JPH0421820B2 - - Google Patents
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- JPH0421820B2 JPH0421820B2 JP59203452A JP20345284A JPH0421820B2 JP H0421820 B2 JPH0421820 B2 JP H0421820B2 JP 59203452 A JP59203452 A JP 59203452A JP 20345284 A JP20345284 A JP 20345284A JP H0421820 B2 JPH0421820 B2 JP H0421820B2
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
血清、尿などの液体に含まれる薬物あるいは各
種疾患に由来する微量成分の分析は病気の診断あ
るいは治療経過の判定などに非常に有意義であ
り、日常の臨床検査に活用されている。本発明は
この微量成分のうち低分子量のものを測定する方
法に関するものである。
種疾患に由来する微量成分の分析は病気の診断あ
るいは治療経過の判定などに非常に有意義であ
り、日常の臨床検査に活用されている。本発明は
この微量成分のうち低分子量のものを測定する方
法に関するものである。
(従来の技術)
血液等の体液には多種多様の成分が含まれてお
り、そのなかには、分子量の近似した物質、生理
活性の似た物質あるいは構造の近似した物質など
も含まれていることも多い。そこで、この分析法
は特異性が高く、かつ微少量まで定量しうること
が要求される。さらに、日常検査として利用され
るために、簡便かつルーチン化しうることが望ま
しい。
り、そのなかには、分子量の近似した物質、生理
活性の似た物質あるいは構造の近似した物質など
も含まれていることも多い。そこで、この分析法
は特異性が高く、かつ微少量まで定量しうること
が要求される。さらに、日常検査として利用され
るために、簡便かつルーチン化しうることが望ま
しい。
血液のこれらの微量成分を検出する方法が種々
開発されているが、感度、特異性、大量検体の短
時間処理などの点にすぐれる酵素免疫測定法が賞
用されている。しかしながら、従来の酵素免疫測
定法の場合には、未だ感度が充分とはいえず、ま
た洗浄操作が繁雑であつたり、チユーブの移しか
えが必要であつたりして正確な濃度を求めること
が容易でなかつた。
開発されているが、感度、特異性、大量検体の短
時間処理などの点にすぐれる酵素免疫測定法が賞
用されている。しかしながら、従来の酵素免疫測
定法の場合には、未だ感度が充分とはいえず、ま
た洗浄操作が繁雑であつたり、チユーブの移しか
えが必要であつたりして正確な濃度を求めること
が容易でなかつた。
そこで、本発明者らはさらに感度を高めかつ繁
雑な操作の少ない分析方法を開発するべく検討を
行ない、測定対象の抗原決定基具有物質に対する
抗体と酵素に対する抗体との結合物を利用する方
法を開発した。この方法は、この結合物に対して
測定対象の抗原決定基具有物質と酵素を競争反応
させその後この酵素の活性を測定することによつ
て抗原決定基具有物質を定量する方法(特開昭59
−164960号公報)である。その際、この抗原決定
基具有物質に対する抗体と反応する抗体あるいは
酵素に対する抗体と反応する抗体をさらに競争反
応させる方法(特願昭58−51494号(特開昭59−
178360号))、あるいは抗原決定基具有物質と高分
子化合物との結合物又は抗原決定基具有物質の重
合物を競争反応さえる方法(特願昭58−51495号
(特開昭59−178361号))も併用させて開発した。
そして、その後さらに検討を進め、この技術に近
縁の種々の抗原決定基具有物質測定法を次々と開
発して特許出願を行なつたが、そのひとつに、測
定対象の抗原決定基具有物質にその抗体と水に不
溶性の高分子物質に作用しうる酵素との結合物を
作用させてその後結合物の酵素活性を測定する方
法(特願昭58−231241号、特開昭60−123767号)
があつた。
雑な操作の少ない分析方法を開発するべく検討を
行ない、測定対象の抗原決定基具有物質に対する
抗体と酵素に対する抗体との結合物を利用する方
法を開発した。この方法は、この結合物に対して
測定対象の抗原決定基具有物質と酵素を競争反応
させその後この酵素の活性を測定することによつ
て抗原決定基具有物質を定量する方法(特開昭59
−164960号公報)である。その際、この抗原決定
基具有物質に対する抗体と反応する抗体あるいは
酵素に対する抗体と反応する抗体をさらに競争反
応させる方法(特願昭58−51494号(特開昭59−
178360号))、あるいは抗原決定基具有物質と高分
子化合物との結合物又は抗原決定基具有物質の重
合物を競争反応さえる方法(特願昭58−51495号
(特開昭59−178361号))も併用させて開発した。
そして、その後さらに検討を進め、この技術に近
縁の種々の抗原決定基具有物質測定法を次々と開
発して特許出願を行なつたが、そのひとつに、測
定対象の抗原決定基具有物質にその抗体と水に不
溶性の高分子物質に作用しうる酵素との結合物を
作用させてその後結合物の酵素活性を測定する方
法(特願昭58−231241号、特開昭60−123767号)
があつた。
(発明が解決しようとする問題点)
この方法は、他の方法と同様、抗原決定基具有
物質を特異性高くかつ極めて高感度で測定できる
ばかりでなく、他の方法に比べ、操作がさらに簡
略になり、また、抗原決定基具有物質を抗体の製
造に使用するだけであるところからほとんど消費
しないで済むという利点があつたが低分子の抗原
決定基具有物質に対する測定感度が低いという問
題があつた。
物質を特異性高くかつ極めて高感度で測定できる
ばかりでなく、他の方法に比べ、操作がさらに簡
略になり、また、抗原決定基具有物質を抗体の製
造に使用するだけであるところからほとんど消費
しないで済むという利点があつたが低分子の抗原
決定基具有物質に対する測定感度が低いという問
題があつた。
(問題点を解決するための手段)
本発明はこのような問題点を解決した抗原決定
基具有物質の測定方法を提供するものであり、前
記の方法に加えて測定対象の抗原決定基具有物質
と少なくとも一の抗原決定基を共通にする抗原決
定基具有物質と高分子化合物との結合物を新に導
入して競争反応させるようにしたことを特徴とし
ている。
基具有物質の測定方法を提供するものであり、前
記の方法に加えて測定対象の抗原決定基具有物質
と少なくとも一の抗原決定基を共通にする抗原決
定基具有物質と高分子化合物との結合物を新に導
入して競争反応させるようにしたことを特徴とし
ている。
すなわち本発明は、測定対象の分子量2万以下
の抗原決定基具有物質1と、この抗原決定基具有
物質1と少なくとも一の抗原決定基を共通にする
抗原決定基具有物質2と分子量10万ダルトン以上
の水溶性高分子化合物との結合物を、この共通の
抗原決定基と反応する抗体とアミラーゼとの結合
物に水溶液中で接触せしめて反応させ、その後こ
の抗体とアミラーゼとの結合物に水に不溶性のデ
ンプンを接触せしめて酵素反応させ、アミラーゼ
活性を測定することを特徴とする抗原決定基具有
物質の測定方法に関するものである。
の抗原決定基具有物質1と、この抗原決定基具有
物質1と少なくとも一の抗原決定基を共通にする
抗原決定基具有物質2と分子量10万ダルトン以上
の水溶性高分子化合物との結合物を、この共通の
抗原決定基と反応する抗体とアミラーゼとの結合
物に水溶液中で接触せしめて反応させ、その後こ
の抗体とアミラーゼとの結合物に水に不溶性のデ
ンプンを接触せしめて酵素反応させ、アミラーゼ
活性を測定することを特徴とする抗原決定基具有
物質の測定方法に関するものである。
本発明方法における測定対象は検体に含まれる
抗原決定基具有物質である。検体の種類は限定さ
れないが、例えば血清、尿などである。血清、尿
などの場合には、通常は特別な前処理を必要とせ
ず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質である。検体の種類は限定さ
れないが、例えば血清、尿などである。血清、尿
などの場合には、通常は特別な前処理を必要とせ
ず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質1(以下リガンド1とい
う。)は抗原決定基を一又は二以上有している分
子量2万以下のものであり、例としては、ジゴキ
シン、テオフイリン、フエノバルビタール、フエ
ニトイン、ペニシリン、アミカシン等の薬物、プ
ロスタグランジン、テストステロン、プロゲステ
ロン、サイロキシン等のホルモンなどを挙げるこ
とができる。
う。)は抗原決定基を一又は二以上有している分
子量2万以下のものであり、例としては、ジゴキ
シン、テオフイリン、フエノバルビタール、フエ
ニトイン、ペニシリン、アミカシン等の薬物、プ
ロスタグランジン、テストステロン、プロゲステ
ロン、サイロキシン等のホルモンなどを挙げるこ
とができる。
抗原決定基具有物質2(以下、リガンド2とい
う。)はリガンド1と少なくとも一の抗原決定基
が共通していなければならない。リガンド2の抗
原決定基は1以上がリガンド1と共通であればよ
く、全てが共通であつてもよい。従つて、リガン
ド2はリガンド1と同一であつてもよい。
う。)はリガンド1と少なくとも一の抗原決定基
が共通していなければならない。リガンド2の抗
原決定基は1以上がリガンド1と共通であればよ
く、全てが共通であつてもよい。従つて、リガン
ド2はリガンド1と同一であつてもよい。
リガンド2と結合している高分子化合物は、分
子量が10万ダルトン以上でかつ水溶性のものを用
いる。高分子化合物の例としては、可溶性デキス
トラン、カルボキシメチル化デキストラン、アミ
ノ化デキストラン、アミロース等の多糖類及びそ
の誘導体、ゼラチン、ヘモシアニン、フエリチン
等の蛋白質、ポリエチレングリコールなどを挙げ
ることができる。これらは、リガンド2と結合さ
せた状態で所定の条件を具備していればよく、例
えば牛血清アルブミンのような比較的低分子のも
のであつても、それを自家重合させるなどして高
分子化したものであつてもよい。
子量が10万ダルトン以上でかつ水溶性のものを用
いる。高分子化合物の例としては、可溶性デキス
トラン、カルボキシメチル化デキストラン、アミ
ノ化デキストラン、アミロース等の多糖類及びそ
の誘導体、ゼラチン、ヘモシアニン、フエリチン
等の蛋白質、ポリエチレングリコールなどを挙げ
ることができる。これらは、リガンド2と結合さ
せた状態で所定の条件を具備していればよく、例
えば牛血清アルブミンのような比較的低分子のも
のであつても、それを自家重合させるなどして高
分子化したものであつてもよい。
リガンド2自身を重合することによつて高分子
化してもよい。重合方法は、下記のリガンド2と
高分子化合物との結合方法のなかから適宜選択す
ればよく、例えば、カルボジイミド、グルタルア
ルデヒド等の二価性架橋剤で高分子化すればよ
い。
化してもよい。重合方法は、下記のリガンド2と
高分子化合物との結合方法のなかから適宜選択す
ればよく、例えば、カルボジイミド、グルタルア
ルデヒド等の二価性架橋剤で高分子化すればよ
い。
リガンド2と高分子化合物との結合方法は双方
の官能基を考慮して決定すればよい。官能基は、
アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール
基、イミダゾール基、フエニル基などを利用する
ことができ、例えばアミノ基相互間を結合させる
場合には、ジイソシアネート法、グルタルアルデ
ヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法
等数多く知られている。また、アミノ基とカルボ
キシル基との間を結合させる方法としては、カル
ボキシル基をサクシンイミドエステル化する方法
のほかカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等
が知られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨ
ウ素酸酸化法(Nakane法)もある。チオール基
を利用する場合には、例えばもう一方の側のカル
ボキシル基をサクシンイミドエステル化してこれ
にシステインを反応させてチオール基を導入し、
チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結
合することができる。フエニル基を利用する方法
としてはジアゾ化法、アルキル化法などである。
結合方法はこれらの例示に限られるものではな
く、このほか例えば「Method in Immunology
and Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測
定法」等の成書に記載されている方法のなかから
適宜選択して利用することができる結合比は1:
1に限らず、目的に応じて任意の比率をとること
ができることはいうまでもない。反応後は、ゲル
過法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイ
ニテイークロマトグラフイーなどを適宜組み合わ
せて精製を行ない、必要により凍結乾燥法等で乾
燥する。
の官能基を考慮して決定すればよい。官能基は、
アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール
基、イミダゾール基、フエニル基などを利用する
ことができ、例えばアミノ基相互間を結合させる
場合には、ジイソシアネート法、グルタルアルデ
ヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法
等数多く知られている。また、アミノ基とカルボ
キシル基との間を結合させる方法としては、カル
ボキシル基をサクシンイミドエステル化する方法
のほかカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等
が知られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨ
ウ素酸酸化法(Nakane法)もある。チオール基
を利用する場合には、例えばもう一方の側のカル
ボキシル基をサクシンイミドエステル化してこれ
にシステインを反応させてチオール基を導入し、
チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結
合することができる。フエニル基を利用する方法
としてはジアゾ化法、アルキル化法などである。
結合方法はこれらの例示に限られるものではな
く、このほか例えば「Method in Immunology
and Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測
定法」等の成書に記載されている方法のなかから
適宜選択して利用することができる結合比は1:
1に限らず、目的に応じて任意の比率をとること
ができることはいうまでもない。反応後は、ゲル
過法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイ
ニテイークロマトグラフイーなどを適宜組み合わ
せて精製を行ない、必要により凍結乾燥法等で乾
燥する。
結合物を構成している抗体はリガンド1とリガ
ンド2の共通の抗原決定基と反応するものでなけ
ればならない。この抗体にはF(ab′)2、Fab′、
Fabなどのフラグメントも含まれる。
ンド2の共通の抗原決定基と反応するものでなけ
ればならない。この抗体にはF(ab′)2、Fab′、
Fabなどのフラグメントも含まれる。
抗体の製造方法としては、リガンド1もしくは
リガンド2又はこのいずれかのリガンドと蛋白と
の結合物を兎、山羊、馬、モルモツト、ニワトリ
などの混血動物に体重1Kgあたり0.3〜2mgを1
〜数回背中皮下、フツトパツド、大腿筋等にアジ
ユバントとともに注射して当該動物の体内に形成
させる。この抗体は血清をそのまま用いてもよ
く、血清から抗体すなわち免疫グロブリンを採取
する公知の方法によつて精製してから用いてもよ
い。
リガンド2又はこのいずれかのリガンドと蛋白と
の結合物を兎、山羊、馬、モルモツト、ニワトリ
などの混血動物に体重1Kgあたり0.3〜2mgを1
〜数回背中皮下、フツトパツド、大腿筋等にアジ
ユバントとともに注射して当該動物の体内に形成
させる。この抗体は血清をそのまま用いてもよ
く、血清から抗体すなわち免疫グロブリンを採取
する公知の方法によつて精製してから用いてもよ
い。
一方、この交替はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。
アミラーゼと抗体との結合方法は双方の官能基
を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、結合方法は前記のリガンド2と高分子化合物
との結合方法のなかから適宜選択すればよい。反
応後はゲル過法、イオン交換クロマトグラフイ
ーアフイニテイークロマトグラフイーなどを適宜
組み合わせて精製を行い、必要により凍結乾燥法
等で乾燥する。
を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、結合方法は前記のリガンド2と高分子化合物
との結合方法のなかから適宜選択すればよい。反
応後はゲル過法、イオン交換クロマトグラフイ
ーアフイニテイークロマトグラフイーなどを適宜
組み合わせて精製を行い、必要により凍結乾燥法
等で乾燥する。
検体に含まれるリガンド1とリガンド2と高分
子化合物との結合物(以下、高分子化リガンド2
という。)を、前記の抗体とアミラーゼとの結合
物に溶液中で接触させる。その際、溶液の温度は
20〜45℃程度、そしてPHは通常4〜8.5程度が適
当である。PHを一定に保つために、必要により、
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いて
もよい。その際、抗体とアミラーゼとの結合物の
適当な量は、その種類、リガンドの種類、あるい
は接触時の条件などによつて異なるので予め試験
をして定めるのがよい。抗体とアミラーゼとの結
合物に対するリガンド1及び高分子化リガンド2
の接触順序は問うところではなく、いずれが先で
あつてもあるいは同時であつてもよい。
子化合物との結合物(以下、高分子化リガンド2
という。)を、前記の抗体とアミラーゼとの結合
物に溶液中で接触させる。その際、溶液の温度は
20〜45℃程度、そしてPHは通常4〜8.5程度が適
当である。PHを一定に保つために、必要により、
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いて
もよい。その際、抗体とアミラーゼとの結合物の
適当な量は、その種類、リガンドの種類、あるい
は接触時の条件などによつて異なるので予め試験
をして定めるのがよい。抗体とアミラーゼとの結
合物に対するリガンド1及び高分子化リガンド2
の接触順序は問うところではなく、いずれが先で
あつてもあるいは同時であつてもよい。
リガンド1及び高分子化リガンド2と反応させ
た抗体とアミラーゼとの結合物は水に不溶性のデ
ンプンに接触させて反応させる。
た抗体とアミラーゼとの結合物は水に不溶性のデ
ンプンに接触させて反応させる。
水に不溶性のデンプンと接触させる抗体とアミ
ラーゼとの結合物は反応物から分離したものでも
よいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。デンプンはそれ自身が可溶性であつて
も、不溶性の担体に結合させるとか、重合させる
などして不溶化して用いることもできる。
ラーゼとの結合物は反応物から分離したものでも
よいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。デンプンはそれ自身が可溶性であつて
も、不溶性の担体に結合させるとか、重合させる
などして不溶化して用いることもできる。
アミラーゼ反応条件は用いる酵素に応じて適当
になるように定めればよい。
になるように定めればよい。
一方、結合物のアミラーゼと同種のアミラーゼ
が検体に含まれている場合には、この検体中のア
ミラーゼを阻害する程度が前記の結合物に結合さ
れているアミラーゼの活性を阻害する程度より大
きいアミラーゼ阻害物質を接触させるのがよい。
が検体に含まれている場合には、この検体中のア
ミラーゼを阻害する程度が前記の結合物に結合さ
れているアミラーゼの活性を阻害する程度より大
きいアミラーゼ阻害物質を接触させるのがよい。
このアミラーゼ阻害物質は検体に含まれている
アミラーゼを完全に失活させかつ結合物に結合さ
れているアミラーゼを全く阻害しないものが最も
好ましいことはいうまでもないが、実用上は要は
測定時においてブランク値を上昇させなければよ
く、測定後にアミラーゼ阻害物質が失活するなど
してこのアミラーゼ活性が回復してもよい。この
アミラーゼ阻害物質の作用が問題になるもう一方
の、アミラーゼは抗体に結合されている状態のも
のであり、遊離状態ではアミラーゼ阻害物質によ
つて失活するものであつてもよい。このアミラー
ゼ阻害物質にはこのような特異性を有する公知の
アミラーゼ阻害物質を利用すればよいが、そのほ
か、検体に含まれているアミラーゼを温血動物に
投与してその抗体を取得し、これをアミラーゼ阻
害物質として用いることもできる。抗体の取得方
法は前述のリガンドに対する抗体の取得方法と同
様でよい。アミラーゼ阻害物質の添加時期は、検
体中のアミラーゼによる後述する水に不溶生のデ
ンプンの分解を実質的に防止できればよく、通常
はこのデンプンの添加前に添加する。しかしなが
ら、一般にアミラーゼ阻害物質による阻害作用は
アミラーゼによる基質であるデンプン分解速度よ
りもはるかにはやいのでアミラーゼ阻害物質をデ
ンプンと同時あるいは多少遅れて添加してもよ
い。
アミラーゼを完全に失活させかつ結合物に結合さ
れているアミラーゼを全く阻害しないものが最も
好ましいことはいうまでもないが、実用上は要は
測定時においてブランク値を上昇させなければよ
く、測定後にアミラーゼ阻害物質が失活するなど
してこのアミラーゼ活性が回復してもよい。この
アミラーゼ阻害物質の作用が問題になるもう一方
の、アミラーゼは抗体に結合されている状態のも
のであり、遊離状態ではアミラーゼ阻害物質によ
つて失活するものであつてもよい。このアミラー
ゼ阻害物質にはこのような特異性を有する公知の
アミラーゼ阻害物質を利用すればよいが、そのほ
か、検体に含まれているアミラーゼを温血動物に
投与してその抗体を取得し、これをアミラーゼ阻
害物質として用いることもできる。抗体の取得方
法は前述のリガンドに対する抗体の取得方法と同
様でよい。アミラーゼ阻害物質の添加時期は、検
体中のアミラーゼによる後述する水に不溶生のデ
ンプンの分解を実質的に防止できればよく、通常
はこのデンプンの添加前に添加する。しかしなが
ら、一般にアミラーゼ阻害物質による阻害作用は
アミラーゼによる基質であるデンプン分解速度よ
りもはるかにはやいのでアミラーゼ阻害物質をデ
ンプンと同時あるいは多少遅れて添加してもよ
い。
酵素反応後はアミラーゼ活性を求める。アミラ
ーゼ活性は、この酵素反応による分解物の増加、
原料であるデンプンの減少、その他、酵素反応に
よる系の変化を追跡すればよい。
ーゼ活性は、この酵素反応による分解物の増加、
原料であるデンプンの減少、その他、酵素反応に
よる系の変化を追跡すればよい。
(作用)
本発明の方法においては、リガンド1が結合物
の抗体部分に結合することによつてその後の酵素
反応に立体障害を生じさせることを利用してい
る。酵素反応されるデンプンが不溶性であるため
に結合物のアミラーゼ部分との接触の大部分が固
−液間になり、その結果、アミラーゼの高分子化
による立体障害が大きく現われる。本発明者らは
このことを確認するためにα−アミラーゼの系を
用いて検討したところ、ペンタオースの場合には
アミラーゼの高分子化によるアミラーゼ活性の低
下がほとんど認められず、一方、不溶化デンプン
の場合にはアミラーゼ活性が著しく低下した。
の抗体部分に結合することによつてその後の酵素
反応に立体障害を生じさせることを利用してい
る。酵素反応されるデンプンが不溶性であるため
に結合物のアミラーゼ部分との接触の大部分が固
−液間になり、その結果、アミラーゼの高分子化
による立体障害が大きく現われる。本発明者らは
このことを確認するためにα−アミラーゼの系を
用いて検討したところ、ペンタオースの場合には
アミラーゼの高分子化によるアミラーゼ活性の低
下がほとんど認められず、一方、不溶化デンプン
の場合にはアミラーゼ活性が著しく低下した。
このような系に高分子化リガンド2を新たに導
入したところに本発明の特徴がある。すなわち、
この高分子化リガンド2を抗体に対してリガンド
1と競争反応させることによつて、リガンド1と
反応しなかつた抗体には高分子化リガンド2が反
応し、このものはその後の酵素反応に大きな立体
障害をもたらす。そこで、リガンド1と高分子化
リガンド2との立体障害の差が大きくあらわれ、
リガンド1が低分子であつてもこれを高感度で測
定できるようになるのである。
入したところに本発明の特徴がある。すなわち、
この高分子化リガンド2を抗体に対してリガンド
1と競争反応させることによつて、リガンド1と
反応しなかつた抗体には高分子化リガンド2が反
応し、このものはその後の酵素反応に大きな立体
障害をもたらす。そこで、リガンド1と高分子化
リガンド2との立体障害の差が大きくあらわれ、
リガンド1が低分子であつてもこれを高感度で測
定できるようになるのである。
(実施例)
CHM化アミラーゼの作製
バチルス・ズブチリスアミラーゼ5mgをPH
6.3の0.1Mリン酸緩衝液1mlに溶かし、
CHMS2mg/mlのDMF溶液100μを加えて室
温で1時間放置して反応させた。この反応液を
セフアデツクスG−25のカラムに入れ、PH6.3
の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル過を行な
い、素通り分画を分取した。
6.3の0.1Mリン酸緩衝液1mlに溶かし、
CHMS2mg/mlのDMF溶液100μを加えて室
温で1時間放置して反応させた。この反応液を
セフアデツクスG−25のカラムに入れ、PH6.3
の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル過を行な
い、素通り分画を分取した。
抗ジゴキシンウサギIgGF(ab′)2の作製
抗ジゴキシンウサギIgG10mgを0.1M酢酸緩衝
液(PH4.0)2mlにペプシン300μgを加え、37
℃で18時間撹拌した。0.1NNaOHを加えてPH
を6.0に調節しこの反応液を予め0.1Mリン酸緩
衝1mMEDTA溶液(PH6.3)で緩衝化したセ
フアクリルS−300ゲルカラムに入れ、上記の
リン酸緩衝液で溶出した。分子量約10万付近に
溶出されたピーク部分を集めて1mlに濃縮し、
目的の抗ジゴキシンウサギIgGF(ab′)2を得た。
液(PH4.0)2mlにペプシン300μgを加え、37
℃で18時間撹拌した。0.1NNaOHを加えてPH
を6.0に調節しこの反応液を予め0.1Mリン酸緩
衝1mMEDTA溶液(PH6.3)で緩衝化したセ
フアクリルS−300ゲルカラムに入れ、上記の
リン酸緩衝液で溶出した。分子量約10万付近に
溶出されたピーク部分を集めて1mlに濃縮し、
目的の抗ジゴキシンウサギIgGF(ab′)2を得た。
α−アミラーゼ−抗ジゴキシンウサギ
IgGFab′結合物の作製 で調製した抗ジゴキシンウサギIgGF
(ab′)26mgを含む0.1Mリン酸緩衝1mMEDTA
溶液(PH6.0)1mlに10mg/mlの2−メルカプ
トエチルアミン塩酸塩水溶液100μを加え、
37℃で90分間撹拌した。この反応液を予め
0.1Mリン酸緩衝液(PH6.3)で緩衝化したセフ
アデツクスG−25カラムでゲル過して未反応
の2−メルカプトメチルアミンを除去し、HS
−Fab′を得た。これにで調製したCHM化α
−アミラーゼ2mgを加え、37℃で90分間反応さ
せた。次にこの反応液を0.1M酢酸緩衝5mM
塩化カルシウム溶液(PH6.0)で緩衝化したセ
フアクリルS−300カラムでゲル過して分子
量20万以上の分画を集め、これを濃縮して目的
の結合物を得た。
IgGFab′結合物の作製 で調製した抗ジゴキシンウサギIgGF
(ab′)26mgを含む0.1Mリン酸緩衝1mMEDTA
溶液(PH6.0)1mlに10mg/mlの2−メルカプ
トエチルアミン塩酸塩水溶液100μを加え、
37℃で90分間撹拌した。この反応液を予め
0.1Mリン酸緩衝液(PH6.3)で緩衝化したセフ
アデツクスG−25カラムでゲル過して未反応
の2−メルカプトメチルアミンを除去し、HS
−Fab′を得た。これにで調製したCHM化α
−アミラーゼ2mgを加え、37℃で90分間反応さ
せた。次にこの反応液を0.1M酢酸緩衝5mM
塩化カルシウム溶液(PH6.0)で緩衝化したセ
フアクリルS−300カラムでゲル過して分子
量20万以上の分画を集め、これを濃縮して目的
の結合物を得た。
高分子化ジゴキシンの作製
ジゴキシン10mgをエタノール500μに懸濁
し、これに0.2Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム水
溶液500μを加えた。この混合物を室温にて
1時間撹拌し、1Mエチレングリコール水溶液
1μを添加した。5分後にヘモシアニン10mg
を加え、室温で3時間撹拌した。これに0.5mg
のNaBH4を加え、4℃でさらに18時間撹拌し
た。この反応液を3回透析後、予め0.02Mリン
酸緩衝化生理食塩水PH7.0で平衡化したセフア
デツクスG−50に流し、未反応のジゴキシンを
除去した。ボイド分画をプールして目的の高分
子化ジゴキシンを得た。
し、これに0.2Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム水
溶液500μを加えた。この混合物を室温にて
1時間撹拌し、1Mエチレングリコール水溶液
1μを添加した。5分後にヘモシアニン10mg
を加え、室温で3時間撹拌した。これに0.5mg
のNaBH4を加え、4℃でさらに18時間撹拌し
た。この反応液を3回透析後、予め0.02Mリン
酸緩衝化生理食塩水PH7.0で平衡化したセフア
デツクスG−50に流し、未反応のジゴキシンを
除去した。ボイド分画をプールして目的の高分
子化ジゴキシンを得た。
ジゴキシンの測定
血清にジゴキシンを0〜12.5ngを含有せし
めた溶液50μにで作製した結合物溶液50μ
、で作製した高分子化ジゴキシン50μ
(100ng/ml)及びヒトアミラーゼインヒビタ
ー50μ(1.0mg/ml)を加えて20分間反応させ
た。反応液にブルースターチ懸濁液1.0mlを加
えて37℃で20分間さらに反応させ、
0.5NNaOH1mlを加えて反応を停止させた。こ
れを撹拌後、3500rpmで2分間遠心し、得られ
た上清の620nmにおける吸光度を測定した。
めた溶液50μにで作製した結合物溶液50μ
、で作製した高分子化ジゴキシン50μ
(100ng/ml)及びヒトアミラーゼインヒビタ
ー50μ(1.0mg/ml)を加えて20分間反応させ
た。反応液にブルースターチ懸濁液1.0mlを加
えて37℃で20分間さらに反応させ、
0.5NNaOH1mlを加えて反応を停止させた。こ
れを撹拌後、3500rpmで2分間遠心し、得られ
た上清の620nmにおける吸光度を測定した。
得られた吸光度とジゴキシンの濃度との関係
を示す検量線を第1図に示す。
を示す検量線を第1図に示す。
(発明の効果)
本発明の方法は、低分子のリガンドを特異性高
くかつ極めて高感度で測定できる。また、操作が
簡単であり、安価かつ容易にリガンドを定量する
ことが可能である。本発明の方法は低分子のリガ
ンドの種類を問わず測定できる。
くかつ極めて高感度で測定できる。また、操作が
簡単であり、安価かつ容易にリガンドを定量する
ことが可能である。本発明の方法は低分子のリガ
ンドの種類を問わず測定できる。
第1図は本発明の方法で測定して得られたジゴ
キシン量と吸光度との関係を示すものである。
キシン量と吸光度との関係を示すものである。
Claims (1)
- 1 測定対象の分子量2万以下の抗原決定基具有
物質1と、この抗原決定基具有物質1と少なくと
も一の抗原決定基を共通にする抗原決定基具有物
質2の分子量10万ダルトン以上の水溶性高分子化
合物との結合物を、この共通の抗原決定基と反応
する抗体とアミラーゼとの結合物に水溶液中で接
触せしめて反応させ、その後この抗体とアミラー
ゼとの結合物に水に不溶性のデンプンを接触せし
めて酵素反応させ、アミラーゼ活性を測定するこ
とを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20345284A JPS6180049A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20345284A JPS6180049A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6180049A JPS6180049A (ja) | 1986-04-23 |
JPH0421820B2 true JPH0421820B2 (ja) | 1992-04-14 |
Family
ID=16474349
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP20345284A Granted JPS6180049A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6180049A (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH087216B2 (ja) * | 1987-09-30 | 1996-01-29 | 富士写真フイルム株式会社 | 乾式免疫分析要素 |
DE68918504T2 (de) * | 1988-06-24 | 1995-03-09 | Fujirebio Kk | Analyseelement vom Trockentyp für einen Immuntest. |
JP2616805B2 (ja) * | 1988-06-24 | 1997-06-04 | 富士写真フイルム株式会社 | 乾式免疫分析要素 |
JP2786336B2 (ja) * | 1991-03-04 | 1998-08-13 | 富士写真フイルム株式会社 | 免疫分析要素および免疫分析方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
JPS59210365A (ja) * | 1983-05-02 | 1984-11-29 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | 均一系免疫試験法ならびにそれに用いるための試薬系、試験キツトおよび試験具 |
-
1984
- 1984-09-28 JP JP20345284A patent/JPS6180049A/ja active Granted
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
JPS59210365A (ja) * | 1983-05-02 | 1984-11-29 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | 均一系免疫試験法ならびにそれに用いるための試薬系、試験キツトおよび試験具 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6180049A (ja) | 1986-04-23 |
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Legal Events
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---|---|---|---|
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