JPS6180050A - 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定方法 - Google Patents
酵素を利用した抗原決定基具有物質測定方法Info
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- JPS6180050A JPS6180050A JP20345384A JP20345384A JPS6180050A JP S6180050 A JPS6180050 A JP S6180050A JP 20345384 A JP20345384 A JP 20345384A JP 20345384 A JP20345384 A JP 20345384A JP S6180050 A JPS6180050 A JP S6180050A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
血清、尿などの体液に含まれる薬物あるいは各種疾患に
由来する微量成分の分析は病気の診断あるいは治療経過
の判定などに非常に有意義であり、日常の臨床検査に活
用されている。本発明はこの微量成分を測定する方法に
関するものである。
由来する微量成分の分析は病気の診断あるいは治療経過
の判定などに非常に有意義であり、日常の臨床検査に活
用されている。本発明はこの微量成分を測定する方法に
関するものである。
（従来の技術）
血液等の体液には多種多様の成分が含まれており、その
なかには、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質
あるいは構造の近似した物質なども含まれていることも
多い。そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量
まで定量しうろことが要求される。さらに、日常検査と
して利用されるために、簡単かつルーチン化しうろこと
が望ましい０ 血族のこれらの微量成分を検出する方法がｆ重々間発さ
れているが、感度、特異性、−大量検体の短時間処理な
どの点にすぐｎる酵素免疫測定法が賞月さ九ている。し
かしながら、従来の酵素免疫測定法の場合には、未だ感
度が充分とはいえず、また洗浄操作が繁雑でちったり、
チーープの移しかえが必要であったりして正確な濃度金
求めることが容易でなかった。
なかには、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質
あるいは構造の近似した物質なども含まれていることも
多い。そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量
まで定量しうろことが要求される。さらに、日常検査と
して利用されるために、簡単かつルーチン化しうろこと
が望ましい０ 血族のこれらの微量成分を検出する方法がｆ重々間発さ
れているが、感度、特異性、−大量検体の短時間処理な
どの点にすぐｎる酵素免疫測定法が賞月さ九ている。し
かしながら、従来の酵素免疫測定法の場合には、未だ感
度が充分とはいえず、また洗浄操作が繁雑でちったり、
チーープの移しかえが必要であったりして正確な濃度金
求めることが容易でなかった。
そこで、本発明名らはさらに感度を高めかつ繁雑な操作
の少ない分析方法を開発するべく検討を行ない、」１１
定対象の抗原決定基具有物質に対する抗体と酵素に対す
る抗体との結合物を利用する方法を開発した。この方法
は、この結合物に対して測定対象の抗原決定基具有物質
と酵素と競争反応させその後この酵素の活性を測定する
ことによって抗原決定基具有物質全定量する方法（特開
昭５９−号公報）である。その際、この抗原 決定基具有物質に対する抗体と反応する抗体あるいは酵
素に対する抗体と反応する抗体をさらに競争反応させる
方法（特願昭５８−５１４９４号）、あるいは抗原決定
基具有物質と高分子化合物との、結合物又は抗原決定基
具有物質の重合物を競争反応させる方法（特願昭５８−
５１４９５号）も併せて開発した。そして、その後さら
に検討を進め、この技術に近縁の種々の抗原決定基具有
物質測定法を次々と開発して特許出願を行なった。その
なかに、測定対象の抗原決定基具有物質にその抗体と水
に不溶性の高分子物質に作用しうる酵素との結合物を作
用させてその後結合物の酵素活性を測定する方法（特願
昭５８−２３１２４１号）があった。また、測定対象の
抗原決定基具有物質にこの抗原決定基具有物質の一の抗
原決定基に対する抗体とアミラーゼとの結合物及びこの
抗原決定基具有物質の他の抗原決定基に対する抗体を接
触させてその後結合物のアミラーゼ活性等を測定する方
法（特願昭５９−１４３８０１号）もあった。
の少ない分析方法を開発するべく検討を行ない、」１１
定対象の抗原決定基具有物質に対する抗体と酵素に対す
る抗体との結合物を利用する方法を開発した。この方法
は、この結合物に対して測定対象の抗原決定基具有物質
と酵素と競争反応させその後この酵素の活性を測定する
ことによって抗原決定基具有物質全定量する方法（特開
昭５９−号公報）である。その際、この抗原 決定基具有物質に対する抗体と反応する抗体あるいは酵
素に対する抗体と反応する抗体をさらに競争反応させる
方法（特願昭５８−５１４９４号）、あるいは抗原決定
基具有物質と高分子化合物との、結合物又は抗原決定基
具有物質の重合物を競争反応させる方法（特願昭５８−
５１４９５号）も併せて開発した。そして、その後さら
に検討を進め、この技術に近縁の種々の抗原決定基具有
物質測定法を次々と開発して特許出願を行なった。その
なかに、測定対象の抗原決定基具有物質にその抗体と水
に不溶性の高分子物質に作用しうる酵素との結合物を作
用させてその後結合物の酵素活性を測定する方法（特願
昭５８−２３１２４１号）があった。また、測定対象の
抗原決定基具有物質にこの抗原決定基具有物質の一の抗
原決定基に対する抗体とアミラーゼとの結合物及びこの
抗原決定基具有物質の他の抗原決定基に対する抗体を接
触させてその後結合物のアミラーゼ活性等を測定する方
法（特願昭５９−１４３８０１号）もあった。
（発明が解決しようとする問題点）
前者の方法に比し後者の方法は測定感度がさらに１桁な
いし２桁高くなる点ですぐれていたが、後者の方法は血
清などの検体にはアミラーゼが含まれているところから
検体中のアミラーゼに特異的に作用するアミラーゼイン
ヒビｙ−を添加する必要があった。
いし２桁高くなる点ですぐれていたが、後者の方法は血
清などの検体にはアミラーゼが含まれているところから
検体中のアミラーゼに特異的に作用するアミラーゼイン
ヒビｙ−を添加する必要があった。
（問題点を解決するための手段）
本発明は、この後者の発明全拡張するものであり、アミ
ラーゼのかわりに他の酵素のうち水に不溶性の高分子物
質に作用しうる酵素を用いることによっても抗原決定基
具有物質を高感度で測定できるという知見に基いている
。この酵素のうち検体に含まｎていない酵素を用いれば
特に酵素阻害物質などを用いなくともθ１１定できると
いう利点がある。
ラーゼのかわりに他の酵素のうち水に不溶性の高分子物
質に作用しうる酵素を用いることによっても抗原決定基
具有物質を高感度で測定できるという知見に基いている
。この酵素のうち検体に含まｎていない酵素を用いれば
特に酵素阻害物質などを用いなくともθ１１定できると
いう利点がある。
すなわち、本発明は、検体に含まれる２以上の抗原決定
基を具有する物質を測定する方法において、該抗原決定
基具有物質に、この抗原決定基具有物質の一の抗原決定
基に対する抗体と水に不溶性の高分子物質に作用しうる
酵素との結合物及び他の抗原決定基に対する抗体を接触
せしめて反応させ、さらに前記の高分子物質に前記の結
合物を接触せしめて酵素反応させ、酵素活性全測定する
ことを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法に関す
るものである。
基を具有する物質を測定する方法において、該抗原決定
基具有物質に、この抗原決定基具有物質の一の抗原決定
基に対する抗体と水に不溶性の高分子物質に作用しうる
酵素との結合物及び他の抗原決定基に対する抗体を接触
せしめて反応させ、さらに前記の高分子物質に前記の結
合物を接触せしめて酵素反応させ、酵素活性全測定する
ことを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法に関す
るものである。
本発明における測定対象は検体に含まれる抗原決定基具
有物質である。検体の種類は限定されないが、例えば血
清、尿などである。血ｍ１尿などの場合には、通常は特
別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうことが
できる。
有物質である。検体の種類は限定されないが、例えば血
清、尿などである。血ｍ１尿などの場合には、通常は特
別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうことが
できる。
抗原決定基具有物質（以下りがンドという。）は抗原決
定基を二以上有しているものであり、例えば、各種内分
泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリ／、アルブミ
ン、フェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウィルス
、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児性抗原
等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原などで
ある。
定基を二以上有しているものであり、例えば、各種内分
泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリ／、アルブミ
ン、フェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウィルス
、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児性抗原
等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原などで
ある。
結合物を構成している抗体はリガンドと反応するもので
なければならない。この抗体にはＦ （ａｂ’）２ 。
なければならない。この抗体にはＦ （ａｂ’）２ 。
Ｆａｂ′、 Ｆａｂなどのフラグメントも含まれる。
抗体の製造方法としては、リガンド又はリガンドと蛋白
との結合物を兎、山羊゛、馬、モルモット、ニワトリな
どの温血動物に体重１ ｋｇあだ、！ｌ） ０．３〜２
ｍ９を１〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等に
アノ−パントとともに注射して当該動物の体内に形成さ
せる。この抗体は各種の抗原決定基を認識する抗体の混
合物であるからこれを分離して用イル。分離方法にはア
フィニティークロマトクラソイ−を用いるのがよく、例
えば、リガンドを酵素あるいは化学試薬により分解して
ゲルｐ過、イオン交換クロマトグラフィーなどで分離し
、この各抗原フラクノヨンを不溶化したアフィニティー
カラムを作製し、このカラム全周いて前記の抗体混合物
を分離することができる。また、この抗体は市販品も存
在する。本発明の方法においては、抗体は単一抗体に分
離しなくともよく、少なくとも２群に分割すれば足りる
。
との結合物を兎、山羊゛、馬、モルモット、ニワトリな
どの温血動物に体重１ ｋｇあだ、！ｌ） ０．３〜２
ｍ９を１〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等に
アノ−パントとともに注射して当該動物の体内に形成さ
せる。この抗体は各種の抗原決定基を認識する抗体の混
合物であるからこれを分離して用イル。分離方法にはア
フィニティークロマトクラソイ−を用いるのがよく、例
えば、リガンドを酵素あるいは化学試薬により分解して
ゲルｐ過、イオン交換クロマトグラフィーなどで分離し
、この各抗原フラクノヨンを不溶化したアフィニティー
カラムを作製し、このカラム全周いて前記の抗体混合物
を分離することができる。また、この抗体は市販品も存
在する。本発明の方法においては、抗体は単一抗体に分
離しなくともよく、少なくとも２群に分割すれば足りる
。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアノ−バントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞ＨＤ出してポリエチレングリコール等ヲ用いてマウ
スミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞
のなかから当該抗体を産生ずるもの全クロー二／グによ
ってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中で
増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロー
ナル抗体を大量に製造することができる。
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアノ−バントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞ＨＤ出してポリエチレングリコール等ヲ用いてマウ
スミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞
のなかから当該抗体を産生ずるもの全クロー二／グによ
ってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中で
増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロー
ナル抗体を大量に製造することができる。
結合物を構成している酵素は水に不溶性の高分子化合物
に作用しうるものであるが、そのなかでは活性の測定方
法が容易なものがよい。このような酵素は、例えばアミ
ラーゼ、ガキストラナーゼ、セルラーゼ、コラーケ９ナ
ーゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラスターゼ、リパ
ーゼ、などである。
に作用しうるものであるが、そのなかでは活性の測定方
法が容易なものがよい。このような酵素は、例えばアミ
ラーゼ、ガキストラナーゼ、セルラーゼ、コラーケ９ナ
ーゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラスターゼ、リパ
ーゼ、などである。
酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮して決定
すればよい。官能基は、アミン基、カルボキシル基、水
酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基などを
利用することができ、例えばアミノ基相互間を結合させ
る場合には、ノイソンアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知
られている。また、アミノ基とカルボキシル基との間全
結合させる方法としては、カルボキシル基をサクンンイ
ミドエステル化する方法のほかカルボッイミド法、ウッ
ドワード試薬法等が知られておシ、アミノ基と糖鎖を架
橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もある。チ
オール基を利用する場合には、例えばもう一方の側のカ
ルボキシル基とサク／ンイミドエステル化してこれにシ
スティンを反応させてチオール基を導入し、チオール基
反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することができ
る。フェニル基を利用する方法としてはノアゾ化法、ア
ルキル化法などがある。結合方法はこれらの例示に限ら
れるものではなく、このほか例えばｒ Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊあるいは「酵素免疫測定法」等の
成書に記載されている方法のなかから適宜選択して利用
することができる。結合比は１．１に限らず、目的に応
じて任意の比率をとることができることはいうまでもな
い。反応後は、ケ゛ル濾過法、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜
組み合わせて精製を行い、必要により凍結乾燥法等で乾
燥する。
すればよい。官能基は、アミン基、カルボキシル基、水
酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基などを
利用することができ、例えばアミノ基相互間を結合させ
る場合には、ノイソンアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知
られている。また、アミノ基とカルボキシル基との間全
結合させる方法としては、カルボキシル基をサクンンイ
ミドエステル化する方法のほかカルボッイミド法、ウッ
ドワード試薬法等が知られておシ、アミノ基と糖鎖を架
橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もある。チ
オール基を利用する場合には、例えばもう一方の側のカ
ルボキシル基とサク／ンイミドエステル化してこれにシ
スティンを反応させてチオール基を導入し、チオール基
反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することができ
る。フェニル基を利用する方法としてはノアゾ化法、ア
ルキル化法などがある。結合方法はこれらの例示に限ら
れるものではなく、このほか例えばｒ Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊあるいは「酵素免疫測定法」等の
成書に記載されている方法のなかから適宜選択して利用
することができる。結合比は１．１に限らず、目的に応
じて任意の比率をとることができることはいうまでもな
い。反応後は、ケ゛ル濾過法、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜
組み合わせて精製を行い、必要により凍結乾燥法等で乾
燥する。
この結合物の抗体とともにり、ガントに作用させる抗体
は結合物の抗体が反応する抗原決定基と異なる抗原決定
基に対して反応するものである。この抗体はＩｇＧ 、
ＩｇＭあるいはＩｇＡであり、Ｆ （ａ ｂ’）ｚ
ｒＦａｂなどのフラグメントであってもよく、また、例
えばＤＮＰ化、アセチル化、ビオチニル化、ニトロ化な
どの化学修飾が施されたものであってもよい。この抗体
は１種類に限られるものではなく、２種類以上あっても
より０ この異なる抗原決定基を認識する抗体は前述の細胞融合
法によるモノクローナル抗体き製造する方法により容易
に取得することができる。また、前述の温血動物を利用
して抗体群を産生させ、これを分離してもよい。その場
合には単一抗体まで分離しなくともよく、例えば２群に
分割してその一方を前述の酵素と結合させ、もう一方を
この抗体に利用してもよい。また、この抗体は完全に分
離しなくともよく、測定を阻害しない程度に他方の抗体
が混入していてもよい。
は結合物の抗体が反応する抗原決定基と異なる抗原決定
基に対して反応するものである。この抗体はＩｇＧ 、
ＩｇＭあるいはＩｇＡであり、Ｆ （ａ ｂ’）ｚ
ｒＦａｂなどのフラグメントであってもよく、また、例
えばＤＮＰ化、アセチル化、ビオチニル化、ニトロ化な
どの化学修飾が施されたものであってもよい。この抗体
は１種類に限られるものではなく、２種類以上あっても
より０ この異なる抗原決定基を認識する抗体は前述の細胞融合
法によるモノクローナル抗体き製造する方法により容易
に取得することができる。また、前述の温血動物を利用
して抗体群を産生させ、これを分離してもよい。その場
合には単一抗体まで分離しなくともよく、例えば２群に
分割してその一方を前述の酵素と結合させ、もう一方を
この抗体に利用してもよい。また、この抗体は完全に分
離しなくともよく、測定を阻害しない程度に他方の抗体
が混入していてもよい。
この抗体には水溶性高分子を結合させたほうが感度を高
める点で好ましい場合がある。水溶性高分子は分子量が
１０００以上のものであり、例えばアルブミン、ヘモシ
アニン等の蛋白質、ポリサ。
める点で好ましい場合がある。水溶性高分子は分子量が
１０００以上のものであり、例えばアルブミン、ヘモシ
アニン等の蛋白質、ポリサ。
カライド、ポリエチレングリコール、ポリヌクレオチド
等である。結合方法は前述の酵素に抗体を結合させる方
法のなかから適宜選択すればよい。
等である。結合方法は前述の酵素に抗体を結合させる方
法のなかから適宜選択すればよい。
同様に、この抗体にさらにこの抗体に対する抗体全反応
させて高分子化してもよい。この第２抗体は例えばヤギ
ＩｇＧに対するウサギＩｇＧなどであシ、第１抗体ある
いは第１抗体とリガンドの結合物を抗原として前述の抗
体の取得方法に準じて取得することができる。この第２
抗体を接触させる時期は第１抗体をリガンドに接触させ
る前であっても後であってもよいが、同時に加えること
が操作上簡便である。
させて高分子化してもよい。この第２抗体は例えばヤギ
ＩｇＧに対するウサギＩｇＧなどであシ、第１抗体ある
いは第１抗体とリガンドの結合物を抗原として前述の抗
体の取得方法に準じて取得することができる。この第２
抗体を接触させる時期は第１抗体をリガンドに接触させ
る前であっても後であってもよいが、同時に加えること
が操作上簡便である。
測定対象のりガントに、前記の一の抗原決定基に対する
抗体と酵素との結合物及び他の抗原決定基に対する抗体
を溶液中で接触させる。その際、＠液の温度は２０〜４
５℃程度、そしてＰＨは通常４〜８，５程度が適当であ
る。−を一定に保つために、必要により、リン酸緩衝液
、酢酸緩衝液などの緩衝１ｆｆｉ用いてもよい。その際
、結合物及び抗体の適当な量は、その種類、リガンドの
種類、あるいは接触時の条件などによって異なるので予
め試験をして定めるのがよい。リガンドへの結合物及び
抗体の接触順序は問うところではなく、いずれが先であ
ってもまた両方同時であってもよい。
抗体と酵素との結合物及び他の抗原決定基に対する抗体
を溶液中で接触させる。その際、＠液の温度は２０〜４
５℃程度、そしてＰＨは通常４〜８，５程度が適当であ
る。−を一定に保つために、必要により、リン酸緩衝液
、酢酸緩衝液などの緩衝１ｆｆｉ用いてもよい。その際
、結合物及び抗体の適当な量は、その種類、リガンドの
種類、あるいは接触時の条件などによって異なるので予
め試験をして定めるのがよい。リガンドへの結合物及び
抗体の接触順序は問うところではなく、いずれが先であ
ってもまた両方同時であってもよい。
一方、結合物の酵素と同種の酵素が検体に含まれている
場合には、この検体中の酵素を阻害する程度が前記の結
合物に結合されている酵素の活性を阻害する程度より大
きい酵素阻害物質を接触させるのがよい。
場合には、この検体中の酵素を阻害する程度が前記の結
合物に結合されている酵素の活性を阻害する程度より大
きい酵素阻害物質を接触させるのがよい。
この酵素阻害物質は検体に含まれている酵素を完全に失
活させかつ結合物に結合されている酵素を全く阻害しな
いものが最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
は要は測定時においてブランク値を上昇させなければよ
く、測定後に酵素阻害物質が失活するなどしてこの酵素
活性が回復してもよい。この酵素阻害物質の作用が問題
になるもう一方の、酵素は抗体に結合されている状態の
ものであり、遊離状態では酵素阻害物質によって失活す
るものであってもよい。この酵素阻害物質にはこのよう
な特異性を有する公知の酵素阻害物質を利用すればよい
が、そのほか、検体に含まれている酵素全温血動物に投
与してその抗体を取得し、これを酵素阻害物質として用
いることもできる。抗体の取得方法は前述のりがンドに
対する抗体の取得方法と同様でよい。酵素阻害物質の添
加時期は、検体中の酵素による後述する水に不溶性の高
分子物質の分解を実質的に防止できればよく、通常はこ
の高分子物質の添加前に添加する。しかしながら、一般
に酵素阻害物質による阻害作用は酵素による基質の分解
速度よりもはるかにはやいので酵素阻害物質を高分子物
質と同時あるいは多少遅れて添加してもよい。
活させかつ結合物に結合されている酵素を全く阻害しな
いものが最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
は要は測定時においてブランク値を上昇させなければよ
く、測定後に酵素阻害物質が失活するなどしてこの酵素
活性が回復してもよい。この酵素阻害物質の作用が問題
になるもう一方の、酵素は抗体に結合されている状態の
ものであり、遊離状態では酵素阻害物質によって失活す
るものであってもよい。この酵素阻害物質にはこのよう
な特異性を有する公知の酵素阻害物質を利用すればよい
が、そのほか、検体に含まれている酵素全温血動物に投
与してその抗体を取得し、これを酵素阻害物質として用
いることもできる。抗体の取得方法は前述のりがンドに
対する抗体の取得方法と同様でよい。酵素阻害物質の添
加時期は、検体中の酵素による後述する水に不溶性の高
分子物質の分解を実質的に防止できればよく、通常はこ
の高分子物質の添加前に添加する。しかしながら、一般
に酵素阻害物質による阻害作用は酵素による基質の分解
速度よりもはるかにはやいので酵素阻害物質を高分子物
質と同時あるいは多少遅れて添加してもよい。
リガンドと反応させた結合物は高分子物質に接触させて
反応させる。
反応させる。
高分子物質と接融させる結合物は反応物から分離したも
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。
この高分子物質は結合物中の酵素が酵素反応しうるもの
であり、通常は基質であるが、水に不溶性のものである
。高分子物質の例としてはα−アミラーゼの場合には不
溶性ｒンプン、セルラーゼの場合にはセルロース、コラ
ーケ１ナーゼの場合にはコラーケ９ン、マンナーゼの場
合にはマンナン、プロテアーゼの場合には不溶性蛋白質
、ニラスターゼの場合にはエラスチン、そしてすｉＥ−
ゼの場合には各種油脂類２挙げることができる。この高
分子物質はそれ自身が可溶性であっても、不溶性の担体
に結合させるとか、重合させるなどして不溶化して用い
ることもできる。
であり、通常は基質であるが、水に不溶性のものである
。高分子物質の例としてはα−アミラーゼの場合には不
溶性ｒンプン、セルラーゼの場合にはセルロース、コラ
ーケ１ナーゼの場合にはコラーケ９ン、マンナーゼの場
合にはマンナン、プロテアーゼの場合には不溶性蛋白質
、ニラスターゼの場合にはエラスチン、そしてすｉＥ−
ゼの場合には各種油脂類２挙げることができる。この高
分子物質はそれ自身が可溶性であっても、不溶性の担体
に結合させるとか、重合させるなどして不溶化して用い
ることもできる。
酵素反応条件は用いる酵素に応じて適当になるように定
めればよい。
めればよい。
酵素反応後は酵素活性を求める。酵素活性は、この酵素
反応による分解物の増加、原料である高分子物質の減少
、その他、酵素反応による系の変化を追跡すればよい。
反応による分解物の増加、原料である高分子物質の減少
、その他、酵素反応による系の変化を追跡すればよい。
（作 用）
本発明の方法においては、リガンドが結合物の抗体部分
に結合することによってその後の酵素反応に立体障害を
生じさせることを利用している。
に結合することによってその後の酵素反応に立体障害を
生じさせることを利用している。
酵素反応させる高分子物質が不溶性であるために結合物
の酵素部分との接触の大部分が固−液間になり、その結
果、酵素の高分子化による立体障害が大きく現われる。
の酵素部分との接触の大部分が固−液間になり、その結
果、酵素の高分子化による立体障害が大きく現われる。
本発明者らはこのことを確認するためにα−アミラーゼ
の系を用いて検討したところ、ペンタオース、の場合に
は酵素の高分子化による酵素活性の低下がほとんど認め
られず、一方、不溶化デンプンの場合には酵素活性が著
しく低下した。
の系を用いて検討したところ、ペンタオース、の場合に
は酵素の高分子化による酵素活性の低下がほとんど認め
られず、一方、不溶化デンプンの場合には酵素活性が著
しく低下した。
このような系に結合物の抗体とは異なる抗原決定基全認
識する新たな抗体を導入したところに本発明の特徴があ
る。すなわち、結合物の抗体部分に一の抗原決定基部分
が結合したりガントの他の抗原決定基部分にこの抗体が
結合することによって結合物を巨大化してその立体障害
をさらに大きくしている。それによって、すがンドの測
定感度を大きく高めているのである。
識する新たな抗体を導入したところに本発明の特徴があ
る。すなわち、結合物の抗体部分に一の抗原決定基部分
が結合したりガントの他の抗原決定基部分にこの抗体が
結合することによって結合物を巨大化してその立体障害
をさらに大きくしている。それによって、すがンドの測
定感度を大きく高めているのである。
（実施例）
実施例１
■ セルラーゼ基質の調製
２紙を２０（７）×２０αの大きさに切断し、あらかじ
め１目意しておいたりアクティブブルー溶液（５ｇリア
クティブブルー、５ ｉ Ｎａ２Ｃｏ、蒸留水２００
ｍｅ ）中に浸した。６０℃に加温し、時々攪拌しなが
ら、３日間加熱を続けた。このｐ紙を蒸留水で十分に洗
浄し、過剰の染料を除去した。続いて、恒温乾燥器で乾
燥させ、１ｍＸ５ｃｒｎの大きさに切断して、目的の基
質を得た。
め１目意しておいたりアクティブブルー溶液（５ｇリア
クティブブルー、５ ｉ Ｎａ２Ｃｏ、蒸留水２００
ｍｅ ）中に浸した。６０℃に加温し、時々攪拌しなが
ら、３日間加熱を続けた。このｐ紙を蒸留水で十分に洗
浄し、過剰の染料を除去した。続いて、恒温乾燥器で乾
燥させ、１ｍＸ５ｃｒｎの大きさに切断して、目的の基
質を得た。
■ セルラーゼ−抗ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ結合物の調
製 セルラーゼ１０ｍ９’１ｐ８６．０のＯ，ｌ Ｍリン酸
緩衝液２ ｍｌに溶かし１−（マレイミドメチルシクロ
ヘキサン−１−カル？ン酸）サクシンイミドエステル（
ＣＨＭＳ ）のツメチルスルホキシド溶液（ｚｍｐＡＪ
）２００μ！を加え、室温で１時間、放置した。この反
応液をセファデツクスＧ−２５を用いてグル濾過し、未
反応のＣＨＭＳを除去した。このＣＨＭＳ化セルラーゼ
を１１ｎｌまで濃縮した。
製 セルラーゼ１０ｍ９’１ｐ８６．０のＯ，ｌ Ｍリン酸
緩衝液２ ｍｌに溶かし１−（マレイミドメチルシクロ
ヘキサン−１−カル？ン酸）サクシンイミドエステル（
ＣＨＭＳ ）のツメチルスルホキシド溶液（ｚｍｐＡＪ
）２００μ！を加え、室温で１時間、放置した。この反
応液をセファデツクスＧ−２５を用いてグル濾過し、未
反応のＣＨＭＳを除去した。このＣＨＭＳ化セルラーゼ
を１１ｎｌまで濃縮した。
一方、抗ヒトＩｇＧ−７ウスＩ ｇＧ １０ ’９ ’
Ｆｌ： ５ ｍＡ ＥＤＴＡを含むｐＨ７，５の０．１
Ｍ ！Ｊン酸緩衝液２ ｍｌにとかしｇ ｍ；）／ｒ
ｕｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭ
Ｓ ）のノオキサン溶液２００μ！加えた。それから３
７℃で一時間放置後、ｌＮヒドロキシルアミン水溶Ｃ夜
（ｐＨ７，５）２００μに加えた。３０分後反応液をセ
フ了デックスＧ−２５でケ゛ルｐ過し未反応のＳＡＭＳ
を除いた。このＨ８−抗ヒ）ＩｇＧマウスＩｇＧ＠液を
前述のＣＨＭ化セルテーゼ１ ｍｌに加え、３７℃で２
時間放置した。この反応液を七フアクリルＳ−３００で
ケ９ル濾過し目的のセルラーゼ−抗ヒ）ＩｇＧマウスＩ
ｇＧ結合物を得た。
Ｆｌ： ５ ｍＡ ＥＤＴＡを含むｐＨ７，５の０．１
Ｍ ！Ｊン酸緩衝液２ ｍｌにとかしｇ ｍ；）／ｒ
ｕｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭ
Ｓ ）のノオキサン溶液２００μ！加えた。それから３
７℃で一時間放置後、ｌＮヒドロキシルアミン水溶Ｃ夜
（ｐＨ７，５）２００μに加えた。３０分後反応液をセ
フ了デックスＧ−２５でケ゛ルｐ過し未反応のＳＡＭＳ
を除いた。このＨ８−抗ヒ）ＩｇＧマウスＩｇＧ＠液を
前述のＣＨＭ化セルテーゼ１ ｍｌに加え、３７℃で２
時間放置した。この反応液を七フアクリルＳ−３００で
ケ９ル濾過し目的のセルラーゼ−抗ヒ）ＩｇＧマウスＩ
ｇＧ結合物を得た。
■ ヒトエｇＧの測定
セルラーゼ−抗ヒ）ＩｇＧマウスＩｇＧ結合物を含む溶
液５０μ！にヒ）ＩｇＧｉ含む標準溶液５０ａ及び結合
物の抗体と別の抗原決定基を認識する抗ヒトＩｇＧマウ
スＩｇＧ ５０ ｔＪ （０，１ｍ（／／ｍｅ ）を加
え、３７℃で３０分間放置した。これにｐＨ５，０の０
．１Ｍ酢酸緩衝ｉ全１ ｍｅ加え、次に■で調製したブ
ルーセルロースＰ紙全１枚加えた。１時間後反応液の吸
光度を波長６５０ ｎｍで測定した。第１図は標準溶液
中のヒトＪｇＧ量と吸光度を示したものである。
液５０μ！にヒ）ＩｇＧｉ含む標準溶液５０ａ及び結合
物の抗体と別の抗原決定基を認識する抗ヒトＩｇＧマウ
スＩｇＧ ５０ ｔＪ （０，１ｍ（／／ｍｅ ）を加
え、３７℃で３０分間放置した。これにｐＨ５，０の０
．１Ｍ酢酸緩衝ｉ全１ ｍｅ加え、次に■で調製したブ
ルーセルロースＰ紙全１枚加えた。１時間後反応液の吸
光度を波長６５０ ｎｍで測定した。第１図は標準溶液
中のヒトＪｇＧ量と吸光度を示したものである。
尚、図中白丸は抗ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ１加えた場合
をそして黒丸は加えなかった場合をそれぞれ示している
。
をそして黒丸は加えなかった場合をそれぞれ示している
。
実施例２
■ 不溶比ブルーデキストランの作製
ブルーデキストラン２０００（ファルマシア社製品）
２ ｊｉ ｆ ０．６ Ｎ ＮａＯＨ水溶液２５ｒｎｌ
に溶かし、こレニセルロース・ぞウダー１ｇ（ファルマ
シア社製品）及びＮａＢＨ４３０ｒｎ９ｆ加えた。攪拌
しつつノグリシノルエーテル５ｒｎｌを加え、室温にて
一夜攪拌した。反応後、生じた塊をス〆−テルで破砕し
、蒸留水で充分洗浄した。遠心して不溶化ブルーデキス
トランを分取した。この不溶化ブルーデキストラン１ｇ
を０．１ Ｍ酢酸緩衝Ｑ ５ Ｑ ｎｔｌに懸濁した。
２ ｊｉ ｆ ０．６ Ｎ ＮａＯＨ水溶液２５ｒｎｌ
に溶かし、こレニセルロース・ぞウダー１ｇ（ファルマ
シア社製品）及びＮａＢＨ４３０ｒｎ９ｆ加えた。攪拌
しつつノグリシノルエーテル５ｒｎｌを加え、室温にて
一夜攪拌した。反応後、生じた塊をス〆−テルで破砕し
、蒸留水で充分洗浄した。遠心して不溶化ブルーデキス
トランを分取した。この不溶化ブルーデキストラン１ｇ
を０．１ Ｍ酢酸緩衝Ｑ ５ Ｑ ｎｔｌに懸濁した。
■ ＣＨＭ化デキストラナーゼの作製
デキストラナーゼ１ ｍ９ ｅ ｐＨ７，３の０．１Ｍ
リン酸緩衝液１ ｍｌに溶かし、ＣＨＭＳ ｌ ｍｇｆ
ｉｌのＤＭＦ溶液１００μＡを加えて室温で１時間放置
して反応させた。この反応液ｆ Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ
−２のカラムに入れ、Ｐｉ−ｔ ７．０の０、１ Ｍ
！Ｊン酸緩衝液を流してケ゛ル濾過を行ない、素通り分
画を分取した。
リン酸緩衝液１ ｍｌに溶かし、ＣＨＭＳ ｌ ｍｇｆ
ｉｌのＤＭＦ溶液１００μＡを加えて室温で１時間放置
して反応させた。この反応液ｆ Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ
−２のカラムに入れ、Ｐｉ−ｔ ７．０の０、１ Ｍ
！Ｊン酸緩衝液を流してケ゛ル濾過を行ない、素通り分
画を分取した。
■ 抗ヒトα−フェトプロティ／ヤギＩｇＧＦ （ａ
ｂ’）２の作製 抗ヒトα−フェトプロティンヤギ■ｇＧ １０ ｍ９を
０、１ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０） ２ｍｌにシフ０
フフ３００μｇｔ加え、３７℃で１８時間攪拌した。０
．１ ＮＮａＱＨを加えてＰＨを６．０に調節しこの反
応液を予め０．１Ｍリン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液
（ｐＨ６，３）で緩衝化したセフアクリルＳ−３００ｒ
ルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出した。分子
量約１０万付近に溶出さｎたピーク部分金集めて１ｍ１
Ｋ濃縮し、目的の抗ヒトα−フェトプロティンヤギ■ｇ
ＧＦ （ａ ｂ’） ２を得た。
ｂ’）２の作製 抗ヒトα−フェトプロティンヤギ■ｇＧ １０ ｍ９を
０、１ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０） ２ｍｌにシフ０
フフ３００μｇｔ加え、３７℃で１８時間攪拌した。０
．１ ＮＮａＱＨを加えてＰＨを６．０に調節しこの反
応液を予め０．１Ｍリン酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液
（ｐＨ６，３）で緩衝化したセフアクリルＳ−３００ｒ
ルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出した。分子
量約１０万付近に溶出さｎたピーク部分金集めて１ｍ１
Ｋ濃縮し、目的の抗ヒトα−フェトプロティンヤギ■ｇ
ＧＦ （ａ ｂ’） ２を得た。
■ デキストラナーゼ−抗ヒトα−フェトプロティンヤ
ギＩｇＧ Ｆａｌ）’結合物の作製■で調製した抗ヒト
α−フェトプロティンヤギＩｇＣｒ Ｆ（ａｂ’）２３
”９ ｅ含む０．１ Ｍリン酸緩衝１ｍＭＥＤＴＡ溶
１ｆｆｌ（ｐＨ６、ｏ ） １ｍｅに１ ＯｒｒＱ／ｍ
ｅの２−メルカゾトエチルアミン塩酸塩水溶ｇｉｏｏμ
Ａｉ加え、３７℃で９０分間攪拌した。この反応液を予
め０、１ Ｍ ｌ）ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化
したセフアゾ、クスＧ−２５カラムでケ０ル濾過して未
反応の２−メルカプトメチルアミン金除去し、Ｈ８Ｆａ
ｂ′を得た。これに■で調製したＣＨＭ化ｒキストラナ
ーゼ１ダを加え、３７℃で９０分間反応後４℃で一夜放
置した。次にこの反応液を２０ ｍＭ ’）ン酸緩衝化
生理食塩水（ｐＨ７，０）で緩衝化したグリセルＣＰＧ
カラムでケ゛ル濾過して分子量１７万以上の分画を集め
、こｎを濃縮して目的の結合物を得た。
ギＩｇＧ Ｆａｌ）’結合物の作製■で調製した抗ヒト
α−フェトプロティンヤギＩｇＣｒ Ｆ（ａｂ’）２３
”９ ｅ含む０．１ Ｍリン酸緩衝１ｍＭＥＤＴＡ溶
１ｆｆｌ（ｐＨ６、ｏ ） １ｍｅに１ ＯｒｒＱ／ｍ
ｅの２−メルカゾトエチルアミン塩酸塩水溶ｇｉｏｏμ
Ａｉ加え、３７℃で９０分間攪拌した。この反応液を予
め０、１ Ｍ ｌ）ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化
したセフアゾ、クスＧ−２５カラムでケ０ル濾過して未
反応の２−メルカプトメチルアミン金除去し、Ｈ８Ｆａ
ｂ′を得た。これに■で調製したＣＨＭ化ｒキストラナ
ーゼ１ダを加え、３７℃で９０分間反応後４℃で一夜放
置した。次にこの反応液を２０ ｍＭ ’）ン酸緩衝化
生理食塩水（ｐＨ７，０）で緩衝化したグリセルＣＰＧ
カラムでケ゛ル濾過して分子量１７万以上の分画を集め
、こｎを濃縮して目的の結合物を得た。
■ ヒトα−フェトプロティンの測定
濃１ｉ ０−１ ｍ９のα−フェトプロティン溶液（８
％ＰＥＧ含有）５０μ！に、■で調製した結合物溶液５
０μｊｌ及Ｕ抗ヒトα−フェトプロティンマウスＩｇＧ
（モノクローナル抗体） ５０ ｔｔＡ（５００４／ｍ
ｅ ）を加えて２０分間反応させた。反応液に不溶化ブ
ルーデキストラン懸濁液１． Ｑ ｍ、ｅ ｆ加えて３
７℃で３０分間さらに反応させ、０．５ ＮＮａＯＨ１
ｍｌ ｋ加えて反応を停止させた。これを攪拌後、３５
００ｒｐｍで２分間遠心し、得られた上清の６２０ ｎ
ｍにおける吸光度全測定した。
％ＰＥＧ含有）５０μ！に、■で調製した結合物溶液５
０μｊｌ及Ｕ抗ヒトα−フェトプロティンマウスＩｇＧ
（モノクローナル抗体） ５０ ｔｔＡ（５００４／ｍ
ｅ ）を加えて２０分間反応させた。反応液に不溶化ブ
ルーデキストラン懸濁液１． Ｑ ｍ、ｅ ｆ加えて３
７℃で３０分間さらに反応させ、０．５ ＮＮａＯＨ１
ｍｌ ｋ加えて反応を停止させた。これを攪拌後、３５
００ｒｐｍで２分間遠心し、得られた上清の６２０ ｎ
ｍにおける吸光度全測定した。
得られた吸光度とヒトα−フェトプロティンの濃度との
関係を示す検量線を第２図に示す。図中白丸は抗ヒトα
−フェトプロティンマウスＩｇＧ’ｉ加えた場合を示し
、一方、黒丸は加えなかった場合を示している。
関係を示す検量線を第２図に示す。図中白丸は抗ヒトα
−フェトプロティンマウスＩｇＧ’ｉ加えた場合を示し
、一方、黒丸は加えなかった場合を示している。
（発明の効果）
本発明の方法は、検体中のりカ゛ンドを特異性高くかつ
極めて高感度で測定できる。この本発明の方法は先願（
特願昭５９−２７７１０号）の方法に比し、感度をさら
に１桁ないし２桁向上させることができる。また、操作
が簡単であり、安価かつ容易にすがノドを定量すること
が可能である。本発明の方法はりがノドの種類を問わず
測定できる。
極めて高感度で測定できる。この本発明の方法は先願（
特願昭５９−２７７１０号）の方法に比し、感度をさら
に１桁ないし２桁向上させることができる。また、操作
が簡単であり、安価かつ容易にすがノドを定量すること
が可能である。本発明の方法はりがノドの種類を問わず
測定できる。
本発明の方法に用いる試薬にはりガントを直接使用せず
、リガンドは抗体の製造に用いられるだけであるから微
量で足りるという利点も有する。従って、本発明の方法
は測定対象と同じリガンドが入手しにくい場合とか、高
価な場合に特に有効である。
、リガンドは抗体の製造に用いられるだけであるから微
量で足りるという利点も有する。従って、本発明の方法
は測定対象と同じリガンドが入手しにくい場合とか、高
価な場合に特に有効である。
第１図は酵素にセルラーゼを用い、ヒトＩｇＧの濃度と
吸光度の関係ｋｍの抗原決定基に対する抗体を加えた場
合（白丸）と加えなかった場合（黒丸）を比較した結果
を示すものであり、第２図は酵素にデキストラナーゼを
用い、ヒトα−フェトプロティンについて同様に比較し
た結果を示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人 弁理士 １） 中 政 浩第１図 ０ｊ５６０．６２５２−５ １０ ４０ １６０ ６４
０ ２５６０ＩｇＧ ７ａｇ／ｍｌ 第２図 Ｊ−フエトフ゛Ｄティン
吸光度の関係ｋｍの抗原決定基に対する抗体を加えた場
合（白丸）と加えなかった場合（黒丸）を比較した結果
を示すものであり、第２図は酵素にデキストラナーゼを
用い、ヒトα−フェトプロティンについて同様に比較し
た結果を示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人 弁理士 １） 中 政 浩第１図 ０ｊ５６０．６２５２−５ １０ ４０ １６０ ６４
０ ２５６０ＩｇＧ ７ａｇ／ｍｌ 第２図 Ｊ−フエトフ゛Ｄティン
Claims (3)
- （１）検体に含まれる２以上の抗原決定基を具有する物
質を測定する方法において、 該抗原決定基具有物質に、この抗原決定基具有物質の一
の抗原決定基に対する抗体と水に不溶性の高分子物質に
作用しうる酵素との結合物及び他の抗原決定基に対する
抗体を接触せしめて反応させ、 さらに、前記の高分子物質に前記の結合物を接触せしめ
て酵素反応させ、酵素活性を測定することを特徴とする
抗原決定基具有物質の測定方法 - （２）他の抗原決定基に対する抗体が水溶性高分子が結
合されたものである特許請求の範囲第１項記載の測定方
法 - （３）他の抗原決定基に対する抗体にこの抗体に対する
抗体をさらに接触せしめることを特徴とする特許請求の
範囲第１項又は第２項記載の測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20345384A JPS6180050A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20345384A JPS6180050A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6180050A true JPS6180050A (ja) | 1986-04-23 |
| JPH0340832B2 JPH0340832B2 (ja) | 1991-06-20 |
Family
ID=16474368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20345384A Granted JPS6180050A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6180050A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01112159A (ja) * | 1987-10-26 | 1989-04-28 | Fujirebio Inc | 乾式免疫分析要素 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
| JPS59210365A (ja) * | 1983-05-02 | 1984-11-29 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | 均一系免疫試験法ならびにそれに用いるための試薬系、試験キツトおよび試験具 |
-
1984
- 1984-09-28 JP JP20345384A patent/JPS6180050A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
| JPS59210365A (ja) * | 1983-05-02 | 1984-11-29 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | 均一系免疫試験法ならびにそれに用いるための試薬系、試験キツトおよび試験具 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01112159A (ja) * | 1987-10-26 | 1989-04-28 | Fujirebio Inc | 乾式免疫分析要素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0340832B2 (ja) | 1991-06-20 |
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