JPH0662852A - フコイダン分解酵素 - Google Patents
フコイダン分解酵素Info
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- JPH0662852A JPH0662852A JP24405592A JP24405592A JPH0662852A JP H0662852 A JPH0662852 A JP H0662852A JP 24405592 A JP24405592 A JP 24405592A JP 24405592 A JP24405592 A JP 24405592A JP H0662852 A JPH0662852 A JP H0662852A
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- degrading enzyme
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 フコイダン分解酵素、及びその製造方法を提
供する。 【構成】 フコイダンに作用してフコイダンを分解し、
フコイダンを低分子化させると共に還元力を増加させる
作用及び基質特異性、３．０〜３．５付近の至適ｐＨ、
５０〜５５℃付近の至適温度、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法で約２万３千の分子量なる理化学的
性質を有するフコイダン分解酵素。真ウニ類に属する動
物から抽出、精製するフコイダン分解酵素の製造方法。 【効果】 フコイダンの構造解析、分解やフコイダンオ
リゴ糖の調製などに有用である。
供する。 【構成】 フコイダンに作用してフコイダンを分解し、
フコイダンを低分子化させると共に還元力を増加させる
作用及び基質特異性、３．０〜３．５付近の至適ｐＨ、
５０〜５５℃付近の至適温度、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法で約２万３千の分子量なる理化学的
性質を有するフコイダン分解酵素。真ウニ類に属する動
物から抽出、精製するフコイダン分解酵素の製造方法。 【効果】 フコイダンの構造解析、分解やフコイダンオ
リゴ糖の調製などに有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フコイダンの構造解析
やフコイダンの分解及びオリゴ糖の製造等に利用できる
フコイダン分解酵素、及びその製造方法に関する。
やフコイダンの分解及びオリゴ糖の製造等に利用できる
フコイダン分解酵素、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】藻類由来の硫酸化多糖の一部であるフコ
イダンは以前から腫瘍増殖阻止効果や抗凝血作用や脂血
清澄作用等の重要な生物活性を持つことが知られてい
る。フコイダンはフコースを主成分とする硫酸化多糖で
あり、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マン
ノース、グルコース等をも含む物が知られているが、由
来となる海藻の種類によってこれらの構成糖の種類や量
が異なる。またその構造もよくわかっておらず、分子量
も均一ではないため、フコイダンの生物活性に関する研
究はあまり進展していない。フコイダンの構造を解析し
たり分子量の調整を行うに当ってはエキソ（ exo )型や
エンド（ endo ) 型のフコイダンを分解する酵素を利用
するのが有利である。従来より、アワビ、ホタテ貝、海
洋微生物などが、それぞれある種の、エンド型のフコイ
ダンを分解する酵素を生産する可能性が報告されてい
る。しかしながら、これらの酵素は一般に生体の中に極
微量含まれているだけなので、これらの酵素を完全に精
製するには様々な精製方法を駆使する必要があり、エン
ド型のフコイダンを分解する酵素の入手は困難である。
実際に、現在までに完全に精製されたエンド型のフコイ
ダンを分解する酵素はホタテ貝由来の酵素しかない〔バ
イオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオ
ケミストリー（ Biosci. Biotech. Biochem. )第５６
巻、第４９０〜４９４頁、１９９２年、日本農芸化学会
誌第６６巻、第３号、第３５８頁、１９９２年〕。
イダンは以前から腫瘍増殖阻止効果や抗凝血作用や脂血
清澄作用等の重要な生物活性を持つことが知られてい
る。フコイダンはフコースを主成分とする硫酸化多糖で
あり、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マン
ノース、グルコース等をも含む物が知られているが、由
来となる海藻の種類によってこれらの構成糖の種類や量
が異なる。またその構造もよくわかっておらず、分子量
も均一ではないため、フコイダンの生物活性に関する研
究はあまり進展していない。フコイダンの構造を解析し
たり分子量の調整を行うに当ってはエキソ（ exo )型や
エンド（ endo ) 型のフコイダンを分解する酵素を利用
するのが有利である。従来より、アワビ、ホタテ貝、海
洋微生物などが、それぞれある種の、エンド型のフコイ
ダンを分解する酵素を生産する可能性が報告されてい
る。しかしながら、これらの酵素は一般に生体の中に極
微量含まれているだけなので、これらの酵素を完全に精
製するには様々な精製方法を駆使する必要があり、エン
ド型のフコイダンを分解する酵素の入手は困難である。
実際に、現在までに完全に精製されたエンド型のフコイ
ダンを分解する酵素はホタテ貝由来の酵素しかない〔バ
イオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオ
ケミストリー（ Biosci. Biotech. Biochem. )第５６
巻、第４９０〜４９４頁、１９９２年、日本農芸化学会
誌第６６巻、第３号、第３５８頁、１９９２年〕。
【０００３】また、ブレチン オブ ザ ジャパニーズ
ソサエティ オブ サイエンティフィック フィッシ
ャリーズ（ Bulletin of the Japanese Society of Sci
entific Fisheries ) 第５０巻、第７号、第１２５５〜
１２６０頁（１９８４年）には、市販のフコイダン（シ
グマ社製）を基質として用いた、キタムラサキウニ（St
rongylocentrotus nudus )のフコイダン分解酵素の検索
が記載されているが、キタムラサキウニの消化管のホモ
ジネートの未精製の上清がフコイダンに作用して還元性
物質が増加することをソモジ−ネルソン（ Somogyi-Nel
son ) 法で確認し、また反応液中に生成してくるフコー
スを初めとする単糖類を薄層クロマトグラフィーで観察
したという報告のみである。すなわちこの報告において
は、未精製のキタムラサキウニ消化管抽出液中に、フコ
イダンを単糖に分解するエキソ型の酵素の存在が示唆さ
れるのみである。上述のごとく、現在エンド型のフコイ
ダンを分解する酵素の入手は困難である。
ソサエティ オブ サイエンティフィック フィッシ
ャリーズ（ Bulletin of the Japanese Society of Sci
entific Fisheries ) 第５０巻、第７号、第１２５５〜
１２６０頁（１９８４年）には、市販のフコイダン（シ
グマ社製）を基質として用いた、キタムラサキウニ（St
rongylocentrotus nudus )のフコイダン分解酵素の検索
が記載されているが、キタムラサキウニの消化管のホモ
ジネートの未精製の上清がフコイダンに作用して還元性
物質が増加することをソモジ−ネルソン（ Somogyi-Nel
son ) 法で確認し、また反応液中に生成してくるフコー
スを初めとする単糖類を薄層クロマトグラフィーで観察
したという報告のみである。すなわちこの報告において
は、未精製のキタムラサキウニ消化管抽出液中に、フコ
イダンを単糖に分解するエキソ型の酵素の存在が示唆さ
れるのみである。上述のごとく、現在エンド型のフコイ
ダンを分解する酵素の入手は困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
の現状にかんがみ、フコイダンの研究や利用に有用な新
規なエンド型のフコイダンを分解する酵素及びその製造
方法を提供することにある。
の現状にかんがみ、フコイダンの研究や利用に有用な新
規なエンド型のフコイダンを分解する酵素及びその製造
方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするフコイダン分解酵素（以下、本発明のフコ
イダン分解酵素と称する）に関する。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンに作用してフコ
イダンを分解し、フコイダンを低分子化させると共に還
元力を増加させる。 （II) 至適ｐＨ：至適ｐＨは３．０〜３．５付近にあ
る。 （III)至適温度：至適温度は５０〜５５℃付近である。 （IV) 分子量：分子量は約２３，０００（ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法による）である。 また本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明のフコ
イダン分解酵素の製造方法に関する発明であって、真ウ
ニ属に属する動物から抽出、精製することを特徴とす
る。
発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするフコイダン分解酵素（以下、本発明のフコ
イダン分解酵素と称する）に関する。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンに作用してフコ
イダンを分解し、フコイダンを低分子化させると共に還
元力を増加させる。 （II) 至適ｐＨ：至適ｐＨは３．０〜３．５付近にあ
る。 （III)至適温度：至適温度は５０〜５５℃付近である。 （IV) 分子量：分子量は約２３，０００（ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法による）である。 また本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明のフコ
イダン分解酵素の製造方法に関する発明であって、真ウ
ニ属に属する動物から抽出、精製することを特徴とす
る。
【０００６】以下本発明について、詳細に説明する。本
発明に使用される原材料は真ウニ属に属する動物であれ
ば特に限定されるものではない。また、本発明のフコイ
ダン分解酵素を採取するのに用いる部位は特に限定され
ないが、消化管壁や生殖巣が利用できる。本発明のフコ
イダン分解酵素を精製するには、例えばキタムラサキウ
ニの消化管壁を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例
えば、ホモジナイザー等で細胞を破砕し、無細胞抽出液
を得る。次いで、この抽出液から通常用いられる精製手
段により精製酵素標品を得ることができ、特に、フコイ
ダンを結合させた陰イオン交換樹脂を作製し、精製に用
いることができ、該樹脂はフコイダン分解酵素の精製に
有用である。
発明に使用される原材料は真ウニ属に属する動物であれ
ば特に限定されるものではない。また、本発明のフコイ
ダン分解酵素を採取するのに用いる部位は特に限定され
ないが、消化管壁や生殖巣が利用できる。本発明のフコ
イダン分解酵素を精製するには、例えばキタムラサキウ
ニの消化管壁を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例
えば、ホモジナイザー等で細胞を破砕し、無細胞抽出液
を得る。次いで、この抽出液から通常用いられる精製手
段により精製酵素標品を得ることができ、特に、フコイ
ダンを結合させた陰イオン交換樹脂を作製し、精製に用
いることができ、該樹脂はフコイダン分解酵素の精製に
有用である。
【０００７】本発明のフコイダン分解酵素の酵素化学的
及び理化学的性質は次の通りである。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンに作用してフコ
イダンを分解し、フコイダンを低分子化させると共に還
元力を増加させる。
及び理化学的性質は次の通りである。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンに作用してフコ
イダンを分解し、フコイダンを低分子化させると共に還
元力を増加させる。
【０００８】本発明者らは、以下に述べるごとく、本発
明のフコイダン分解酵素の作用機作を２−アミノピリジ
ンを用いた蛍光標識方法による分析で決定した。後述の
方法により精製したヒバマタ由来フコイダン（シグマ社
製）２ｍｇを充分に乾燥させ、パルステーションモデル
４０００及びパルステーションピリジルアミネーション
リエイジェントキット（共に宝酒造社製）を用い、各々
の取扱説明書に記載の方法に従ってピリジルアミノ化
（ＰＡ化）を行い、ＰＡ化フコイダンを得た。次いで、
このＰＡ化フコイダンを２００μｌの蒸留水に溶かし、
ＨＰＬＣ用カラムＯＨｐａｋ ＳＢ−２００４（昭和電
工社製）により分子量分画を行い高分子画分のみを集
め、凍結乾燥した。５μｇのＰＡ化フコイダンを３μｇ
の精製した本発明のフコイダン分解酵素標品と共に、３
時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣにより分析した。
使用したカラムはショウデックス（ Shodex ) ＳＢ−８
０３（昭和電工社製）で、蛍光検出器（日立製作所製、
Ｆ−１１５０、Ｅｘ３２０ｎｍ／Ｅｍ４００ｎｍに設
定）により検出した。対照として、本発明のフコイダン
分解酵素標品の代りに、オートクレーブで１２０℃、５
分の処理により変性させた本発明の酵素の精製標品の３
μｇを用いて同様の条件により反応させ、分析を行っ
た。
明のフコイダン分解酵素の作用機作を２−アミノピリジ
ンを用いた蛍光標識方法による分析で決定した。後述の
方法により精製したヒバマタ由来フコイダン（シグマ社
製）２ｍｇを充分に乾燥させ、パルステーションモデル
４０００及びパルステーションピリジルアミネーション
リエイジェントキット（共に宝酒造社製）を用い、各々
の取扱説明書に記載の方法に従ってピリジルアミノ化
（ＰＡ化）を行い、ＰＡ化フコイダンを得た。次いで、
このＰＡ化フコイダンを２００μｌの蒸留水に溶かし、
ＨＰＬＣ用カラムＯＨｐａｋ ＳＢ−２００４（昭和電
工社製）により分子量分画を行い高分子画分のみを集
め、凍結乾燥した。５μｇのＰＡ化フコイダンを３μｇ
の精製した本発明のフコイダン分解酵素標品と共に、３
時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣにより分析した。
使用したカラムはショウデックス（ Shodex ) ＳＢ−８
０３（昭和電工社製）で、蛍光検出器（日立製作所製、
Ｆ−１１５０、Ｅｘ３２０ｎｍ／Ｅｍ４００ｎｍに設
定）により検出した。対照として、本発明のフコイダン
分解酵素標品の代りに、オートクレーブで１２０℃、５
分の処理により変性させた本発明の酵素の精製標品の３
μｇを用いて同様の条件により反応させ、分析を行っ
た。
【０００９】その結果を図１に示す。すなわち図１は、
ＰＡ化フコイダンに本発明のフコイダン分解酵素を作用
させ、分解物の蛍光分析を行った際のクロマトグラムで
ある。図１において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時
間（分）を示し、図中の矢印ａ、ｂの各ピークはＰＡ化
フコイダンの溶出位置を示す。図１によれば、未変性の
フコイダン分解酵素を用いた場合には（矢印ａ）、変性
させた本発明の酵素を用いた場合（矢印ｂ）に比べて、
ＰＡ化フコイダンの溶出位置が低分子側にシフトしてお
り、本発明のフコイダン分解酵素の作用によりＰＡ化フ
コイダンが低分子化されていることがわかる。
ＰＡ化フコイダンに本発明のフコイダン分解酵素を作用
させ、分解物の蛍光分析を行った際のクロマトグラムで
ある。図１において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時
間（分）を示し、図中の矢印ａ、ｂの各ピークはＰＡ化
フコイダンの溶出位置を示す。図１によれば、未変性の
フコイダン分解酵素を用いた場合には（矢印ａ）、変性
させた本発明の酵素を用いた場合（矢印ｂ）に比べて、
ＰＡ化フコイダンの溶出位置が低分子側にシフトしてお
り、本発明のフコイダン分解酵素の作用によりＰＡ化フ
コイダンが低分子化されていることがわかる。
【００１０】精製したヒバマタ由来のフコイダンに本発
明のフコイダン分解酵素を作用させ、分解物の還元末端
をＰＡ化して、蛍光分析を行った。２ｍｇの精製したヒ
バマタ由来フコイダンを、１５μｇの精製した本発明の
フコイダン分解酵素標品と共に、後述する酵素活性の測
定方法に記載した条件に従って１２時間反応させた後、
反応液をパルステーションモデル４０００及びパルステ
ーションピリジルアミネーションリエイジェントキット
（共に宝酒造社製）を用い、各々の取扱説明書に記載の
方法に従ってＰＡ化し、ＰＡ化した反応液をＨＰＬＣに
より分析した。使用したカラムはショウデックスＳＢ−
８０３で蛍光検出器（日立製作所製、Ｆ−１１５０、Ｅ
ｘ３２０ｎｍ／Ｅｍ４００ｎｍに設定）により検出し
た。対照として、本発明のフコイダン分解酵素標品の代
りに、オートクレーブで１２０℃、５分の処理により変
性させた本発明の酵素の精製標品の１５μｇを用いて同
様の条件により反応させ、分析を行った。
明のフコイダン分解酵素を作用させ、分解物の還元末端
をＰＡ化して、蛍光分析を行った。２ｍｇの精製したヒ
バマタ由来フコイダンを、１５μｇの精製した本発明の
フコイダン分解酵素標品と共に、後述する酵素活性の測
定方法に記載した条件に従って１２時間反応させた後、
反応液をパルステーションモデル４０００及びパルステ
ーションピリジルアミネーションリエイジェントキット
（共に宝酒造社製）を用い、各々の取扱説明書に記載の
方法に従ってＰＡ化し、ＰＡ化した反応液をＨＰＬＣに
より分析した。使用したカラムはショウデックスＳＢ−
８０３で蛍光検出器（日立製作所製、Ｆ−１１５０、Ｅ
ｘ３２０ｎｍ／Ｅｍ４００ｎｍに設定）により検出し
た。対照として、本発明のフコイダン分解酵素標品の代
りに、オートクレーブで１２０℃、５分の処理により変
性させた本発明の酵素の精製標品の１５μｇを用いて同
様の条件により反応させ、分析を行った。
【００１１】結果を図２に示す。すなわち図２は精製し
たヒバマタ由来のフコイダンに本発明のフコイダン分解
酵素標品を作用させ、その反応生成物をＰＡ化して分析
を行った際のクロマトグラムである。縦軸は相対蛍光強
度、横軸は保持時間（分）を示し、図中の矢印ａ、ｂの
各ピークはＰＡ化されたフコイダン分解物の溶出位置を
示す。変性させた本発明のフコイダン分解酵素を用いた
場合には、矢印ａで示される分子量の大きなＰＡ化され
たフコイダンのピークしか検出されないのに対して、未
変性のフコイダン分解酵素標品を用いて酵素反応を行っ
た場合には、矢印ａで示されるピークの溶出位置よりも
低分子側に矢印ｂで示す様々な分子量のＰＡ化されたフ
コイダン分解物のピークが検出された。すなわち、本発
明のフコイダン分解酵素がフコイダンをエンド型に切断
していることがわかる。
たヒバマタ由来のフコイダンに本発明のフコイダン分解
酵素標品を作用させ、その反応生成物をＰＡ化して分析
を行った際のクロマトグラムである。縦軸は相対蛍光強
度、横軸は保持時間（分）を示し、図中の矢印ａ、ｂの
各ピークはＰＡ化されたフコイダン分解物の溶出位置を
示す。変性させた本発明のフコイダン分解酵素を用いた
場合には、矢印ａで示される分子量の大きなＰＡ化され
たフコイダンのピークしか検出されないのに対して、未
変性のフコイダン分解酵素標品を用いて酵素反応を行っ
た場合には、矢印ａで示されるピークの溶出位置よりも
低分子側に矢印ｂで示す様々な分子量のＰＡ化されたフ
コイダン分解物のピークが検出された。すなわち、本発
明のフコイダン分解酵素がフコイダンをエンド型に切断
していることがわかる。
【００１２】（II) 至適ｐＨ：至適ｐＨは３．０〜３．
５付近にある（図３）。すなわち図３は、ヒバマタ由来
のフコイダンを基質として用いた際の本発明のフコイダ
ン分解酵素のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであ
り、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
５付近にある（図３）。すなわち図３は、ヒバマタ由来
のフコイダンを基質として用いた際の本発明のフコイダ
ン分解酵素のｐＨと相対活性の関係を表すグラフであ
り、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。
【００１３】（III)至適温度：至適温度は５０〜５５℃
付近である（図４）。すなわち図４は、ヒバマタ由来の
フコイダンを基質として用いた際の本発明のフコイダン
分解酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、
縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
付近である（図４）。すなわち図４は、ヒバマタ由来の
フコイダンを基質として用いた際の本発明のフコイダン
分解酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、
縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
【００１４】（IV) 分子量：分子量は約２３，０００
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）
である。
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）
である。
【００１５】本発明のフコイダン分解酵素の活性の測定
は以下の様にして行う。 （１）市販フコイダンの精製 １ｇのヒバマタ由来のフコイダン（シグマ社製）を５０
ｍｌの２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解し、同緩衝液で
十分透析後、遠心分離して不溶物を除き、あらかじめ２
００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ２．５）で平衡化した２５０ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロース（ＤＥＡＥ−Sepharose ) ＦＦ（フ
ァルマシア社製）を詰めたカラムに流す。同カラムを、
２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ２．５）で洗浄し、次に２００〜３０
００ｍＭの塩化ナトリウムでグラジエント溶出し、８０
０〜２０００ｍＭの溶出画分を集め、限外ろ過により脱
塩、濃縮し４０ｍｌの精製フコイダン溶液を得た。
は以下の様にして行う。 （１）市販フコイダンの精製 １ｇのヒバマタ由来のフコイダン（シグマ社製）を５０
ｍｌの２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解し、同緩衝液で
十分透析後、遠心分離して不溶物を除き、あらかじめ２
００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ２．５）で平衡化した２５０ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロース（ＤＥＡＥ−Sepharose ) ＦＦ（フ
ァルマシア社製）を詰めたカラムに流す。同カラムを、
２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ２．５）で洗浄し、次に２００〜３０
００ｍＭの塩化ナトリウムでグラジエント溶出し、８０
０〜２０００ｍＭの溶出画分を集め、限外ろ過により脱
塩、濃縮し４０ｍｌの精製フコイダン溶液を得た。
【００１６】（２）活性の測定 上記精製フコイダン溶液１００μｌと１２５ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
３．０）１００μｌを加え、適当に希釈したフコイダン
分解酵素を５０μｌ加えてよくかくはんし３７℃で１８
時間保温する。別に対照としてフコイダン溶液の代りに
水を加えたものと、酵素溶液の代りに酵素の溶媒として
用いた緩衝液を加えたものも同条件で保温する。これら
の反応液に含まれる還元糖量をソモジ−ネルソン法〔福
井作蔵著、「還元糖の定量法」（第２版）第９頁、学会
出版センター、１９９０年〕により測定し、別にＬ−フ
コースを標準物質として作成した検量線よりＬ−フコー
ス当量を求める。その後、下記の式（数１）より酵素溶
液の活性を求める。
トリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
３．０）１００μｌを加え、適当に希釈したフコイダン
分解酵素を５０μｌ加えてよくかくはんし３７℃で１８
時間保温する。別に対照としてフコイダン溶液の代りに
水を加えたものと、酵素溶液の代りに酵素の溶媒として
用いた緩衝液を加えたものも同条件で保温する。これら
の反応液に含まれる還元糖量をソモジ−ネルソン法〔福
井作蔵著、「還元糖の定量法」（第２版）第９頁、学会
出版センター、１９９０年〕により測定し、別にＬ−フ
コースを標準物質として作成した検量線よりＬ−フコー
ス当量を求める。その後、下記の式（数１）より酵素溶
液の活性を求める。
【００１７】
【数１】 〔（Ｔ−Ｅ−Ｆ）×０．２５×ｄｆ〕／（０．０５×１８×６０） ＝（Ｕ／ｍｌ）
【００１８】 Ｔ ：反応液中に生成した還元力のＬ−フコース
当量（μｍｏｌ） Ｅ ：フコイダンの代りに水を用いた反応液中に
生成した還元力のＬ−フコース当量（μｍｏｌ） Ｆ ：酵素溶液の代りに酵素が溶解している緩衝
液を加えた反応液中に生成した還元力のＬ−フコース当
量（μｍｏｌ） ０．２５ ：反応液の液量（ｍｌ） ０．０５ ：反応に使用した酵素液の液量（ｍｌ） １８×６０：反応時間（分） ｄｆ ：酵素溶液の希釈倍率 １単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏ
ｌのＬ−フコース当量の還元力を生成させる酵素量とす
る。
当量（μｍｏｌ） Ｅ ：フコイダンの代りに水を用いた反応液中に
生成した還元力のＬ−フコース当量（μｍｏｌ） Ｆ ：酵素溶液の代りに酵素が溶解している緩衝
液を加えた反応液中に生成した還元力のＬ−フコース当
量（μｍｏｌ） ０．２５ ：反応液の液量（ｍｌ） ０．０５ ：反応に使用した酵素液の液量（ｍｌ） １８×６０：反応時間（分） ｄｆ ：酵素溶液の希釈倍率 １単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏ
ｌのＬ−フコース当量の還元力を生成させる酵素量とす
る。
【００１９】タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍ
の吸光度を測定することにより行う。その際１ｍｇ／ｍ
ｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算する。
の吸光度を測定することにより行う。その際１ｍｇ／ｍ
ｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算する。
【００２０】
【実施例】以下に本発明を実施例をもって示すが、本発
明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではな
い。
【００２１】実施例１ 以下の操作は４℃で行った。キタムラサキウニ２．７ｋ
ｇ（１４個）の消化管壁及び消化管内容物１９２ｇを常
法によりアセトンパウダー（２０ｇ）とし、３００ｍｌ
の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に懸
濁し、２時間かくはん後遠心分離し上清を得た。その上
清に７０％飽和となるように硫安を加え１時間かくはん
後遠心分離し沈殿を得た。その沈殿を２０ｍｌの１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解後、５
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ３．０）で透析した。この酵素液を遠心
分離した上清に、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で平衡化し
たＤＥＡＥ−セファロースＦＦ２５ｍｌを加えかくはん
後ガラスフィルターでろ過し、ろ液３０ｍｌを得た。
ｇ（１４個）の消化管壁及び消化管内容物１９２ｇを常
法によりアセトンパウダー（２０ｇ）とし、３００ｍｌ
の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に懸
濁し、２時間かくはん後遠心分離し上清を得た。その上
清に７０％飽和となるように硫安を加え１時間かくはん
後遠心分離し沈殿を得た。その沈殿を２０ｍｌの１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解後、５
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ３．０）で透析した。この酵素液を遠心
分離した上清に、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で平衡化し
たＤＥＡＥ−セファロースＦＦ２５ｍｌを加えかくはん
後ガラスフィルターでろ過し、ろ液３０ｍｌを得た。
【００２２】別に、本酵素の精製に使用するために、フ
コイダンを結合させた陰イオン交換樹脂の調製を下記の
要領で行った。以下の操作は２３℃で行った。５ｍｌの
ＤＥＡＥ−セファロースＦＦをガラス製のカラムに詰
め、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で平衡化した。このカラ
ムに、上述した、酵素活性の測定のために精製したフコ
イダン溶液を流し、次に、平衡化に用いた緩衝液で洗浄
し、フコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂を得た。
コイダンを結合させた陰イオン交換樹脂の調製を下記の
要領で行った。以下の操作は２３℃で行った。５ｍｌの
ＤＥＡＥ−セファロースＦＦをガラス製のカラムに詰
め、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で平衡化した。このカラ
ムに、上述した、酵素活性の測定のために精製したフコ
イダン溶液を流し、次に、平衡化に用いた緩衝液で洗浄
し、フコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂を得た。
【００２３】このようにして得られた、フコイダンを結
合させた陰イオン交換樹脂に、上記のフコイダン分解酵
素液３０ｍｌを流し、次に、５０ｍＭ塩化ナトリウムを
含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で
洗浄し、非吸着分を除いた。この後、２００ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）を流して溶出してくるタンパク質を集め、精製
フコイダン分解酵素１５５ｍＵを得た。本酵素標品の比
活性は８．０ｍＵ／ｍｇであった。また、精製したフコ
イダン分解酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り均一なバンドを呈した。以上の精製工程の各結果を表
１に示す。
合させた陰イオン交換樹脂に、上記のフコイダン分解酵
素液３０ｍｌを流し、次に、５０ｍＭ塩化ナトリウムを
含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で
洗浄し、非吸着分を除いた。この後、２００ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）を流して溶出してくるタンパク質を集め、精製
フコイダン分解酵素１５５ｍＵを得た。本酵素標品の比
活性は８．０ｍＵ／ｍｇであった。また、精製したフコ
イダン分解酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り均一なバンドを呈した。以上の精製工程の各結果を表
１に示す。
【００２４】
【表１】 表 １ 工 程 総タンパク 総活性 比活性 収 率 (mg) (mU) (mU/mg) （％） ──────────────────────────────────── アセトンパウダー抽出液* 2280 − − − 硫安塩析 28.7 105*** 3.0 100 DEAE−セファロースFF処理 26.9 120*** 3.7 114 カラムクロマトグラフィー** 21.3 155*** 8.0 148 ────────────────────────────────────
【００２５】* 還元性物質が多いため酵素活性の測定
ができない。 ** フコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂によるカ
ラムクロマトグラフィー *** 酵素反応を阻害する物質が共存するため、見掛上酵
素活性が低くなっている。精製が進むに従って酵素反応
を阻害する物質が除去されるので、酵素活性が上昇す
る。
ができない。 ** フコイダンを結合させた陰イオン交換樹脂によるカ
ラムクロマトグラフィー *** 酵素反応を阻害する物質が共存するため、見掛上酵
素活性が低くなっている。精製が進むに従って酵素反応
を阻害する物質が除去されるので、酵素活性が上昇す
る。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、フコイダンの構造解析や
フコイダンの分解やフコイダンオリゴ糖の調製などに有
用なフコイダン分解酵素及びその簡便な製造方法が提供
された。
フコイダンの分解やフコイダンオリゴ糖の調製などに有
用なフコイダン分解酵素及びその簡便な製造方法が提供
された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＡ化フコイダンに本発明のフコイダン分解酵
素を作用させ、分解物の蛍光分析を行った際のクロマト
グラムである。
素を作用させ、分解物の蛍光分析を行った際のクロマト
グラムである。
【図２】精製したヒバマタ由来のフコイダンに本発明の
フコイダン分解酵素標品を作用させ、その反応生成物を
ＰＡ化して分析を行った際のクロマトグラムである。
フコイダン分解酵素標品を作用させ、その反応生成物を
ＰＡ化して分析を行った際のクロマトグラムである。
【図３】本発明の酵素のｐＨと相対活性の関係を表すグ
ラフである。
ラフである。
【図４】本発明の酵素の反応温度と相対活性の関係を表
すグラフである。
すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 遠藤 正彦 青森県弘前市富士見町18の７
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするフコイダン分解酵素。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンに作用してフコ
イダンを分解し、フコイダンを低分子化させると共に還
元力を増加させる。 （II) 至適ｐＨ：至適ｐＨは３．０〜３．５付近にあ
る。 （III)至適温度：至適温度は５０〜５５℃付近である。 （IV) 分子量：分子量は約２３，０００（ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法による）である。 - 【請求項２】 真ウニ類に属する動物から抽出、精製す
ることを特徴とする請求項１記載のフコイダン分解酵素
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24405592A JPH0662852A (ja) | 1992-08-21 | 1992-08-21 | フコイダン分解酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24405592A JPH0662852A (ja) | 1992-08-21 | 1992-08-21 | フコイダン分解酵素 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662852A true JPH0662852A (ja) | 1994-03-08 |
Family
ID=17113061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24405592A Pending JPH0662852A (ja) | 1992-08-21 | 1992-08-21 | フコイダン分解酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0662852A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0731551A1 (fr) * | 1995-03-08 | 1996-09-11 | KSB Aktiengesellschaft | Moteur électrique |
| FR2731564A1 (fr) * | 1995-03-08 | 1996-09-13 | Ksb Ag | Moteur electrique |
| EP1010761A1 (en) * | 1997-09-03 | 2000-06-21 | Takara Shuzo Co, Ltd. | Gene |
| EP0994122A4 (en) * | 1997-07-03 | 2002-03-06 | Masakuni Tako | ACETYLFUCOIDANE PREPARED FROM NEMACYSTIS DECIPIENS FROM OKINAWA AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF |
| EP0919237A4 (en) * | 1996-01-26 | 2004-10-13 | Takara Bio Inc | APOPTOSIS INDUCERS |
| JP2010119352A (ja) * | 2008-11-20 | 2010-06-03 | Tottori Univ | 新規なフコイダン資化性微生物 |
-
1992
- 1992-08-21 JP JP24405592A patent/JPH0662852A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0731551A1 (fr) * | 1995-03-08 | 1996-09-11 | KSB Aktiengesellschaft | Moteur électrique |
| FR2731564A1 (fr) * | 1995-03-08 | 1996-09-13 | Ksb Ag | Moteur electrique |
| EP0919237A4 (en) * | 1996-01-26 | 2004-10-13 | Takara Bio Inc | APOPTOSIS INDUCERS |
| EP0994122A4 (en) * | 1997-07-03 | 2002-03-06 | Masakuni Tako | ACETYLFUCOIDANE PREPARED FROM NEMACYSTIS DECIPIENS FROM OKINAWA AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF |
| EP1010761A1 (en) * | 1997-09-03 | 2000-06-21 | Takara Shuzo Co, Ltd. | Gene |
| EP1010761A4 (en) * | 1997-09-03 | 2005-01-05 | Takara Bio Inc | UNCOMFORTABLE |
| EP1826272A2 (en) | 1997-09-03 | 2007-08-29 | Takara Bio Inc. | Genes |
| JP2010119352A (ja) * | 2008-11-20 | 2010-06-03 | Tottori Univ | 新規なフコイダン資化性微生物 |
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