求の範囲第1項記載の方法。 (3) フラクトシルトランスフェラーゼはバチルス・
サチルス(B、 5ubtilis )株、Noより
11871、N0IB11872又はNOより1117
1由来のものである、特許請求の範囲第2項記載の方法
。 (4) フラクトシルトランスフェラーゼはアクセプタ
ーアルドースの不存在下で少なくとも0.1Mの軸対ス
クロース比を有し、アクセプターアルドースの不存在下
でフラクトースドナーから有意量のアルコール沈澱可能
な物質を形成せず、界面活性剤の存在に影響されず、約
60℃で最適活性を有しかつ45℃までで少なくとも2
0分間活性である、特許請求の範囲第2項、第6項又は
第4項記載の方法。 (5) フラクトクルサツカライドはスクロース、ラフ
ィノース又はスタキオースである、特許請求の範囲第1
項記載の方法。 (6) ビルスマイヤー試薬を使って塩素化を行なう、
特許請求の範囲第1項記載の方法。 (7) 保護されたヒドロキシ基は脂肪族又は芳香族カ
ルボニルオキシ基であり、加水分解により脱保護される
か、あるいはアリールブルコキシ基であり、還元開裂に
より脱保護する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 (8) アクセプターアルドースの不存在下で少なくと
も0.1Mの辷対シュクロース比を有し、アクセプター
アルドースの不存在下でフラクトースドナーから有意蓋
のアルコール沈澱可能な物質を形成せず、界面活性剤の
存在により影響されず、約60℃で最適活性を有しかつ
45℃までで少なくとも20分間活性である、フラクト
クルトランスフェラーゼ。 (9) バチルス・サチルス(、B、 5ubtili
s )由来の、特許請求の範囲第8項記載のフラクトシ
ルトランスフェラーゼ。 On バチルス・サチルス(B、 su’btilie
)株Noより11871.11872又は11875由
来の、特許請求の範囲第9項記載のフラクトシルトラン
スフェラーゼ。 αJ アルコール、フラクトシルジサッカライド又はオ
リゴザツカライドの水溶液を特許請求の範囲第8項記載
のフラクトシルトランスフェラーゼにより処理し、つい
で反応混合物からフラクトシドを分離することを特徴と
する、アルコールからフラクトシドを製造する方法。 (12酵素は固定化している、特許請求の範囲第1項又
は第11項記載の方法。 (131フルコールはD−7ラビノース、L−フコース
、6〜デオキシグルコース、6−oニメチルガラクトー
ス、ラクトース、がラクトース6−アセテート、マンノ
ース、5−チオ−シーグルコース、マルトース、1−チ
オ−グルコース、マルトトリオース、6−0−メチルα
−シーグルコース、マルトペンタオース、D−アラビノ
ース、マルトヘキサオース、6−クロロ−6−ジオキシ
グルコース、メリビオース、ガラクトース、キシロース
、インマルトース、L−アラビノース、ホエイ透過′r
i、(ラクトース)、4−クロロがラクトース、リボー
ス、リキソース、グルコース6−アセテート、グルコン
酸、グルコース6−リン酸塩、L−ラムノース、6−0
−メチルグルコース、メチルα−D−グルコシド、キシ
リトール、グリセロールおよびエタノールから選択する
、特許請求の範囲第11項記載の方法。 ■ フラクトフルジー又はオリゴサツカライドはスクロ
ース、ラフィノース又はスタキオースから選ぶ、特許請
求の範囲第11項又は第12項記載の方法。 (2) 4−クロロ−4−デオキシ−L−アラビノピラ
ノンルー1,6−ジクロロ−1,6−ジヂオキシフラク
トフラノシド(4,1’、 6’−トリクロロ−4,1
’、6’−トリデオキシ)アラビノスクロース。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8316790 | 1983-06-21 | ||
GB838316790A GB8316790D0 (en) | 1983-06-21 | 1983-06-21 | Chemical process |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6037993A true JPS6037993A (ja) | 1985-02-27 |
JPH0777559B2 JPH0777559B2 (ja) | 1995-08-23 |
Family
ID=10544535
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59128395A Expired - Lifetime JPH0777559B2 (ja) | 1983-06-21 | 1984-06-21 | フラクトシルトランスフェラーゼおよびその使用方法 |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4617269A (ja) |
EP (1) | EP0130054B1 (ja) |
JP (1) | JPH0777559B2 (ja) |
KR (1) | KR850000434A (ja) |
AT (1) | ATE50774T1 (ja) |
AU (1) | AU578418B2 (ja) |
CA (1) | CA1225348A (ja) |
DE (1) | DE3481514D1 (ja) |
DK (1) | DK172955B1 (ja) |
ES (1) | ES8603577A1 (ja) |
FI (1) | FI85160C (ja) |
GB (2) | GB8316790D0 (ja) |
IE (1) | IE58153B1 (ja) |
IL (1) | IL72176A (ja) |
MX (1) | MX7714E (ja) |
NO (1) | NO162080C (ja) |
NZ (1) | NZ208606A (ja) |
PH (1) | PH20732A (ja) |
PT (1) | PT78770B (ja) |
SU (1) | SU1630617A3 (ja) |
ZA (1) | ZA844655B (ja) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE451849B (sv) * | 1985-12-11 | 1987-11-02 | Svenska Sockerfabriks Ab | Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter |
GB8622345D0 (en) * | 1986-09-17 | 1986-10-22 | Tate & Lyle Plc | Sucrose derivatives |
NL8701616A (nl) * | 1987-07-09 | 1989-02-01 | Stamicarbon | Fructosyltransferase en bereiding van fructose-oligomeren daarmee. |
FR2629985B1 (fr) * | 1988-04-14 | 1994-01-21 | Roussel Uclaf | Application comme produits sucrants faiblement caloriques d'oligosaccharides fructosyles et les aliments, produits dietetiques et boissons les renfermant |
US5874261A (en) * | 1988-09-02 | 1999-02-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for the purification of glycosyltransferases |
US5476924A (en) * | 1989-01-27 | 1995-12-19 | Duke University | Protecting group for acetals and methods of using the same in the activation of saccharides |
US4980463A (en) * | 1989-07-18 | 1990-12-25 | Noramco, Inc. | Sucrose-6-ester chlorination |
US5215905A (en) * | 1989-12-29 | 1993-06-01 | Miwon Co., Ltd. | Immobilization of fructosyltransferase on a basic, porous anion-exchange resin |
KR0161531B1 (ko) * | 1990-03-08 | 1998-11-16 | 하야시바라 겐 | 락토수크로오스 고함유 분말의 제조방법과 그 분말의 용도 |
CA2062715A1 (en) | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Steve Roth | Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis |
US5180674A (en) * | 1990-04-16 | 1993-01-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis |
US6518051B1 (en) * | 1991-04-11 | 2003-02-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis |
US5334524A (en) * | 1992-05-18 | 1994-08-02 | Solvay Enzymes, Inc. | Process for producing levan sucrase using Bacillus licheniformis |
JPH07274990A (ja) * | 1994-04-15 | 1995-10-24 | Mitsubishi Kasei Eng Co | 環状イヌロオリゴ糖の精製方法 |
US6423833B1 (en) * | 1998-05-05 | 2002-07-23 | Steven J. Catani | Functional sugar polymers from inexpensive sugar sources and apparatus for preparing same |
EP1888611A4 (en) * | 2005-05-04 | 2011-04-13 | Vb Medicare Pvt Ltd | GENERATING PHOSPHOROXYCHLORIDE AS A BYPRODUCTIVE PRODUCT OF PHOSPHORPENTACHLORIDE AND DMF AND ITS USE IN THE CHLORINATION REACTION THROUGH CONVERSION INTO A VILSMEIER HAACK REAGENT |
US20100190975A1 (en) * | 2005-06-01 | 2010-07-29 | Pharmed Medicare Private Limited | Method for purification of chlorinated sucrose derivatives by solvent extraction |
KR20080052639A (ko) * | 2005-09-22 | 2008-06-11 | 팜드 메디케어 프리베이트 리미티드 | 전세포 생체촉매반응에 의한 수크로스-6-아세테이트제조방법 |
US20070100139A1 (en) * | 2005-10-31 | 2007-05-03 | Healthy Brands, Llc | Methods for chlorinating sucrose-6-ester |
CN100418976C (zh) | 2006-04-03 | 2008-09-17 | 广州科宏食品添加物有限公司 | 一种三氯蔗糖的制备方法 |
CA2650219A1 (en) * | 2006-04-27 | 2007-11-08 | V.B. Medicare Pvt. Ltd. | Continuous neutralizer mixer reactor and a continuous process for quenching chlorination reaction mixture in production of chlorinated sucrose |
CN100420697C (zh) * | 2006-08-30 | 2008-09-24 | 河北苏科瑞科技有限公司 | 一种制备蔗糖-6-有机酸酯的方法 |
US20080300392A1 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-04 | Polymed Therapeutics, Inc. | Novel chlorination process for preparing sucralose |
US20080300401A1 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-04 | Polymed Therapeutics, Inc. | Novel chlorination process for preparing sucralose |
CN101812095B (zh) * | 2010-04-30 | 2012-06-27 | 苏州浩波科技股份有限公司 | 三氯蔗糖的制备方法 |
US8884004B2 (en) | 2011-09-02 | 2014-11-11 | Divi's Laboratories, Ltd. | Process for the preparation of sucralose |
CN106554345B (zh) * | 2015-09-29 | 2018-11-30 | 杭州杜易科技有限公司 | 一种五氯化磷氯化副产物的回收和利用的方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS55118369A (en) * | 1979-03-06 | 1980-09-11 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Method of making beverage and food |
US4309505A (en) * | 1980-05-19 | 1982-01-05 | Cpc International Inc. | Process for the production of fructose transferase enzyme |
ATE9355T1 (de) * | 1980-07-08 | 1984-09-15 | Tate & Lyle Public Limited Company | Verfahren zur herstellung von 4,1',6'-trichlor4,1',6'-trideoxygalactosucrose (tgs). |
JPS57166981A (en) * | 1981-04-08 | 1982-10-14 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Novel fructosyl transferase and its preparation |
-
1983
- 1983-06-21 GB GB838316790A patent/GB8316790D0/en active Pending
-
1984
- 1984-06-18 DK DK198402977A patent/DK172955B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-06-20 AU AU29577/84A patent/AU578418B2/en not_active Expired
- 1984-06-20 CA CA000457025A patent/CA1225348A/en not_active Expired
- 1984-06-20 ZA ZA844655A patent/ZA844655B/xx unknown
- 1984-06-20 SU SU843757905A patent/SU1630617A3/ru active
- 1984-06-20 IE IE155184A patent/IE58153B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-06-20 ES ES533607A patent/ES8603577A1/es not_active Expired
- 1984-06-20 FI FI842513A patent/FI85160C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-06-20 PT PT78770A patent/PT78770B/pt active IP Right Revival
- 1984-06-21 DE DE8484304206T patent/DE3481514D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-21 NO NO842496A patent/NO162080C/no unknown
- 1984-06-21 US US06/622,853 patent/US4617269A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-21 PH PH30866A patent/PH20732A/en unknown
- 1984-06-21 EP EP84304206A patent/EP0130054B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-21 KR KR1019840003492A patent/KR850000434A/ko not_active Application Discontinuation
- 1984-06-21 MX MX8411186U patent/MX7714E/es unknown
- 1984-06-21 AT AT84304206T patent/ATE50774T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-06-21 GB GB08415877A patent/GB2145080B/en not_active Expired
- 1984-06-21 NZ NZ208606A patent/NZ208606A/en unknown
- 1984-06-21 JP JP59128395A patent/JPH0777559B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-06-21 IL IL72176A patent/IL72176A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPS6037993A (ja) | フラクトシルトランスフェラーゼおよびその使用方法 | |
JP2926421B2 (ja) | 糖代用物質の製造に有用なオリゴデキストランの酵素による合成方法および新規なオリゴデキストラン | |
FI82836C (fi) | Ny tetraklorraffinos och dess anvaendning vid framstaellning av sucralos. | |
CA2110111C (en) | Production of saccharide carboxylic acids | |
Cheetham et al. | Synthesis of novel disaccharides by a newly isolated fructosyl transferase from Bacillus subtilis | |
JP2834871B2 (ja) | フラクトース含有オリゴ糖の製造法 | |
Kobayashi | Cyclodextrin producing enzyme (CGTase) | |
Watanabe et al. | Enzymatic synthesis of a 2-O-α-D-glucopyranosyl cyclic tetrasaccharide by kojibiose phosphorylase | |
US6562600B1 (en) | Production of cyclic alternan tetrasaccharides from oligosaccharide substrates | |
JP4012595B2 (ja) | オリゴ糖組成物の製造方法 | |
US4962026A (en) | Process for the production of panosyl derivatives | |
JPH0686475B2 (ja) | 新規なステビオール配糖体及びその製造方法 | |
JP2004097233A (ja) | 新規イソマルトオリゴ糖の製造法 | |
JP3148505B2 (ja) | 非還元末端6‐アジド化マルトペンタオースの製造方法 | |
JPH0567279B2 (ja) | ||
JP3630378B2 (ja) | ガラクトシルグリセロール類の製造方法 | |
Alexander | Comparative studies of yeast and sugarcane invertases | |
JP3995774B2 (ja) | 新規α−フコシダーゼ | |
JPH062072B2 (ja) | N−アセチルグルコサミン、グルコサミン、マンノ−ス又はアロ−スを末端に含む少糖類の製造方法 | |
JPH0824592B2 (ja) | α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖体の製造法 | |
JPH0440998B2 (ja) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |