JPH0112760B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はインターフエロンの濃縮精製法に関す
るものである。 インターフエロンは生きている細胞をウイルス
または特別の試剤等で刺激することによつて細胞
から産生される蛋白質であり、その化学構造は動
物種によつて異なり、また同じ動物種においても
複数のインターフエロン種が知られている。また
産生細胞種によつても多少異なる。 細胞または細胞外液から回収されるインターフ
エロンは、これで動物の組織または細胞を処理す
ると広範囲のウイルスに対する保護効果を生じさ
せる。インターフエロンは抗ウイルス活性として
ウイルス種に対する非特異性とインターフエロン
を産生した細胞と同一種の組織および細胞に対し
ては有効な抗ウイルス活性を与えるものの他種の
組織および細胞に対しては多くの場合無効であつ
たり、弱い抗ウイルス活性しか与えないという動
物種特異性が知られている。インターフエロンの
作用として抗ウイルス活性以外に抗腫疸性、細胞
増殖抑制作用、マクロフアージの機能促進その他
の多面的な作用が知られている。（「インターフエ
ロン研究の進歩」（蛋白質核酸酵素別冊第25号、
共立出版、1981年）、小林茂保著「増補版インタ
ーフエロン−基礎研究から臨床応用への展望」
（1978年・講談社サイエンテイフイク）等参照。） このためインターフエロンはウイルス性疾患例
えばＢ型肝炎、ヘルペス、インフルエンザ等の治
療薬または予防薬として、さらに脳腫瘍、骨肉
腫、白血病その他の抗ガン剤としても期待されて
いる。 ここでヒトに投与されるべきインターフエロン
は先に述べたインターフエロンの種特異性のため
ヒトインターフエロンでなければならずこれは天
然においてはヒト細胞によつて産生される。 現在、ヒトインターフエロンはヒトインターフ
エロンα、βおよびγの三種に分類されている。 ヒトインターフエロンαはヒト白血球細胞によ
つて産生されるインターフエロンに代表され、ヒ
トインターフエロンβはヒト二倍体線維芽細胞に
よつて産生されるインターフエロン（ヒトフイブ
ロブラストインターフエロン）に代表される。ま
た、ヒトインターフエロンγは、Ｔリンパ球細胞
によつて産生されるインターフエロンである。 本発明は、これらヒトインターフエロンの濃縮
精製法に関するものであり、特にヒトインターフ
エロンβの濃縮精製に最適な方法を提供するもの
である。 ヒトインターフエロンβは、通常、ガラスもし
くはプラスチツク等の表面またはDEAE化デキス
トランのマイクロキヤリア−表面上等で培養され
たヒトインターフエロンβ産生細胞（以後単に細
胞と略すことがある）を例えばPolyI：Ｃのよう
な合成二本鎖RNAによる誘発処理と続いて行な
う超誘発処理（例えばシクロヘキシミドとアクチ
ノマイシンＤの組合せによる代謝阻害法または紫
外線照射法等）に付した後、細胞を培養液中に20
〜48時間培養することにより、この培養液中に産
生され、ヒトインターフエロンβを含有する産生
液として取得される。 この場合、培養液としては、例えばイーグル
MEM培養液が用いられ、必要に応じ血清および
種々の添加物が加えられる。もちろんこれ以外の
培養液が用いられる場合もありうる。 このようにして得られるヒトインターフエロン
を含有している産生液中のヒトインターフエロン
は一般的に低濃度〔数千〜数万単位（生物学的検
定法により、NIH供与ヒトインターフエロンリ
フアランススタンダードで換算した力価すなわち
国際単位を示す）／ml〕であり、この産生液には
ヒトインターフエロンの他に細胞由来、培養由来
または添加物由来の多くの夾雑物を含んでいるの
で医療に用いるにはヒトインターフエロンを濃縮
精製することが要求されている。 純品としてのヒトインターフエロンの生物学的
活性は蛋白質１mg当り0.4〜１×10⁹単位と言われ
ている。 従来から、ヒトインターフエロンの濃縮精製法
について多くの方法が報告されている。例えば硫
酸アンモニウムを用いる沈澱法、中空繊維限外
過膜を使用する膜濃縮法、CM−セフアデツクス
を用いるイオン交換法、セフアデツクスやポリア
クリルアミドゲル等を用いる分子ふるい法等が知
られている。 ヒトインターフエロンβのもつ疎水性を利用し
て疎水性担体、例えばコンカナバリンＡ、オクチ
ル基、トリプトフイル基、フエニル基等を導入し
たアガロースゲルを用いる疎水性クロマトグラフ
イーによるヒトインターフエロンの濃縮精製法も
知られている。〔W.A.Carterら、Biochemistry
15、704（1976）；J.Biol.Chem.251、5381（1976）；
ibid.251、7260（1976）〕。 近年、下式の化学構造を有する色素を結合させ
た担体を用いるインターフエロンの精製が知られ
ている。この色素はCIBA−GEIGY社から“シ
バクロンブルーF3GA”または“シバクロンブル
ー3GA”なる商品名で売られている青色色素で
あり、一般名はCIリアクテイブブルー２である。 上記色素を結合させた担体を用いるヒトおよび
動物のインターフエロンの精製および示性化が
Jankowskiらによつて「Biochemistry」第15巻
第5182〜5187頁（1976）に、またBollinらによつ
て「Preparative Biochemistry」第８巻第259〜
292頁（1978）に、またEricksonらによつて
「Archives of Virology」第63巻、第253〜261頁
（1980）に示されている。 E.ナイトらは特開昭50−61997において粗ヒト
インターフエロンβ溶液を、架橋アガロースゲル
に上記色素を結合させた“ブルーセフアロース”
（フアルマシア社製）にかけ比活性４×10⁸単位／
mg・蛋白質で純度95％以上の精製ヒトインターフ
エロンβを収率50％で得たと主張している。 しかし、ここで精製されたヒトインターフエロ
ンβを注射用商品とするには含有されるエチレン
グリコールおよび高濃度の塩化ナトリウムを除去
するいわゆる脱塩工程が必要である。脱塩するた
めには、例えば“セフアデツクスＧ−25”を用い
るゲル過法や透析などの手段があるが、エチレ
ングリコールが高粘性を有するため、その十分な
除去は難かしい。また単に“ブルーセフアロー
ズ”での精製では、発熱性物質の除去が必ずしも
十分でなく、注射用に供するには問題がある。 また“ブルーセフアローズ”は、インターフエ
ロンの産生に使用したアクチノマイシンＤに対し
て親和性があり、インターフエロン回収区分には
アクチノマイシンＤが混入されやすい。アクチノ
マイシンＤは抗ガン剤として用いられているもの
の、一方強い突然変異原であり、その混入が認め
られることは極めて大きな問題点となる。 さらに本発明と関連のある亜鉛キレート担体カ
ラムクロマトグラフイーを用いるものとしてV.
G.Edyらの方法が知られている〔J.Biol.Chem.
252、5934（1978）〕。Edyらは、亜鉛キレート担体
カラム容量の約14倍の粗Ｆ−IF溶液（２万IU／
ml、蛋白質含量0.4mg／ml）を中性条件下カラム
に通夜してＦ−IFをカラムに吸着させた後、酸
性溶出液を用いて32倍精製されたＦ−IFの溶液
を得ている。また溶出液PHグラデイエント法を用
いて3100倍精製された蛋白質１mg当り10⁸

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 粗ヒトインターフエロンβ溶液を、CIリア
   クテイブブルー２と架橋アガロースゲルがエーテ
   ル結合で結ばれている不溶性ブルー担体と接触さ
   せ、該インターフエロンを該ブルー担体に吸着さ
   せた後、溶出液を用いて該インターフエロンを溶
   液として回収し、ついで該インターフエロン回収
   液をコバルト、ニツケル及び亜鉛からなる群から
   選ばれた少なくとも一つの金属をキレート化させ
   たキレート基結合担体に接触させ、該インターフ
   エロンを該キレート基結合担体に吸着させた後、
   溶出液を用いて該インターフエロンを溶液として
   回収することを特徴とするヒトインターフエロン
   βの濃縮精製法。