JPS60123767A - 酵素を用いた抗原決定基具有物質測定法 - Google Patents
酵素を用いた抗原決定基具有物質測定法Info
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- JPS60123767A JPS60123767A JP23124183A JP23124183A JPS60123767A JP S60123767 A JPS60123767 A JP S60123767A JP 23124183 A JP23124183 A JP 23124183A JP 23124183 A JP23124183 A JP 23124183A JP S60123767 A JPS60123767 A JP S60123767A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定する方
法に関するものである。
法に関するものである。
血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析は病気の
診断あるいは治療経過の利足などに非常に有意緩でめり
、日常の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多イ■多４求の成分が含まれており、そのな
かには、分子前の近似した物質、生理活性の似た物質あ
るいは構造の近似した物質なども含まれていることも多
い。そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量ま
で定量しうろことが要求される。さらに、日常検査とし
て利用されるために、簡便かつルーチン化しうろことが
望ましい。
診断あるいは治療経過の利足などに非常に有意緩でめり
、日常の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多イ■多４求の成分が含まれており、そのな
かには、分子前の近似した物質、生理活性の似た物質あ
るいは構造の近似した物質なども含まれていることも多
い。そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量ま
で定量しうろことが要求される。さらに、日常検査とし
て利用されるために、簡便かつルーチン化しうろことが
望ましい。
このような条件を備えた分析法として免疫学的測定法が
ある。この方法は、抗原一抗体間の高い新′ＡＩｊ性と
、抗体が抗原決定基を判別する高い特異性を利用してお
り、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、血球等の
凝集反応を利用した方法等に大別される。
ある。この方法は、抗原一抗体間の高い新′ＡＩｊ性と
、抗体が抗原決定基を判別する高い特異性を利用してお
り、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、血球等の
凝集反応を利用した方法等に大別される。
ラジオイムノアッセイは、感度はすぐれているが、人体
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されており、特殊な施設を必要とす
る。一方、酵紫免投法はこのような問題はないが、ラジ
オイムノアッセイもそうであるが、遊離標識物と結合標
識物の分離が必要である。そして、この分離操作は、非
常に繁雑でるり、操作及び測定誤差の両面で問題になっ
ている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合にはこ
の分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く、数ｎ
ｌ／ ＝ ｆ 、！９のような極微量を測定すること
は困難である。
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されており、特殊な施設を必要とす
る。一方、酵紫免投法はこのような問題はないが、ラジ
オイムノアッセイもそうであるが、遊離標識物と結合標
識物の分離が必要である。そして、この分離操作は、非
常に繁雑でるり、操作及び測定誤差の両面で問題になっ
ている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合にはこ
の分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く、数ｎ
ｌ／ ＝ ｆ 、！９のような極微量を測定すること
は困難である。
本発明者らは上記のような欠点のない測定方法を開発す
べく種々検削の結果、水に不溶性の高分子物質を基質と
する酵素に抗原決定基具有物質を結合させ、この抗原決
定基具有物質と測定対象たる抗原決定基具有物質とを抗
体に対して競争反応させ、その後この結合物の酵素活性
を」り定すると測定対象たる抗原決定基具有物質の量に
応じて酵素活性が顕著に低下することを見出し、この方
法を用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前述
の分離操作を行なわないで簡便に測定しうろことを見出
してその内容を特許出願（％願昭５８−号）した。そし
て、さらに研究を進 め、前記酵素に抗原決定基具有物質でなく抗体を結合さ
せてこの結合物の抗体に測定対象の抗原決定基具有物質
を反応させ、その後この結合物の酵素活性を測定すると
やはり測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵
素活性が顕著に低下することを見出した。そして、この
方法は先の方法に比べ、操作がさらに簡略になり、また
、抗原決定基具有物質を抗体の製造に使用するだけであ
るところからほとんど消費しないで済むことを見出して
本発明を完成するに至った。
べく種々検削の結果、水に不溶性の高分子物質を基質と
する酵素に抗原決定基具有物質を結合させ、この抗原決
定基具有物質と測定対象たる抗原決定基具有物質とを抗
体に対して競争反応させ、その後この結合物の酵素活性
を」り定すると測定対象たる抗原決定基具有物質の量に
応じて酵素活性が顕著に低下することを見出し、この方
法を用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前述
の分離操作を行なわないで簡便に測定しうろことを見出
してその内容を特許出願（％願昭５８−号）した。そし
て、さらに研究を進 め、前記酵素に抗原決定基具有物質でなく抗体を結合さ
せてこの結合物の抗体に測定対象の抗原決定基具有物質
を反応させ、その後この結合物の酵素活性を測定すると
やはり測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵
素活性が顕著に低下することを見出した。そして、この
方法は先の方法に比べ、操作がさらに簡略になり、また
、抗原決定基具有物質を抗体の製造に使用するだけであ
るところからほとんど消費しないで済むことを見出して
本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、検体に含まれる抗原決定基具有物質
と、この抗原決定基具有物質に対する抗体と水に不溶性
の高分子物質に作用しうる酵素との結合物を、溶液中で
接触せしめて反応させ、その後この結合物に前記の高分
子物質を接触せしめて酵素反応させ、酵素活性を測定す
ることを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法に関
するものである。
と、この抗原決定基具有物質に対する抗体と水に不溶性
の高分子物質に作用しうる酵素との結合物を、溶液中で
接触せしめて反応させ、その後この結合物に前記の高分
子物質を接触せしめて酵素反応させ、酵素活性を測定す
ることを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法に関
するものである。
本発明方法における測定対象は検体に含まれる抗原決定
基具有物質である。検体の種類は限定されないが、例え
ば血清、尿などである。血清、尿などの場合には、通常
は特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうこ
とができる。
基具有物質である。検体の種類は限定されないが、例え
ば血清、尿などである。血清、尿などの場合には、通常
は特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうこ
とができる。
抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）は抗原決
定基を−又は二以上有しているものであり、例えば、各
種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、ア
ルブミン、フェリチン等の廂漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウ
ィルス、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児
性抗原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原
などである。
定基を−又は二以上有しているものであり、例えば、各
種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、ア
ルブミン、フェリチン等の廂漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウ
ィルス、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児
性抗原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原
などである。
結合物を構成している抗体はりガントと反応するもので
なければならない。この抗体にはＦ（ａｂ′）２゜Ｆａ
ｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラグメントも含まれる。
なければならない。この抗体にはＦ（ａｂ′）２゜Ｆａ
ｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラグメントも含まれる。
抗体の製造方法としては、リガンド又はリガンドと蛋白
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなど
の混血動物に体重１ ｋｇあたり０３〜２ ｍ９を１〜
数回背中皮下、フッドパ、ド、大腿筋等にアソユパント
とともに注射して当該動物の体内に形成させる。この抗
体は血清をそのまま用いてもよく、血清から抗体すなわ
ち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって精製し
てから用いてもよい。
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなど
の混血動物に体重１ ｋｇあたり０３〜２ ｍ９を１〜
数回背中皮下、フッドパ、ド、大腿筋等にアソユパント
とともに注射して当該動物の体内に形成させる。この抗
体は血清をそのまま用いてもよく、血清から抗体すなわ
ち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって精製し
てから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してＩリエチレンクリコール等ヲ用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してＩリエチレンクリコール等ヲ用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
結合物を構成している酵素は水に不溶性の高分子化合物
に作用しうるものであるが、そのほか活性の測定方法が
容易なものがよい。このような酵素は、例えばアミラー
ゼ、セルラーゼ、コラ−ゲナーゼ、マンナーゼ、プロテ
アーゼ、エラスターゼ、リパーゼ、などである。
に作用しうるものであるが、そのほか活性の測定方法が
容易なものがよい。このような酵素は、例えばアミラー
ゼ、セルラーゼ、コラ−ゲナーゼ、マンナーゼ、プロテ
アーゼ、エラスターゼ、リパーゼ、などである。
酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮して決定
すればよい。官能基は、アミン基、カルゼキ／ル基、水
酸基、チオ−ル基、イミダゾール基、フェニル基などを
利用することができ、例えばアミン基相互間を結合させ
る場合には、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ノフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知
られている。また、アミン基とカルボキシル基との間を
結合させる方法としては、カルボキシル基をサクシンイ
ミドエステル化する方法のほかカルピノイミド法、ウッ
ドワーク試薬法等が知られており、アミン基と糖鎖を架
橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もある。チ
オール基を利用する場合には、例えばもう一方の側のカ
ルボキシル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
スティンを反応させてチオール基を導入し、チオール基
反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することができ
る。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、ア
ルキル化法などがある。結合方法はこれらの例示に限ら
れるものではなく、このほか例えばｒＭｅｔｈｏｄ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊ あるいは「
酵素抗体測定法」等の成曹に記載されている方法のなか
から適宜選択して利用することができる。結合比はｌ：
１に限らず、目的に応じて任意の比率をとることができ
ることはいうまでもない。反応後は、グル濾過法、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィ―などを適宜組み合わせて精製を行い、必要によ
り凍結乾燥法等で乾燥する。
すればよい。官能基は、アミン基、カルゼキ／ル基、水
酸基、チオ−ル基、イミダゾール基、フェニル基などを
利用することができ、例えばアミン基相互間を結合させ
る場合には、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ノフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知
られている。また、アミン基とカルボキシル基との間を
結合させる方法としては、カルボキシル基をサクシンイ
ミドエステル化する方法のほかカルピノイミド法、ウッ
ドワーク試薬法等が知られており、アミン基と糖鎖を架
橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もある。チ
オール基を利用する場合には、例えばもう一方の側のカ
ルボキシル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
スティンを反応させてチオール基を導入し、チオール基
反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することができ
る。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、ア
ルキル化法などがある。結合方法はこれらの例示に限ら
れるものではなく、このほか例えばｒＭｅｔｈｏｄ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊ あるいは「
酵素抗体測定法」等の成曹に記載されている方法のなか
から適宜選択して利用することができる。結合比はｌ：
１に限らず、目的に応じて任意の比率をとることができ
ることはいうまでもない。反応後は、グル濾過法、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィ―などを適宜組み合わせて精製を行い、必要によ
り凍結乾燥法等で乾燥する。
検体に含まれるリガンドと、前記の抗体と酵素との結合
物を溶液中で接触させる。その際、溶液の温度は２０〜
４５℃程度、そして、Ｈは通常４〜８５程度が適当であ
る。ＰＨを一定に保つために、必要により、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。その際、
結合物の適当な量は、その種類、リガンドの種類、ある
いは接触時の条件などによって異なるので予め試験をし
て定めるのがよい。リガンドと結合物との接触時間はい
ずれも、通常は充分に反応しうる程度がよく、例えば３
７℃の場合には２０〜６０分間程度が適当である。
物を溶液中で接触させる。その際、溶液の温度は２０〜
４５℃程度、そして、Ｈは通常４〜８５程度が適当であ
る。ＰＨを一定に保つために、必要により、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。その際、
結合物の適当な量は、その種類、リガンドの種類、ある
いは接触時の条件などによって異なるので予め試験をし
て定めるのがよい。リガンドと結合物との接触時間はい
ずれも、通常は充分に反応しうる程度がよく、例えば３
７℃の場合には２０〜６０分間程度が適当である。
リガンドと反応させた結合物は高分子物質に接触させて
反応させる。
反応させる。
高分子物質と接触させる結合物は反応物から分離したも
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。
この高分子物質は結合物が酵素反応しうるものであり、
通常は基質であるが、水に不溶性であるところに特徴が
ある。すなわち、高分子物質が不溶性であるために結合
物の酵素部分との接触の大部分が固−液間になシ、その
結果、酵素の高分子化による立体障害が大きく現われる
。本発明者らはこのことを確認するためにα−アミラー
ゼの系を用いて検討したところ、インタオースの場合に
は酵素の高分子化による酵素活性の低下がほとんど認め
られず、一方、不溶化デンプンの場合には酵素活性が著
しく低下した。高分子物質の例としては、α−アミラー
ゼの場合には不溶性デンプン、セルラーゼの場合にはセ
ルロース、コラ−ゲナーゼの場合にはコラーゲン、マン
ナーゼの場合にはマンナン、プロテアーゼの場合には不
溶性蛋白質、エラスターゼの場合にはエラスチン、そし
てリノや−ゼの場合には各種油脂類を挙げることができ
る。
通常は基質であるが、水に不溶性であるところに特徴が
ある。すなわち、高分子物質が不溶性であるために結合
物の酵素部分との接触の大部分が固−液間になシ、その
結果、酵素の高分子化による立体障害が大きく現われる
。本発明者らはこのことを確認するためにα−アミラー
ゼの系を用いて検討したところ、インタオースの場合に
は酵素の高分子化による酵素活性の低下がほとんど認め
られず、一方、不溶化デンプンの場合には酵素活性が著
しく低下した。高分子物質の例としては、α−アミラー
ゼの場合には不溶性デンプン、セルラーゼの場合にはセ
ルロース、コラ−ゲナーゼの場合にはコラーゲン、マン
ナーゼの場合にはマンナン、プロテアーゼの場合には不
溶性蛋白質、エラスターゼの場合にはエラスチン、そし
てリノや−ゼの場合には各種油脂類を挙げることができ
る。
この高分子物質はそれ自身が可溶性であっても、不溶性
の担体に結合させるとか、重合させるなどして不俗化し
て用いることもできる。
の担体に結合させるとか、重合させるなどして不俗化し
て用いることもできる。
酵素反応条件は用いる酵素に応じて適当になるように定
めればよい。
めればよい。
酵素反応後は酵素活性をめる。酵素活性は、この酵素反
応による分解物の増加、原料である高分子物質の減少、
その他、酵素反応による系の変化を追跡すればよい。
応による分解物の増加、原料である高分子物質の減少、
その他、酵素反応による系の変化を追跡すればよい。
本発明の方法は、リカ゛ンドを特異性高くかつ極めて高
感度で測定できる。また、操作が簡単であり、安価かつ
容易にリガンドを定量することが可能である。本発明の
方法はリガンドの種類を問わず測定できるが比較的高分
子の測定に威力を発揮する。本発明の方法に用いる試薬
にはりがンドを直接使用せず、リガンドは抗体の製造に
用いられるだけであるから微量で足りるという利点も有
する。従って、本発明の方法は測定対象と同じリガンド
が入手しにくい場合とか、高４ｔｕｂな場合に特に有効
である。
感度で測定できる。また、操作が簡単であり、安価かつ
容易にリガンドを定量することが可能である。本発明の
方法はリガンドの種類を問わず測定できるが比較的高分
子の測定に威力を発揮する。本発明の方法に用いる試薬
にはりがンドを直接使用せず、リガンドは抗体の製造に
用いられるだけであるから微量で足りるという利点も有
する。従って、本発明の方法は測定対象と同じリガンド
が入手しにくい場合とか、高４ｔｕｂな場合に特に有効
である。
以下、°更施例を示す。
実施例１
■ セルラーゼ基質の調製
Ｐ紙を２０ ｔｙｎ Ｘ ２０ ａｎの大きさに切断し
、あらかじめ用意しておいたりアクティブブルー溶液（
５！ｊリアクテイブブルー、５１ Ｎａ２ＣＯ３蒸留水
２００ ｍｌ ）中に浸した。６０℃に加温し、時々攪
拌しながら、３日間加熱を続けた。この戸紙を蒸留水で
十分に洗浄し、過剰の染料を除去した。続いて、恒温乾
燥器で乾燥させ、１ ｔｙｎ Ｘ ５ ｔｙｎの大きさ
に切断して、目的の基啄を得だ。
、あらかじめ用意しておいたりアクティブブルー溶液（
５！ｊリアクテイブブルー、５１ Ｎａ２ＣＯ３蒸留水
２００ ｍｌ ）中に浸した。６０℃に加温し、時々攪
拌しながら、３日間加熱を続けた。この戸紙を蒸留水で
十分に洗浄し、過剰の染料を除去した。続いて、恒温乾
燥器で乾燥させ、１ ｔｙｎ Ｘ ５ ｔｙｎの大きさ
に切断して、目的の基啄を得だ。
■ セルラーゼ−抗ヒ）ＩｇＧヤギＩｇＧ結合物の調製
セルラーゼｌｉ曖をＰＨ６，０の０．１Ｍリン酸緩衝ｆ
ｉ ２ ｒａｒｅに溶かし４−（マレイミドメチルシク
ロヘキサン−１−カルビン醒）サクンンイミドエステル
（ＣＨＭＳ）のツメチルスルホキシド溶液（２ｎｙ、／
＋、ｌｌ ）２００μｌを卵え、室温で１時間、放置し
た。この反応液をセファデックスＧ−２５を用いてケ９
ルｐ過し、未反応のＣＨＭＳを除去した。このＣＨＭＳ
化セルラーゼをエゴまで濃縮した。
ｉ ２ ｒａｒｅに溶かし４−（マレイミドメチルシク
ロヘキサン−１−カルビン醒）サクンンイミドエステル
（ＣＨＭＳ）のツメチルスルホキシド溶液（２ｎｙ、／
＋、ｌｌ ）２００μｌを卵え、室温で１時間、放置し
た。この反応液をセファデックスＧ−２５を用いてケ９
ルｐ過し、未反応のＣＨＭＳを除去した。このＣＨＭＳ
化セルラーゼをエゴまで濃縮した。
一方、抗ヒトＩｇＧヤギＩｇＧ １ ’０１％”ｋ ５
ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰｌ−１７，５の０．１ Ｍ
！Ｊンば緩衝［２ｍｌにとかし９ ｍ９ＡｎｌのＳ−ア
セチルメルカグトコハク酸無水物（ＳＡＭＳ ）のノオ
キサン溶液２００μで加えた。それから３７℃で一時間
放置後、ＩＭヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ７，５）
２００μｌ加えた。３０分後反応液をセフアゾ、クス
Ｇ−２５でケ゛ル沖過し未反応のＳＡＭＳを除いた。こ
のＨＳ−抗ヒトＩｇＧヤギＩｇＧ溶液を前述のＣＨＭ化
セルテーゼ１ｍｌに加え、３７℃で２時間放置した。こ
の反応液をセフアクリルＳ−３００でダル濾過し目的の
セルラーゼ−抗ヒ） ＩｇＧヤギＩｇＧ結合物を得た。
ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰｌ−１７，５の０．１ Ｍ
！Ｊンば緩衝［２ｍｌにとかし９ ｍ９ＡｎｌのＳ−ア
セチルメルカグトコハク酸無水物（ＳＡＭＳ ）のノオ
キサン溶液２００μで加えた。それから３７℃で一時間
放置後、ＩＭヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ７，５）
２００μｌ加えた。３０分後反応液をセフアゾ、クス
Ｇ−２５でケ゛ル沖過し未反応のＳＡＭＳを除いた。こ
のＨＳ−抗ヒトＩｇＧヤギＩｇＧ溶液を前述のＣＨＭ化
セルテーゼ１ｍｌに加え、３７℃で２時間放置した。こ
の反応液をセフアクリルＳ−３００でダル濾過し目的の
セルラーゼ−抗ヒ） ＩｇＧヤギＩｇＧ結合物を得た。
■ ヒトＩｇＧの測定
セルラーゼ−抗ヒ）ＩｇＧヤギＩｇＧ結合物を含む溶液
５０μｌにヒ）ｒｇＧを含む標準溶液５０μｌを加え、
３７℃で３０分間放置した。これにｐＨ５，０の０６１
Ｍ酢酸緩衝液を１ ｍｌ加え、次に■で調製したブルー
セルロースＦ紙を１枚加えた。１時間後反応液の吸光度
を波長６５０ ｎｍで測定した。第１図は標準溶液中の
ヒ）ＩｇＧ量と吸光度を示したものである。
５０μｌにヒ）ｒｇＧを含む標準溶液５０μｌを加え、
３７℃で３０分間放置した。これにｐＨ５，０の０６１
Ｍ酢酸緩衝液を１ ｍｌ加え、次に■で調製したブルー
セルロースＦ紙を１枚加えた。１時間後反応液の吸光度
を波長６５０ ｎｍで測定した。第１図は標準溶液中の
ヒ）ＩｇＧ量と吸光度を示したものである。
実施例２
■ ＣＨＭ化アミラーゼの調製
バチルス・ズブチリスアミラーゼ５ｒｎｇをＰＨ６，３
（７） Ｏ，Ｉ Ｍ １７ ン酸緩衝液１ ｕｔｌ Ｋ
溶かし、ＣＨＭＳ ２ ｍ？ＡｎｌのＤＭＦ溶液１００
μｌを加えて室温で１時間放置して反応させた。この反
応液をセファデックスＧ−２５のカラムに入れ、ＰＨ６
，３の０．１ Ｍ リン酸緩衝液を流してグル沖過を行
ない、素通シ分画を分取した。
（７） Ｏ，Ｉ Ｍ １７ ン酸緩衝液１ ｕｔｌ Ｋ
溶かし、ＣＨＭＳ ２ ｍ？ＡｎｌのＤＭＦ溶液１００
μｌを加えて室温で１時間放置して反応させた。この反
応液をセファデックスＧ−２５のカラムに入れ、ＰＨ６
，３の０．１ Ｍ リン酸緩衝液を流してグル沖過を行
ない、素通シ分画を分取した。
■ 抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧＦ（ａｂ’
）２の調製 抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧ １０ ｍ’／
を０．１ Ｍ酢酸緩１１ｊｉ７液（ｐＨ４，０） ２ｒ
ｕｌＫｄ！ンン３００ｔｚＪを加え、３７℃で１８時間
攪拌した。０．ｌＮＮａＯＨを加えてＰＨを６．０に調
節しこの反応液を予め０１Ｍリン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤ
ＴＡ溶液（ＰＨ６，３）で緩衝化したセフアクリルＳ
−３００ｒ’ルヵラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶
出した。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を
集めて１ ｊｔｔｌ！に濃縮し、目的の抗ヒトα−フェ
トプロティンヤギＩｇＧＦ（ａｂ’）２を得た。
）２の調製 抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧ １０ ｍ’／
を０．１ Ｍ酢酸緩１１ｊｉ７液（ｐＨ４，０） ２ｒ
ｕｌＫｄ！ンン３００ｔｚＪを加え、３７℃で１８時間
攪拌した。０．ｌＮＮａＯＨを加えてＰＨを６．０に調
節しこの反応液を予め０１Ｍリン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤ
ＴＡ溶液（ＰＨ６，３）で緩衝化したセフアクリルＳ
−３００ｒ’ルヵラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶
出した。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を
集めて１ ｊｔｔｌ！に濃縮し、目的の抗ヒトα−フェ
トプロティンヤギＩｇＧＦ（ａｂ’）２を得た。
■ α−アミラーゼ−抗ヒトα−フェトプロティンヤギ
ＩｇＧ Ｆａｌ）’結合物の調製■で調製した抗ヒトα
−フェトプロティンヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２６ ｍ
９を含む０．１Ｍリン駿緩衝１ ｍＭＥＤＴＡ溶液（Ｐ
Ｈ６，０） １ ｍｌに１．０ ｍ９／ｌｎｌの２−メ
ルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μｌを加え、
３７℃で９０分間攪拌した。この反応液を予め０、１
Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，３）で緩衝化したセファ
デックスＧ−２５カラムでケ゛ル濾過して未反応の２−
メルカプトメチルアミンを除去し、Ｈ８−Ｆａｌｌ’を
得だ。これに■で調製した研■化α−アミラーゼ２■を
加え、３７℃で９０分間反応させた。次にこの反応液′
ｆｆ：０１Ｍ酢酸緩衝５ ｍＭ塩化カルシウム浴液（ｐ
Ｈ６，０）で緩衝化したセフアクリルＳ −３００カラ
ムでゲル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これ
を濃縮して目的の結合物を得た。
ＩｇＧ Ｆａｌ）’結合物の調製■で調製した抗ヒトα
−フェトプロティンヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２６ ｍ
９を含む０．１Ｍリン駿緩衝１ ｍＭＥＤＴＡ溶液（Ｐ
Ｈ６，０） １ ｍｌに１．０ ｍ９／ｌｎｌの２−メ
ルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μｌを加え、
３７℃で９０分間攪拌した。この反応液を予め０、１
Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，３）で緩衝化したセファ
デックスＧ−２５カラムでケ゛ル濾過して未反応の２−
メルカプトメチルアミンを除去し、Ｈ８−Ｆａｌｌ’を
得だ。これに■で調製した研■化α−アミラーゼ２■を
加え、３７℃で９０分間反応させた。次にこの反応液′
ｆｆ：０１Ｍ酢酸緩衝５ ｍＭ塩化カルシウム浴液（ｐ
Ｈ６，０）で緩衝化したセフアクリルＳ −３００カラ
ムでゲル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これ
を濃縮して目的の結合物を得た。
■ α−フェトゾロティンの測定
濃度Ｏ〜２０００ ｎｇのα−フェトプロティン溶液５
０μｌに■で調製した結合物浴液５０ＰＡを加えて２０
分間反応させた。反応液にブルースターチ懸濁１夜１．
Ｑ ｉｉ／ ’ｆ加えて３７℃で２０分間さらに反応
させ、０．５ ＮＮａＯＨ１ｍｌを加えて反応を停止さ
せた。これを攪拌後、３５００ ｒｐｍで２分間遠心し
、得られだ上清の６２０ ｎｍにおける吸光度を測定し
た。
０μｌに■で調製した結合物浴液５０ＰＡを加えて２０
分間反応させた。反応液にブルースターチ懸濁１夜１．
Ｑ ｉｉ／ ’ｆ加えて３７℃で２０分間さらに反応
させ、０．５ ＮＮａＯＨ１ｍｌを加えて反応を停止さ
せた。これを攪拌後、３５００ ｒｐｍで２分間遠心し
、得られだ上清の６２０ ｎｍにおける吸光度を測定し
た。
得られた吸光度とα−フェトプロティンの濃度上の関係
を示す検量線を第２図に示す。
を示す検量線を第２図に示す。
第１図は本発明の方法で測定して得られたヒトＩｇＧ量
と吸光度との関係を示すものであり、第２図は同じくα
−フェトプロティン量と吸光度との関係を示すものであ
る。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人 弁理士田中政浩 第１図 １０ ４０１６０６４０２５６０ ヒト ’９Ｇ ）１９／ｍｌ 第２図 ５ ２０ ８０３２０１２８０
と吸光度との関係を示すものであり、第２図は同じくα
−フェトプロティン量と吸光度との関係を示すものであ
る。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人 弁理士田中政浩 第１図 １０ ４０１６０６４０２５６０ ヒト ’９Ｇ ）１９／ｍｌ 第２図 ５ ２０ ８０３２０１２８０
Claims (1)
- 検体に含まれる抗原決定基具有物質と、この抗原決定基
具有物質に対する抗体と水に不溶性の高分子物質に作用
しうる酵素との結合物を、溶液中で接触せしめて反応さ
せ、その後この結合物に前記の高分子物質を接触せしめ
て酵素反応さぜ、酵素活性を測定することを特徴とする
抗原決定基具有物質の測定方法
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23124183A JPS60123767A (ja) | 1983-12-09 | 1983-12-09 | 酵素を用いた抗原決定基具有物質測定法 |
| DE8484307834T DE3485339D1 (de) | 1983-11-18 | 1984-11-13 | Verfahren zur messung eines biologischen ligands. |
| US06/670,764 US4692404A (en) | 1983-11-18 | 1984-11-13 | Method of measuring biological ligand by the use of enzymes |
| EP84307834A EP0144176B1 (en) | 1983-11-18 | 1984-11-13 | Method of measuring a biological ligand |
| ES537707A ES537707A0 (es) | 1983-11-18 | 1984-11-16 | Un metodo de medir un ligando biologico |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23124183A JPS60123767A (ja) | 1983-12-09 | 1983-12-09 | 酵素を用いた抗原決定基具有物質測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60123767A true JPS60123767A (ja) | 1985-07-02 |
| JPH0340831B2 JPH0340831B2 (ja) | 1991-06-20 |
Family
ID=16920530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23124183A Granted JPS60123767A (ja) | 1983-11-18 | 1983-12-09 | 酵素を用いた抗原決定基具有物質測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60123767A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
| JPS59210365A (ja) * | 1983-05-02 | 1984-11-29 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | 均一系免疫試験法ならびにそれに用いるための試薬系、試験キツトおよび試験具 |
-
1983
- 1983-12-09 JP JP23124183A patent/JPS60123767A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
| JPS59210365A (ja) * | 1983-05-02 | 1984-11-29 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | 均一系免疫試験法ならびにそれに用いるための試薬系、試験キツトおよび試験具 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0340831B2 (ja) | 1991-06-20 |
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