JPS6031479B2 - 純コンドロイチナ−ゼｃの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコンドロィチン硫酸Ｃタイプ分解酵素であるコ
ンドロィチナーゼＣの製造法に関するものであり、さら
に詳しくはコンドロィチナーゼＣの部分精製液をコンド
ロィチン硫酸８タイプで処理したコンドロィチン硫酸Ｂ
タイプ固定化アガロースを分離剤とするカラムクロマト
グラフイーに付することを特徴とする純コンドロィチナ
ーゼＣの製造法に関するものである。

コンドロィチン硫酸Ｃタイプは動物の結合組織中に見出
される酸性ムコ多糖体の一種で、その保水性により細胞
の新陳代謝を円滑ならしめ、組織の柔軟性の維持を図つ
ているものと推測されているが、その構造、物性、生物
活性などについては不明な部分が多く、例えばその構造
についても一応推定されてはいるが確立されてはいない
。

コンドロィチン硫酸Ｃタイプの構造を明確にすることは
コンドロイチン硫酸Ｃタイプの生体内における役割の追
求、さらに生理機序を明らかにする上で極めて望ましい
ことであり、これらを明らかにすることはコソドロィチ
ン硫酸Ｃタイプの医薬用、食品添加用、さらに化粧用へ
の用途の拡大に大きく寄与するものと考えられる。この
ようにコンドロィチン硫酸Ｃタイプの研究において、温
和な条件下であるためにこれを必要以上に痛めることな
く分解するコンド。

ィチナーゼＣに対する期待は大きく、コンドロイチナー
ゼＣの果たす役割は大きいものがある。コンドロィチナ
ーゼＣに関してはミケラシ−らによってコンド。

ィチン硫酸またはへパリンを添加した堵地で培養したフ
ラボバクテリウム属の菌体内に該酵素が産生されること
を見出され、アガロースを支持体とする露気泳動法によ
って分離精製されている。（Ｙ．Ａ．Ｍｉｃｈｅｌａｃ
ｃｉ ＆ Ｃ．Ｐ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ：Ｊ．Ｂｉｏ１．
Ｃｈｅｍ．、２５１、１１５４（１９７６））。しかし
、この方法では露気泳動という手法であるために、コン
ドロィチナーゼＣを大量に分離精製するには適した方法
とは云い難い。本発明者らはこのような従来法の難点を
解決し、他の酵素を含まない高純度のコンドロィチナー
ゼＣを大量に分離、精製する方法について鋭意研究を行
なった結果、コンドロィチナーゼＣの部分精製液をコン
ドロィチン硫酸Ｂタイプで処理したコンドロィチン硫酸
Ｂタイプ固定化アガロ−スを分離剤とするカラム・クロ
マトグラフィに付することによって、容易に大量の高純
度コンドロィチナーゼＣが得られることを見出し本発明
に到達した。

すなわち、本発明の目的は他の酵素を含まない高純度の
コンドロィチナーゼＣを大量に、かつ容易に得ることに
あり、本発明の目的は、本発明の方法に従って分離、精
製を行なうことによって、容易にその目的を達すること
ができる。

次に本発明をさらに詳細に説明する。

本発明はコンドロィチナ−ゼＣの部分精製液を、コンド
ロィチン硫酸Ｂタイプ処理を行なったコンドロィチン硫
酸Ｂタイプ固定化アガロースを分離剤とするカラムクロ
マトグラフィーによってさらに精製し、高純度のコンド
ロィチナーゼＣを製造する方法にあるが、本発明におけ
るコンドロィチナーゼＣの部分精製液とはコンドロィチ
ナ−ゼＣ産生菌体を破壊して得られる抽出液を、例えば
プロタミン硫酸処理した後ヒドロキシアパタィトカラム
クロマトグラフィー、ゲル炉過法、分別沈澱法等によっ
て部分的に精製して得られるコンドロィチナーゼＣ含有
画分をいうが、なかでもヒドロキシア／ぐタイトカラム
クロマトグラフイーによる分画が好ましい。

コンドロィチナーゼＣ産生菌体としてはフラボバクテリ
ウム属の菌、なかでも特にフラボバクテリウ ム・ヘパ
リナム（ＦｌａＶｏ戊ｃｔ的側ｈｅｐａｎｎｕｍ）が挙
げられるが、培養に際しては、培地にコンドロィチン硫
酸またはへパリン酸を添加すると菌体内に高濃度にコン
ドロィチナーゼＣが蓄積される。

したがって本発明のコンドロィチナーゼＣの部分精製液
としてはコンドロィチン硫酸またはへパリンを添加した
培地を用いて培養したフラボバクテリウム属の菌体を破
壊して得られる抽出液をプロタミン硫酸処理しヒドロキ
シアパタイトを用いたカラムクロマトグラフイーによっ
て部分的に精製されたものが最も適している。フラボバ
クテリウムへパリナムをコンドロイチン硫酸を添加した
培地を用いて培養すると該菌体内にコンドロイチナーゼ
Ｃ、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＡＣな
どの諸酵素が産生される。また、コンドロィチン硫酸の
代りもこへパリンを添加した培地を用いても、該菌体に
コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヘパリ
ナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼＡＣなど
の諸酵素が産生される。このようにして得られた菌体を
超音波処理などの通常の方法によって菌体を破壊し、得
られる抽出液のｐＨを調整してプロタミン硫酸を加え、
遠心分離して得られる上７青液をヒドロキシアパタィト
カラムに負荷し、次いで０．０９ Ｍの緩衝液に添加し
た塩化ナトリウムの濃度を０．２Ｍまで、または塩化ナ
トリウムを添加することなく緩衝液の濃度を０．１９
Ｍまで直接的に高めながら熔出を行なうとコンド。

ィチナーゼＣ含有画分が溶出してくる。このとき、コン
ドロイチン硫酸を添加した培地を用いて培養した菌体の
抽出液を用いた場合にはコンドロィチナーゼＢが、ヘパ
リンを添加した培地を用いて培養した菌体の抽出液を用
いた場合にはへパリナーゼが該画分に共存している。本
分画で用いるヒドロキシアパタィトは目から調整したも
のを用いても、または市販品を用いても何ら差し支えな
い。

本分画で用いる緩衝液は中性附近にｐＨにあるものであ
れば、何れを用いても差し支えない。

中性以外のｐＨ城ではコンドロィチナーゼＣが失活する
恐れがあるので好ましくない。また緩衝液の濃度は０．
０５Ｍ以下でなければならない。０．０８Ｍを超える濃
度ではコンドロィチナーゼＣが溶出する恐れがあるので
好ましくない。

本分画を行なう際緩衛液に添加された塩化ナトリウムの
濃度が０．２ Ｍを超える濃度、または緩衝液の濃度が
０．１９Ｍを超える濃度ではコンドロィチナーゼＢある
いはへパリナーゼの混入量が増えるので好ましくない。

次いでコンドロィチン硫酸Ｂタイプを固定化したビーズ
状のアガロースに、さらにコンドロィチン硫酸Ｂタイプ
を結合せしめたものを充填した力ラムに該画分を負荷し
、緩衝液に添加された塩化ナトリウムの濃度を０．１９
Ｍまで、または塩化ナトリウムを添加することなく緩衝
液の濃度を０．惚けまで直線的に高めながら溶出を行な
うことによって、共存する他酵素を含まない高純度のコ
ンドロィチナーゼＣを容易に得ることができる。本精製
に用いるコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化用のアガロ
ースとしては官能基としてカルボキシル基、ェポキシ基
またはアミノ基を本精製に用いるコンドロィチン硫酸Ｂ
タイプ固定化用のアガロースとしては官能基としてアミ
ノ基カルボキシル基またはヱポキシ基を有するアガロー
スであれば何れを用いても差し支えないが特にビーズ状
に成形されたアガロースが好ましい。

このような官能基を有するアガロースを目から調製した
ものを用いても、または市販されているもの、例えばＡ
Ｈ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）姫、活性ェポ
キシセフア ロース（Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）服、活性シァノゲンブロマィドセ
フアロース（ＣＮＢｒ−Ａｃｔｉｖａにｄ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）燈あるいは服（以上何れもスェーデン国ファ
ルマシャ・ファイン・ケミカルズ社の商標名）などを用
いても何ら差し支えない。このようなアガロースにコン
ドロィチン硫酸Ｂタイプを固定化する方法は既に知られ
ているィンマンの方法（Ｊ．Ｋ．ｌｎｍａｎ：Ｍｅｍｏ
船 ｍＥｍｙｍｏｌｏ瓢、３４、３０、１９７４）に準
じて行なう。

すなわち、官能基を有するアガロースの懸濁液にコンド
ロィチン硫酸Ｂタイプ液を加え、これにカルボジィミド
類を加えて反応せしめた後アガロ−スを分取することに
よって容易にコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロ
ースを得ることができる。このようにして得られたコン
ドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロースに、さらにコ
ンドロィチン硫酸Ｂタイプを加えて処理する。

すなわち、カラムにコンドロィチソ硫酸Ｂタイプ固定化
アガロースを充填し、コンドロィチン硫酸Ｂタイプ溶液
を流してコンドロィチン硫酸Ｂタイプで処理する。また
この処理はコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化ァガロー
スをコソドロィチン硫酸Ｂタイプ溶液中に浸潰しても良
い。この際用いる緩衝液は濃度が０．３Ｍ未満で、ｐＨ
が６〜８の範囲にあるものであれば、何れを用いても差
し支えない。

緩衝液の濃度が０．３Ｍ以上の濃度ではコンドロィチン
硫酸Ｂタイプの結合量が低下するので好ましくない。ま
た、６未満および８を超えるｐＨ城ではコンドロィチン
硫酸Ｂタイプの結合量が低下するので好ましくない。コ
ソドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロースにさらにコ
ンドロィチン硫酸Ｂタイプで処理したアガロースを用い
ることによってのみ、コンドロィチナーゼＣは収率よく
、かつ高純度に精製することができる。

このコンドロィチン硫酸Ｂタイプで処理したコンド。ィ
チン硫酸Ｂタイプ固定化ァガロースを用いると高い収率
を与える。また、このようにコンドロィチン硫酸Ｂタイ
プで処理を行なったコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化
アガロースを用いて精製すると、高純度のコンドロィチ
ナーゼＣが効率よく得られるばかりでなく、連続使用に
際して適宜コンドロィチン硫酸Ｂタイプで処理を行なう
ことによって簡単に再生することができ、コンドロィチ
ン硫酸Ｂタイプのアガロースへの固定化から始める必要
がないので、中途で簡単な再生法を導入することによっ
て長期にわたる連続精製が可能であるという大きな利点
を有するものである。次いでコンドロィチン硫酸Ｂタイ
プを固定化した好ましくはビーズ状のアガロースに、さ
らにコンドロィチン硫酸Ｂタイプで処理したものを充填
したカラムに該画分を負荷し、濃度０．００８Ｍ以下の
緩衝液に添加された塩化ナトリウムの濃度を０．１９の
まで、また塩化ナトリウムを添加することなく緩衝液の
濃度を０．０８ Ｍまで直線的に高めながら溶出を行な
うことによって、共存する他酵素を含まない高純度のコ
ンドロィチナーゼＣを容易に得ることができる。

この場合、塩化ナトリウムの濃度が０．１８Ｍを超える
濃度、あるいは緩衝液の濃度が０．０８Ｋを超える濃度
では共存する他酵素が溶出、混入してくる恐れがあるの
で好ましくない。

溶出に用いる緩衝液は、ｐＨが中性附近にあるものであ
れば何れを用いても差し支えない。

中性以外のｐＨ域ではコンドロィチナーゼＢが失活する
恐れがあるので好ましくない。このように、さらにコン
ドロィチン硫酸Ｂタイプで処理したコンドロィチン硫酸
Ｂタイプ固定化アガロースを分離別とするカラムクロマ
トグラフィーを用いて精製したコンドロィチナーゼＣは
精製前のものに比して約３５倍という高い精製度を示し
、また回収率は高い値を与える。

このようにして得られたコンドロィチナーゼＣはコンド
ロィチン硫酸Ｃタイプのみを分解し、他のコンドロィチ
ン硫酸Ａ、Ｂの各タイプ、へパリチン硫酸などは分解し
ない。

また、その作用至適用温度は２０ｏｏ、作用至超ｐＨ‘
ま８．０で、ミケラシ−らのコンドロイチナーゼＣ（Ｙ
．Ｍ．Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉ＆ Ｃ．Ｐ．Ｄｉｅｍｃｈ
：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍへ ２５１、１１５４、１９
７６）と同じ値を示す。次に本発明を調整例、実施例お
よび比較例によってさらに詳細に説明するが、本発明は
その要旨を超えない限りこれらによって限定されるもの
ではない。

調整例 １ 菌体の培養 べプトン１．５％、肉エキス０．４５％、酵母エキス１
．０％、麦芽エキス１．０％、コンドロィチン硫酸Ｃタ
イプ（Ｓ舎量７．１％）１．０％を含む液体塔地（ｐＨ
７．０）にフラボバクテリウム・へパリナムＡＴＣＣＩ
３１２５を接種し、３０ｏｏにおいて２０時間振盤培養
を行ない、培養液を同液体培地に３％になるように加え
、３０ｏｏにおいて２餌寿間振盤培養を行なつた。

調整例 ２ 菌体の培養 べプトン１．５％、肉エキス０．４５％、酵母エキス１
．０％、麦芽エキス１．０％を含む液体培地（ｐＨ７．
０）にフラボバクテリウム、ヘパリナムＡＴＣＣＩ３１
２５を接種し、３０００において２餌時間振錘培養を行
ない、培養液を同液体培地に３％になるように加え、３
０００において培養を行ない、培養１粥時間目にへパリ
ン（半井化学（株）製、１５０国際単位／雌）を０．０
２％になるように加え、さらに６時間培養を行なった。

調整例 ３菌体抽出液の調製 調製例１によって得られたフラボバクテリゥム・ヘパリ
ナムＡＴＣＣＩ３１２５を常法に従って遠心分離して菌
体を集め、洗液後０．７Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）
３０凧‘に菌体５夕を懸濁し、１０キロサイクル／秒で
１５分間超音波処理を行ない、遠心分離して細胞壁を除
き、菌体注出液を得た。

調整例 ４ 菌体抽出液の調製 調整例２によって得られたフラボバクテリゥム・ヘパリ
ナムＡＴＣＣＩ３１２５を調整例３と同様に処理して菌
体抽出液を得た。

調製例 ５ コンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロースの調製コ
ンドロィチン硫酸Ｂタイプ（Ｓ含量７．２％）５０の９
を含む溶液１の上を、予めｐＨを４７．５に調整したＡ
Ｈ−セファロースの１夕を含む懸濁液６地に加え、１ー
エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピノレ）カルボ
ジイミド１５のｐを含む溶液０．５叫を加え、ｐＨを４
．７５に保ちながら一夜室温に保ち、炉過後洗浄してコ
ンド。

ィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロース１．０５夕を得た
。実施例 １ 粗コンドロィチナーゼＣ画分の調製 調製例３によって得られた菌体抽出液をヴィスキングチ
ューブを用いて、流水に対して４℃において一夜透析を
行ない、透析内液８０の‘‘こ０．１ハ４になるように
酢酸ナトリウムを加え、州を６．５に調整した後プロタ
ミン硫酸７５雌を加えて１時間放置し、遠′０分離して
生じた沈澱を除き、水を加えて２倍に希釈し、ベルナル
ディの方法（Ｇ．ＢＣｒＭｒｄｉ：Ｍｅ仇ｏｄ ｉｎ
ＥｍＭｍｏｌｏｇｙ、２２、３２５、１９７１）に従っ
て調製したヒドロキシァパタィトを充填した力ラム（２
．２×８．０伽）を予め０．０８Ｍ隣酸塩緩衝液（ｐＨ
６．８）を用いて平衝化した後負荷し、次いで同緩衝液
に塩化ナトリウムを加え、その濃度を０．２Ｍまで直線
的に高めながら１時間当り３５泌の流速で溶出を行ない
、溶出液第１５０〜４００泌の画分２５０の‘にコンド
ロィチナーゼＣを得た。

該画分のコンドロィチナーゼＣは全活性６００単位、蛋
白１服当り５８．９単位であった。コンドロィチナーゼ
Ｃの活性は酵素液ｏ．２私に１０ｍＭ酢酸カルシウム溶
液０．１の‘を加え、これにコンド。

ィチン硫酸Ｃタイプを１Ｍ当り１０ｍｐ含む基質溶液０
．１叫を加え、３７０に１時間保った後直ちに２分間煮
沸し、０．０磯塩酸２．５の‘を加え、遠心分離して得
られる上清液の２３加川における吸収を測定した。空試
験として酵素液の代り‘こ水を用いて同様に処理して吸
光度を測定する。このとき吸光度の差が１のときを１単
位とした。該画分にはコンドロィチナーゼＣの他にコン
ドロィチナーゼＢが検出された。

実施例 ２ コンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロースのコソド
ロィチン硫酸Ｂタイプによる処理調製例３によって得ら
れたコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロース１．
０５夕を０．００８Ｍ隣酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）１０
の‘に懸濁し、これをカラム（１×５弧）に流し込んで
コンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロースを充填し
、次いでコンドロィチン硫酸Ｂタイプ５０の９を含む同
緩衝液３の‘を負荷し、同緩衝液１００私を１時間当り
３５奴の流速で流して過剰のコンドロィチン硫酸Ｂタイ
プを除いた。

負荷したコンドロィチン硫酸Ｂタイプ５０の９に対して
、洗液中に回収したコンドロィチン硫酸Ｂタイプは１５
の９であった。

このことから差し引き３５の９のコンドロィチン硫酸Ｂ
タイプがコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロース
に結合したことになる。コンドロィチン硫酸Ｂタイプは
ビッタ−およびミュアーのカルバゾール法（Ｊ．Ｂｉｔ
にｒ＆日．Ｍ．Ｍｕｉｒ：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
、４、３３０、１９６２）に従ってコンドロィチン硫酸
Ｂタイプ水溶液０．５肌に０．９５％のホウ酸を含む濃
硫酸３の‘を加え、１００ｏｏに１０分保ち、０．１２
５％カルバゾールェタノール溶液０．１泌を加え、１０
０ｑｏに１８分保ち、冷却後５３血の吸光度を測定し、
得られるウロン酸量からコンドロィチン硫酸Ｂタイプ量
を算出した。

実施例 ３ コンドロィチナーゼＣの精製 実施例１によって得られた粗コンドロィチナーゼＣ溶液
２５０の‘（全活性６０山里位、５８．９筆位ノのタ蛋
白）をヴィスキングチューブを用いて、水に対して４℃
において透析した後、実施例２によって得られたコンド
ロィチン硫酸Ｂタイプ処理を行なったコンドロィチン硫
酸Ｂタイプ固定化アガロースカラム（１×５ｃｍ）に負
荷し、０．００９Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）に塩化
ナトリウムを加え、その濃度を０．１８Ｍまで直線的に
高めながら１時間当り３０私の流速で溶出を行ない、溶
出液第１２５〜２５０の‘の画分１２５の上にコンドロ
ィチナーゼＣを得た。

該画分のコンドロィチナーゼＣは全活性４３９単位で、
回収率は約７２％、また蛋白１の９当り２．０５０筆位
で３８昔という高い精製度を示した。また、該画分には
コンドロィチナーゼＢは見出されなかった。実施例 ４
粗コンドロィチナーゼＣ画分の調製 調製例４によって得られた菌体抽出液を、実施例１と同
様に透析、プロタミン硫酸処理を行なった後、ヒドロキ
シアパタィト・力ラムクロマトグラフイを行ない、溶出
液第２００〜４００私の画分２００の上にコンドロィチ
ナーゼＣを得た。

該画分のコンドロイチナーゼＣは全活性３６山単位、蛋
白１の９当り６の単位であった。また該画分にはへパリ
ナーゼおよびコンドロイチナーゼＢが検出された。実施
例 ５コンドロィチナーゼＣの精製 実施例４によって得られた粗コンドロィチナ−ゼＣ溶液
２００の土（全活性３６山単位、６山単位／奴蛋白）を
実施例３と同様にコンドロィチン硫酸Ｂタイプ処理を行
なったコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロースを
用いたカラムクロマトグラフィを行ない、溶出液第１２
５〜２５０の‘の函分１２５初‘にコンドロィチナーゼ
Ｃを得た。

該画分のコンドロィチナーゼＣは全活性２５２単位で回
収率は約７０％、また蛋白１の９当り２．１６０単位で
約３６倍という高い精製度を示した。また該画分にはへ
パリナーゼおよびコンドロイチナーゼＢは見出されなか
った。比較例 １〜２ ヒドロキシアパタィトを用いた分画によって得られたコ
ンドロィチナーゼＣ画分１２５叫（全活性３０山単位、
２９単位／雌蛋白）を透析後、コンドロィチン硫酸Ｂタ
イプ固定化アガロースおよびさらにコンドロィチン硫酸
Ｂタイプを結合せしめたコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固
定化アガロースをそれぞれ充填したカラム（１〜５肌）
に負荷し、０．００９Ｋ隣酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）に
塩化ナトリウムを添加し、その濃度を０．１８Ｍまで直
線的に高めながら１時間当り３０の上の流速で溶出を行
ない、共存する他酵素を含まないコンドロィチナーゼＣ
を得た。

その結果は第１表に示す通りであった。・士言王、 コ
ンドロィチナ−ゼＣの欄の数値はコンドロィチナーゼＣ
の単位数で表した。

比較例１はコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロー
スを用いた。

比較例２はコンドロィチン硫酸Ｂタイプ固定化アガロー
スを、さらにコンドロィチン硫酸Ｂタイプ５０の夕を含
む０．００９の燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）３の‘を負
荷、コンドロィチン硫酸Ｂタイプ処理し、洗総して過剰
のコンド。

ィチン硫酸Ｂタイプを除いた後用いた。この結果から明
らかな如く、比較例１では全量２４単位のコンドロィチ
ナーゼＣしか得られず、回収率が８％であったのに対し
て、比較例２では全量２１３単位のコンドロィチナ−ゼ
Ｃが得られ、７２％という高い回収率を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コンドロイチナーゼＣの部分精製液を、コンドロイ
   チン硫酸Ｂタイプで処理したコンドロイチン硫酸Ｂタイ
   プ固定化アガロースを分離剤とするカラムクロマトグラ
   フイーに付することを特徴とする純コンドロイチナーゼ
   Ｃの製造法。 ２ コンドロイチナーゼＣの部分精製液が、コンドロイ
   チナーゼＣ産生菌体を破壊した後得られる抽出液をプロ
   タミン硫酸処理しさらにヒドロキシアパタイトを用いて
   分画されたコンドロイチナーゼＣ含有液である特許請求
   の範囲第１項記載の製造法。 ３ コンドロイチナーゼＣ産生菌体がコンドロイチン硫
   酸またはヘパリンを添加した培地を用いて培養したフラ
   ボバクテリウム属の菌体である特許請求の範囲第１項記
   載の製造法。