JP3825061B2 - ハプトグロビンの製造方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明はハプトグロビンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハプトグロビンは、分子量８万５千〜４０万の血漿糖蛋白質であり、血中に遊離するヘモグロビンの代謝に重要な役割を演ずる。ハプトグロビンはヘモグロビンと特異的に結合し、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を形成する特性を有する。血漿中のハプトグロビンは、溶血により生じたヘモグロビンと複合体を形成し、ヘモグロビンの正常な代謝経路である肝に運ばれるが、ヘモグロビン量がハプトグロビンとの結合量を上回ったときは、余剰のヘモグロビンは遊離の状態で血漿中に存在し、ヘモグロビン血症及び腎を経てヘモグロビン尿症を引き起こす。従って、ハプトグロビンは、熱傷、火傷、輸血、対外循環下開心術などの溶血反応に伴うヘモグロビン血症、ヘモグロビン尿症の治療に有効とされている。
【０００３】
ハプトグロビンは通常、コーンの第IV、第IV−１、第IV−４画分等から調製される。その製造方法、即ち、精製方法としては、硫安分画、アクリノール分画、陰イオン交換体処理（特開昭５０−７７５１６）、コロイド珪酸処理（特開昭６３−１７８９９）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記の事情を考慮して、ハプトグロビンの精製に有用な手段を提供しようとさらに研究を重ねた結果、固定化ヘパリンによる処理がハプトグロビンの精製に有用であること、特にコーンの第II＋III 上清画分からのハプトグロビンの回収・精製に有用であることを見出して、本発明を完成した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の工程を含み、少なくとも（ａ）、（ｂ）の工程はこの順番で処理することを特徴とするハプトグロビンの製造方法である。
（ａ）コーンの第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分を固定化ヘパリンに接触処理してハプトグロビンを該固定化ヘパリンに吸着させる工程
（ｂ）固定化ヘパリンからハプトグロビンを溶出する工程
（１）出発原料
本発明の処理対象となる出発原料であるハプトグロビン含有水溶液は、ハプトグロビンおよび夾雑物を含有する水溶液であり、コーンの第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分である。
【０００６】
▲２▼接触処理
本発明の接触処理は、ハプトグロビン含有水溶液を固定化ヘパリンに接触させ、ハプトグロビンを固定化ヘパリンに吸着させることにより行われる。固定化ヘパリンはヘパリンを不溶性担体に共有結合させたものである。この不溶性担体としてはデキストラン系（商品名はセファデックス）、アガロース系（商品名はセファロース）、セルロース系（商品名はセルロファイン）、親水性ビニルポリマー系（商品名はトヨパール）、シリカゲル系等が例示される。また、固定化ヘパリンは市販品を用いてもよい。
【０００７】
該固定化ヘパリンにおいて、ヘパリンの結合率は、不溶性担体１ｍｌ容に対し、通常、０．１〜１００ｍｇ程度である。また、固定化ヘパリンの使用量としては、ハプトグロビン１ｇに対し０．１〜１０リットル容（ゲル）の固定化ヘパリンを使用する。
また、用いられるヘパリンは分子量２万程度の酸性多糖類であり、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸、硫酸基から構成される多糖類の硫酸エステル体である。
【０００８】
ハプトグロビン含有水溶液と固定化ヘパリンの接触処理条件としては、ｐＨ６〜８程度、塩濃度は０．２Ｍ以下、好ましくは、０．０１〜０．１５Ｍ程度が例示される。また、エタノールが１０〜４０％、好ましくは、１５〜３０％程度共存することが好ましい。さらに、固定化ヘパリンに吸着したハプトグロビンの溶出条件としては、ｐＨ６〜８程度、塩濃度０．５Ｍ以下、好ましくは、０．１〜０．４Ｍ程度が例示される。本処理はバッチ法、カラム法のいずれでも行ってもよい。
【０００９】
▲３▼ 高度精製
本発明は、ハプトグロビンの公知の精製方法の一工程として導入することも可能である。例えば、限外濾過、陰イオン交換体処理、硫安分画等の方法と組み合わせることにより、高度精製を行い純化したハプトグロビンを製造できる。特に、固定化ヘパリンの接触処理の後、更に限外濾過および陰イオン交換体処理を順次施し、蛋白比（ハプトグロビン量／Ａ280 ）を０．５ｍｇ／Ａ280 以上とすることが好ましい。ここで、蛋白比とは、単位容量当たりのハプトグロビン量（重量）を２８０ｎｍでの吸光度で除したものを意味する。限外濾過膜としては、分画分子量１万〜３０万程度のものが使用され、陰イオン交換体としては、陰イオン交換基を有する不溶性担体であればいずれも使用することができる。陰イオン交換基の例としては、ジエチルアミノエチル基（通称はＤＥＡＥ）、四級アンモニウム基、例えば、ジエチル［２−ヒドロキシプロピル］アミノエチル基（通称はＱＡＥ）、（ＣＨ3 ）3 Ｎ+ ＣＨ2 −（通称はＱ）、四級メチルアンモニウム基（ＱＭＡ）等が挙げられる。不溶性担体の例としては、デキストラン（商品名、セファデックス、ファルマシア社製）、アガロース（商品名、セファロース、ファルマシア社製）、ビニル系親水性ポリマー（商品名、トヨパール、東ソー社製）、セルロース（商品名、セルロファイン、生化学工業社製）、多孔性シリカゲル（商品名、セファロシル、ＳＥＰＲＡＣＯＲ社製）等があげられる。
【００１０】
さらに公知の製剤化技術を組み合わせることにより、臨床上適用できるハプトグロビン製剤を提供することができる。
【００１１】
【発明の効果】
本発明の方法はハプトグロビンの精製に有用であること、特にコーンの第II＋III 上清画分からのハプトグロビンの回収・精製に有用である。
本発明により精製されるハプトグロビンは０．５ｍｇ／Ａ280 以上の蛋白比を有する。
【００１２】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
実施例１
コーンの第II＋III 上清画分２０００ｍｌをヘパリン−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製、不溶性担体部分：親水性ビニルポリマー系、ヘパリン結合率：担体１ｍｌ容当たり１５ｍｇ、カラムの大きさ：２００ｍｌ容）カラムにアプライした後、２１％エタノール、０．１２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭクエン酸Ｎａ塩緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄し、続いて０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭクエン酸Ｎａ塩緩衝液（ｐＨ７．２）によりハプトグロビンを溶出させた。結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
実施例２
実施例１で得られたハプトグロビンの溶出液１０００ｍｌを限外濾過（分画分子量１万）により、濃縮・透析した後、予め５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸Ｎａ塩緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＤＥＡＥ−デキストラン（商品名ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０）カラムにアプライし、上記緩衝液で洗浄し、続いて０．１３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸Ｎａ塩緩衝液（ｐＨ７）で溶出させた。結果を表２に示す。
【００１５】
【表２】
精製されたハプトグロビンは０．５７ｍｇ／Ａ280 の蛋白比を有していた。また、セルロースアセテート膜電気泳動の結果、出発原料である第II＋III 上清画分には存在していたβ画分蛋白が、精製ハプトグロビンからは消失することが判明した。
実施例３
実施例１で得られたハプトグロビンの溶出液を限外濾過（分画分子量１０万）により、濃縮・脱塩した。
【００１７】
実施例４
実施例１および２に準じて、２度目の精製実験を行った。その結果、精製されたハプトグロビンは０．６４ｍｇ／Ａ280 の蛋白比を有していた。
実施例５
実施例１および２で得られたハプトグロビンの溶出液にグリシンを２０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、ｐＨを７に調整した上で、６０℃、１０時間の液状加熱処理を行った。処理後に透析を行った。その結果、ハプトグロビンは加熱処理に対して極めて安定であり、濁りの生成も観察されなかった。
Claims (5)
- 以下の工程を含み、少なくとも（ａ）、（ｂ）の工程はこの順番で処理することを特徴とするハプトグロビンの製造方法。
（ａ）コーンの第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分を固定化ヘパリンに接触処理してハプトグロビンを該固定化ヘパリンに吸着させる工程
（ｂ）固定化ヘパリンからハプトグロビンを溶出する工程 - （ａ）の工程が、塩濃度０．２Ｍ以下、エタノール１０〜４０％の条件で行われることを特徴とする請求項１に記載のハプトグロビンの製造方法。
- （ｂ）の工程が、塩濃度０．５Ｍ以下の条件で行われることを特徴とする請求項１または２に記載のハプトグロビンの製造方法。
- 限外濾過、陰イオン交換体処理及び／又は硫安分画と組み合わせることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のハプトグロビンの製造方法。
- 蛋白比が０．５ｍｇ／Ａ２８０以上であるハプトグロビンを得ることを特徴とする請求項４に記載のハプトグロビンの製造方法。
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